CN117209577B

CN117209577B - 一种植物减数分裂相关蛋白GmPRD1及其编码基因和应用

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Publication number: CN117209577B
Application number: CN202311098625.1A
Authority: CN
Inventors: 冯献忠; 杨素欣; 陈笑
Original assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Current assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority date: 2023-08-29
Filing date: 2023-08-29
Publication date: 2024-07-30
Anticipated expiration: 2043-08-29
Also published as: CN117209577A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种植物减数分裂相关蛋白GmPRD1及其编码基因和应用。本发明在大豆中克隆了GmPRD1基因，证明了该基因参与减数分裂过程，影响雌雄配子体的正常发育。由于PRD1基因参与减数分裂过程前期DNA双链的断裂，因此本发明为利用大豆GmPRD1基因创制大豆二倍体配子提供了新方法，也为大豆利用无融合生殖进行杂种优势的固定提供新的基因资源，在大豆新品种培育方面具有重要的应用价值。

Description

一种植物减数分裂相关蛋白GmPRD1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种植物减数分裂相关蛋白GmPRD1及其编码基因和应用。

背景技术

减数分裂是指有性生殖的个体在形成生殖细胞过程中发生的一种特殊分裂方式，是真核生物有性生殖过程中配子形成所必需的过程。该过程主要包括DNA复制、姐妹染色单体黏连、同源染色体配对、联会、重组和分离等一系列重要的生物学事件。其中，同源染色体重组是发生在减数分裂前期I的重要事件，它不仅为物种的遗传变异和进化提供了基础，而且重组过程中产生的交叉结为同源染色体提供了直接的物理连结，保证了同源染色体的正确分离。因此，同源染色体重组是确保真核生物染色体正确分离和产生遗传多样性的关键步骤。

近年来，随着水稻无融合生殖研究取得重大进展，使其在农作物杂种优势育种中的应用提供了可能。二倍配子体无融合生殖(Diploid gametophyte apomixis)是指经过类似有丝分裂的异常减数分裂和没有精卵细胞融合而产生胚或种子的特殊生殖方式，后代基因型与母本保持一致，在杂种优势的固定中具有重要作用。而类似有丝分裂的减数分裂则需要3个过程的改变：①同源染色体不发生遗传重组；②第一次减数分裂后期姐妹染色单体提前分离；③跳过减数第二次分裂。以上3点是成功产生与母本遗传物质完全一致的二倍体配子的重要条件。基于以上3点，在水稻中将三个减数分裂的关键基因REC8、PAIR1(SPO11-1)以及OSD1进行基因编辑成功得到了二倍体配子，该株系称为MiMe。MiMe结合诱导单倍体的MTL基因编辑株系，成功获得了二倍体的克隆种子，该种子的基因型与亲本完全相同。

同源重组是由染色体上形成程序化的DNA双链断裂(Double strand breaks,DSBs)开始的。减数分裂同源重组起始于II型拓扑异构酶SPO11(sporulation 11)切割染色体双链DNA，产生DSB的过程。在酿酒酵母中，除了SPO11之外，减数分裂DSB的形成还需要9种其他蛋白质(Rad50、Mre11、Xrs2、Rec102、Rec104、Rec114、Ski8、Mer2和Mei4)。

若能获得更多参与减数分裂过程，从而影响雌配子体正常发育的基因，将会为利用无融合生殖进行杂种优势的固定提供新的基因资源。

发明内容

本发明提供一种植物减数分裂相关蛋白GmPRD1及其编码基因和应用。GmPRD1基因的突变会影响大豆减数分裂过程从而导致雌雄配子发育异常。由于该基因影响DNA双链的断裂，因此该基因的克隆将为大豆二倍体配子的产生和利用无融合生殖进行杂种优势的固定提供新的基因资源。

本发明通过筛选大豆突变体库获得了一个与减数分裂相关的突变体，经BSA测序分析获得了候选基因，将其命名为GmPRD1，其CDS序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明提供一种蛋白GmPRD1，所述大豆蛋白GmPRD1具有如下任一种氨基酸序列：

(1)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(2)如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

(3)与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90％；更优选为95％；进一步优选为99％。上述如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列为大豆GmPRD1蛋白的氨基酸序列，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到与本发明公开的GmPRD1蛋白具有相同活性的GmPRD1蛋白的突变体蛋白。

本发明还提供一种基因GmPRD1，所述基因GmPRD1用于编码所述蛋白GmPRD1；

所述基因GmPRD1具有如下任一种核苷酸序列：

(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)与SEQ ID NO.1所示的序列互补、同源、或经一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失得到的编码相同功能蛋白的核苷酸序列。上述如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为大豆中GmPRD1蛋白的CDS序列。本发明所述的GmPRD1蛋白的编码基因可以为任意能够编码上述GmPRD1蛋白的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明提供一种抑制因子，所述抑制因子包括能够抑制所述蛋白GmPRD1的编码基因表达的干扰RNA或gRNA。

优选的，所述gRNA包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。所述gRNA用于抑制(失活)大豆GmPRD1蛋白的编码基因表达，该gRNA可与Cas9等基因编辑工具配合作用，实现大豆GmPRD1蛋白的编码基因的敲除或降低表达量。

本发明还提供一种生物材料，包括所述基因GmPRD1或所述抑制因子。

优选的，所述生物材料为重组载体、表达盒、重组菌或宿主细胞中的任一种。

上述GmPRD1基因或其编码蛋白或大豆GmPRD1蛋白的抑制因子的应用可以GmPRD1基因或其编码蛋白或大豆GmPRD1基因的编码蛋白的抑制因子本身的形式应用，或者以含有GmPRD1基因的编码蛋白或其抑制因子的表达盒、载体、含有所述表达盒或所述载体的宿主细胞的形式应用。

根据本发明所述蛋白GmPRD1、所述基因GmPRD1、所述抑制因子、或所述生物材料在以下任一项中的应用：

1)调控植物减数分裂中的应用；

2)调控植物雌配子和/或雄配子发育中的应用；

3)在植物中产生二倍体配子；

4)植物无融合生殖中的应用；

5)调控植物花粉发育中的应用；

6)植物育种中的应用。

其中，2)和5)中的调控为负调控。

本发明还提供一种调控植物减数分裂过程中DSB形成的方法，包括：调控植物中所述GmPRD1蛋白的编码基因的表达量。由于发生同源重组的前提是DSB的形成，因此，可以通过基因编辑PRD1基因来破坏同源染色体重组过程用于无融合生殖。由此可见，本发明克隆的GmPRD1基因在大豆无融合生殖(杂种优势固定)中具有重要的应用价值。

根据所述调控植物减数分裂过程中DSB形成的方法，通过降低或沉默植物中所述GmPRD1蛋白的编码基因的表达量，影响所述植物的减数分裂过程。

根据所述调控植物减数分裂过程中DSB形成的方法，上述降低植物中GmPRD1蛋白的编码基因的表达量可通过本领域常规技术手段实现，例如：利用CRISPR/Cas9技术敲除植物中GmPRD1蛋白的编码基因。

利用CRISPR/Cas9技术，以如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为gRNA敲除植物中GmPRD1蛋白的编码基因。利用该方法能够显著提高植物中GmPRD1蛋白的编码基因的敲除效率。

本发明提供一种植物无融合生殖育种方法，包括利用所述调控植物减数分裂过程中DSB形成的方法。

根据所述应用、或所述方法，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

优选的，所述植物包括大豆、拟南芥、小麦、水稻、玉米、棉花和花生中的任一种。

本发明的有益效果：

本发明首次在大豆中克隆了参与大豆减数分裂过程的GmPRD1基因。通过降低GmPRD1基因的表达量，能够影响植物正常的减数分裂过程。GmPRD1基因的克隆为大豆无融合生殖育种提供了新的基因资源，在利用大豆无融合生殖育种中具有重大的应用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍。

图1为本发明实施例1中野生型Williams 82与Gmprd1突变体植株表型观察。图中A为野生型Williams 82和大豆Gmprd1突变体植株表型图；图中B为野生型Williams 82花粉碘化钾染色图；图中C为大豆Gmprd1突变体花粉碘化钾染色图；图中D为野生型Williams82花粉扫描电镜图；图中E为大豆Gmprd1突变体花粉扫描电镜图。

图2为本发明实施例2中GmPRD1基因在大豆染色体上的定位。图中A为大豆Gmprd1突变体群体BSA测序；图中B为Glyma.11G253600基因的基因组序列结构示意图。红色的竖线表示基因突变的位点。

图3为本发明实施例3中野生型Williams 82与Gmprd1突变体的染色体行为观察。

图4为本发明实施例3中野生型Williams 82与Gmprd1突变体的胚囊观察。

图5为本发明实施例4中利用CRISPR/Cas9敲除GmPRD1基因后植株表型观察；

图中A为野生型Williams 82与GmPRD1-crispr#1,GmPRD1-crispr#2植株表型图；图中B为野生型Williams 82花粉碘化钾染色图；图中C为GmPRD1-crispr#1花粉碘化钾染色图；图中D为GmPRD1-crispr#1,GmPRD1-crispr#2植株的基因型。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1GmPRD1基因突变体的获得

以Williams 82品种为背景，通过EMS诱变构建大豆突变体库。通过筛选大豆突变体库，筛选到1个与减数分裂相关的突变体，并将其命名为Gmprd1。大豆Gmprd1突变体在营养生长阶段生长正常，和野生型Williams 82没有任何差别。在种子发育阶段，突变体表现为不结实，所结豆荚为小肉荚。对花粉进行I₂-KI染色分析，结果显示：与野生型Williams82相比，大豆Gmprd1突变体的花粉呈现完全败育的表型。对花粉进行扫描电镜观察，发现与野生型Williams 82相比，大豆Gmprd1突变体的花粉粒呈现干瘪皱缩的形态(图1)。以上观察结果表明大豆Gmprd1突变体的花粉发育是异常的。

实施例2大豆突变体Gmprd1的基因定位

本发明采用一种基于M2群体的候选因果突变位点基因定位的方法对大豆Gmprd1突变体进行基因定位。采取同等数量的M2代Gmprd1突变株和野生植株Williams 82的叶片，分别提取其全基因组DNA，并将提取的DNA等量混合，混合成突变基因池及野生基因池。将混合成的突变基因池与野生基因池分别进行全基因组重测序。经BSA重测序后，一共检测到51502个SNPs和indels。通过与之前测序的数据比较，最终保留5458个该M2群体特异性的标记用于突变位点定位。基于M2-seq的方法，在全基因组绘制delta SNP index绝对值的拟合曲线，最终将候选区域定位在11号染色体32～35Mb的区域。在该区域筛选发现有一个基因Glyma.11G253600即GmPRD1基因(CDS序列如SEQ ID NO.1所示，编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO,2所示)的第四个外显子区域内存在单碱基A到T的突变，该碱基突变导致氨基酸编码提前终止(图2)。因此，推断Gmprd1突变体是由Glyma.11G253600基因突变所导致的。

实施例3Gmprd1突变体的细胞学表型分析

为了验证大豆GmPRD1基因是否参与减数分裂过程，从而影响雌雄配子体的正常发育，本发明对野生型Williams 82和Gmprd1突变体的减数分裂时期染色体和胚囊发育进行了观察。首先研究了野生型和Gmprd1突变体的减数分裂时期的染色体行为。

一、减数分裂时期染色体行为观察

1.分别取长度为1～2.5mm处于不同发育时期的野生型Williams82和Gmprd1突变体的花蕾，将其置于卡诺氏固定液中室温固定24h或过夜。将固定后的花蕾用清水冲洗干净后置于70％乙醇中，可于4℃长期保存。

2.将固定后的样品用ddH₂O漂洗3次，彻底洗去固定液或乙醇。随后用10mM柠檬酸缓冲液(pH4.5)冲洗花蕾。

3.配制3％果胶酶(w/v)和2％纤维素酶(w/v)混合酶解液，室温下酶解花蕾30～60min。将酶解后的花蕾用ddH₂O漂洗3次洗去酶解液。

4.在载玻片上滴加10μL 60％醋酸，用解剖针和镊子剥离已酶解花蕾中的花药，并将花药置于60％的醋酸中。

5.盖上盖玻片，将载玻片翻转后置于干净滤纸上按压载玻片，使花粉粒释放出来。

6.将按压后的载玻片放入液氮中，速冻后揭片，滴加10μL 60％乙酸，30s后再加入50μL-20℃预冷的卡诺氏固定液使染色体固定。

7.自然风干玻片，然后滴加6-8μL DAPI染液，盖上盖玻片，黑暗中染色5min。

8.在激光共聚焦显微镜下观察染色后的材料。

结果如图3所示。根据减数分裂时期染色体的形态，减数分裂前期I可分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终变期5个时期。在野生型中，染色体在细线期呈现细的线状结构。在偶线期，发生了同源染色体配对。在粗线期染色体缩短变粗，呈现粗线状。在双线期，发生交叉的染色单体开始分离。在终变期，染色体进一步浓缩，可以清楚地观察到20个二价体。在进入中期I时，20个二价体在赤道板上排列。在后期I，每条染色体从它的同源物中分离出来，并迁移到相反的两极。然而，在Gmprd1突变体中，在前期I的早期很少观察到同源染色体配对和联会，在终变期时Gmprd1突变体染色体行为与野生型显著不同。与野生型相比，在Gmprd1突变体中，明显观察到40个单价体分布在细胞核内。在野生型中，同源染色体移动到两极，每个极点在末期I有一组单倍体染色体。然后，两个单独的子细胞进行另一轮染色体分离，在末期II共产生四个子细胞。而在Gmprd1突变体中，除了在末期I观察到两个分离的染色体团外，还同时观察到零散分布在细胞核内的不同染色质团。在末期II，并没有形成等价的四个子细胞。

二、胚囊观察

1.在体视显微镜下解剖花蕾，将胚囊剥离出来置于卡诺固定液固定24h或过夜，将固定后的样品用ddH₂O冲洗干净后置于70％乙醇中。

2.配置50％，30％，15％的乙醇和纯水进行梯度复水。

3.配置1％曙红(eosin-Y)染色8h，然后用纯水冲洗至无色。

4.用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(0.1mol/l,pH 5.0)处理8h，随后用Hoecheststaining于25℃，黑暗条件下染色24h。

5.用蒸馏水冲洗三次，配置不同浓度的乙醇进行梯度脱水(15％,30％,50％,70％,85％,95％,and 100％)。

6.用乙醇：水杨酸甲酯(1：1)处理1h，随后用水杨酸甲酯处理三次，每次分别2h，2h，15h，于水杨酸甲酯中保存。

7.将样品吸出放在凹槽载玻片上，用激光共聚焦显微镜观察样品。

结果如图4所示。大孢子母细胞经过减数分裂形成四个单倍体大孢子，位于珠孔端的三个大孢子降解，而近合点端的一个大孢子发育成功能大孢子，功能大孢子进行连续的三次有丝分裂，最终形成八核胚囊。在野生型中，可以清晰的看见大孢子母细胞经过减数分裂和三次有丝分裂后形成了八核胚囊，而在Gmprd1突变体中并没有观察到。该结果表明，Gmprd1基因的突变导致植株雌配子体发育异常。

实施例4GmPRD1基因的敲除

构建GmU6启动子驱动gRNA(序列如SEQ ID NO.3所示)和GmUbi3启动子驱动Cas9蛋白的CRISPR/cas9重组质粒，并通过农杆菌介导的大豆子叶节浸染法进行大豆遗传转化。经大豆遗传转化后，最终获得48株T0代转基因植株。经bar试纸条鉴定阳性转基因植株，共获得阳性转基因植株11株，其中有2株阳性转基因植株在打靶位点处发生编辑。GmPRD1-crispr#1为T0代获得的嵌合突变体，在打靶位点发生缺失和替换；GmPRD1-crispr#2为T1代获得的纯合突变体，在打靶位点处插入1个碱基。对编辑植株进行表型观察，发现GmPRD1基因敲除后与Gmprd1突变体表型一致(图5)。该遗传转化实验结果进一步说明Gmprd1突变体的表型是由Glyma.11G253600基因突变所导致的，GmPRD1基因在调控大豆减数分裂过程方面具有重要作用。GmPRD1的发现也为大豆无融合生殖育种提供了宝贵的基因资源。

本发明在大豆中克隆了GmPRD1基因，证明了该基因参与减数分裂过程，影响雌雄配子体的正常发育。由于PRD1基因参与减数分裂过程前期DNA双链的断裂，因此本发明为利用大豆GmPRD1基因创制大豆二倍体配子提供了新方法，也为大豆利用无融合生殖进行杂种优势的固定提供新的基因资源，在大豆新品种培育方面具有重要的应用价值。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.蛋白GmPRD1、基因GmPRD1、抑制因子、或生物材料在以下任一项中的应用：

1）大豆减数分裂异常；

2）大豆雌配子和/或雄配子发育异常；

3）在大豆中产生二倍体配子；

4）大豆无融合生殖；

5）大豆花粉发育异常;

所述蛋白GmPRD1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述基因GmPRD1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述抑制因子为能够抑制所述蛋白GmPRD1的编码基因表达的干扰RNA或gRNA；

所述生物材料为包括所述抑制因子的重组载体、表达盒或重组菌中的任一种；

所述蛋白GmPRD1或基因GmPRD1的应用为抑制 SEQ ID NO.2 所示蛋白或 SEQ ID NO.1所示基因的表达。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种大豆无融合生殖育种方法，其特征在于，通过降低或沉默植物中所述GmPRD1蛋白的编码基因的表达量，影响所述植物的减数分裂过程；

所述蛋白GmPRD1的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述大豆无融合生殖育种方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术敲除植物中GmPRD1蛋白的编码基因。

5.根据权利要求3或4所述大豆无融合生殖育种方法，其特征在于，利用CRISPR/Cas9技术，以如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为gRNA敲除植物中GmPRD1蛋白的编码基因。