CN117210453A - 病毒核酸释放液、提取病毒核酸的试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种病毒核酸释放液、提取病毒核酸的试剂盒及方法，所述一种病毒核酸释放液由以下浓度的组分组成：2M～5M胍盐、0.1％～2％Tween‑20、0.5％～3％TritonX‑100、5mM～50mM Tris‑HCl，所述Tris‑HCl溶液的pH为6～7.5。本发明选用合适浓度的胍盐、非离子表面活性剂Tween‑20和TritonX‑100、以及缓冲溶液四种成分作为病毒核酸释放液，不仅具有良好的裂解病毒的效果，同时还可以有效保存病毒核酸；使用本发明病毒核酸释放液，并配合优化的纯化液以及病毒核酸的提取方法等关键技术手段，实现了简单、环保、快捷、高效地提取病毒核酸的效果。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，更具体地，本发明涉及一种病毒核酸释放液、提取病毒核酸的试剂盒及方法。
背景技术
由于特异性和敏感性，分子诊断测定可用于检测多种病原体，特别是用于呼吸道传播和血液传播的病毒。在这些检测中，提取的核酸的浓度和质量会影响关键技术步骤，例如分子杂交、聚合酶链式反应(PCR)、实时定量聚合酶链式反应(qPCR)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。因此，提取病毒核酸的方法对于疾病的准确分子诊断非常重要。
众所周知，病毒核酸主要分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，长度比基因组DNA短。有些病毒感染的高峰期，病毒滴度过低，导致从复杂的生物标本中提取病毒核酸比较困难。目前市面上和实验室中提取病毒核酸常用的途径有以下三种：
1、传统的Trizol法
Trizol法的试剂成分比较简单，需要的试剂有Trizol(主要成分是苯酚和异硫氰酸胍)、氯仿、异丙醇、无水乙醇和无核酸酶的水。Trizol一般是作为提取总RNA、DNA的试剂，在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA、DNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA、DNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，DNA与RNA可以通过异丙醇或乙醇沉淀，这样就能获得所需要的核酸。
传统的Trizol法提取病毒核酸中使用的Trizol试剂的主要成分是苯酚和异硫氰酸胍，而且需要加入氯仿才能使DNA、RNA和蛋白质分离，而苯酚和氯仿都是危险化学品，购买和使用危险化学品都会受到国家严格的限制，而且使用危险化学品进行生产会有污染环境的风险以及可能会危害生产车间工人的生命健康和安全。
2、病毒核酸提取试剂盒(硅胶柱和磁珠法)
主要包括：(1)、病毒裂解液，包含异硫氰酸胍或盐酸胍、SDS、TritonX-100等组分，用于裂解病毒，使病毒核酸释放出来；(2)、Carrier RNA，又叫核酸助沉剂，在核酸提取环节，提取使用到的离心管壁多是聚丙烯的材料，管壁上有静电，会吸附核酸，在提取纯化过程中采用Carrier RNA可帮助核酸去除静电效应，保证核酸能很好被吸附到纯化柱上，提高洗脱效率，从而达到尽可能多的回收样本中核酸；(3)、蛋白酶K，能使蛋白变性，裂解病毒释放核酸，消除核酸分解酶(RNase)以防止病毒的RNA降解；(4)、核酸洗涤液，清洗核酸；(5)、无核酸酶的水，离心收集核酸沉淀后使用无核酸酶的水溶解核酸；(6)、2ml中间带滤膜的收集管或磁珠。另外还需要自行准备1.5ml EP管、无水乙醇、加热器等。
目前市面上这类病毒核酸提取试剂盒需要严苛的实验条件，例如：柱提法需要自备特定规格的EP管和无水乙醇用于核酸提取实验，需要用到能够进行高温加热的金属加热器或者水浴锅，加入的蛋白酶K需要保存于-20℃，对储存温度有要求；磁珠法成本更高，需要专业磁珠分离仪器，且寡核苷酸、RNA等易被破坏的物质可能会影响磁珠法的分离效果。若实验室中缺少其中部分仪器设备，则无法完成实验，或者导致实验结果有偏差。且病毒提取试剂盒基本都是保存和裂解病毒是分开的，都是先采样鼻咽拭子至病毒保存液中保存，后续再将吸取一部分保存液至裂解液中进行提取核酸，这些步骤比较繁琐。
3、病毒采样与核酸提取一体管，适合大批量提取病毒样本的核酸
现在市面上推出了新款的病毒采样及核酸提取试剂盒，例如友康公司研发的病毒采样与核酸提取一体管(型号：NM003)，能够将病毒采样和核酸提取合二为一，采样的同时能够完成核酸提取，在短时间内获得核酸。其预期用途是用于临床样本的病毒采集、灭活以及核酸提取。该试剂盒共包含4根管：采样管、提取棒一体管、清洗管和纯化管，采样管中主要是病毒裂解液，包括盐酸胍和EDTA等成分，用于裂解病毒并释放核酸；提取棒一体管中包含核酸提取棒，核酸提取棒在裂解液条件下能够吸附核酸；清洗管中含有清洗液，可以清洗吸附在核酸提取棒上的核酸；纯化管中含有纯化液，在纯化液条件下，吸附在核酸提取棒上的核酸能够迅速释放核酸至溶液中，得到的核酸溶液可以直接用于做下游实验。
目前病毒采样与核酸提取一体化病毒提取试剂盒，它的适用范围是拭子样本和痰液样本，适用范围较窄。采集样本后需要在48小时内送检，不能长期保存。产品包装包含4根15ml体积以上的管，占用大量的空间，也增加了生产成本，而且在使用时需要将吸附核酸的吸附棒在不同的管子之间进行转移，在转移过程中会损耗一部分核酸，而且也给实验操作人员带来不便。并且由于是15ml离心管，移液器深入管中进行操作，非常不方便，还容易污染管中的液体。该试剂盒要求采样完成后，必须保证采样管直立10分钟以上，确保核酸提取棒充分接触病毒核酸才能完成核酸吸附，在核酸纯化环节中，需要保持纯化管剧烈漩涡3分钟才能得到纯化的核酸，这些步骤耗时较长，使整个实验操作时间都显著延长。且在实际实验检测发现，提取的核酸虽然纯度较高，但是核酸含量非常低，几乎检测不到明显的核酸(在荧光定量PCR实验中，检测病毒内参基因的CT值都较高，表示提取得到的核酸量很低)，影响对整个结果的判断。
因此提供一种安全环保、简单高效的病毒核酸提取试剂盒，非常有意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种病毒核酸释放液、提取病毒核酸的试剂盒及方法。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供了一种病毒核酸释放液，其由以下浓度的组分组成：2M～5M胍盐、0.1％～2％Tween-20、0.5％～3％TritonX-100、5mM～50mM Tris-HCl，所述Tris-HCl溶液的pH为6～7.5。
本发明的第二方面，提供了一种提取病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述病毒核酸释放液、纯化液和核酸沉淀液，所述纯化液由饱和氯化钠溶液和糖原组成，所述纯化液中糖原的浓度为0.05μg/μL-1μg/μL。
本发明的第三方面，提供了一种提取病毒核酸的方法，使用上述提取病毒核酸的试剂盒，包括以下步骤：将待测样本在病毒核酸释放液中振荡混匀；加入纯化液混匀后离心；取上清加入核酸沉淀液混匀；使用吸附柱进行过滤，弃滤液；在吸附柱中加入清洗液，离心弃滤液，再甩干吸附柱；在吸附柱的膜中央加入DEPC水，室温静置后离心；舍弃吸附柱，即得。
在本发明中，发明人经过大量的实验，选用合适浓度的胍盐、非离子表面活性剂Tween-20和TritonX-100、以及缓冲溶液四种成分作为病毒核酸释放液，不仅具有良好的裂解病毒的效果，同时还可以有效保存病毒核酸；使用本发明病毒核酸释放液，并配合优化的纯化液以及病毒核酸的提取方法等关键技术手段，实现了高效、高质量地提取病毒核酸的效果。
附图说明
图1为本发明试验例1中使用四种病毒核酸释放液提取的DNA/RNA浓度结果。
图2为本发明试验例1中使用四种病毒核酸释放液提取的DNA/RNA纯度结果。
图3为对本发明试验例1中使用四种病毒核酸释放液提取的核酸进行荧光定量PCR扩增的Ct值结果。
图4为本发明试验例2中病毒核酸释放液中Tris-HCl的pH对提取的DNA/RNA浓度的影响。
图5为本发明试验例2中病毒核酸释放液中Tris-HCl的pH对提取的DNA/RNA纯度的影响。
图6为本发明试验例2中病毒核酸释放液中Tris-HCl的pH对提取的DNA/RNA的Ct值的影响。
图7为本发明试验例3中病毒核酸释放液中Tween-20的浓度对提取的DNA/RNA浓度的影响。
图8为本发明试验例3中病毒核酸释放液中Tween-20的浓度对提取的DNA/RNA纯度的影响。
图9为本发明试验例3中病毒核酸释放液中Tween-20的浓度对提取的DNA/RNA的Ct值的影响。
图10为本发明试验例4中病毒核酸释放液中Tris-HCl的浓度对提取的DNA/RNA浓度的影响。
图11为本发明试验例4中病毒核酸释放液中Tris-HCl的浓度对提取的DNA/RNA纯度的影响。
图12为本发明试验例4中病毒核酸释放液中Tris-HCl的浓度对提取的DNA/RNA的Ct值的影响。
图13为本发明试验例5中病毒核酸释放液中TritonX-100的浓度对提取的DNA/RNA浓度的影响。
图14为本发明试验例5中病毒核酸释放液中TritonX-100的浓度对提取的DNA/RNA纯度的影响。
图15为本发明试验例5中病毒核酸释放液中TritonX-100的浓度对提取的DNA/RNA的Ct值的影响。
图16为本发明试验例6中病毒核酸释放液中异硫氰酸胍的浓度对提取的DNA/RNA浓度的影响。
图17为本发明试验例6中病毒核酸释放液中异硫氰酸胍的浓度对提取的DNA/RNA纯度的影响。
图18为本发明试验例6中病毒核酸释放液中异硫氰酸胍的浓度对提取的DNA/RNA的Ct值的影响。
图19为本发明试验例7中纯化液中糖原的浓度对提取的DNA/RNA浓度的影响。
图20为本发明试验例7中纯化液中糖原的浓度对提取的DNA/RNA纯度的影响。
图21为本发明试验例7中纯化液中糖原的浓度对提取的DNA/RNA的Ct值的影响。
图22为本发明试验例8中常规法和柱体法对提取的DNA/RNA浓度的影响。
图23为本发明试验例8中常规法和柱体法对提取的DNA/RNA纯度的影响。
图24为本发明试验例8中常规法和柱体法对提取的DNA/RNA的Ct值的影响。
图25为本发明试验例9中将病毒存放于病毒核酸释放液1、3、5、7天后，再提取的DNA/RNA浓度的变化。
图26为本发明试验例9中将病毒存放于病毒核酸释放液1、3、5、7天后，再提取的DNA/RNA纯度的变化。
图27为本发明试验例9中将病毒存放于病毒核酸释放液1、3、5、7天后，再提取的DNA/RNA的Ct值的变化。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(MolecuLar Cloning:ALaboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
在本发明中，发明人经过大量的实验，选用胍盐、非离子表面活性剂Tween-20和TritonX-100、以及缓冲溶液作为病毒核酸释放液，由这四种成分组成的病毒核酸释放液不仅具有良好的裂解病毒的效果，同时稳定性高，还可以有效保存病毒核酸；其中，胍盐可选自盐酸胍或异硫氰酸胍，优选异硫氰酸胍，胍盐不仅能够快速破坏细胞膜，还是强力的蛋白质变性剂，能够变性蛋白质，使得蛋白质变性沉淀，从而让核酸能够摆脱蛋白质的缠绕；且胍盐具有无RNA酶和DNA酶活性的特点，能够在灭活病毒的同时提高病毒的检出率，能够破坏RNA酶的分子结构，使样本中可能存在的核酸酶失活，起到稳定保存病毒样本的作用；非离子表面活性剂TritonX-100能够溶解脂质以增加细胞膜的通透性，Tween-20是具有脂肪酸的酯基团和长聚氧乙烯链的聚山梨酯表面活性剂，具有破坏病毒蛋白结构的作用，溶解蛋白的能力高；缓冲溶液的作用是维持病毒核酸释放液在恒定的pH环境中，核酸稳定性好。
此外，本发明还优化了病毒核酸提取试剂盒中纯化液的配方，优化后的纯
化液包括饱和氯化钠溶液和一定浓度的糖原，通过饱和氯化钠溶液将病毒核酸释放液中除核酸外的其他大部分杂质，尤其是蛋白质析出，通过离心之后，杂质都沉淀在管底，此时核酸仍保留在溶液中，使核酸保持稳定，吸出溶液即可获得初步纯化的核酸；糖原是一种支链碳水化合物，主要用作核酸共沉淀物，在后续有助于核酸沉淀液沉淀核酸，对于样本中如鼻咽拭子中的少量病毒核酸提取，沉淀是必不可少的，而糖原不会干扰260/280读数值和核酸下游实验，如常规PCR、荧光定量PCR、测序等等。
在以上基础上，本发明还对常规提取病毒核酸的方法进行了改进，提出了使用吸附柱来提取病毒核酸的方法，提取的病毒核酸的扩增效果更好。
使用本发明的提取病毒核酸的试剂盒进行病毒核酸的提取，可以实现快速、高效、安全地提取生物样品中的核酸，提取的核酸量比相同条件下其他类型的病毒核酸提取试剂盒更高，通过荧光定量PCR检测的CT值也更低，高质量的病毒核酸样本，有利于后续检测。所使用试剂均为无毒无害且安全有效的试剂，不含苯酚、氯仿等危险化学品，病毒核酸释放液的体积小，所需要的包装条件也更简单，节约包装材料和空间，降低生产成本，更加环保；在提取病毒核酸的过程中，所需实验条件简单，只要实验室具备低温离心机即可完成整个核酸提取过程，无需配备其他实验仪器，整个实验操作过程无需加热，无需蛋白酶K处理，只需要转移一次液体，降低核酸丢失的风险，减少实验操作步骤，节约实验操作时间，全程只需用时8min。本发明的提取病毒核酸的试剂盒适用范围更广，不仅适用于鼻咽拭子，还可用于病毒液、血清、尿液、宫颈脱落细胞碎片与经预处理的粪便等样本，且临床采样的咽拭子可以直接放进去，在运输过程中裂解，这样还比其他试剂盒减少很多裂解所需的时间。
在本发明的其中一些实施例中，公开了一种病毒核酸释放液，其由以下浓度的组分组成：2M～5M胍盐、0.1％～2％Tween-20、0.5％～3％TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚-100)、5mM～50mM Tris-HCl，所述Tris-HCl溶液的pH为6～7.5。
在其中一些实施例中，所述胍盐的浓度为2.5M～5M，优选为3M～4M。
在其中一些实施例中，所述Tween-20的浓度为0.5％～1.2％，优选为0.8％～1.2％。
在其中一些实施例中，所述TritonX-100的浓度为1％～2.5％，优选为1.5％～2.5％。
在其中一些实施例中，所述Tris-HCl的浓度为10mM～35mM，优选为25mM～35mM。
在其中一些实施例中，所述病毒核酸释放液由以下浓度的组分组成：3M～4M胍盐、0.8％～1.2％Tween-20、1.5％～2.5％TritonX-100、25mM～35mM Tris-HCl。
在其中一些实施例中，所述病毒核酸释放液由以下浓度的组分组成：3M～3.2M异硫氰酸胍、0.9％～1.1％Tween-20、1.9％～2.1％TritonX-100、29mM～31mM Tris-HCl，所述Tris-HCl溶液的pH为6.8～7.5。
在其中一些实施例中，所述胍盐为盐酸胍或异硫氰酸胍，优选为异硫氰酸胍。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种提取病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒包括上述病毒核酸释放液、纯化液和核酸沉淀液，所述纯化液由饱和氯化钠溶液和糖原组成，所述纯化液中糖原的浓度为0.05μg/μL-1μg/μL。
在其中一些实施例中，所述纯化液中糖原的浓度为0.4μg/μL-0.8μg/μL。
在其中一些实施例中，所述纯化液中糖原的浓度为0.7μg/μL-0.8μg/μL。
在其中一些实施例中，所述核酸沉淀液为异丙醇，可以与纯化液中的糖原将核酸共沉淀析出，此时再将溶液进行离心，核酸就会析出沉淀于管底，将上清液去掉后，即可得到核酸。
在其中一些实施例中，所述试剂盒还包括清洗液和洗脱液；所述清洗液为75％乙醇，使用DEPC水配制，其作用是加入到吸附柱中后离心，即可洗涤核酸，离心后吸附在柱子上的核酸即是高纯度的核酸；所述洗脱液为DEPC水或无RNA酶和无DNA酶水，其不含醇类物质，能够很好保护核酸不被降解，有利于核酸的保存以及下游应用。
在本发明的另一些实施例中，公开了一种提取病毒核酸的方法，使用上述提取病毒核酸的试剂盒，包括以下步骤：将待测样本在病毒核酸释放液中振荡混匀；加入纯化液混匀后离心；取上清加入核酸沉淀液混匀；使用吸附柱进行过滤，弃滤液；在吸附柱中加入清洗液，离心弃滤液，再甩干吸附柱；在吸附柱的膜中央加入DEPC水，室温静置后离心；舍弃吸附柱，即得。
在其中一些实施例中，所述待测样本为拭子、病毒液、血清、尿液或经预处理的粪便。
在其中一些实施例中，当所述待测样本为拭子时，保持拭子的头部直立放置于病毒核酸释放液中，以使头部完全浸没在病毒核酸释放液中。
在以下实施例中，所使用的水疱性口炎病毒(VSV)、单纯性疱疹病毒(HSV)分别为293T细胞(人胚肾细胞)和Vero细胞(绿猴肾细胞)培养得到的病毒。异硫氰酸胍购自Macklin/麦克林；Tween-20和Tris-HCl溶液(pH6.8)购自Beyotime/碧云天；TritonX-100购自APPLYGEN/普利莱；吸附柱购自NESTEBIO公司。
下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。
实施例1病毒核酸释放液、及提取病毒核酸的试剂盒
本实施例中的病毒核酸释放液由以下浓度的组分组成：3M异硫氰酸胍、1％Tween-20、2％TritonX-100、30mM Tris-HCl溶液(pH 6.8)。
本实施例的提取核酸病毒的试剂盒包括上述病毒核酸释放液、纯化液(饱和
氯化钠溶液和0.8μg/μL糖原)、核酸沉淀液(95％异丙醇)、清洗液(DEPC水配制的75％乙醇)和洗脱液(DEPC处理过的超纯水溶液)。
实施例2病毒核酸释放液、及提取病毒核酸的试剂盒
本实施例中的病毒核酸释放液由以下浓度的组分组成：4M异硫氰酸胍、0.5％Tween-20、1％TritonX-100、10mM Tris-HCl溶液(pH 6.8)。
本实施例的提取核酸病毒的试剂盒包括上述病毒核酸释放液、纯化液(饱和氯化钠溶液和0.1μg/μL糖原)、核酸沉淀液(95％异丙醇)、清洗液(DEPC水配制的75％乙醇)和洗脱液(DEPC处理过的超纯水溶液)。
实施例3病毒核酸释放液、及提取病毒核酸的试剂盒
本实施例中的病毒核酸释放液由以下浓度的组分组成：2.5M异硫氰酸胍、2％Tween-20、3％TritonX-100、40mM Tris-HCl溶液(pH 6.8)。
本实施例的提取核酸病毒的试剂盒包括上述病毒核酸释放液、纯化液(饱和氯化钠溶液和1μg/μL糖原)、核酸沉淀液(99％异丙醇)、清洗液(DEPC水配制的75％乙醇)和洗脱液(DEPC处理过的超纯水溶液)。
实施例4提取拭子中病毒核酸的方法
本实施例提供了一种提取拭子病毒核酸的方法，使用实施例1所述的试剂盒，包括以下步骤：
(1)、将病人采样完成的咽拭子头部折断至装有1mL病毒核酸释放液的采样管中，运输过程保持直立以使咽拭子头部完全浸没在病毒核酸释放液中；
(2)、样本运输至实验室后，剧烈涡旋振荡1min，吸取800μL病毒核酸释放液至新的2mL离心管中。
(3)、加入100μL纯化液至样品中。涡旋震荡混匀。4℃，15000rpm离心1分钟；
(4)、收集离心后的上清液850μL至新的2mL EP管中，加入850μL的核酸沉淀液(上清液的1倍体积)，涡旋震荡混匀；
(5)、将吸附柱装在2mL收集管中，转移700μL混合液至吸附柱中，12000rpm离心30s；倒弃滤液，将吸附柱装在收集管中，转移剩余混合液至吸附柱中，12000rpm离心30s。重复此步骤直到混合液都从吸附柱中过滤；
(6)、将吸附柱重新装在收集管中，加入600μL清洗液到吸附柱中，12000rpm离心30s；
(7)、倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装在收集管中，12000rpm离心空柱30s甩干吸附柱；
(8)、将吸附柱转移到新的1.5ml离心管中，往吸附柱膜中央加入30～50uL DEPC水，室温静置2分钟，12000rpm离心30s。
(9)、舍弃吸附柱，-80℃保存核酸。
实施例5提取血清、尿液、粪便等样本中病毒核酸的方法
本实施例提供了一种提取血清、尿液、粪便等样本中病毒核酸的方法(其中，对粪便样本先进行预处理，即挑取黄豆大小的粪便加入到1.5mL生理盐水溶解，震荡混匀，4℃,1000rpm离心5min，取上清)，使用实施例1所述的试剂盒，包括以下步骤：
(1)、取100μL待测样本，加入到含700μL病毒核酸释放液的2ml EP管中，在室温裂解5分钟，然后加入100μL纯化液，在离心机中4℃，15000rpm离心1min，吸取上清液并转移至新的2ml EP管中；
(2)、再往上一步吸取的上清液中按1：1加入核酸沉淀液，涡旋震荡混匀。4℃，15000rpm离心1分钟；
(3)、收集离心后的上清液850μL至新的2mL EP管中，加入850μL的核酸沉淀液(上清液的1倍体积)，涡旋震荡混匀；
(4)、将吸附柱装在2mL收集管中，转移700μL混合液至吸附柱中，12000rpm离心30s；倒弃滤液，将吸附柱装在收集管中，转移剩余混合液至吸附柱中，12000rpm离心30s。重复此步骤直到混合液都从吸附柱中过滤；
(5)、将吸附柱重新装在收集管中，加入600μL清洗液到吸附柱中，12000rpm离心30s；
(6)、倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新装在收集管中，12000rpm离心空柱30s甩干吸附柱；
(7)、将吸附柱转移到新的1.5mL离心管中，往吸附柱膜中央加入30～50uL DEPC水，室温静置2分钟，12000rpm离心30s。
(8)、舍弃吸附柱，-80℃保存核酸。
实施例6临床验证
一、拭子样本的临床验证
使用本发明实施例1的试剂盒及市售友康病毒采样及核酸提取试剂盒，按实施例4的方法分别提取病人(临床确诊感染合胞病毒8例、偏肺病毒8例、鼻病毒8例、副流感病毒8例、腺病毒5例)咽拭子的核酸。对提取得到的核酸进行荧光定量PCR，比较核酸提取的效果。反应体系和反应程序如表1和表2所示，其中，所涉及的引物序列如表3所示。
表1
| 组分名称 | 用量 |
| RNase-free ddH2O | 5.2μl |
| 2×One Step SYBR Green Mix | 10μl |
| One Step SYBR Green Enzyme Mix | 1μl |
| Gene Specific Primer Forward(10μM) | 0.4μl |
| Gene Specific Primer Reverse(10μM) | 0.4μl |
| 核酸模板 | 3μl |
表2
表3
结果如表4所示。
表4
从表4结果可知，相比友康试剂盒，使用本发明试剂盒提取的核酸，进行扩增时，其Ct值明显更小，且除了腺病毒外，差异均有统计学意义；分析腺病毒结果差异不显著的可能原因是腺病毒样本量较少。
二、血清、尿液、粪便等样本的临床验证
按实施例5的方法，使用本发明实施例1的试剂盒提取病人(临床确诊感染HPV病毒15例、HCMV病毒10例、BK病毒5例、NoV病毒7例，样本分别取自宫颈脱落细胞、血清、尿液、粪便)的核酸；同时按实施例5的方法，使用市售广州达安基因核酸提取或纯化试剂(磁珠法)提取上述病人核酸。使用市售人乳头瘤病毒(HPV)检测试剂盒(罗氏公司)定量检测上述临床确诊感染HPV病毒的病人的核酸，使用HCMV人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法，广州达安基因股份公司)定量检测上述临床确诊感染HCMV病毒的病人的核酸，使用BK病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法，北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司，货号SMD-02-034)定量检测上述临床确诊感染BK病毒的病人的核酸，使用诺如病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法，湖北朗德医疗科技有限公司)定量检测上述临床确诊感染NoV病毒的病人的核酸。比较本发明实施例1的试剂盒和市售广州达安基因核酸提取或纯化试剂(磁珠法)核酸提取的效果。
结果分别如表5、表6、表7、表8所示。
表5
表6
表7
表8
从表5～8结果可知，本发明的试剂盒可以用于血清、尿液、粪便、宫颈刮落细胞等多种样本类型的病毒核酸提取，且相对于市售试剂盒提取的病毒核酸，浓度更高，Ct值更低，说明本发明的试剂盒效果更佳。试验例1病毒核酸释放液配方的优化
分别采用四种病毒核酸释放液的试剂盒(仅病毒核酸释放液不相同，纯化液、核酸沉淀液、清洗液和洗脱液均同实施例1)、以及竞品试剂盒提取水疱性口炎病毒(VSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)的核酸(n＝3)，再分别进行荧光定量PCR，比较核酸提取的效果。
1、实验分组
(1)、病毒核酸释放液为2M异硫氰酸胍和3％TritonX-100的试剂盒
(2)、病毒核酸释放液为2M异硫氰酸胍、3％TritonX-100和5mM Tris-HCl溶液(pH6.8)的试剂盒
(3)、病毒核酸释放液为2M异硫氰酸胍、0.1％Tween-20和3％TritonX-100的试剂盒
(4)、病毒核酸释放液为2M异硫氰酸胍、0.1％Tween-20、3％TritonX-100、
和5mM Tris-HCl溶液(pH 6.8)的试剂盒
(5)、市售友康病毒采样及核酸提取试剂盒
2、采用常规法提取核酸
(1)、取100μL水疱性口炎病毒(VSV)或单纯性疱疹病毒(HSV)，分别加入到四种含700μL病毒核酸释放液的2ml EP管中，在室温裂解5分钟，然后加入100μL纯化液，在离心机中4℃，15000rpm离心1min，吸取上清液并转移至新的2ml EP管中；
(2)、按1：1在上清液中加入核酸沉淀液，室温静置沉淀2分钟，再在离心机中4℃，15000rpm离心1分钟，倒掉上清液，保留核酸沉淀；
(3)、加入1ml清洗液洗涤核酸沉淀，再在离心机中4℃，15000rpm离心1分钟，倒掉上清液，保留核酸沉淀；
(4)、静置沉淀待清洗液完全挥发后，加入30μl DEPC水溶解核酸。
另，参考竞品试剂盒的说明书提取100μL水疱性口炎病毒(VSV)或单纯性疱疹病毒(HSV)的核酸。
3、荧光定量PCR扩增
对上述得到的核酸使用诺唯赞公司的HiScript IIOne Step qRT-PCR SYBRGreen Kit(货号：Q221-01)试剂盒进行荧光定量PCR，反应体系和扩增程序如表1和表2。其中表1中所涉及的正向引物和反向引物如表9所示。
表9
4、实验结果
结果如图1～3所示。在异硫氰酸胍与TritonX-100基础上，再联合Tween-20
与Tris-HCl缓冲液，作为病毒核酸释放液，提取得到的核酸综合效果最佳，体现在：提取得到的DNA/RNA浓度高(图1)、纯度高(在高纯度1.8-2.1范围之间)(图2)，荧光定量PCR扩增的CT值最低(图3)，与市售友康病毒采样及核酸提取试剂盒(图1～3中的竞品试剂盒)之间的差异有统计学意义。而在异硫氰酸胍与TritonX-100基础上，仅联合Tween-20或Tris-HCl缓冲液，作为病毒核酸释放液，提取得到的核酸，其浓度较低，荧光定量PCR扩增的CT值较高。因此，病毒核酸释放液选定为异硫氰酸胍、Tween-20、TritonX-100和Tris-HCl溶液。
试验例2病毒核酸释放液中Tris-HCl pH的优化
改变病毒核酸释放液中Tris-HCl的pH，其他组分浓度保持不变(均同实施例1)，得到四种病毒核酸释放液(Tris-HCl的pH分别为6、6.8、7.5和8)，根据试验例1的方法提取水疱性口炎病毒(VSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)的核酸(n＝3)，再进行荧光定量PCR扩增，比较提取的核酸效果。
结果如图4～6所示。使用不同pH的Tris-HCl病毒核酸释放液提取的核酸，尽管浓度和纯度差异不大(图4～5)，但荧光定量PCR扩增的Ct值差异非常大(图6)，当Tris-HCl的pH为6～7.5时，Ct值相对较小；而Tris-HCl的pH为8时，纯度偏高(纯度最佳范围为1.8～2.1，超过2.1认为可能是降解导致)，Ct值也大幅
提高。因此，病毒核酸释放液中的Tris-HCl的pH为6～7.5，优选为6.8～7.5。
试验例3病毒核酸释放液中Tween-20浓度的优化
改变病毒核酸释放液中Tween-20的浓度，其他组分浓度保持不变(均同实施例1)，得到七种病毒核酸释放液(Tween-20的体积浓度分别为0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％和5％)，根据试验例1的方法提取水疱性口炎病毒(VSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)的核酸(n＝3)，再进行荧光定量PCR扩增，比较核酸提取的效果。
结果如图7～9所示。病毒核酸释放液中Tween-20的浓度不同，其提取得到的核酸的结果存在明显差异。使用较低浓度(如0.05％)的Tween-20，其核酸浓度会偏低，Ct值偏高；而使用较高浓度(如3％、5％)的Tween-20，则会引起最后洗涤时无法完全除去，影响纯度和Ct值。
对这七种病毒核酸释放液提取的核酸进行扩增时，其Ct值差异有统计学意义(F＝6.090,P＝0.003)，具体来说：Tween-20的体积浓度为0.05％、3％和5％时提取的核酸，其相应Ct值，比Tween-20的体积浓度为0.1％、0.5％、1％、2％时提取的核酸相应的Ct值高。当病毒核酸释放液中Tween-20的体积浓度为0.1％～2％时，提取的核酸浓度和纯度较高，Ct值较好；作为优选地，当病毒核酸释放液中Tween-20的体积浓度为0.5％～1.2％时，提取的核酸的效果最好，浓度和纯度更高，Ct值更低，Tween-20的体积浓度更优选为0.8％～1.2％，最优选为1％。
试验例4病毒核酸释放液中缓冲液(Tris-HCl)浓度的优化
改变病毒核酸释放液中的缓冲液(Tris-HCl)的浓度，其他组分浓度保持不变(均同实施例1)，得到四种病毒核酸释放液(Tris-HCl的浓度分别为1mM、2mM、5mM、10mM、30mM、50mM、80mM、100mM)，根据试验例1的方法提取水疱性口炎病毒(VSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)的核酸(n＝3)，再进行荧光定量PCR，比较核酸提取的效果。
结果如图10～12所示。病毒核酸释放液中Tris-HCl的浓度不同，其提取得到的核酸的结果存在非常大的差异。使用较低浓度(如1mM、2mM)的Tris-HCl，无法维持核酸释放液处于酸性条件下，对核酸的释放作用较小，其核酸浓度很低，Ct值很高；而使用较高浓度(如浓度大于50mM)的Tris-HCl，Ct值也会提高。当病毒核酸释放液中Tris-HCl的浓度在5mM～50mM时，浓度相对较高，纯度也在1.8-2.1范围内，对提取的核酸进行扩增时，其Ct值更小，扩增效果更佳。作为优选地，当病毒核酸释放液中Tris-HCl的浓度在10mM～35mM时，提取的核酸浓度和纯度更高，Ct值更低，更为优选地，Tris-HCl的浓度为25mM～35mM，最优选为30mM。
试验例5病毒核酸释放液中TritonX-100浓度的优化
改变病毒核酸释放液中的TritonX-100的浓度，其他组分浓度保持不变(均同实施例1)，得到七种病毒核酸释放液(TritonX-100的体积浓度分别为0.1％、0.5％、1％、2％、3％、5％，10％)，根据试验例1的方法提取水疱性口炎病毒(VSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)的核酸(n＝3)，再进行荧光定量PCR，比较核酸提取的效果。
结果如图13～15所示。病毒核酸释放液中TritonX-100的浓度不同，其提取得到的核酸的结果存在显著差异。随着TritonX-100的浓度不断增大，提取得到的核酸浓度整体也不断增大，但纯度随着TritonX-100浓度的增加而呈下降趋势，当TritonX-100的浓度超过5％时，提取的核酸纯度仅在1.5左右，提示存在较多的杂质。当病毒核酸释放液中TritonX-100的浓度在0.5％～3％时，提取的核酸浓度和纯度相对较高，对提取的核酸进行扩增时，其Ct值较好。作为优选地，当病毒核酸释放液中TritonX-100的浓度在1％～2.5％时，提取的核酸浓度和纯度更高，Ct值更低，更为优选地TritonX-100的浓度为1.5％～2.5％，最优选为2％。试验例6病毒核酸释放液中异硫氰酸胍(GTC)浓度的优化
改变病毒核酸释放液中的异硫氰酸胍(GTC)的浓度，其他组分浓度保持不变(均同实施例1)，得到六种病毒核酸释放液(异硫氰酸胍GTC的浓度分别为1M、2M、3M、4M、5M、6M)，根据试验例1的方法提取水疱性口炎病毒(VSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)的核酸(n＝3)，再进行荧光定量PCR，比较核酸提取的效果。
结果如图16～18所示。病毒核酸释放液中异硫氰酸胍(GTC)的浓度较小(1M)时，存在病毒裂解不完全的情况，浓度和纯度都较低，而当浓度较高(6M)时，由于异硫氰酸胍常温时会达到饱和状况，会析出晶体，因此，影响了裂解效果。当病毒核酸释放液中异硫氰酸胍的浓度为2～5M时，提取的核酸浓度和纯度都较好，进行扩增时，其Ct值较低；作为优选的，异硫氰酸胍的浓度为2.5～5M；更为优选的，异硫氰酸胍的浓度为3～4M，最优选为3M。
试验例7试剂盒纯化液中糖原浓度的优化
改变试剂盒纯化液中糖原的浓度，试剂盒其他成分和浓度保持不变(均同实施例1)，得到九种纯化液(糖原浓度分别为0μg/μL、0.02μg/μL、0.05μg/μL、0.15μg/μL、0.4μg/μL、0.8μg/μL、1μg/μL、1.5μg/μL、2μg/μL)，根据试验例1的方法提取水疱性口炎病毒(VSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)的核酸(n＝3)，再进行荧光定量PCR，比较核酸提取的效果。
结果如图19～21所示。纯化液中糖原的添加与否，以及糖原的浓度，对提取得到的核酸的结果具有极其显著的影响。一方面，饱和氯化钠联合糖原作为纯化液，比单独使用饱和氯化钠作为纯化液的效果显著要好，提取的核酸浓度较高，Ct值较低，差异之间存在统计学意义。另一方面，随着糖原的浓度不断增加，核酸浓度会随之提高，Ct值有所下降，但当糖原浓度超过1μg/μL时，虽然得到的浓度较高，但纯度并不好。纯化液中糖原的浓度为0.05～1μg/μL时，提取的核酸浓度和纯度较好，进行扩增时，其Ct值较低；作为优选的，糖原的浓度为0.4～1μg/μL，更优选为0.4～0.8μg/μL，最优选为0.8μg/μL。
试验例8核酸提取方法的优化
使用实施例1的试剂盒，分别采用常规法和柱提法提取水疱性口炎病毒(VSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)的核酸(n＝3)。常规法提取核酸过程如试验例1。柱提法提取核酸的过程如实施例5。对提取得到的核酸进行荧光定量PCR，比较
核酸提取的效果。
结果如图22～24所示。从图22～24可知，相比常规法，使用柱提法提取的核酸，能减少核酸的损失，并且洗涤更加充分，杂质明显减少。进行扩增时，其Ct值明显更小，扩增效果显著提高，因此，使用柱提法提取核酸效果更好。
试验例9体系稳定性验证
将水疱性口炎病毒(VSV)和单纯性疱疹病毒(HSV)加入实施例1的病毒核酸
释放液中，于4℃放置1、3、5、7天，再采用试验例1的方法进行核酸提取，
对提取得到的核酸进行荧光定量PCR，比较核酸提取的效果。
结果如图25～27所示。从图25～27可知，病毒在病毒核酸释放液中存放1、3、5、7天后，再提取核酸，存放五天的样本其浓度、纯度和Ct值变化均不大，效果相差不大，说明本发明的病毒核酸释放液稳定性好，具有很好的病毒保存效果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种病毒核酸释放液，其特征在于，其由以下浓度的组分组成：2M～5M胍盐、0.1％～2％Tween-20、0.5％～3％TritonX-100、5mM～50mM Tris-HCl，所述Tris-HCl溶液的pH为6～7.5。
2.根据权利要求1所述的病毒核酸释放液，其特征在于，所述胍盐为盐酸胍或异硫氰酸胍；所述胍盐的浓度为2.5M～5M，优选为3M～4M；和/或，
所述Tween-20的浓度为0.5％～1.2％，优选为0.8％～1.2％；和/或，
所述TritonX-100的浓度为1％～2.5％，优选为1.5％～2.5％；和/或，
所述Tris-HCl的浓度为10mM～35mM，优选为25mM～35mM。
3.根据权利要求1或2所述的病毒核酸释放液，其特征在于，所述病毒核酸释放液由以下浓度的组分组成：3M～4M胍盐、0.8％～1.2％Tween-20、1.5％～2.5％TritonX-100、25mM～35mM Tris-HCl。
4.根据权利要求3所述的病毒核酸释放液，其特征在于，所述病毒核酸释放液由以下浓度的组分组成：3M～3.2M异硫氰酸胍、0.9％～1.1％Tween-20、1.9％～2.1％TritonX-100、29mM～31mM Tris-HCl，所述Tris-HCl溶液的pH为6.8～7.5。
5.一种提取病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～4任一项所述的病毒核酸释放液、纯化液和核酸沉淀液，所述纯化液由饱和氯化钠溶液和糖原组成，所述纯化液中糖原的浓度为0.05μg/μL-1μg/μL。
6.根据权利要求5所述的提取病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述纯化液中糖原的浓度为0.4μg/μL～0.8μg/μL；优选为0.7μg/μL～0.8μg/μL；和/或所述核酸沉淀液为95～99％的异丙醇。
7.根据权利要求5或6所述的提取病毒核酸的试剂盒，其特征在于，所述
试剂盒还包括清洗液和洗脱液；所述清洗液为DEPC水配制的75％～80％乙醇；
所述洗脱液为DEPC水或无RNA酶和无DNA酶水。
8.一种提取病毒核酸的方法，其特征在于，使用权利要求5～7任一项所述的提取病毒核酸的试剂盒，包括以下步骤：将待测样本在病毒核酸释放液中振荡混匀；加入纯化液混匀后离心；取上清加入核酸沉淀液混匀；使用吸附柱进行过滤，弃滤液；在吸附柱中加入清洗液，离心弃滤液，再甩干吸附柱；在吸附柱的膜中央加入洗脱液，室温静置后离心；舍弃吸附柱，即得。
9.根据权利要求8所述的提取病毒核酸的方法，其特征在于，所述待测样
本为拭子、病毒液、血清、尿液、宫颈脱落细胞碎片或粪便。
10.根据权利要求9所述的提取病毒核酸的方法，其特征在于，当所述待测样本为拭子时，保持拭子的头部直立放置于病毒核酸释放液中。
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