CN117210422A - 一种细菌漆酶变构体及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌漆酶变构体及其制备方法，其中还公开了相应核酸序列以及包含有该序列的工程菌；本发明通过在特定的序列位点进行删除相应序列或缺失片段，更为具体的为删除了序列中形成MR螺旋和R‑loop结构的序列，使得所获得的细菌漆酶的变构体酶活性增强和表达量的有效提高。

Description

一种细菌漆酶变构体及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程和酶工程领域，尤其涉及高表达量的细菌漆酶变构体及其制备方法。

背景技术

漆酶，一种含多个铜离子的多酚氧化酶，主要以单体糖蛋白的形式存在。漆酶有着广泛的催化底物谱，能够催化氧化酚类和芳香族化合物，发生反应后唯一的产物就是水，因此本质上是一种环保催化剂。此外，还能和其他酶协同催化，是最具有潜力的工业酶制剂。漆酶可以用于食品加工、纸浆漂白和绿色合成等工业领域，具有广阔的应用价值。在自然界中，漆酶的来源广泛，在真菌、细菌、植物和动物中都发现了漆酶，不同物种来源的漆酶功能相似。其中，细菌来源的漆酶相对于其他漆酶，具有生长周期短、热稳定性好且pH范围宽等优势，更适合大规模工业化应用。然而，目前有关提高细菌来源漆酶活性和表达量的方法甚少，因此，对提高细菌漆酶活性和表达量的研究具有重要研究意义和实际应用价值。定向改造策略是对蛋白质进行多轮积累、连续突变、表达、筛选，从而引导蛋白质的表达朝人们需要的方向进行的手段。它是目前应用最广泛的蛋白质改造手段，但其筛选时间长、工作量大、且突变随机不可预测，影响蛋白质改造效率。随着结构生物学和计算生物学的快速发展，计算机模拟辅助酶改造通过分析蛋白序列、结构与功能之间的关系，预测基因改造范围与位点，可显著增加有效变构体的比例，大大缩短实验周期。许多研究表明，通过计算机辅助的理性设计，酶分子改造能够显著提高酶的催化特性，并能够显著降低建立、筛选变构体文库所需的工作量。

然而，定点改造技术只集中在对蛋白质分子的小范围改造，特别是点突变。随着对蛋白质折叠以及蛋白质结构认识的深入，人们不断探索通过对蛋白酶结构域基因进行改造，发现结构域改造后酶的酶活、表达量以及其他特性均有显著改善。目前，计算机辅助设计改在漆酶结构域基因主要针对脱氢酶、纤维素酶、甘露聚糖酶等，目前仍鲜有通过基因结构域优化改造提升漆酶活性和表达量的专利报道。

发明内容

本发明提供了一种细菌漆酶变构体、相关序列、工程菌及其制备方法。

本发明是通过以下的技术方案来实现的。

一种细菌漆酶变构体，所述细菌漆酶变构体的氨基酸序列相较于SEQ ID NO.1所示的野生型细菌漆酶的氨基酸序列存在至少一个缺失片段；所述缺失片段被移除后，不改变由His443，Cys500和His505所形成的Cu1的空间结构。

优选地，所述的缺失片段为野生型细菌漆酶中的形成R-loop结构或MR螺旋的氨基酸序列。

优选地，所述缺失片段的位置为SEQ ID NO.1所示的野生型细菌漆酶的氨基酸序列的61-68、128-140、198-206、256-264、313-322或373-385号位中的任意一个位点。

优选地，所述细菌漆酶变构体的氨基酸序列为SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.9所示序列的任意一种。

本发明还提供了一种编码前述的细菌漆酶变构体的核酸序列。

优选地，所述的核酸序列为SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.18所示序列的任意一种。

本发明还提供了一种工程菌所述的工程菌中含有前述述的核酸序列和/或包含有所述的细菌漆酶变构体。

本发明还提供了一种细菌漆酶变构体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、获取序列：以大肠杆菌来源的漆酶CueO的晶体结构为原型，通过AutodockVina、RosettaFold、PyMOL、Procheck软件进行蛋白质辅助设计，得到细菌漆酶变构体、序列结构与基因序列；

步骤2、合成漆酶基因：根据宿主菌株的密码子偏爱，合成得到含偏爱密码子优化的细菌漆酶变构体的基因的克隆载体质粒pUC-GW-Kan及其宿主菌株；

步骤3、提取漆酶基因模板：对含克隆载体质粒的宿主菌株进行培养、收集，提取质粒，得到含细菌漆酶变构体的基因模板的载体pUC-GW-Kan；

步骤4、构建重组载体：通过酶切连接法将细菌漆酶变构体的基因与pET28a+质粒连接构建重组载体，得到重组载体；

步骤5、构建重组菌株：将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，得到重组菌株；

步骤6、诱导培养：用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养重组菌株，并加入硫酸铜(CuSO4)进一步培养，并提取蛋白；

步骤7、漆酶活性的测定：使用ABTS法测定漆酶活性。

优选地，步骤5所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21 DE3菌株，所述菌株又称为大肠杆菌BL21(D3)菌株。

漆酶的催化机理为Cu1位于酶的活性中心可以结合底物，成为电子的接收者并将电子转移到Cu2上，将活性中心的氧分子还原成水。因此本发明选择了远离Cu1离子的位点进行删减，如61-68、128-140、198-206、256-264、313-322号位；可以根据电脑模拟出模型试错得出以下位点被删减不会影响到活性中心。R-loop的存在会影响到蛋氨酸丰富的螺旋结构(MR)，与MR螺旋通过亲水和疏水相互作用牵引在一起，阻碍了底物进入活性中心的通道，先前本发明已经将MR螺旋进行了删减，在此基础上再对R-loop(氨基酸序列在373-385)进行删减，将运输通道打开，有利于大分子底物进入对接部位。同时又不影响对接区域，因此本发明简化了该结构。除此之外，本发明还大胆尝试了将198-206号氨基酸进行删减，将结合位置进一步打开，更有利于大分子底物结合，但可能对小分子底物的结合产生不利影响。

与其他多铜氧化酶一样，漆酶CueO的晶体结构的重要特征是四个Cu离子排列在两个位置，分成三类，分别为Cu1(位于His443，Cys500和His505所形成的空间之间)，Cu2和两个Cu3，后三者形成TNC三簇结构。Cu1位于底物结合部位，当底物被氧化后，能够将电子传递给Cu1，Cu1再将电子由单核中心通道向氧分子结合中心传递。Cu2和Cu3位于氧分子结合部位，此部位为TNC三簇结构，氧分子最后接受电子生成水。传统的方法主要是对蛋白酶序列的C端和/或N端进行删除，然而由于漆酶CueO的C端和N端是构成其活性的主要组成氨基酸，故不能采用传统方法。本发明在进行删减时的原则是保留活性中心，以及Cu1、Cu2和Cu3的所处空间不变，防止酶功能缺失。普遍认为，空间上远离活性中心的氨基酸对酶功能的影响不大。具体可参见：Wang,H.,Liu,X.,Zhao,J.et al.Crystal structures of multicopperoxidase CueO G304K mutant:structural basis ofthe increased laccaseactivity.SciRep 8,14252(2018).

R-loop可以与MR螺旋形成疏水口袋，疏水相互作用主要发生在结构域III中MR螺旋的Leu367、Aal375、Met376、结构域II中R环上的Met303、Met305和Ile307，以及螺旋α1的Val207和Phe210和结构域II的相邻环之间。结构域II中R环上的Gly304的主链酰胺与结构域III中MR螺旋的Ala375的主链羰基之间存在氢键。本发明将MR螺旋进行了删减，为了使疏水口袋能够进一步放大，便于底物进入催化位点，本发明将R-loop也进行了适当删减。

本发明的有益技术效果在于：

本发明通过在特定的序列位点进行删除相应序列(缺失片段)，更为具体的为删除了序列中形成MR螺旋和R-loop结构的序列，使得所获得的细菌漆酶的变构体酶活性增强和表达量的有效提高。

附图说明

图1是突变基因表达载体构建琼脂糖凝胶电泳图；

图2是野生型细胞漆酶CueO重组载体的构建；

图3是蛋白质浓度标准曲线图；

图4是漆酶变构体的表达量与野生型漆酶的倍数图；

图5是漆酶变构体的活性与野生型漆酶的倍数图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：

本发明的目的是提供一系列高表达量的CueO漆酶，含有SEQ ID NO.2–9的氨基酸序列。旨在提供一系列漆酶变构体及其表达菌株的制备方法和应用，包括以下步骤：

步骤1、以来源大肠杆菌的漆酶CueO的晶体结构为原型，通过Autodock Vina、Rosetta Fold、PyMOL、Procheck等软件进行辅助设计蛋白质，依据计算机模拟结果和漆酶的催化机制，得到漆酶变构体结构与基因序列。

步骤2、合成漆酶基因：于基因合成公司进行基因合成得到含偏爱密码子优化的漆酶基因的克隆载体质粒pUC-GW-Kan及其宿主菌株；

步骤3、提取漆酶基因模板：对含克隆载体治质粒的宿主菌株进行培养、收集，提取质粒，得到含漆酶基因模板的载体pUC-GW-Kan；

步骤4、构建重组载体：对pUC-GW-Kan和pET28a+质粒用限制性内切酶消化，回收，并用T4连接酶连接构建重组载体；

步骤5、构建重组菌株：将重组载体转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，得到重组菌株；

步骤6、诱导培养：用IPTG和CuSO₄诱导培养重组菌株，并提取蛋白；

步骤7、漆酶浓度的测定：使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定漆酶浓度；

步骤8、漆酶活性的测定：使用ABTS法测定漆酶活性。

进一步，所述步骤3中液体培养基为LB培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)：其组分为胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，使用时称取25g LB肉汤培养基粉末溶解于1L水中。

进一步，所述步骤3中质粒的提取利用的是天根生化科技(北京)有限公司的质粒提取试剂盒，具体的过程按照试剂盒的操作说明。提取好的质粒用超微量紫外分光光度计测量质粒浓度盒纯度，做好标签并放置于-20℃备用。

进一步，所述步骤4中的酶切体系为：

10×NEB缓冲液	5μl
		DNA	≤1μg
内切酶1	1μl
		内切酶2	1μl
灭菌双蒸水	至50μl
		孵育温度	37℃
孵育时间	2h

最后在体系中加入10μl 6×Gel loading buffer用于终止酶切反应；

将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为110V，45分钟。根据凝胶成像结果切胶并回收正确的条带(上海翊圣生物科技有限公司)如图1所示。通过T4连接酶将漆酶基因克隆至pET28a+质粒中；

进一步，所述步骤5中，采用化学转化法将步骤3所述的重组载体转化至宿主菌株BL21(DE3)中，转化产物涂布于LB(含50μg/mL硫酸卡那霉素)平板在37℃过夜培养筛选阳性克隆。挑取单菌落，提取质粒并进行菌落PCR验证；

PCR体系如下：

Template	0.5μl
		Forward Primer(10μM)	1μl
Reverse Primer(10μM)	1μl
		10×EasyTaq Buffer	2.5μl
2.5mM dNTPs	2μl
		EasyTaq DNA Polymerase	0.25μl
Nuclease-free Water	to 25μl

PCR程序如下：

进一步，所述步骤6中，挑取阳性克隆接入LB培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)中，于37℃过夜培养。将过夜培养物接种于80mL LB培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)中，37℃剧烈振荡(200rpm)培养，至菌液的OD600值达到0.6–0.8左右，再向发酵体系中加入一定浓度的IPTG，和CuSO₄，37℃条件下培养。诱导完毕后，8000rpm离心15分钟，弃上清，收集菌体；用Buffer A和PMSF重悬菌体，超声波破碎(超声3s，间歇6s，70％的功率，90个循环)后8000rpm离心15min。收集上清液并用0.45μm滤膜过滤得到的蛋白液即为含有目的蛋白CueO的粗酶液；

所述Buffer A溶液含有20mM磷酸钠，500mM氯化钠，20mM咪唑，pH＝7.3。

进一步，所述步骤7中漆酶蛋白浓度检测：配置不同浓度的牛血清蛋白标准液，取200μL Bradford溶液和20μL标准蛋白液混合均匀加入酶标板中。使用酶标仪测定在OD₅₉₅处的吸光值，以标准蛋白的A₅₉₅平均值为纵坐标，对应的蛋白质浓度为横坐标，建立标准曲线。通过检测漆酶蛋白与Bradford的混合液在OD₅₉₅处的吸光值，测定漆酶蛋白的浓度。

进一步，所述步骤8中的酶活定义为每分钟氧化1μmol ABTS转化为产物所需的酶量为1U。每分钟吸光变化值定义为一个酶活单位以U/L表示计算公式如下：

U＝106×V总×N×ΔA/(V酶×ε×ΔT)

其中V总为总反应体系1mL，ΔA＝A₄₂₀－A₀，V酶为稀释一定比例酶液，ε为ABTS的摩尔吸光系数36,000，N为漆酶稀释倍数，ΔT为反应时间1min。

反应体系如下：

ABTS法：反应体系含有1mmol/L ABTS，50mmol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液和2mmol/LCu²⁺，总体积1mL，55℃反应1min迅速在420nm处测定吸光值。

所述檬酸-磷酸盐缓冲液溶液的配方为：2.4016g柠檬酸溶于250mL 1mol/L磷酸缓冲液，而1L 1mol/L磷酸缓冲液中含有132mL 1mol/L磷酸氢钾溶液和868mL mol/L磷酸二氢钾溶液。

实施例1

以来源大肠杆菌的漆酶CueO的晶体结构为原型，通过分子对接软件AutodockVina删减野生型漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的部分氨基酸，得到变构体1-8共8个漆酶变构体；具体氨基酸序列如SEQ ID NO.2-9所示的序列；其中野生型漆酶的对应DNA序列如SEQ ID NO.10所示的序列，变构体1-8对应的DNA序列如SEQ ID NO.11-18所示的序列。采用RosettaFold对删减后的立体结构进行同源建模，并用PyMOL软件与Procheck软件对该建模结果进行分析与评估。在上述计算机模拟结果的基础上，结合漆酶催化机制的深度解析，具体得到以下8中变构体。如下表1所示，表中数值范围表示该位点缺失，-表示该位点不缺失。

表1、8个变构体的缺失位点

实施例2

野生型细菌漆酶CueO重组载体的构建：

将合成的载体菌取出，接种于LB培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)中，在摇床上37℃过夜培养。收集菌体后按质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，得到含野生型细菌漆酶的载体。利用HindIII单酶切含漆酶基因的载体pUC-GW-Kan和空载体pET28a+，在37℃下酶切2小时，通过产物回收试剂盒将酶切片段回收。再用SacI单酶切回收产物，在37℃下酶切2小时，以DNA凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将目的片段回收。再通过T4连接酶在16℃的环境中过夜连接将漆酶基因插入pET28a+质粒中获得重组载体，如图2所示。

实施例3

细菌漆酶变构体重组载体的构建：

将含变构体基因的载体菌取出，接种于LB培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)中富集培养。按质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，得到含漆酶变构体基因的载体。利用EcoRI和SalI双酶切含漆酶基因的载体pUC-GW-Kan和空载体pET28a+，在37℃下酶切2小时，以DNA凝胶回收试剂盒通过切胶等操作将目的片段回收，再通过T4连接酶在16℃的环境中过夜连接将漆酶基因插入pET28a+质粒中获得重组载体。

实施例4：

基因工程菌的构建：

将重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，转化产物涂布于LB(含50μg/mL硫酸卡那霉素)平板中，37℃培养。随机挑取部分阳性克隆子接种于液体LB(含50μg/mL硫酸卡那霉素)中于37℃，200rpm进行培养。收集菌体并按质粒提取试剂盒提取质粒进行PCR验证。验证引物如下：

Yack-pet28-M①F：AAGGGGTTATGGTAGTTATTG

Yack-pet28-M①R：GGTAGATTGCTGCGTAGTTC

Yack-pet28-M②F：CGATTAGAGACCCCAAGG

Yack-pet28-M②R：AGCGTGTTGCGTGTAAAT

Yack-pet28-cDNA①F：TGACCGAAGAAACCACCCT

Yack-pet28-cDNA①R：AGCCGTTCAGAAGTTGTAAGC

Yack-pet28-cDNA②F：TGGAGTTGAGCGGTCTTT

Yack-pet28-cDNA②R：CCAATACAGGGTGGTTTCTT

在上述的引物中前两对引物(Yack-pet28-M①/②)，其中至少有一端是与质粒上的序列匹配，另一端与细菌漆酶变构体的核算序列匹配，实现检测，两对引物的功能相同。后面两对引物的则仅仅与细菌漆酶异构的核酸匹配，同样用于检测工程菌中是否含有目标基因。

将验证成功的重组菌株保存于25％的甘油管中，放置于-80℃中保存。

实施例5

漆酶的表达及浓度测定

将实施例4所得的重组工程菌接种至LB培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)中，于37℃过夜活化。将过夜培养物接种于80mL LB培养基(含50μg/mL硫酸卡那霉素)中，37℃剧烈振荡(200rpm)培养至菌液的OD600值达到0.6–0.8左右，加入诱导剂IPTG(终浓度0.5mM)，和CuSO₄(终浓度1mM)，37℃条件下培养72小时。诱导完毕后，测量菌液在600nm下的吸光值并将菌液在8000rpm的条件下离心15分钟，弃上清，收集菌体。通过超声破碎、离心、过滤，得到的蛋白液即为含有目的蛋白的粗酶液。用SDS-PAGE对粗酶液进行检测，并用Bradford试剂盒测定其蛋白浓度；具体的标准曲线如图3所示；根据不同诱导时间，得到下表2中不同的蛋白质浓度。

表2蛋白质浓度

实施例6

漆酶的纯化

将实施例5所得的粗酶液按GE Healthcare镍柱蛋白纯化说明书对其进行纯化，收集其流出液。用SDS-PAGE对粗酶液及流出液进行检测，并用Bradford试剂盒测定其蛋白浓度。

实施例7

漆酶活性的测定：

在pH6.4的柠檬酸-磷酸盐缓冲液中，使用1mM ABTS为底物，在55℃下水浴与酶液反应1min，反应后测定420nm的吸光值并计算酶活。一个酶活单位为每分钟氧化1μmol ABTS所需的酶。

结果表明，漆酶变构体在IPTG和CuSO₄共同诱导72小时，200rpm，37℃培养后，活性为野生型漆酶CueO的0.8-1.5倍，表达量为野生型漆酶CueO的0.9–10倍。其中，变构体4的酶活力可达323.8U/L，是原型漆酶CueO活力的1.5倍(参见图5)；表达量可达2706.4mg/mL，是野生型漆酶CueO表达量的10倍(参见图4)；具体数值参见下表3，具体为用相应变构体的表达量和酶活力除以野生型的相应表达量和酶活力获得相应的倍数。

表3、8种变构体的表达量及其酶活力相较与野生型倍数表

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种细菌漆酶变构体，其特征在于：所述细菌漆酶变构体的氨基酸序列为SEQ IDNO.6所示序列。

2.根据权利要求1所述的细菌漆酶变构体，其特征在于：所述的缺失片段为野生型细菌漆酶序列中形成R-loop结构或MR螺旋的氨基酸序列。

3.一种编码如权利要求1或2任一项所述的细菌漆酶变构体的核酸序列，其特征在于：所述的核酸序列为SEQ ID NO.15所示序列。

4.一种工程菌，其特征在于：所述的工程菌中含有权利要求3中所述的核酸序列。

5.一种工程菌，其特征在于：所述的工程菌中含有权利要求1-2任一项所述的细菌漆酶变构体。

6.一种如权利要求1-2任一项所述的细菌漆酶变构体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

步骤1、获取序列：以大肠杆菌来源的漆酶CueO的晶体结构为原型，通过AutodockVina、RosettaFold、PyMOL、Procheck软件进行蛋白质辅助设计，得到细菌漆酶变构体、序列结构与基因序列；

步骤2、合成漆酶基因：根据宿主菌株的密码子偏爱，合成得到含偏爱密码子优化的细菌漆酶变构体的基因的克隆载体质粒pUC-GW-Kan及其宿主菌株；

步骤3、提取漆酶基因模板：对含克隆载体质粒的宿主菌株进行培养、收集，提取质粒，得到含细菌漆酶变构体的基因模板的载体pUC-GW-Kan；

步骤4、构建重组载体：通过酶切连接法将细菌漆酶变构体的基因与pET28a+质粒连接构建重组载体，得到重组载体；

步骤5、构建重组菌株：将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，得到重组菌株；

步骤6、诱导培养：用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG诱导培养重组菌株，并加入硫酸铜进一步培养诱导培养，并提取蛋白；

步骤7、漆酶活性的测定：使用ABTS法测定漆酶活性。

7.根据权利要求6所述的细菌漆酶变构体的制备方法，其特征在于：步骤5所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21 DE3菌株。