CN117202895A - 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 - Google Patents

脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN117202895A
CN117202895A CN202280024207.5A CN202280024207A CN117202895A CN 117202895 A CN117202895 A CN 117202895A CN 202280024207 A CN202280024207 A CN 202280024207A CN 117202895 A CN117202895 A CN 117202895A
Authority
CN
China
Prior art keywords
nanoparticle composition
total lipids
lipids present
sphingomyelin
lipid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280024207.5A
Other languages
English (en)
Inventor
凌丹丹
潘晓彬
张志一
英博
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Aibo Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Suzhou Aibo Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Aibo Biotechnology Co ltd filed Critical Suzhou Aibo Biotechnology Co ltd
Publication of CN117202895A publication Critical patent/CN117202895A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/24—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing atoms other than carbon, hydrogen, oxygen, halogen, nitrogen or sulfur, e.g. cyclomethicone or phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本文提供含鞘磷脂组合物和相关纳米颗粒组合物、脂质纳米颗粒，包括脂筏纳米颗粒。本文还提供所述纳米颗粒组合物用于递送核酸分子以实现增强的核酸表达的相关方法和用途。

Description

脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
本申请要求2021年10月8日提交的PCT/CN2021/122690和2022年9月9日提交的PCT专利申请PCT/CN2022/117968的优先权权益，其内容以引用的方式整体并入本文中。
1.技术领域
本公开总体上涉及脂质化合物，其可与其它脂质组分，诸如中性脂质、胆固醇和聚合物结合的脂质组合使用，以形成脂质纳米颗粒用于在活体外和活体内递送治疗剂(例如核酸分子，包括核酸模拟物，诸如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉核酸(morpholino))以实现治疗或预防目的，包括疫苗接种。
2.背景技术
治疗性核酸具有彻底改变疫苗接种、基因疗法、蛋白质替代疗法和其它遗传性疾病治疗方法的潜力。从2000年代开始对治疗性核酸进行首次临床研究以来，核酸分子和其递送方法的设计已取得重大进展。然而，核酸治疗剂仍面临若干挑战，包括低细胞渗透性和对包括RNA在内的某些核酸分子降解的高敏感性。因此，需要开发新方法和组合物来促进核酸分子的活体外或活体内递送，从而实现治疗和/或预防目的。
3.发明内容
本文提供脂质化合物，包括其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其可单独使用或与其它脂质组分，诸如中性脂质、带电脂质、类固醇(包括例如所有固醇)和/或其类似物和/或聚合物结合的脂质和/或聚合物组合使用，以形成脂质纳米颗粒来递送治疗剂(例如核酸分子，包括核酸模拟物，诸如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉核酸)。在一些情况下，使用脂质纳米颗粒递送核酸，诸如反义和/或信使RNA。
本文提供含鞘磷脂组合物和相关方法、纳米颗粒组合物和脂质纳米颗粒。在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物经配制成包含多个脂质纳米颗粒的纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒包含如本文所述的脂筏纳米颗粒(LRNP)。
在一个方面，本文提供纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含多个脂质纳米颗粒，其中脂质纳米颗粒包含：(a)占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％的鞘磷脂；(b)阳离子脂质；(c)类固醇；(d)聚合物结合的脂质；以及(e)核酸。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至40mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至30mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至25mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％。
在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约30-55mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约35mol％至50mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％至50mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约50mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％，并且其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％，并且其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％，并且其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％，并且其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％，并且其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％。
在一些实施方案中，类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约35mol％至45mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约33.5mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10-20mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40-50mol％，并且其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；并且其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％；并且其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％至48.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约50mol％，并且其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；并且其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％，并且其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％，并且其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约33.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％，并且其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约48.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％，并且其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％，并且其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％。
在一些实施方案中，聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％，其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％，并且其中聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％；其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约50mol％；其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％；并且其中聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％；其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％；并且其中聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％；其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％；其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约48.5mol％；并且其中聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％；其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％；并且其中聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％；其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％；其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％；并且其中聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％；其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约33.5mol％；并且其中聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％；其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％；其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％；并且其中聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约5mol％；其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约48.5mol％；并且其中聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约5mol％；其中阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；其中类固醇占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％；并且其中聚合物结合的脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％；并且其中纳米颗粒组合物还包含占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约5mol％的第二磷脂；任选地，其中第二磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
在一些实施方案中，鞘磷脂为鞘磷脂化合物。在一些实施方案中，鞘磷脂选自表X中的SM-01、SM-02、SM-03、SM-04、SM-05、SM-06和SM-07。
在一些实施方案中，类固醇为胆固醇或胆固醇衍生物。
在一些实施方案中，阳离子脂质是根据选自01-I、01-II、02-I、02-II、03-I、03-II-A、03-II-B、03-II-C、03-II-D、04-I、04-III、04-IV、05-I、06-I和其子式的任一式的化合物。在一些实施方案中，阳离子脂质是选自表1至表5中的任一者中列出的化合物的化合物。
在一些实施方案中，聚合物结合的脂质为DMG-PEG2000或DMPE-PEG2000。
在一些实施方案中，核酸编码RNA或蛋白质；并且其中在哺乳动物细胞或哺乳动物的组织中从核酸表达的RNA或蛋白质的量大于从配制于参考纳米颗粒组合物中的核酸表达的RNA或蛋白质的量，所述参考纳米颗粒组合物不包含占存在于参考纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至40mol％的鞘磷脂。
在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物含有1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)而不是鞘磷脂。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的摩尔百分率与DSPC占存在于参考纳米颗粒组合物中的总脂质的摩尔百分率相同。在一些实施方案中，在纳米颗粒组合物与参考纳米颗粒组合物之间，其余内含物相同。
在一些实施方案中，与从配制于参考纳米颗粒组合物中的核酸表达的RNA或蛋白质的量相比，在哺乳动物细胞或哺乳动物的组织中从核酸表达的RNA或蛋白质的量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，核酸为mRNA。
在一些实施方案中，多个脂质纳米颗粒中的至少约50％的脂质纳米颗粒具有半层状(semi-lamellar)形态。在一些实施方案中，多个脂质纳米颗粒中的至少约55％的脂质纳米颗粒具有半层状形态。
在一些实施方案中，多个脂质纳米颗粒的平均大小为约40nm至约150nm。在一些实施方案中，其中多个脂质纳米颗粒的平均大小为约50nm至约100nm。在一些实施方案中，其中多个颗粒的平均大小为约95nm。
在一些实施方案中，所述核酸的包封效率为至少约50％。在一些实施方案中，所述核酸的包封效率为至少约80％。在一些实施方案中，所述核酸的包封效率为至少约90％。
在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的多分散性指数(PDI)为约0至约0.25。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒的PDI小于0.1。在一些实施方案中，其中所述组合物的PDI小于0.05。
在本文所提供的纳米颗粒组合物的一些实施方案中，纳米颗粒组合物为如本文所述的含鞘磷脂组合物。
在一相关方面，本文提供一种在细胞中表达核酸的方法，并且所述方法包括(a)将核酸配制于本文所述的任何纳米颗粒组合物中，以及(b)在合适条件下将纳米颗粒组合物递送至细胞，并且其中核酸由细胞表达。
在一些实施方案中，核酸编码RNA、肽或多肽。在一相关方面，核酸为DNA。在一相关方面，核酸为mRNA。在一些实施方案中，细胞为哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞经分离并且通过使纳米颗粒组合物与细胞接触来执行递送。在其它实施方案中，细胞处于受试者中的其原生环境中，并且通过向受试者施用有效量的纳米颗粒组合物来执行递送。在一些实施方案中，受试者为人类。在一些实施方案中，受试者为非人类哺乳动物。
在一些实施方案中，本文所提供的方法是一种在哺乳动物细胞或哺乳动物的组织中表达mRNA的方法，所述方法包括(a)将mRNA配制于纳米颗粒组合物中的多个脂质纳米颗粒内，所述纳米颗粒组合物包含摩尔比为约5-40％的鞘磷脂、约30％至55％的阳离子脂质；约20％至50％的类固醇；以及约0.5％至3％的聚合物结合的脂质；(b)将纳米颗粒组合物递送至哺乳动物细胞或哺乳动物；并且其中所递送的mRNA在哺乳动物细胞中或在哺乳动物中表达。
在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约10-40％的鞘磷脂、约35％至50％的阳离子脂质；约30％至50％的类固醇；以及约0.5-2％的聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约10-30％的鞘磷脂、约35％至45％的阳离子脂质；约35％至45％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约10％的鞘磷脂、约50％的阳离子脂质；约38.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约10％的鞘磷脂、约45％的阳离子脂质；约43.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约10％的鞘磷脂、约40％的阳离子脂质；约48.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约15％的鞘磷脂、约45％的阳离子脂质；约38.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约15％的鞘磷脂、约40％的阳离子脂质；约43.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约20％的鞘磷脂、约45％的阳离子脂质；约33.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约20％的鞘磷脂、约40％的阳离子脂质；约38.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约5％的鞘磷脂、约45％的阳离子脂质；约48.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，所述方法中使用的纳米颗粒组合物包含摩尔比为约5％的鞘磷脂、约45％的阳离子脂质；约43.5％的类固醇；约1.5％的聚合物结合的脂质，以及约5％的不是鞘磷脂的第二磷脂脂质；其中任选地，第二磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
在本发明方法的一些实施方案中，鞘磷脂为鞘磷脂化合物。在本发明方法的一些实施方案中，鞘磷脂选自表X中的SM-01、SM-02、SM-03、SM-04、SM-05、SM-06和SM-07。在本发明方法的一些实施方案中，类固醇为胆固醇或胆固醇衍生物。在本发明方法的一些实施方案中，阳离子脂质是根据选自01-I、01-II、02-I、02-II、03-I、03-II-A、03-II-B、03-II-C、03-II-D、04-I、04-III、04-IV、05-I、06-I和其子式的任一式的化合物，或者其中阳离子脂质是选自表1至表5中的任一者中列出的化合物的化合物。在本发明方法的一些实施方案中，聚合物结合的脂质为DMG-PEG2000或DMPE-PEG2000。
在本文所提供的方法的一些实施方案中，纳米颗粒组合物为如本文所述的含鞘磷脂组合物。
在本文所提供的方法的一些实施方案中，纳米颗粒组合物为如本文所述的纳米颗粒组合物。
在另一相关方面，本文提供一种脂筏纳米颗粒(LRNP)，其包含(a)鞘磷脂；以及(b)类固醇；以及至少一种不是鞘磷脂或类固醇的第一脂质组分，其中LRNP具有异质结构，所述异质结构包含至少一个包含鞘磷脂和类固醇的液体有序(Lo)域和至少一个包含第一脂质组分的液体无序(Ld)区。
在一些实施方案中，如与Ld区相比，Lo域包含较高鞘磷脂浓度。在一些实施方案中，如与Ld区相比，Lo域包含较高类固醇浓度。
在一些实施方案中，在电子显微术下，Ld区为电子致密的。在一些实施方案中，在电子显微术下，Lo域不是电子致密的。在一些实施方案中，在电子显微术下，Lo域呈现单层或多层结构。在一些实施方案中，在电子显微术下，LRNP呈现半层状形态。
在一些实施方案中，如与参考颗粒相比，LRNP由细胞以较高水平吸收；任选地，其中LRNP由细胞内吞。
在一些实施方案中，LRNP还包含核酸。在一些实施方案中，核酸编码RNA或蛋白质。
在一些实施方案中，在哺乳动物细胞或哺乳动物的组织中从核酸表达的RNA或蛋白质的量大于从配制于核酸-脂质参考颗粒中的核酸表达的RNA或蛋白质的量，所述核酸-脂质参考颗粒具有与LRNP相同的脂质组成，除了鞘磷脂由相等摩尔百分率的第二磷脂置换。在一些实施方案中，第二磷脂为DSPC。
在一些实施方案中，LRNP处于本文所述的纳米颗粒组合物中。在一些实施方案中，LRNP构成纳米颗粒组合物中的所有脂质纳米颗粒的约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，LRNP构成纳米颗粒组合物中的脂质纳米颗粒的至少50％。在一些实施方案中，LRNP构成纳米颗粒组合物中的脂质纳米颗粒的至少55％。
在一些实施方案中，本文所述的LRNP具有与本文所述的任何含鞘磷脂组合物相同的内含物、组成、摩尔比或百分率。在一些实施方案中，本文所述的LRNP具有与本文所述的任何纳米颗粒组合物相同的内含物、组成、摩尔比或百分率。
例如，在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于LRNP中的总脂质的约5-40mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于颗粒中的总脂质的约20mol％至50mol％。在LRNP的一些实施方案中，第一脂质组分包含(c)阳离子脂质；以及(d)聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于颗粒中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，聚合物结合的脂质占存在于颗粒中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
在另一相关方面，本文提供一种纳米颗粒组合物，其包含(a)占存在于组合物中的总脂质的约5-40mol％的鞘磷脂；以及(b)类固醇；以及至少一种不是鞘磷脂或类固醇的第一脂质组分；其中组合物中的至少约50％的脂质纳米颗粒在电子显微术下具有半层状形态。在一些实施方案中，第一脂质组分包含(c)阳离子脂质；以及(d)聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，类固醇占存在于颗粒中的总脂质的约20mol％至50mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于颗粒中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，聚合物结合的脂质占存在于颗粒中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物还包含(e)核酸。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物为如本文所述的含鞘磷脂组合物。
在另一相关方面，本文提供一种纳米颗粒组合物，其包含(a)鞘磷脂，(b)阳离子脂质，(c)类固醇；(d)聚合物结合的脂质；以及(e)核酸，其中阳离子脂质是选自表Y中的化合物的化合物。在一些实施方案中，类固醇为胆固醇。在一些实施方案中，聚合物结合的脂质为DMG-PEG。在一些实施方案中，鞘磷脂为鞘磷脂化合物。在一些实施方案中，鞘磷脂化合物选自表X中的化合物。在一些实施方案中，核酸分子编码RNA、肽或蛋白质。在一些实施方案中，核酸分子为DNA。在一些实施方案中，核酸分子为mRNA。
4.附图说明
图1A是含有平衡存在的富含磷脂的液晶相域和富含鞘脂的液体有序相域(筏)的生物膜的示意图。
图1B说明通过生物膜中胆固醇与鞘磷脂之间的氢键结产生的可能相互作用。
图1C说明DSCP与鞘磷脂之间的结构相似性和差异。具体来说，DSCP缺乏鞘磷脂的与胆固醇形成氢键的酰胺基团。
图2A是对比左侧含有由鞘磷脂和其它脂质(例如胆固醇)形成的微域(筏)的脂筏纳米颗粒(LRNP)的异质外观与右侧缺乏筏的先前所述的LNP的同质外观的示意图。
图2B显示在低温电子显微术(Cryo-EM)下脂筏纳米颗粒(LRNP)的半层状形态。箭头A指向LRNP中的层状结构，并且箭头B指向LRNP的非层状结构。比例尺200nm。
图2C显示在低温电子显微术(Cryo-EM)下脂质纳米颗粒的电子致密形态。比例尺200nm。
图3A显示用含有编码绿色荧光蛋白(GFP)的mRNA的不同LNP制剂处理的Hela细胞中的GFP表达水平(相对光单位；RLU)。包括未处理的细胞作为阴性对照。
图3B显示用含有编码绿色荧光蛋白(GFP)的mRNA的不同LNP制剂处理的Hela细胞中的GFP表达水平(相对光单位；RLU)。包括未处理的细胞作为阴性对照。
图3C显示用分别含有不同阳离子脂质C1和Lipid 5的LNP制剂处理的Hela细胞中的绿色荧光蛋白(GFP)表达水平(相对光单位；RLU)。包括未处理的细胞作为阴性对照。
图4显示注射有含有hEPO mRNA的不同LNP制剂的雌性ICR小鼠中的hEPO表达水平(μg/ml)。
图5显示来自表5B的三种不同LNP制剂在低温电子显微术(Cryo-EM)下的微观形态。比例尺200nm。
图6显示注射有表6.6中的不同LNP的雌性ICR小鼠中的EPO表达水平(μg/ml)，所述LNP含有不同比率的鞘磷脂。
图7显示注射有表6.7中的不同LNP的雌性ICR小鼠中的EPO表达水平(μg/ml)，所述LNP含有不同链长的鞘磷脂。
图8显示用表6.8.1中的含有C2或C3的LNP制剂处理的Hela细胞中的绿色荧光蛋白(GFP)表达水平(相对光单位；RLU)。包括未处理的细胞作为阴性对照。
图9显示注射有表6.8.2中的LNP的雌性ICR小鼠中的EPO表达水平(μg/ml)以研究不同阳离子脂质的效应。
图10显示表6.9中的含有编码荧光素酶的mRNA的不同LNP在雌性ICR小鼠中的组织生物分布，如通过离体组织成像所测量，以每个组织的总通量(p/s)表示。
5.具体实施方式
5.1一般技术
本文所描述或引用的技术和程序包括本领域技术人员一般充分理解和/或使用常规方法通常采用的技术和程序，例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第3版，2001)；Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel等人编，2003)中所描述的广泛使用的方法。
5.2术语
除非另有描述，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与一般技术者通常所理解相同的含义。出于解释本说明书的目的，将应用以下术语描述，并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，反之亦然。所有专利、申请、公布的申请和其它出版物均以引用的方式整体并入。如果对所陈述的术语的任何描述与以引用的方式并入本文中的任何文件相冲突，则应以下文对所陈述的术语的描述为准。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“脂质”是指一组有机化合物，其包括但不限于脂肪酸酯，并且一般以难溶于水但可溶于许多非极性有机溶剂中为特征。尽管脂质一般具有弱水溶性，但是某些类别的脂质(例如经极性基团改性的脂质，例如DMG-PEG2000)具有有限的水溶性并且在某些条件下可溶于水。已知的脂质类型包括生物分子，诸如脂肪酸、蜡、固醇、脂溶性维生素、单酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯和磷脂。脂质至少可分为三类：(1)“简单脂质”，包括脂肪和油，以及蜡；(2)“复合脂质”，包括磷脂和糖脂(例如DMPE-PEG2000)；以及(3)“衍生脂质”，诸如类固醇。此外，如本文所用，脂质还包括类脂质化合物。术语“类脂质化合物”又简称为“类脂质”，是指脂质样化合物(例如具有脂质样物理性质的两亲性化合物)。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是指具有至少一个纳米(nm)级尺寸(例如1至1,000nm)的颗粒，其含有一种或多种类型的脂质分子。本文所提供的LNP可进一步含有至少一种非脂质有效负载分子(例如一种或多种核酸分子)。在一些实施方案中，LNP包含部分或完全包封于脂质壳内的非脂质有效负载分子。特定来说，在一些实施方案中，其中有效负载是带负电荷的分子(例如编码病毒蛋白的mRNA)，并且LNP的脂质组分包含至少一种阳离子脂质。不受理论束缚，预期阳离子脂质可与带负电荷的有效负载分子相互作用，并且在LNP形成期间促进有效负载并入和/或包封至LNP中。可形成如本文所提供的LNP的一部分的其它脂质包括但不限于中性脂质和带电脂质，诸如类固醇、聚合物结合的脂质和各种两性离子性脂质。在某些实施方案中，根据本公开的LNP包含如本文所述的鞘磷脂。
术语“阳离子脂质”是指在其环境的任何pH值或氢离子活性下带正电荷，或能够响应于其环境(例如其预定用途的环境)的pH值或氢离子活性而带正电荷的脂质。因此，术语“阳离子”涵盖“永久性阳离子”和“可阳离子化”。在某些实施方案中，阳离子脂质中的正电荷由季氮原子的存在引起。在某些实施方案中，阳离子脂质包含两性离子性脂质，所述两性离子性脂质在其预定用途的环境中(例如在生理pH值下)带正电荷。在某些实施方案中，阳离子脂质是如本文所述的式01-I、01-II、02-I、02-II、03-I、03-II-A、03-II-B、03-II-C、03-II-D、04-I、04-III、04-IV、05-I和06-I(和其子式)的一种或多种脂质。
术语“聚合物结合的脂质”是指既包含脂质部分又包含聚合物部分的分子。聚合物结合的脂质的实例是聚乙二醇化脂质(PEG-脂质)，其中聚合物部分包含聚乙二醇。
术语“中性脂质”涵盖在所选pH值下或在所选pH值范围内以不带电形式或以中性两性离子形式存在的任何脂质分子。在一些实施方案中，所选的有用pH值或范围对应于预定脂质用途的环境中的pH条件，诸如生理pH值。作为非限制性实例，可与本公开结合使用的中性脂质包括但不限于磷脂酰胆碱，诸如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)；磷脂酰乙醇胺，诸如1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、2-((2,3-双(油酰氧基)丙基)二甲基铵基)磷酸氢乙酯(DOCP)；鞘磷脂(SM)；神经酰胺；类固醇，诸如固醇和其衍生物。本文所提供的中性脂质可为合成的或者衍生自天然来源或化合物(从其分离或改性)。
术语“带电脂质”涵盖在所选pH值下或在所选pH值范围内以带正电荷或带负电荷形式存在的任何脂质分子。在一些实施方案中，所选pH值或范围对应于预定脂质用途的环境中的pH条件，诸如生理pH值。作为非限制性实例，可与本公开结合使用的带电脂质包括但不限于磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇、固醇半琥珀酸酯、二烷基三甲基铵-丙烷(例如DOTAP、DOTMA)、二烷基二甲基氨基丙烷、乙基磷酸胆碱、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基固醇(例如DC-Chol)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸钠盐(DOPS-Na)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1’-外消旋-甘油)钠盐(DOPG-Na)和1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸钠盐(DOPA-Na)。本文所提供的带电脂质可为合成的或者衍生自天然来源或化合物(从其分离或改性)。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“烷基”是指仅由碳和氢原子组成的饱和直链或支链烃链基团。在一个实施方案中，烷基具有例如1至24个碳原子(C1-C24烷基)、4至20个碳原子(C4-C20烷基)、6至16个碳原子(C6-C16烷基)、6至9个碳原子(C6-C9烷基)、1至15个碳原子(C1-C15烷基)、1至12个碳原子(C1-C12烷基)、1至8个碳原子(C1-C8烷基)或1至6个碳原子(C1-C6烷基)并且通过单键连接至分子其余部分。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基等。除非另有说明，否则烷基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“烯基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其含有一个或多个碳-碳双键。如一般技术者所理解，术语“烯基”还涵盖具有“顺式”和“反式”构型或替代地，“E”和“Z”构型的基团。在一个实施方案中，烯基具有例如2至24个碳原子(C2-C24烯基)、4至20个碳原子(C4-C20烯基)、6至16个碳原子(C6-C16烯基)、6至9个碳原子(C6-C9烯基)、2至15个碳原子(C2-C15烯基)、2至12个碳原子(C2-C12烯基)、2至8个碳原子(C2-C8烯基)或2至6个碳原子(C2-C6烯基)并且通过单键连接至分子其余部分。烯基的实例包括但不限于乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基等。除非另有说明，否则烯基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“炔基”是指仅由碳和氢原子组成的直链或支链烃链基团，其含有一个或多个碳-碳三键。在一个实施方案中，炔基具有例如2至24个碳原子(C2-C24炔基)、4至20个碳原子(C4-C20炔基)、6至16个碳原子(C6-C16炔基)、6至9个碳原子(C6-C9炔基)、2至15个碳原子(C2-C15炔基)、2至12个碳原子(C2-C12炔基)、2至8个碳原子(C2-C8炔基)或2至6个碳原子(C2-C6炔基)并且通过单键连接至分子其余部分。炔基的实例包括但不限于乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基等。除非另有说明，否则炔基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚烷基”或“亚烷基链”是指将分子其余部分连接至基团的直链或支链多价(例如二价或三价)烃链，其仅由碳和氢组成并且为饱和的。在一个实施方案中，亚烷基具有例如1至24个碳原子(C1-C24亚烷基)、1至15个碳原子(C1-C15亚烷基)、1至12个碳原子(C1-C12亚烷基)、1至8个碳原子(C1-C8亚烷基)、1至6个碳原子(C1-C6亚烷基)、2至4个碳原子(C2-C4亚烷基)、1至2个碳原子(C1-C2亚烷基)。亚烷基的实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚正丁基等。亚烷基链通过单键连接至分子其余部分，并且通过单键连接至基团。亚烷基链与分子其余部分和与基团的连接点可通过链内的一个碳或任何两个碳。除非另有说明，否则亚烷基链任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚烯基”是指将分子其余部分连接至基团的直链或支链多价(例如二价或三价)烃链，其仅由碳和氢组成并且含有一个或多个碳-碳双键。在一个实施方案中，亚烯基具有例如2至24个碳原子(C2-C24亚烯基)、2至15个碳原子(C2-C15亚烯基)、2至12个碳原子(C2-C12亚烯基)、2至8个碳原子(C2-C8亚烯基)、2至6个碳原子(C2-C6亚烯基)或2至4个碳原子(C2-C4亚烯基)。亚烯基的实例包括但不限于亚乙烯基、亚丙烯基、亚正丁烯基等。亚烯基通过单键或双键连接至分子其余部分，并且通过单键或双键连接至基团。亚烯基与分子其余部分和与基团的连接点可通过链内的一个碳或任何两个碳。除非另有说明，否则亚烯基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“环烷基”是指仅由碳和氢原子组成的非芳族饱和单环或多环烃基。环烷基可包括稠合或桥连环系统。在一个实施方案中，环烷基具有例如3至15个环碳原子(C3-C15环烷基)、3至10个环碳原子(C3-C10环烷基)或3至8个环碳原子(C3-C8环烷基)。环烷基通过单键连接至分子其余部分。单环环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环环烷基的实例包括但不限于金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7,7-二甲基-双环[2.2.1]庚基等。除非另有说明，否则环烷基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚环烷基”是多价(例如二价或三价)环烷基。除非另有说明，否则亚环烷基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“环烯基”是指仅由碳和氢原子组成并且包括一个或多个碳-碳双键的非芳族单环或多环烃基。环烯基可包括稠合或桥连环系统。在一个实施方案中，环烯基具有例如3至15个环碳原子(C3-C15环烯基)、3至10个环碳原子(C3-C10环烯基)或3至8个环碳原子(C3-C8环烯基)。环烯基通过单键连接至分子其余部分。单环环烯基的实例包括但不限于环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基、环庚烯基、环辛烯基等。除非另有说明，否则环烯基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚环烯基”是多价(例如二价或三价)环烯基。除非另有说明，否则亚环烯基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“杂环基”是指含有一个或多个(例如一个、一个或两个、一个至三个、或一个至四个)独立地选自氮、氧、磷和硫的杂原子的非芳族基团单环或多环部分。杂环基可在任何杂原子或碳原子处连接至主结构。杂环基可为单环、双环、三环、四环或其它多环系统，其中多环系统可为稠合、桥连或螺环系统。杂环基多环系统可在一个或多个环中包含一个或多个杂原子。杂环基可为饱和或部分不饱和的。饱和杂环烷基可称为“杂环烷基”。部分不饱和的杂环烷基在杂环基含有至少一个双键时可称为“杂环烯基”，或在杂环基含有至少一个三键时可称为“杂环炔基”。在一个实施方案中，杂环基具有例如3至18个环原子(3元至18元杂环基)、4至18个环原子(4元至18元杂环基)、5至18个环原子(3元至18元杂环基)、4至8个环原子(4元至8元杂环基)或5至8个环原子(5元至8元杂环基)。当在本文中出现时，数字范围，诸如“3至18”是指给定范围中的每个整数；例如，“3至18个环原子”意指杂环基可由3个环原子、4个环原子、5个环原子、6个环原子、7个环原子、8个环原子、9个环原子、10个环原子等(至多并且包括18个环原子)组成。杂环基的实例包括但不限于咪唑基、咪唑烷基、噁唑基、噁唑烷基、噻唑基、噻唑烷基、吡唑烷基、吡唑基、异噁唑烷基、异噁唑基、异噻唑烷基、异噻唑基、吗啉基、吡咯基、吡咯烷基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、吡啶基、哌啶基、喹啉基和异喹啉基。除非另有说明，否则杂环基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚杂环基”是多价(例如二价或三价)杂环基。除非另有说明，否则亚杂环基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“芳基”是指含有至少一个芳族烃环的单环芳族基团和/或多环单价芳族基团。在某些实施方案中，芳基具有6至18个环碳原子(C6-C18芳基)、6至14个环碳原子(C6-C14芳基)或6至10个环碳原子(C6-C10芳基)。芳基的实例包括但不限于苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基、芘基、联苯基和联三苯基。术语“芳基”还指双环、三环或其它多环烃环，其中至少一个环是芳族环，并且其它环可为饱和、部分不饱和或芳族环，例如二氢萘基、茚基、二氢茚基或四氢萘基(tetrahydronaphthyl/tetralinyl)。除非另有说明，否则芳基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚芳基”是多价(例如二价或三价)芳基。除非另有说明，否则亚芳基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“杂芳基”是指含有至少一个芳族环的单环芳族基团和/或多环芳族基团，其中至少一个芳族环含有一个或多个(例如一个、一个或两个、一个至三个、或一个至四个)独立地选自O、S和N的杂原子。杂芳基可在任何杂原子或碳原子处连接至主结构。在某些实施方案中，杂芳基具有5至20个、5至15个或5至10个环原子。术语“杂芳基”还指双环、三环或其它多环，其中至少一个环是芳族环，并且其它环可为饱和、部分不饱和或芳族环，其中至少一个芳族环含有一个或多个独立地选自O、S和N的杂原子。单环杂芳基的实例包括但不限于吡咯基、吡唑基、吡唑啉基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、噻二唑基、异噻唑基、呋喃基、噻吩基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基和三嗪基。双环杂芳基的实例包括但不限于吲哚基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并噻吩基、喹啉基、四氢异喹啉基、异喹啉基、苯并咪唑基、苯并吡喃基、吲哚嗪基、苯并呋喃基、异苯并呋喃基、色酮基、香豆素基、噌啉基、喹噁啉基、吲唑基、嘌呤基、吡咯并吡啶基、呋喃并吡啶基、噻吩并吡啶基、二氢异吲哚基和四氢喹啉基。三环杂芳基的实例包括但不限于咔唑基、苯并吲哚基、菲咯啉基、吖啶基、菲啶基和呫吨基。除非另有说明，否则杂芳基任选地经取代。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“亚杂芳基”是多价(例如二价或三价)杂芳基。除非另有说明，否则亚杂芳基任选地经取代。
当本文所述的基团被称为“经取代”时，其可经一个或多个任何适当的取代基取代。取代基的说明性实例包括但不限于本文所提供的例示性化合物和实施方案中可见的那些，以及：卤素原子，诸如F、CI、Br或I；氰基；氧代(＝O)；羟基(-OH)；烷基；烯基；炔基；环烷基；芳基；-(C＝O)OR’；-O(C＝O)R’；-C(＝O)R’；-OR’；-S(O)xR’；-S-SR’；-C(＝O)SR’；-SC(＝O)R’；-NR’R’；-NR’C(＝O)R’；-C(＝O)NR’R’；-NR’C(＝O)NR’R’；-OC(＝O)NR’R’；-NR’C(＝O)OR’；-NR’S(O)xNR’R’；-NR’S(O)xR’；以及-S(O)xNR’R’，其中：R’在每次出现时独立地为H、C1-C15烷基或环烷基，并且x为0、1或2。在一些实施方案中，取代基是C1-C12烷基。在其它实施方案中，取代基是环烷基。在其它实施方案中，取代基是卤基，诸如氟基。在其它实施方案中，取代基是氧代。在其它实施方案中，取代基是羟基。在其它实施方案中，取代基是烷氧基(-OR’)。在其它实施方案中，取代基是羧基。在其它实施方案中，取代基是氨基(-NR’R’)。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“任选地选用的”或“任选地”(例如任选地经取代)意指随后描述的事件或情况可能会发生或可能不会发生，并且所述描述包括所述事件或情况发生的情况和其不发生的情况。举例来说，“任选地经取代的烷基”意指烷基可经取代或可不经取代，并且所述描述包括经取代的烷基和不具有取代的烷基二者。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语生物活性化合物的“前药”是指可在生理条件下或通过溶剂分解而转化为生物活性化合物的化合物。在一个实施方案中，术语“前药”是指生物活性化合物的药学上可接受的代谢前体。前药在施用至有需要的受试者时可为无活性的，但在活体内转化为生物活性化合物。前药通常在活体内迅速转型以产生母体生物活性化合物，例如通过在血液中水解而转型。前药化合物在哺乳动物生物体中通常提供溶解性、组织相容性或延迟释放的优点(参见Bundgard,H.,Design of Prodrugs(1985)，第7-9页，第21-24页(Elsevier,Amsterdam))。关于前药的论述提供于Higuchi,T.等人，A.C.S.Symposium Series，第14卷；以及Bioreversible Carriers in Drug Design,Edward B.Roche编辑，American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中。
在一个实施方案中，术语“前药”还意图包括任何共价键结的载体，当将此类前药施用哺乳动物受试者时，其在活体内释放活性化合物。化合物的前药可通过修饰化合物中存在的官能团来制备，其方式是使得修饰可在常规操作中或在活体内裂解而得到母体化合物。前药包括羟基、氨基或巯基键结至任何基团的化合物，当将化合物的前药施用哺乳动物受试者时，所述基团裂解而分别形成游离羟基、游离氨基或游离巯基。
前药的实例包括但不限于本文所提供化合物中的醇官能团的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物或胺官能团的酰胺衍生物。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“药学上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐二者。
药学上可接受的酸加成盐的实例包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等；以及有机酸，诸如但不限于乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、褐藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸(cyclamic acid)、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羟基乙烷磺酸、甲酸、延胡索酸、半乳糖二酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧代戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲烷磺酸、粘液酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、帕莫酸(pamoic acid)、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
药学上可接受的碱加成盐的实例包括但不限于通过将无机碱或有机碱添加至游离酸化合物而制备的盐。衍生自无机碱的盐包括但不限于钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。在一个实施方案中，无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙盐和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不限于以下的盐：伯胺、仲胺和叔胺；经取代胺，包括天然存在的经取代胺；环胺和碱性离子交换树脂，诸如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、丹醇(deanol)、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因(procaine)、哈胺(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、苯乙苄胺(benethamine)、苄星(benzathine)、乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱(theobromine)、三乙醇胺、氨基丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、聚胺树脂等。在一个实施方案中，有机碱是异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱和咖啡因。
本文所提供的化合物可含有一个或多个不对称中心，因此可产生对映异构体、非对映异构体和其它立体异构形式，所述形式可根据绝对立体化学定义为(R)-或(S)-或对于氨基酸可定义为(D)-或(L)-。除非另有说明，否则本文所提供的化合物意图包括所有所述可能的异构体，以及其外消旋和光学纯形式。光学活性(+)与(-)、(R)-与(S)-或(D)-与(L)-异构体可使用手性合成子或手性试剂制备，或使用常规技术，例如色谱法和分步结晶法拆分。用于制备/分离个别对映异构体的常规技术包括从适合的光学纯前体手性合成或使用例如手性高压液相色谱法(HPLC)拆分外消旋物(或盐或衍生物的外消旋物)。当本文所述化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心时，除非另有说明，否则所述化合物打算包括E和Z几何异构体。同样，还打算包括所有互变异构形式。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“异构体”是指具有相同分子式的不同化合物。“立体异构体”是仅原子在空间中的排列方式不同的异构体。“阻转异构体”是由围绕单键的受阻旋转得到的立体异构体。“对映异构体”是一对互为不可重叠的镜像的立体异构体。一对对映异构体的任何比例的混合物可称为“外消旋”混合物。“非对映异构体”是具有至少两个不对称原子但不互为镜像的立体异构体。
“立体异构体”还可包括E和Z异构体或其混合物，以及顺式和反式异构体或其混合物。在某些实施方案中，本文所述的化合物经分离为E或Z异构体。在其它实施方案中，本文所述的化合物是E和Z异构体的混合物。
“互变异构体”是指化合物的彼此平衡的异构形式。异构形式的浓度将取决于化合物所处的环境，并且可根据例如化合物是固体还是在有机溶液或水溶液中而有所不同。
还应注意，本文所述的化合物可在一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。举例来说，化合物可用放射性同位素，诸如氚(3H)、碘-125(125I)、硫-35(35S)或碳-14(14C)进行放射性标记，或者可为同位素富集的，诸如氘(2H)、碳-13(13C)或氮-15(15N)。如本文所用，“同位素体”是同位素富集的化合物。术语“同位素富集”是指原子的同位素组成不同于该原子的天然同位素组成。“同位素富集”还可指化合物含有的至少一个原子的同位素组成不同于该原子的天然同位素组成。术语“同位素组成”是指给定原子存在的每种同位素的量。经放射性标记和同位素富集的化合物可用作治疗剂，例如癌症治疗剂；研究试剂，例如结合分析试剂；以及诊断剂，例如活体内成像剂。本文所述化合物的所有同位素变化形式，无论是否具有放射性，都打算涵盖在本文所提供的实施方案的范围内。在一些实施方案中，提供本文所述化合物的同位素体，例如同位素体是氘、碳-13和/或氮-15富集的。如本文所用，“氘代”是指化合物中的至少一个氢(H)已经氘(以D或2H表示)置换，即，化合物在至少一个位置处富含氘。
应注意，如果所描绘的结构与该结构的名称之间存在差异，则应以所描绘的结构为准。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括但不限于被美国食品与药物管理局(United States Food and DrugAdministration)批准可接受用于人类或家畜的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、风味增强剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
术语“组合物”意欲涵盖含有任选地选用的指定量的指定成分(例如本文所提供的mRNA分子)的产品。
如本文所用，“mol％”是指组分相对于纳米颗粒组合物中的所有脂质组分的总mol(例如，鞘磷脂和类固醇和阳离子脂质和中性脂质和聚合物结合的脂质等的总mol)的摩尔百分率。
如本文可互换使用，术语“聚核苷酸”或“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括例如DNA和RNA。核苷酸可为脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或其类似物，或可通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应并入聚合物中的任何底物。聚核苷酸可包含经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和其类似物。核酸可为单股或双股形式。如本文所用并且除非另有说明，否则“核酸”还包括核酸模拟物，诸如锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉核酸。如本文所用，“寡核苷酸”是指短的合成聚核苷酸，其长度一般但未必少于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“聚核苷酸”不是互相排斥的。以上关于聚核苷酸的描述同样完全适用于寡核苷酸。除非另有说明，否则本文所公开的任何单股聚核苷酸序列的左手端为5’端；双股聚核苷酸序列的左手方向称为5’方向。新生RNA转录物的5’至3’添加方向称为转录方向；DNA股上具有与RNA转录物相同的序列并且相对于RNA转录物的5’端而位于5’处的序列区域称为“上游序列”；DNA股上具有与RNA转录物相同的序列并且相对于RNA转录物的3’端而位于3’处的序列区域称为“下游序列”。
如本文所用，术语“非天然存在”当参考如本文所述的核酸分子使用时打算意谓所述核酸分子在自然界中不存在。编码病毒肽或蛋白质的非天然存在的核酸含有至少一种通常不存在于病毒的天然存在的毒株(包括病毒的野生型毒株)中的遗传改变或化学修饰。遗传改变包括例如引入编码病毒的异源肽或多肽的可表达核酸序列的修饰、其它核酸添加、核酸缺失、核酸取代和/或对病毒的遗传物质的其它功能破坏。此类修饰包括例如对病毒物种的异源、同源、或异源和同源多肽的编码区和其功能片段的修饰。额外修饰包括例如对非编码调节区的修饰，其中所述修饰改变基因或操纵子的表达。额外修饰还包括例如将核酸序列并入诸如质粒或人工染色体的载体中。化学修饰包括例如一种或多种如本文所述的功能性核苷酸类似物。
“分离的核酸”是指与天然地伴随原生序列的其它基因组DNA序列以及蛋白质或复合物(诸如核糖体和聚合酶)基本上分离的核酸，例如RNA、DNA或混合核酸。“分离”的核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其它核酸分子分离的核酸分子。此外，当通过重组技术制造时，“分离”的核酸分子，诸如mRNA分子，可基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当化学合成时，其可基本上不含化学前体或其它化学品。在特定实施方案中，本文所述的编码抗原的一种或多种核酸分子是分离或纯化的。该术语包括已从其天然存在的环境移出的核酸序列，并且包括重组或克隆的DNA或RNA分离物以及化学合成的类似物或由异源系统生物合成的类似物。基本上纯的分子可包括分子的分离形式。
术语“编码核酸”或其语法等效物当用于指核酸分子时包括：(a)处于原生状态或通过本领域技术人员熟知的方法操作时可转录产生mRNA并且接着转译成肽和/或多肽的核酸分子；以及(b)mRNA分子本身。反义股是此类核酸分子的互补序列，并且可由其推断出编码序列。术语“编码区”是指编码核酸序列中转译成肽或多肽的部分。术语“非转译区”或“UTR”是指编码核酸中不转译成肽或多肽的部分。取决于UTR相对于核酸分子的编码区的取向，UTR如果位于编码区5’端，则称为5’-UTR，并且UTR如果位于编码区3’端，则称为3’-UTR。
如本文所用，术语“mRNA”是指包含一个或多个开放阅读框(ORF)的信使RNA分子，其可经具有该mRNA的细胞或生物体转译以产生一种或多种肽或蛋白质产物。含有一个或多个ORF的区域称为mRNA分子的编码区。在某些实施方案中，mRNA分子还包含一个或多个非转译区(UTR)。
在某些实施方案中，mRNA是仅包含一个ORF的单顺反子mRNA。在某些实施方案中，单顺反子mRNA编码包含选定抗原(例如致病性抗原或肿瘤相关抗原)的至少一个抗原决定基的肽或蛋白质。在其它实施方案中，mRNA是包含两个或更多个ORF的多顺反子mRNA。在某些实施方案中，多顺反子mRNA编码可彼此相同或不同的两种或更多种肽或蛋白质。在某些实施方案中，由多顺反子mRNA编码的每种肽或蛋白质包含选定抗原的至少一个抗原决定基。在某些实施方案中，由多顺反子mRNA编码的不同肽或蛋白质各自包含不同抗原的至少一个抗原决定基。在本文所述任一实施方案中，所述至少一个抗原决定基可为抗原的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个抗原决定基。
术语“核碱基”涵盖嘌呤和嘧啶，包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷以及其天然或合成类似物或衍生物。
如本文所用，术语“功能性核苷酸类似物”是指经典核苷酸A、G、C、U或T的经修饰型式，所述型式(a)保留对应经典核苷酸的碱基配对特性，并且(b)含有至少一种对对应天然核苷酸的(i)核碱基、(ii)糖基、(iii)磷酸酯基或(iv)(i)至(iii)的任何组合的化学修饰。如本文所用，碱基配对不仅涵盖经典沃森-克里克(Watson-Crick)腺嘌呤-胸腺嘧啶、腺嘌呤-尿嘧啶或鸟嘌呤-胞嘧啶碱基对，而且还涵盖在经典核苷酸与功能性核苷酸类似物之间或在一对功能性核苷酸类似物之间形成的碱基对，其中氢键供体与氢键受体的布置允许在经修饰的核碱基与经典核碱基之间或在两个互补的经修饰核碱基结构之间形成氢键。举例来说，鸟苷(G)的功能性类似物保留与胞嘧啶(C)或胞嘧啶的功能性类似物碱基配对的能力。此类非经典碱基配对的一个实例是经修饰核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。如本文所述，功能性核苷酸类似物可为天然存在或非天然存在的。因此，含有功能性核苷酸类似物的核酸分子可具有至少一个经修饰的核碱基、糖基和/或核苷间键联。本文提供对核酸分子的核碱基、糖基或核苷间键联的例示性化学修饰。
如本文所用，术语“转译增强子元件”、“TEE”和“转译增强子”是指核酸分子中用于促进核酸的编码序列转译成蛋白质或肽产物，诸如通过帽依赖性或非帽依赖性转译而转译成蛋白质或肽产物的区域。TEE通常位于核酸分子(例如mRNA)的UTR区，并且增强位于上游或下游的编码序列的转译水平。举例来说，核酸分子的5’-UTR中的TEE可位于核酸分子的启动子与起始密码子之间。各种TEE序列为此项技术中已知的(Wellensiek等人，Genome-wideprofiling of human cap-independent translation-enhancing elements,NatureMethods,2013年8月；10(8):747-750；Chappell等人，PNAS，2004年6月29日，101(26)9590-9594)。已知一些TEE在多个物种之间保守(Pánek等人，Nucleic Acids Research，第41卷，第16期，2013年9月1日，第7625-7634页)。
如本文所用，术语“茎-环序列”是指具有至少两个区域的单股聚核苷酸序列，当以相反方向阅读时，所述两个区域彼此互补或基本上互补，并且因此能够彼此碱基配对形成至少一个双螺旋和未配对的环。所得到的结构称为茎-环结构、发夹或发夹环，其为在许多RNA分子中发现的二级结构。
如本文所用，术语“肽”是指含有二至五十(2-50)个经一个或多个共价肽键连接的氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物或非天然氨基酸)的氨基酸聚合物。
术语“多肽”与“蛋白质”在本文中可互换使用，指具有超过五十(50)个由共价肽键连接的氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于针对蛋白质的描述，反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及一个或多个氨基酸残基是非天然存在的氨基酸(例如氨基酸类似物)的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质(例如抗原)。
在肽或多肽的情况下，如本文所用，术语“衍生物”是指包含病毒肽或蛋白质的氨基酸序列或病毒肽或蛋白质的片段的肽或多肽，其已通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而发生改变。如本文所用，术语“衍生物”还指病毒肽或蛋白质，或者病毒肽或蛋白质的片段，其已例如通过使任何类型的分子共价连接至多肽而经化学修饰。例如但非限制，病毒肽或蛋白质或者病毒肽或蛋白质的片段可例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护基/阻断基衍生化、蛋白水解裂解、化学裂解、配制、衣霉素代谢合成、与细胞配体或其它蛋白质连接等而经化学修饰。衍生物以在所连接分子的类型或位置方面不同于天然存在或起始肽或多肽的方式经修饰。衍生物还包括一个或多个天然存在于病毒肽或蛋白质上的化学基团的缺失。此外，病毒肽或蛋白质或者病毒肽或蛋白质的片段的衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。在特定实施方案中，衍生物是衍生出所述衍生物的原生或未经修饰的肽或多肽的功能性衍生物。
术语“功能性衍生物”是指保留衍生出所述衍生物的天然存在或起始肽或多肽的一种或多种功能或活性的衍生物。例如，冠状病毒S蛋白的功能性衍生物可保留结合宿主细胞上的一种或多种其受体的能力。例如，冠状病毒N蛋白的功能性衍生物可保留结合RNA或包装病毒基因组的能力。
术语“一致性”是指两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系，如通过比对和比较序列所确定。相对于参考多肽序列的“氨基酸序列一致性百分比(％)”定义为在比对序列并且必要时为了实现最大序列一致性百分比而引入间隙之后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基一致的氨基酸残基的百分比，并且不考虑将任何保守取代视为序列一致性的一部分。出于确定氨基酸序列一致性百分比的目的而进行的比对可以本领域的技能内的多种方式，例如使用公开可得的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNAStar,Inc.)软件来实现。本领域技术人员可确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较的序列的全长内实现最大比对所需的任何算法。
对氨基酸残基/位置的“修饰”是指如与起始氨基酸序列相比一级氨基酸序列的变化，其中该变化是由涉及所述氨基酸残基/位置的序列改变引起的。例如，典型修饰包括用另一氨基酸取代残基(例如，保守或非保守取代)、插入一个或多个(例如，通常少于5、4或3个)与所述残基/位置相邻的氨基酸和/或所述残基/位置的缺失。
在肽或多肽的情况下，如本文所用，术语“片段”是指包含少于全长的氨基酸序列的肽或多肽。此类片段可例如来自于氨基末端的截短、羧基末端的截短和/或氨基酸序列中残基的内部缺失。片段可例如由选择性RNA剪接或由活体内蛋白酶活性产生。在某些实施方案中，片段是指包含多肽的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少30个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少连续100个氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个、至少700个、至少750个、至少800个、至少850个、至少900个或至少950个连续氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。在特定实施方案中，多肽的片段保留多肽的至少1种、至少2种、至少3种或更多种功能。
如本文所用，术语“基因疫苗”是指包含至少一种核酸分子的治疗性或预防性组合物，所述至少一种核酸分子编码与标靶疾病(例如感染性疾病或赘生性疾病)相关的抗原。向受试者施用疫苗(“疫苗接种”)允许产生编码的肽或蛋白质，由此在受试者体内引发针对标靶疾病的免疫反应。在某些实施方案中，免疫反应包括适应性免疫反应，诸如产生针对编码的抗原的抗体，和/或能够特异性消除表达该抗原的患病细胞的免疫细胞的活化和增殖。在某些实施方案中，免疫反应还包括先天免疫反应。根据本公开，疫苗可在标靶疾病的临床症状发作之前或之后施用受试者。在一些实施方案中，对健康或无症状受试者进行疫苗接种使经疫苗接种的受试者对标靶疾病的发展具有免疫性或不太敏感。在一些实施方案中，对显示疾病症状的受试者进行疫苗接种改善经疫苗接种的受试者的疾病状况或治疗疾病。
术语“先天免疫反应”和“先天免疫”是此项技术中公认的，并且是指身体的免疫系统在识别出病原体相关分子模式时启动的非特异性防御机制，其涉及不同形式的细胞活动，包括通过各种路径的细胞因子产生和细胞死亡。如本文所用，先天免疫反应包括但不限于炎症细胞因子的产生(例如I型干扰素或IL-10产生)增加；NFκB路径的活化；免疫细胞的增殖、成熟、分化和/或存活增加，以及在一些情况下细胞凋亡的诱导。先天免疫的活化可使用此项技术中已知的方法检测，诸如测量(NF)-κB活化情况。
术语“适应性免疫反应”和“适应性免疫”是此项技术中公认的，并且是指身体的免疫系统在识别出特定抗原时启动的抗原特异性防御机制，包括体液反应和细胞介导的反应。如本文所用，适应性免疫反应包括由疫苗组合物，诸如本文所述的遗传组合物触发和/或增强的细胞反应。在一些实施方案中，疫苗组合物包含作为抗原特异性适应性免疫反应的标靶的抗原。在其它实施方案中，疫苗组合物在施用后允许在经免疫的受试者中产生抗原，所述抗原是抗原特异性适应性免疫反应的标靶。适应性免疫反应的活化可使用此项技术中已知的方法检测，诸如测量抗原特异性抗体的产生或抗原特异性细胞介导的细胞毒性的水平。
术语“施用(administer/administration)”是指将存在于体外的物质(例如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)注射或以其它方式物理递送至患者体内的操作，诸如经粘膜、真皮内、静脉内、肌肉内递送和/或本文所述或此项技术中已知的任何其它物理递送方法递送。当治疗疾病、病症、疾患或其症状时，通常在疾病、病症、疾患或其症状发作之后进行物质的施用。当预防疾病、病症、疾患或其症状时，通常在疾病、病症、疾患或其症状发作之前进行物质的施用。
“长期”施用与急性模式相对，是指以连续模式施用一种或多种剂(例如持续一段时间，诸如数天、数周、数月或数年)，由此在较长一段时间内维持初始治疗效应(活性)。“间歇性”施用是指治疗不是不间断地连续进行，而是本质上周期性的。
如本文所用，术语“靶向递送”或动词形式“靶向”是指相较于递送至任何其它器官、组织、细胞或细胞内隔室(称为非标靶位置)，促进所递送的剂(诸如本文所述的脂质纳米颗粒组合物中的治疗性有效负载分子)到达特定器官、组织、细胞和/或细胞内隔室(称为标靶位置)的过程。靶向递送可使用此项技术中已知的方法检测，例如通过在全身施用后将所递送的剂在标靶细胞群体中的浓度与所递送的剂在非标靶细胞群体处的浓度相比较来检测。在某些实施方案中，靶向递送使得标靶位置处的浓度为非标靶位置处的浓度的至少2倍高。
“有效量”一般是足以降低症状的严重程度和/或频率；消除症状和/或潜在原因；防止症状和/或其潜在原因的发生；和/或改善或补救由疾病、病症或疾患，包括例如由感染和赘瘤形成引起或与之相关的损害的量。在一些实施方案中，有效量是治疗有效量或预防有效量。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指足以减少和/或改善给定疾病、病症或疾患，和/或其相关症状(例如感染性疾病，诸如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，诸如癌症)的严重程度和/或持续时间的剂(例如疫苗组合物)的量。本公开的物质/分子/剂(例如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)的“治疗有效量”可根据诸多因素而变化，诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及物质/分子/剂在个体体内引发所需反应的能力。治疗有效量包含物质/分子/剂的治疗有益效应胜过其任何有毒或有害效应的量。在某些实施方案中，术语“治疗有效量”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病、病症或疾患的如本文所述的脂质纳米颗粒组合物或者其中所含治疗剂或预防剂(例如治疗性mRNA)的量。
“预防有效量”是当施用受试者时将具有预期预防效应，例如预防疾病、病症、疾患或相关症状(例如感染性疾病，诸如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，诸如癌症)、延迟其发作(或复发)或降低其发作(或复发)可能性的药物组合物的量。通常但不是必须地，由于预防剂量是在疾病、病症或疾患之前或其早期阶段用于受试者，因此预防有效量可能小于治疗有效量。完全的治疗或预防效应未必通过施用一次剂量而发生，而可能仅在施用一系列剂量后才发生。因此，治疗或预防有效量可分一次或多次施用来施用。
术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指完全或部分缓解病症、疾病或疾患或与病症、疾病或疾患相关的一种或多种症状，或者减缓或停止那些症状的进一步进展或恶化，或者缓解或根除病症、疾病或疾患自身的原因。
术语“预防(prevent/preventing/prevention)”是指降低疾病、病症、疾患或相关症状(例如感染性疾病，诸如由病毒感染引起的感染性疾病，或赘生性疾病，诸如癌症)发作(或复发)的可能性。
术语“管理(manage/managing/management)”是指受试者从疗法(例如预防剂或治疗剂)获得的有益效应，其不会引起疾病的治愈。在某些实施方案中，向受试者施用一种或多种疗法(例如预防剂或治疗剂，诸如本文所述的脂质纳米颗粒组合物)以“管理”感染性或赘生性疾病、其一种或多种症状，由此预防疾病的进展或恶化。
术语“预防剂”是指可以完全或部分地抑制受试者的疾病和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的任何剂。
术语“治疗剂”是指可用于治疗、预防或缓解疾病、病症或疾患，包括用于治疗、预防或缓解疾病、病症或疾患和/或其相关症状的一种或多种症状的任何剂。
术语“疗法”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病、病症或疾患的任何方案、方法和/或剂。在某些实施方案中，术语“疗法(therapies/therapy)”是指本领域技术人员，诸如医务人员已知可用于预防、管理、治疗和/或改善疾病、病症或疾患的生物疗法、支持疗法和/或其它疗法。
如本文所用，“预防有效血清效价”是受试者(例如人类)体内完全或部分地抑制受试者的疾病、病症或疾患，和/或其相关症状的发展、复发、发作或扩散的抗体的血清效价。
在某些实施方案中，“治疗有效血清效价”是受试者(例如人类)体内降低受试者的与疾病、病症或疾患相关的严重程度、持续时间和/或症状的抗体的血清效价。
术语“血清效价”是指一名受试者中来自多个样品(例如在多个时间点)或在至少10名、至少20名、至少40名至多达约100名、1000名或更多受试者的群体中的平均血清效价。
术语“副作用”涵盖疗法(例如预防剂或治疗剂)的不想要的作用和/或不良作用。不想要的作用未必为不良作用。疗法(例如预防剂或治疗剂)的不良作用可能为有害的、令人不适的或有风险的。副作用的实例包括腹泻、咳嗽、肠胃炎、喘鸣、恶心、呕吐、厌食、腹部绞痛、发烧、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、呼吸困难、失眠、头晕、粘膜炎、神经和肌肉影响、疲劳、口干、食欲不振、施用部位出现皮疹或肿胀、诸如发烧、发冷和疲劳之类的流感样症状、消化道问题和过敏反应。患者经历的其它不期望的作用众多并且为此项技术中所知的。有许多作用描述于Physician’s Desk Reference(第68版，2014)中。
术语“受试者”与“患者”可互换使用。如本文所用，在某些实施方案中，受试者是哺乳动物，诸如非灵长类动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如猴和人类)。在特定实施方案中，受试者是人类。在一个实施方案中，受试者是患有感染性疾病或赘生性疾病的哺乳动物(例如人类)。在另一实施方案中，受试者是有患上感染性疾病或赘生性疾病的风险的哺乳动物(例如人类)。
术语“可检测探针”是指提供可检测信号的组合物。该术语包括但不限于通过活性提供可检测信号的任何荧光团、生色团、放射性标记、酶、抗体或抗体片段等。
术语“可检测剂”是指可用于确定样品或受试者中所需分子，诸如由本文所述的mRNA分子编码的抗原的存在(existence/presence)的物质。可检测剂可为能够被目测的物质或者能够以其它方式确定和/或测量(例如通过定量)的物质。
“基本上全部”是指至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或约100％。
如本文所用并且除非另有说明，否则术语“约”或“大约”意指一般技术者所确定的特定值的可接受的误差，其部分取决于测量或确定值的方式。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在1、2、3或4个标准偏差以内。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内、0.5％以内、0.05％以内或更低以内。如本文所用，当“约”与数值范围结合使用时，术语“约”打算适用于此类经修饰范围的两端(例如，“约5至10”意谓“约5至约10”)。
除非上下文另外明确指出，否则本文所用的单数形式术语“一个(种)(a/an)”和“所述”包括多个(种)被指称物。
本说明书中引用的所有出版物、专利申请、登录号和其它参考文献都以引用的方式整体并入本文中，其引用程度就如同特定并且单独地指示每一个别出版物或专利申请以引用的方式并入一般。本文所论述的出版物仅为了其在本申请的申请日之前的公开内容而提供。本文中的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于所述出版物。此外，提供的公布日期可能与实际公布日期有所不同，实际公布日期可能需要独立确认。
已经描述本发明的多个实施方案。然而，应理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下可进行各种修改。因此，实验部分和实施例中的描述旨在说明而不是限制权利要求书中所描述的发明范围。
5.3含鞘磷脂组合物
鞘脂是指一类复杂脂质，其由类鞘氨醇长链碱、系栓至鞘氨醇(1,3-二羟基-2-氨基-4-十八烯)主链的氨基的脂肪酸和可变极性头基构成。鞘氨醇碱和脂肪酸单独构成神经酰胺，并且连接的头基可介于磷酸胆碱(鞘磷脂)至糖(糖神经鞘脂质)至复杂碳水化合物范围内。如图1A所说明，鞘脂充当细胞膜的结构组分，并且趋向于彼此缔合以及与胆固醇和某些类别的蛋白质，诸如通过糖基磷脂酰肌醇锚附接至膜的那些蛋白质缔合。聚集体在遗传上称为“筏”。设想筏为质膜的相对较小、独特并且液体有序(Lo)子域，由于鞘脂的高度饱和烷基链和分子间氢键结，所述子域迅速形成并且分散。
哺乳动物细胞通常含有鞘磷脂(例如，N-硬脂酰基-D-赤型-鞘氨醇磷酸胆碱)。天然鞘磷脂通常含有混合群体，其中酰胺连接的酰基链的长度差异很大(例如，14至24个碳、14至20个碳、16至24个碳、16至20个碳或18个碳)。图1B显示与胆固醇形成氢键的例示性鞘磷脂分子。如图1C所示，鞘磷脂的氢键形成酰胺来自鞘氨醇主链，而其它结构相似的磷脂缺少该主链，诸如1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
本公开部分地基于令人惊讶的发现，即通过使用鞘磷脂作为结构脂质来配制脂质纳米颗粒(LNP)，形成具有独特半层状形态的LNP。不受任何理论束缚，预期富含鞘磷脂的液体有序域(筏)可形成并且分散于脂质纳米颗粒的液体无序(Ld)非筏区中，并且这些含筏颗粒的异质性质在电子显微镜下产生半层状形态。这些含筏颗粒在本公开中有时称为脂筏纳米颗粒(LRNP)。
特定来说，图2A是对比左侧含有由鞘磷脂和其它脂质(例如胆固醇)形成的微域(筏)的根据本公开的LRNP的异质外观与右侧缺乏筏的先前所述的LNP的同质外观的示意图。
如本文所用，术语颗粒的“半层状形态”意谓颗粒的微观结构含有层状(单层或多层)部分(参见图2B由箭头A指向的区域)和电子致密部分(参见图2B由箭头B指向的区域)，其中层状部分围绕小于整个的电子致密核。在一些实施方案中，具有半层状形态的颗粒可包含两个或更多个层状部分，其共同围绕小于整个的电子致密核。
不受任何理论束缚，预期颗粒的层状部分具有脂质双层结构，并且颗粒的电子致密部分具有非层状脂质双层结构，其可包括例如三维管、棒、立方对称体等。使用本领域技术人员已知和使用的技术可容易地确定所得脂质颗粒的半层状形态。此类技术包括但不限于低温透射电子显微术(“Cryo-TEM”)、电子低温显微术(“Cryo-EM”)、差示扫描量热法(“DSC”)、X射线衍射等。如本文中用于描述颗粒形态的术语“电子致密”意谓颗粒或颗粒的一部分具有防止电子穿透的密度，导致在电子显微镜下的实心深色外观。
图2B和图2C是显示本发明LRNP和参考LNP的形态的Cryo-EM图像，其使用本文实施例3中描述的Cryo-EM分析进行评估和表征。与本发明LRNP的半层状形态形成对比，图2C显示参考脂质纳米颗粒的电子致密形态，其在整个颗粒中具有实心深色外观。
如图2B所示，半层状纳米颗粒包含电子致密核和至少一个层状部分，其中层状部分仅围绕电子致密核的一部分。半层状纳米颗粒的一些层状部分呈现单层膜外观(参见图2B箭头C)，其在本文中称为“单层”结构，而其它部分呈现多层膜外观(参见图2B箭头D)，其在本文中称为“多层”结构。半层状颗粒可具有一个(参见图2B箭头E)或多个层状部分(参见图2B箭头F)。
图5和图9为本发明LRNP和参考LNP的Cryo-EM图像，其使用本文实施例3中描述的Cryo-EM分析进行评估和表征。不受任何理论束缚，当含鞘磷脂LNP中的鞘磷脂含量增加时，LNP的微观形态趋向于朝向较高分层水平转变。例如，如图5右图所示，当鞘磷脂占LNP制剂的总脂质含量的约30mol％(摩尔百分率)时，大部分颗粒转变为完全层状形态，其中层状部分完全围绕颗粒的电子致密核(箭头)，所述完全层状形态在本申请中有时称为“壳-核”形状。
已发现，本公开的LNP在用于诸如治疗性核酸(例如mRNA)的活性剂的活体外或活体内递送时提供优势。具体来说，如本文实施例所示，本公开提供稳定脂筏纳米颗粒(LRNP)，如与先前已知的核酸-脂质颗粒组合物相比，其有利地向经包封核酸(例如，mRNA)赋予增加的活性。作为非限制性实例，实施例4的图3A至图3C、实施例5的图4、实施例8的图8和图9以及实施例9的图10一致地显示，在本文所公开的LRNP的一个实施方案中，在哺乳动物细胞或哺乳动物的组织中由本发明LRNP中所含的mRNA表达的蛋白质显著多于由配制于先前描述的参考核酸-脂质颗粒组合物中的相同mRNA表达的蛋白质的量。
5.3.1制剂
在一个方面，本文提供含鞘磷脂组合物。在一些实施方案中，本文所述的含鞘磷脂组合物经配制为纳米颗粒组合物。可与本公开结合使用的纳米颗粒组合物包括例如脂质纳米颗粒(LNP)、纳米脂蛋白颗粒、脂质体、脂质囊泡和脂质复合物(lipoplex)。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物是包括一个或多个脂质双层的囊泡。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包括经水性隔室隔开的两个或更多个同心双层。脂质双层可经官能化和/或彼此交联。脂质双层可包括一种或多种配体、蛋白质或通道。在一些实施方案中，本文所提供的纳米颗粒组合物为脂质纳米颗粒。包含核酸的脂质纳米颗粒和其制备方法为此项技术中已知的，诸如在例如美国专利公布第2004/0142025号、美国专利公布第2007/0042031号、PCT公布第WO 2017/004143号、PCT公布第WO 2015/199952号、PCT公布第WO 2013/016058号和PCT公布第WO 2013/086373号中公开的那些，这些公布中的每一者的完整公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，本文所提供的纳米颗粒组合物的最大尺寸为1μm或更短(例如，≤1μm、≤900nm、≤800nm、≤700nm、≤600nm、≤500nm、≤400nm、≤300nm、≤200nm、≤175nm、≤150nm、≤125nm、≤100nm、≤75nm、≤50nm或更短)，诸如当通过动态光散射(DLS)、透射电子显微术、扫描电子显微术或另一方法测量时。在一个实施方案中，本文所提供的脂质纳米颗粒具有至少一个在约40nm至约200nm范围内的尺寸。在一个实施方案中，所述至少一个尺寸在约40nm至约100nm范围内。
在一些实施方案中，组合物包含鞘磷脂和至少一种不是鞘磷脂的脂质。在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物包含：(a)鞘磷脂，以及(b)类固醇。
在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物包含(a)鞘磷脂、(b)类固醇，并且还包含不是鞘磷脂或类固醇的第一脂质组分。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中的第一脂质组分包含(c)阳离子脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中的第一脂质组分包含(d)聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物中的第一脂质组分包含(e)不是鞘磷脂的第二磷脂。在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物中的第一脂质组分包含(c)阳离子脂质和(d)聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物中的第一脂质组分包含(c)阳离子脂质、(d)聚合物结合的脂质和(e)不是鞘磷脂的第二磷脂。
在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物包含鞘磷脂、类固醇、不是鞘磷脂或类固醇的第一脂质组分、和非脂质组分。在一些实施方案中，非脂质组分为核酸分子。
在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物包含鞘磷脂。如本文所用并且除非另有说明，否则“鞘磷脂”是指鞘磷脂化合物或其盐，或其立体异构体或立体异构体的混合物。如本文所用并且除非另有说明，否则本文所提供的“鞘磷脂化合物”具有以下结构：
其中R为烷基或烯基。如本文所用并且除非另有说明，否则本文所提供的对鞘磷脂的描述(诸如摩尔比)在适用范围内还适用于鞘磷脂化合物，反之亦然。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至40mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至30mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至25mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约15mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约20mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％、约6mol％、约7mol％、约8mol％、约9mol％、约10mol％、约11mol％、约11.5mol％、约12mol％、约12.5mol％、约13mol％、约13.5mol％、约14mol％、约14.5mol％、约15mol％、约15.5mol％、约16mol％、约16.5mol％、约17mol％、约17.5mol％、约18mol％、约18.5mol％、约19mol％、约19.5mol％、约20mol％、约21mol％、约22mol％、约23mol％、约24mol％、约25mol％、约30mol％、约35mol％或约40mol％。
在一些实施方案中，组合物中的鞘磷脂是具有以下结构的鞘磷脂化合物：
其中R为烷基或烯基。在一个实施方案中，R为C11-C23烷基。在一个实施方案中，R为C11-C19烷基。在一个实施方案中，R为C13-C19烷基。在一个实施方案中，R为C15-C19烷基。在一个实施方案中，R为C11烷基(例如，-(CH2)10-CH3)。在一个实施方案中，R为C13烷基(例如，-(CH2)12-CH3)。在一个实施方案中，R为C14烷基(例如，-(CH2)13-CH3)。在一个实施方案中，R为C15烷基(例如，-(CH2)14-CH3)。在一个实施方案中，R为C16烷基(例如，-(CH2)15-CH3)。在一个实施方案中，R为C17烷基(例如，-(CH2)16-CH3)。在一个实施方案中，R为C18烷基(例如，-(CH2)17-CH3)。在一个实施方案中，R为C19烷基(例如，-(CH2)18-CH3)。在一个实施方案中，R为C20烷基(例如，-(CH2)19-CH3)。在一个实施方案中，R为C21烷基(例如，-(CH2)20-CH3)。在一个实施方案中，R为C22烷基(例如，-(CH2)21-CH3)。在一个实施方案中，R为C23烷基(例如，-(CH2)22-CH3)。在一个实施方案中，烷基为直链烷基。在一个实施方案中，烷基为支链烷基。在一个实施方案中，烷基未经取代。在一些实施方案中，本文所提供的鞘磷脂选自下表X中所示的SM-01、SM-02、SM-03、SM-06和SM-07分子。
在一个实施方案中，R为C11-C23烯基。在一个实施方案中，R为C13-C19烯基。在一个实施方案中，R为C15-C19烯基。在一个实施方案中，R为C11烯基。在一个实施方案中，R为C13烯基。在一个实施方案中，R为C14烯基。在一个实施方案中，R为C15烯基。在一个实施方案中，R为C16烯基。在一个实施方案中，R为C17烯基。在一个实施方案中，R为C18烯基。在一个实施方案中，R为C19烯基。在一个实施方案中，R为C20烯基。在一个实施方案中，R为C21烯基。在一个实施方案中，R为C22烯基。在一个实施方案中，R为C23烯基。在一个实施方案中，烯基具有一个双键。在一个实施方案中，双键具有Z构型。在一个实施方案中，双键位于烯基R基团的9位。在一个实施方案中，烯基为直链烯基。在一个实施方案中，烯基为支链烯基。在一个实施方案中，烯基未经取代。在一些实施方案中，本文所提供的鞘磷脂选自实施例7的表X中所示的SM-04和SM-05分子。
在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物还包含类固醇。在一些实施方案中，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约35mol％至45mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约38.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约38.5mol％。在一些实施方案中，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约43.5mol％。
在一些实施方案中，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％、约34mol％、约34.5mol％、约35mol％、约35.5mol％、约36mol％、约36.5mol％、约37mol％、约37.5mol％、约38mol％、约38.5mol％、约39mol％、约39.5mol％、约40mol％、约40.5mol％、约41mol％、约41.5mol％、约42mol％、约42.5mol％、约43mol％、约43.5mol％、约44mol％、约44.5mol％、约45mol％、约45.5mol％、约46mol％、约46.5mol％、约47mol％、约47.5mol％、约48mol％或约48.5mol％。
在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物包含：(a)鞘磷脂，以及(b)类固醇。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至40mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至30mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至25mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至40mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至30mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约35mol％至45mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约35mol％至45mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约15mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约20mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约38.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且类固醇占存在于组合物中的总脂质的约43.5mol％。
在一些实施方案中，组合物中的类固醇选自部分5.3.5(结构脂质)中描述的类固醇。在一些实施方案中，类固醇为胆固醇或胆固醇衍生物。
在一些实施方案中，包含(a)鞘磷脂和(b)类固醇的含鞘磷脂组合物还包含(c)至少一种不是鞘磷脂或类固醇的第一脂质组分。
在一些实施方案中，第一脂质组分包含(c)阳离子脂质。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约35mol％至50mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％至50mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％。在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约50mol％。
在一些实施方案中，阳离子脂质占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约35.5mol％、约36mol％、约36.5mol％、约37mol％、约37.5mol％、约38mol％、约38.5mol％、约39mol％、约39.5mol％、约40mol％、约40.5mol％、约41mol％、约41.5mol％、约42mol％、约42.5mol％、约43mol％、约43.5mol％、约44mol％、约44.5mol％。
在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物包含：(a)鞘磷脂，(b)类固醇；以及(c)阳离子脂质。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至30mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至25mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约15mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约35mol％至45mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约38.5mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约43.5mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约35mol％至50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％至50mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约50mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约15mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约40mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约45mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约38.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约43.5mol％。
在一些实施方案中，阳离子脂质是如本文部分5.3.2(阳离子脂质)中所述的脂质化合物。在一些实施方案中，阳离子脂质是根据选自本文所述的式01-I、01-II、02-I、02-II、03-I、03-II-A、03-II-B、03-II-C、03-II-D、04-I、04-III、04-IV、05-I、06-I和其子式的任一式的化合物。在一些实施方案中，阳离子脂质是选自表1至表5中列出的化合物的化合物。在一些实施方案中，阳离子脂质是选自实施例8的表Y的化合物。
在一些实施方案中，第一脂质组分包含聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％、约0.6mol％、约0.7mol％、约0.8mol％、约0.9mol％、约1mol％、约1.1mol％、约1.2mol％、约1.3mol％、约1.4mol％、约1.5mol％、约1.6mol％、约1.7mol％、约1.8mol％、约1.9mol％、约2mol％、约2.1mol％、约2.2mol％、约2.3mol％、约2.4mol％、约2.5mol％、约2.6mol％、约2.7mol％、约2.8mol％、约2.9mol％或约3mol％。
在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物包含：(a)鞘磷脂，(b)类固醇，(c)阳离子脂质，以及(d)聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至30mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至25mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约15mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约35mol％至45mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约38.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约35mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约15mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约38.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约3mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％；其中阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约50mol％；其中类固醇占存在于组合物中的总脂质的约38.5mol％；并且其中聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％；类固醇占存在于组合物中的总脂质的约43.5mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约10mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％；类固醇占存在于组合物中的总脂质的约48.5mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约15mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％；类固醇占存在于组合物中的总脂质的约38.5mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约15mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％；类固醇占存在于组合物中的总脂质的约43.5mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约20mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％；类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约20mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％；类固醇占存在于组合物中的总脂质的约38.5mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％；类固醇占存在于组合物中的总脂质的约48.5mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％；类固醇占存在于组合物中的总脂质的约48.5mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％。
在一些实施方案中，聚合物结合的脂质选自本文部分5.3.4(聚合物结合的脂质)中描述的脂质。在一些实施方案中，聚合物结合的脂质为DMG-PEG。在一些实施方案中，聚合物结合的脂质为DMG-PEG2000或DMPE-PEG2000。
在一些实施方案中，第一脂质组分包含不是鞘磷脂的第二磷脂。在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％。在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至30mol％。在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％。在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％。在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约10mol％。在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约15mol％。在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约20mol％。在一些实施方案中，鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:3至3:1。在一些实施方案中，鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:3。在一些实施方案中，鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:1。在一些实施方案中，鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约3:1。
在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物包含：(a)鞘磷脂，(b)类固醇，(c)阳离子脂质，(d)聚合物结合的脂质，以及(e)不是鞘磷脂的第二磷脂。在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约30mol％至55mol％；聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％，并且鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:3至3:1。
在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约5mol％至20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％，并且鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:3至3:1。在一些实施方案中，鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:1。
在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约5mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％，并且鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:3至3:1。在一些实施方案中，鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:1。
在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约15mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％，并且鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:3至3:1。在一些实施方案中，鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:1。
在一些实施方案中，总磷脂含量(包括鞘磷脂和第二磷脂)占存在于组合物中的总脂质的约20mol％，类固醇占存在于组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％，并且鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:3至3:1。在一些实施方案中，鞘磷脂与第二磷脂之间的摩尔比为约1:1。
在一些实施方案中，鞘磷脂占存在于组合物中的总脂质的约5mol％；阳离子脂质占存在于组合物中的总脂质的约45mol％；类固醇占存在于组合物中的总脂质的约43.5mol％；并且聚合物结合的脂质占存在于组合物中的总脂质的约1.5mol％；并且其中组合物还包含占存在于组合物中的总脂质的约5mol％的第二磷脂。
在一些实施方案中，第二磷脂是选自本文部分5.3.6(磷脂)的化合物。在一些实施方案中，第二磷脂为DSPC。
在一相关方面，本公开至少部分地基于以下发现：与不含鞘磷脂的参考含核酸脂质纳米颗粒相比，包含鞘磷脂作为结构组分的含核酸脂质纳米颗粒可导致核酸分子的表达水平增强。不受理论束缚，预期这些脂质纳米颗粒含有富含鞘磷脂的液体有序(Lo)域(筏)，其分散于由其它脂质组分形成的液体无序(Ld)非筏区域中。在一些实施方案中，这些脂质纳米颗粒在电子显微术下展现半层状形态，诸如图2B中所说明。
在一些实施方案中，含鞘磷脂组合物包含：(a)鞘磷脂，(b)类固醇，(c)阳离子脂质，(d)聚合物结合的脂质，以及(e)非脂质组分。在一些实施方案中，非脂质组分包含治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂是如本文部分5.3.7(治疗性有效负载)中所述的分子。在一些实施方案中，非脂质组分为核酸分子。在一些实施方案中，非脂质组分为mRNA分子。
在一些实施方案中，本文所述的含鞘磷脂组合物经配制为纳米颗粒组合物。根据本公开，本文所述的任何含鞘磷脂组合物均可经配制为纳米颗粒组合物。任何含鞘磷脂组合物的如本文所述的含量、组成和/或脂质摩尔比或百分率中的任一者还适用于纳米颗粒组合物，加以必要修正。仅出于说明性和非限制性目的，本文中对含鞘磷脂组合物的描述(诸如含鞘磷脂组合物包含占存在于含鞘磷脂组合物中的总脂质的约10mol％的鞘磷脂)当应用于纳米颗粒组合物时将为：纳米颗粒组合物包含占存在于纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％的鞘磷脂。
在一些实施方案中，本文所述的含鞘磷脂组合物经配制为脂质纳米颗粒组合物。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含多个脂质纳米颗粒。因此，任何含鞘磷脂组合物的如本文所述的含量、组成和/或脂质摩尔比或百分率中的任一者还适用于纳米颗粒组合物中的纳米颗粒(包括LRNP)，加以必要修正。仅出于说明性和非限制性目的，本文中对含鞘磷脂组合物的描述(诸如含鞘磷脂组合物包含占存在于含鞘磷脂组合物中的总脂质的约10mol％的鞘磷脂)当应用于一个或多个脂质纳米颗粒时将为：一个或多个脂质纳米颗粒包含占存在于一个或多个脂质纳米颗粒中的总脂质的约10mol％的鞘磷脂。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含多个包含核酸分子的纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含多个将核酸分子封入脂质壳内的纳米颗粒。在一些实施方案中，脂质壳保护核酸分子免于降解。在一些实施方案中，纳米颗粒还促进将封入的核酸分子运输至细胞内隔室和/或机构中以发挥预期治疗或预防功能。在某些实施方案中，当存在于脂质纳米颗粒中时，核酸在水溶液中抵抗核酸酶的降解。
在一些实施方案中，如本文所述，纳米颗粒组合物包含(a)鞘磷脂和(b)类固醇。在一些实施方案中，如本文所述，纳米颗粒组合物包含(a)鞘磷脂，(b)类固醇，并且还包含不是鞘磷脂或类固醇的第一脂质组分。在一些实施方案中，如本文所述，纳米颗粒组合物中的第一脂质组分包含(c)阳离子脂质。在一些实施方案中，如本文所述，纳米颗粒组合物中的第一脂质组分包含(c)阳离子脂质和(d)聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，如本文所述，纳米颗粒组合物中的第一脂质组分包含(c)阳离子脂质，(d)聚合物结合的脂质，并且还包含(e)不是鞘磷脂的第二磷脂。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含多个纳米颗粒。在一些实施方案中，组合物中的一个或多个纳米颗粒具有包含至少一个液体有序(Lo)域和至少一个液体无序(Ld)区的异质结构。在一些实施方案中，至少一个Lo域分散于纳米颗粒的Ld区中。
在一些实施方案中，纳米颗粒包含(a)鞘磷脂、(b)类固醇、以及不是鞘磷脂或类固醇的第一脂质组分。在一些实施方案中，Lo域包含鞘磷脂。在一些实施方案中，如与纳米颗粒的Ld区相比，Lo域的鞘磷脂浓度较高。在一些实施方案中，Lo域包含类固醇。在一些实施方案中，如与纳米颗粒的Ld区相比，Lo域的类固醇浓度较高。在一些实施方案中，Ld区包含第一脂质组分。在一些实施方案中，如与Lo域相比，Ld区含有较高浓度的第一脂质组分。在一些实施方案中，第一脂质组分包含阳离子脂质。在一些实施方案中，第一脂质组分包含聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，第一脂质组分包含不是鞘磷脂的第二磷脂。在一些实施方案中，第一脂质组分包含阳离子脂质和聚合物结合的脂质。在一些实施方案中，第一脂质组分包含阳离子脂质、聚合物结合的脂质和不是鞘磷脂的第二磷脂。
在一些实施方案中，纳米颗粒是如本文所述的脂筏纳米颗粒(LRNP)，并且包含分散于至少一个液体无序(Ld)区中的一个或多个液体有序(Lo)域。在一些实施方案中，LRNP的Lo域包含脂筏。在一些实施方案中，LRNP的Lo域包含鞘磷脂和类固醇。在一些实施方案中，LRNP的Lo域包含鞘磷脂和类固醇，其通过氢键彼此键结，如图1B所描绘。
在一些实施方案中，纳米颗粒的Ld区在电子显微术下为电子致密的。在一些实施方案中，纳米颗粒的Lo域在电子显微术下不是电子致密的。在一些实施方案中，纳米颗粒的Lo域在电子显微术下呈现单层结构。在一些实施方案中，纳米颗粒的Lo域在电子显微术下呈现多层结构。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一个电子致密核。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一个层状部分，其围绕小于整个电子致密核。在一些实施方案中，纳米颗粒包含两个或更多个层状部分，其共同围绕小于整个电子致密核。在一些实施方案中，纳米颗粒在电子显微术下呈现半层状形态，其中纳米颗粒包含电子致密核和至少一个层状部分，并且其中层状部分围绕小于整个电子致密核。在一些实施方案中，电子显微术为低温透射电子显微术(“Cryo-TEM”)、电子低温显微术(“Cryo-EM”)、差示扫描量热法(“DSC”)或x射线衍射。在一些实施方案中，电子显微术为Cryo-TEM。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含多个纳米颗粒，其中所述多个纳米颗粒的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％具有半层状形态。在一些实施方案中，根据本公开的纳米颗粒组合物中的多个纳米颗粒的至少55％具有半层状形态。在一些实施方案中，纳米颗粒的半层状形态是在电子显微术下可见的微观形态。在一些实施方案中，电子显微术为低温透射电子显微术(“Cryo-TEM”)、电子低温显微术(“Cryo-EM”)、差示扫描量热法(“DSC”)或x射线衍射。在一些实施方案中，电子显微术为Cryo-TEM。
在本公开的各个实施方案中，纳米颗粒组合物还包含非脂质组分。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中的多个纳米颗粒包含非脂质组分。在一些实施方案中，非脂质组分包含治疗剂。在一些实施方案中，非脂质组分是如本文部分5.3.7(治疗性有效负载)中所述的分子。在一些实施方案中，非脂质组分为核酸分子。在一些实施方案中，非脂质组分为mRNA分子。
在一些实施方案中，纳米颗粒包含核酸。在一些实施方案中，核酸编码RNA或蛋白质。在一些实施方案中，从纳米颗粒中的核酸表达的RNA或蛋白质的量大于从配制于核酸-脂质参考纳米颗粒组合物(参考纳米颗粒组合物)中的核酸表达的RNA或蛋白质的量。
在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物不含鞘磷脂。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物不含占存在于颗粒中的总脂质的约5mol％至40mol％的鞘磷脂。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物不含占存在于颗粒中的总脂质的约10mol％至30mol％的鞘磷脂。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物不含占存在于颗粒中的总脂质的约10mol％至25mol％的鞘磷脂。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物不含占存在于颗粒中的总脂质的约10mol％至20mol％的鞘磷脂。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物不含占存在于颗粒中的总脂质的约10mol％至15mol％的鞘磷脂。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物不含占存在于颗粒中的总脂质的约10mol％的鞘磷脂。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物不含占存在于颗粒中的总脂质的约15mol％的鞘磷脂。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物不含占存在于颗粒中的总脂质的约20mol％的鞘磷脂。
在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物含有第二脂质而不是鞘磷脂。在一些实施方案中，其中第二脂质在存在于参考纳米颗粒组合物中的总脂质中的摩尔百分率与鞘磷脂在存在于纳米颗粒组合物中的总脂质中的摩尔百分率相同，其中参考纳米颗粒组合物用作参考(例如，用于比较研究)。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物具有与纳米颗粒组合物相同的组成，除了在参考纳米颗粒组合物中，鞘磷脂由相等摩尔百分率的第二脂质置换。在一些实施方案中，第二脂质为磷脂。在一些实施方案中，第二脂质为DSPC。
在一些实施方案中，在将含核酸的纳米颗粒组合物递送至宿主细胞之后，核酸通过宿主细胞内源性转录和/或转译机构表达以形成RNA和/或蛋白质。在一些实施方案中，在将含核酸的纳米颗粒组合物递送至宿主细胞之后，如与配制于如本文所述的参考纳米颗粒组合物中的核酸相比，配制于本发明含鞘磷脂纳米颗粒组合物中的核酸的表达水平有所增强。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物包含相同组成，除了鞘磷脂由相等摩尔百分率的另一磷脂置换。在一些实施方案中，另一磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一些实施方案中，鞘磷脂在存在于根据本公开的含鞘磷脂纳米颗粒组合物中的总脂质中的摩尔百分率与DSPC在存在于参考纳米颗粒组合物中的总脂质中的摩尔百分率相同。在一些实施方案中，参考纳米颗粒组合物不包含鞘磷脂。
在一些实施方案中，与配制于参考纳米颗粒组合物中的核酸的表达水平相比，配制于本发明含鞘磷脂纳米颗粒组合物中的核酸分子的表达水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，核酸的表达水平经测量为由宿主细胞产生的核酸编码的RNA或蛋白质的量。在一些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞，诸如来自人类或非人类脊椎动物的细胞。
因此，根据本公开的纳米颗粒组合物可用于在宿主细胞或宿主受试者的组织中表达核酸分子(例如，DNA或RNA)的方法中，其中所述方法包括将核酸分子配制于根据本公开的含鞘磷脂纳米颗粒组合物内，以及将所述纳米颗粒组合物递送至宿主细胞或宿主受试者；并且其中所递送的核酸分子在宿主细胞中或在宿主受试者中表达。在一些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物细胞(诸如源自人类或非人类脊椎动物的细胞)。在一些实施方案中，宿主受试者为哺乳动物(诸如人类或非人类脊椎动物)。在一些实施方案中，递送纳米颗粒组合物可通过使纳米颗粒组合物在活体外与宿主细胞接触来执行。在一些实施方案中，递送纳米颗粒组合物可通过将纳米颗粒组合物活体内施用至宿主受试者来执行。在一些实施方案中，核酸编码RNA、肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码非mRNA的RNA。在一些实施方案中，核酸分子编码作为mRNA的RNA。在一些实施方案中，核酸分子为DNA。在一些实施方案中，核酸分子为RNA。在一些实施方案中，所递送的核酸分子为mRNA。
因此，在本公开的一相关方面，本文提供用于表达核酸分子的方法，其中所述方法包括将核酸分子配制于根据本公开的含鞘磷脂纳米颗粒组合物内，以及将纳米颗粒组合物递送至宿主细胞，并且其中所递送的核酸分子在宿主细胞中表达。在一些实施方案中，分离宿主细胞并且通过在活体外在合适条件下使纳米颗粒组合物与宿主细胞接触来执行递送，其中核酸分子由宿主细胞表达。在一些实施方案中，宿主细胞处于受试者中的其原生环境中，并且通过向受试者施用适量的纳米颗粒组合物来执行递送，其中核酸分子在受试者的宿主细胞中表达。在一些实施方案中，核酸分子编码RNA、肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码非mRNA的RNA。在一些实施方案中，核酸分子编码作为mRNA的RNA。在一些实施方案中，核酸分子为DNA。在一些实施方案中，核酸分子为RNA。在一些实施方案中，核酸分子为mRNA。
根据本公开，本文所述的纳米颗粒组合物可包含至少一种脂质组分和一种或多种额外组分，诸如治疗剂和/或预防剂(例如，本文所述的治疗性核酸)。可针对一种或多种特定应用或标靶来设计纳米颗粒组合物。纳米颗粒组合物的成分可基于特定应用或标靶，和/或基于一种或多种成分的功效、毒性、费用、易用性、可用性或其它特征来选择。类似地，纳米颗粒组合物的特定配方可根据例如每种成分的特定组合的功效和毒性，针对特定应用或标靶来选择。
在一些实施方案中，在活体外，例如通过使宿主细胞与纳米颗粒组合物接触，或在活体内，例如通过将纳米颗粒组合物施用至含有宿主细胞的受试者，可将包封于纳米颗粒中的治疗剂和/或预防剂递送至宿主细胞。在一些实施方案中，在递送后，包封于纳米颗粒中的治疗性核酸分子可通过宿主细胞内源性转录和转译机构表达。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中的治疗剂:脂质比率(即N/P，其中N代表阳离子脂质的摩尔数并且P代表作为核酸主链的一部分存在的磷酸酯的摩尔数)介于2:1至30:1范围内，例如3:1至22:1。在一个实施方案中，N/P介于6:1至20:1或2:1至12:1范围内。例示性N/P范围包括约3:1、约6:1、约12:1和约22:1。
可针对一种或多种特定应用或标靶来设计纳米颗粒组合物。举例来说，纳米颗粒组合物可设计成用于将治疗剂和/或预防剂，诸如RNA递送至哺乳动物体内的特定细胞、组织、器官或系统或其群组。纳米颗粒组合物的物理化学特性可经改变以增加对特定身体标靶的选择性。举例来说，可基于不同器官的开窗大小来调整粒径。纳米颗粒组合物中所包含的治疗剂和/或预防剂还可基于一个或多个所需的递送标靶进行选择。举例来说，治疗剂和/或预防剂可针对特定适应症、疾患、疾病或病症和/或针对递送至特定细胞、组织、器官或系统或其群组(例如局部或特异性递送)进行选择。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物可包含编码感兴趣多肽的mRNA，其能够在细胞内转译以产生感兴趣多肽。此类组合物可设计成特异性递送至特定器官。在某些实施方案中，组合物可设计成特异性递送至哺乳动物肝脏。
纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂的量可取决于纳米颗粒组合物的大小、组成、期望标靶和/或应用，或其它特性，以及治疗剂和/或预防剂的特性。举例来说，可用于纳米颗粒组合物中的RNA的量可取决于RNA的大小、序列和其它特征。纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂和其它成分(例如脂质)的相对量还可变化。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物中脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可为约5:1至约60:1，诸如为约5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、22:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1和60:1。举例来说，脂质组分与治疗剂和/或预防剂的wt/wt比率可为约10:1至约40:1。在某些实施方案中，wt/wt比率为约20:1。纳米颗粒组合物中治疗剂和/或预防剂的量可例如使用吸收光谱法(例如紫外-可见光谱法)测量。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含一种或多种RNA，并且可选择一种或多种RNA、脂质和其量来提供特定N:P比。组合物的N:P比是指一种或多种脂质中的氮原子与RNA中磷酸酯基的数量的摩尔比。在一些实施方案中，选择较低的N:P比。可选择一种或多种RNA、脂质和其量以提供约2:1至约30:1，诸如2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、12:1、14:1、16:1、18:1、20:1、22:1、24:1、26:1、28:1或30:1的N:P比。在某些实施方案中，N:P比可为约2:1至约8:1。在其它实施方案中，N:P比为约5:1至约8:1。举例来说，N:P比可为约5.0:1、约5.5:1、约5.67:1、约6.0:1、约6.5:1或约7.0:1。举例来说，N:P比可为约5.67:1。
纳米颗粒组合物的物理特性可取决于其组分。举例来说，包含胆固醇作为结构脂质的纳米颗粒组合物可具有与包含不同结构脂质的纳米颗粒组合物不同的特征。类似地，纳米颗粒组合物的特征可取决于其组分的绝对或相对量。举例来说，包含较高摩尔分率的磷脂的纳米颗粒组合物可具有与包含较低摩尔分率的磷脂的纳米颗粒组合物不同的特征。特征还可根据纳米颗粒组合物的制备方法和条件而变化。
纳米颗粒组合物可通过多种方法表征。举例来说，可使用显微术(例如透射电子显微术或扫描电子显微术)来检查纳米颗粒组合物的形态和大小分布。可使用动态光散射或电位测定法(例如电位滴定法)来测量ζ电位。动态光散射还可用于确定粒径。还可使用仪器，诸如Zetasizer Nano ZS(Malvem Instruments Ltd,Malvem,Worcestershire,UK)来测量纳米颗粒组合物的多个特征，诸如粒径、多分散性指数和ζ电位。
在各个实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可在数十纳米至数百纳米之间。举例来说，平均大小可为约40nm至约150nm，诸如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约80nm至约90nm、或约90nm至约100nm。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物的平均大小可为约70nm至约100nm。在一些实施方案中，平均大小可为约80nm。在其它实施方案中，平均大小可为约100nm。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含多个纳米颗粒，并且所述多个纳米颗粒的平均大小为约40nm至约150nm。在一些实施方案中，所述多个颗粒的平均大小为约50nm至约100nm。在一些实施方案中，所述多个颗粒的平均大小为约95nm。
纳米颗粒组合物可为相对均质的。多分散性指数可用于指示纳米颗粒组合物的均质性，例如纳米颗粒组合物的粒径分布。较小(例如小于0.3)的多分散性指数一般指示较窄的粒径分布。纳米颗粒组合物的多分散性指数可为约0至约0.25，诸如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的多分散性指数可为约0.10至约0.20。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含多个纳米颗粒，并且纳米颗粒组合物的多分散性指数(PDI)为约0至约0.25。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的PDI小于0.1。
纳米颗粒组合物的ζ电位可用于指示组合物的动电位。举例来说，ζ电位可描述纳米颗粒组合物的表面电荷。具有相对较低正或负电荷的纳米颗粒组合物一般是期望的，这是因为带较高电荷的物质可与体内的细胞、组织和其它成分发生不期望的相互作用。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的ζ电位可为约-10mV至约+20mV、约-10mV至约+15mV、约-10mV至约+10mV、约-10mV至约+5mV、约-10mV至约0mV、约-10mV至约-5mV、约-5mV至约+20mV、约-5mV至约+15mV、约-5mV至约+10mV、约-5mV至约+5mV、约-5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。
治疗剂和/或预防剂的包封效率描述相对于所提供的初始量，在制备后经纳米颗粒组合物包封或以其它方式与纳米颗粒组合物缔合的治疗剂和/或预防剂的量。包封效率期望较高(例如接近100％)。包封效率可例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或清洁剂破坏纳米颗粒组合物之前与之后含有纳米颗粒组合物的溶液中治疗剂和/或预防剂的量来测量。荧光可用于测量溶液中游离治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的量。对于本文所述的纳米颗粒组合物，治疗剂和/或预防剂的包封效率可为至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可为至少80％。在某些实施方案中，包封效率可为至少90％。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含核酸作为治疗剂，并且所述核酸的包封效率为至少约50％。在一些实施方案中，所述核酸的包封效率为至少约80％。在一些实施方案中，所述核酸的包封效率为至少约90％。
纳米颗粒组合物可任选地包含一种或多种包衣。举例来说，可将纳米颗粒组合物配制成具有包衣的胶囊、膜片或片剂。包含本文所述组合物的胶囊、膜片或片剂可具有任何有用的大小、抗拉强度、硬度或密度。
5.3.2阳离子脂质
在一个实施方案中，本文所述的含鞘磷脂组合物、纳米颗粒组合物或纳米颗粒中所含的阳离子脂质为国际专利公布第WO2021204175号中描述的阳离子脂质，该案的全文以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，阳离子脂质为式(01-I)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1和G2各自独立地为键、C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中所述亚烷基或亚烯基中的一个或多个-CH2-任选地经-O-置换；
L1为-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-(C6-C10亚芳基)-R1、-(6元至10元亚杂芳基)-R1或R1；
L2为-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-(C6-C10亚芳基)-R2、-(6元至10元亚杂芳基)-R2或R2；
R1和R2各自独立地为C6-C32烷基或C6-C32烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地为H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地为C1-C32烷基或C2-C32烯基；
G3为C2-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基；
R3为-N(R4)R5；
R4为C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、4元至8元杂环基或C6-C10芳基；或R4、G3或G3的一部分与其所连接的氮一起形成环状部分；
R5为C1-C12烷基或C3-C8环烷基；或R4、R5与其所连接的氮一起形成环状部分；
x为0、1或2；并且
其中各烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基、亚环烯基、亚芳基、亚杂芳基和环状部分独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，阳离子脂质为式(01-II)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
为单键或双键；
G1和G2各自独立地为键、C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中所述亚烷基或亚烯基中的一个或多个-CH2-任选地经-O-置换；
L1为-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-(C6-C10亚芳基)-R1、-(6元至10元亚杂芳基)-R1或R1；
L2为-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-(C6-C10亚芳基)-R2、-(6元至10元亚杂芳基)-R2或R2；
R1和R2各自独立地为C6-C32烷基或C6-C32烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地为H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地为C1-C32烷基或C2-C32烯基；
G4为键、C1-C23亚烷基、C2-C23亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基；
R3为-N(R4)R5；
R4为C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、4元至8元杂环基或C6-C10芳基；或R4、G3或G3的一部分与其所连接的氮一起形成环状部分；
R5为C1-C12烷基或C3-C8环烷基；或R4、R5与其所连接的氮一起形成环状部分；
x为0、1或2；并且
其中各烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基、亚环烯基、亚芳基、亚杂芳基和环状部分独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，所述化合物为式(01-I-B)、(01-I-B’)、(01-I-B”)、(01-I-C)、(01-I-D)或(01-I-E)的化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
在一个实施方案中，G1和G2各自独立地为C3-C7亚烷基。在一个实施方案中，G1和G2各自独立地为C5亚烷基。在一个实施方案中，G3为C2-C4亚烷基。在一个实施方案中，G3为C2亚烷基。在一个实施方案中，G3为C4亚烷基。
在一个实施方案中，R3具有以下结构中的一种：
在一个实施方案中，R1、R2、Rc和Rf各自独立地为支链C6-C32烷基或支链C6-C32烯基。在一个实施方案中，R1、R2、Rc和Rf各自独立地为支链C6-C24烷基或支链C6-C24烯基。在一个实施方案中，R1、R2、Rc和Rf各自独立地为-R7-CH(R8)(R9)，其中R7为C0-C5亚烷基，并且R8和R9独立地为C2-C10烷基。在一个实施方案中，R1、R2、Rc和Rf各自独立地为-R7-CH(R8)(R9)，其中R7为C0-C1亚烷基，并且R8和R9独立地为C4-C8烷基。
在一个实施方案中，所述化合物为表1中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
表1.
在一个实施方案中，本文所提供的含鞘磷脂组合物、纳米颗粒组合物或纳米颗粒中所含的阳离子脂质为国际专利申请第PCT/CN2022/072694号中描述的阳离子脂质，该案的全文以引用的方式并入本文中。在一个实施方案中，阳离子脂质为式(02-I)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1和G2各自独立地为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中G1和G2中的一个或多个-CH2-任选地经-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-置换；
各L1独立地为-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-NRaP(＝O)(ORb)(ORc)；
各L2独立地为-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-NRdP(＝O)(ORe)(ORf)；
R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地为H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地为C1-C24烷基或C2-C24烯基；
G3为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中亚烷基或亚烯基的一部分或全部任选地经C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基置换；
R3为-N(R4)R5、-OR6或-SR6；
R4为C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4元至8元杂环烷基；
R5为H、C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4元至8元杂环烷基；
R6为氢、C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基或C6-C10芳基；
x为0、1或2；并且
其中各烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基和亚环烯基独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，阳离子脂质为式(02-II)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1和G2各自独立地为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中G1和G2中的一个或多个-CH2-任选地经-O-、-C(＝O)O-或-OC(＝O)-置换；
各L1独立地为-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-NRaP(＝O)(ORb)(ORc)；
各L2独立地为-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-NRdP(＝O)(ORe)(ORf)；
R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地为H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地为C1-C24烷基或C2-C24烯基；
G3为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中亚烷基或亚烯基的一部分或全部任选地经C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基置换；
R3为-N(R4)R5、-OR6或-SR6；
R4为C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4元至8元杂环烷基；
R5为H、C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4元至8元杂环烷基；
R6为氢、C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基或C6-C10芳基；
x为0、1或2；并且
其中各烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基和亚环烯基独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，所述化合物为式(02-V-A)、(02-V-B)、(02-V-C)、(02-V-D)、(02-V-E)、(02-V-F)的化合物：
其中z为2至12的整数，
x0为1至11的整数；
y0为1至11的整数；
x1为0至9的整数；
y1为0至9的整数；
x2为2至5的整数；
x3为1至5的整数；
x4为0至3的整数；
y2为2至5的整数；
y3为1至5的整数；并且
y4为0至3的整数；
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
在一个实施方案中，z为2至6的整数。在一个实施方案中，z为2、4或5。在一个实施方案中，x0和y0独立地为2至6。在一个实施方案中，x0和y0独立地为4或5。在一个实施方案中，x1和y1独立地为2至6。在一个实施方案中，x1和y1独立地为4或5。在一个实施方案中，x2和y2独立地为2至5的整数。在一个实施方案中，x2和y2独立地为3或5。在一个实施方案中，x3和y3均为1。在一个实施方案中，x4和y4独立地为0或1。
在一个实施方案中，各L1独立地为-OR1、-OC(＝O)R1或-C(＝O)OR1，并且各L2独立地为-OR2、-OC(＝O)R2或-C(＝O)OR2。在一个实施方案中，R1和R2独立地为直链C6-C10烷基或-R7-CH(R8)(R9)，其中R7为C0-C5亚烷基，并且R8和R9独立地为C2-C10烷基或C2-C10烯基。
在一个实施方案中，所述化合物为式(02-VI-A)、(02-VI-B)、(02-VI-C)、(02-VI-D)、(02-VI-E)或(02-VI-F)的化合物：
其中z为2至12的整数；
y为2至12的整数；
x0为1至11的整数；
x1为0至9的整数；
x2为2至5的整数；
x3为1至5的整数；并且
x4为0至3的整数；
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
在一个实施方案中，z为2至6的整数。在一个实施方案中，z为2、4或5。在一个实施方案中，x0为4或5。在一个实施方案中，x1为4或5。在一个实施方案中，x2为2至5的整数。在一个实施方案中，x2为3或5。在一个实施方案中，x3为0或1。在一个实施方案中，y为2至6的整数。在一个实施方案中，y为5。
在一个实施方案中，各L1独立地为-OR1、-OC(＝O)R1或-C(＝O)OR1，并且L2为-OC(＝O)R2或-C(＝O)OR2、-NRdC(＝O)R2或-C(＝O)NReRf。在一个实施方案中，R1为直链C6-C10烷基或-R7-CH(R8)(R9)，其中R7为C0-C5亚烷基，并且R8和R9独立地为C2-C10烷基或C2-C10烯基。在一个实施方案中，R2和Rf各自独立地为直链C6-C18烷基、C6-C18烯基或-R7-CH(R8)(R9)，其中R7为C0-C5亚烷基，并且R8和R9独立地为C2-C10烷基或C2-C10烯基。在一个实施方案中，Rd和Re各自独立地为H。
在一个实施方案中，所述化合物为表2中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
表2.
/>
在一个实施方案中，本文所述的含鞘磷脂组合物、纳米颗粒组合物或纳米颗粒中所含的阳离子脂质为国际专利公布第WO2022152109号中描述的阳离子脂质，该案的全文以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，阳离子脂质为式(03-I)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1和G2各自独立地为键、C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中G1和G2中的一个或多个-CH2-任选地经-O-置换；
各L1独立地为-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-NRaP(＝O)(ORb)(ORc)、-(C6-C10亚芳基)-R1、-(6元至10元亚杂芳基)-R1、-(4元至8元亚杂环基)-R1或R1；
各L2独立地为-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-NRdP(＝O)(ORe)(ORf)、-(C6-C10亚芳基)-R2、-(6元至10元亚杂芳基)-R2、-(4元至8元亚杂环基)-R2或R2；
R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地为H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地为C1-C24烷基或C2-C24烯基；
G3为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基，其中亚烷基或亚烯基的一部分或全部任选地经C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基、C3-C8亚环炔基、4元至8元亚杂环基、C6-C10亚芳基或5元至10元亚杂芳基置换；
R3为氢、C1-C12烷基、C2-C12烯基、C2-C12炔基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C3-C8环炔基、4元至8元杂环基、C6-C10芳基或5元至10元杂芳基；或R3、G1或G1的一部分与其所连接的氮一起形成环状部分；或R3、G3或G3的一部分与其所连接的氮一起形成环状部分；
R4为C1-C12烷基或C3-C8环烷基；
x为0、1或2；
n为1或2；
m为1或2；并且
其中各烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基、杂环基、芳基、杂芳基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基、亚环烯基、亚环炔基、亚杂环基、亚芳基、亚杂芳基和环状部分独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，所述化合物为式(03-II-A)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
在一个实施方案中，所述化合物为式(03-II-B)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
在一个实施方案中，所述化合物为式(03-II-C)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
在一个实施方案中，所述化合物为式(03-II-D)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
在一个实施方案中，G1和G2各自独立地为C2-C12亚烷基。在一个实施方案中，G1和G2各自独立地为C5亚烷基。在一个实施方案中，G3为C2-C6亚烷基。
在一个实施方案中，R3为C1-C12烷基、C2-C12烯基或C3-C8环烷基。在一个实施方案中，R3为C3-C8环烷基。在一个实施方案中，R3未经取代。在一个实施方案中，R4为经取代的C1-C12烷基。在一个实施方案中，R4为-CH2CH2OH。
在一个实施方案中，L1为-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-NRaC(＝O)R1或-C(＝O)NRbRc；并且L2为-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-NRdC(＝O)R2或-C(＝O)NReRf。在一个实施方案中，R1、R2、Rc和Rf各自独立地为直链C6-C18烷基、直链C6-C18烯基或-R7-CH(R8)(R9)，其中R7为C0-C5亚烷基，并且R8和R9独立地为C2-C10烷基或C2-C10烯基。在一个实施方案中，R1、R2、Rc和Rf各自独立地为直链C7-C15烷基、直链C7-C15烯基或-R7-CH(R8)(R9)，其中R7为C0-C1亚烷基，并且R8和R9独立地为C4-C8烷基或C6-C10烯基。在一个实施方案中，Ra、Rb、Rd和Re各自独立地为H。
在一个实施方案中，所述化合物为表3中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
表3.
在一个实施方案中，本文所提供的颗粒或组合物中所含的阳离子脂质为国际专利申请第PCT/CN2022/094227号中描述的阳离子脂质，该案的全文以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，阳离子脂质为式(04-I)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1和G2各自独立地为键、C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
L1为-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-OC(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)OR1、-SC(＝S)R1、-C(＝S)SR1、-C(＝S)R1、-CH(OH)R1、-P(＝O)(ORb)(ORc)、-(C6-C10亚芳基)-R1、-(6元至10元亚杂芳基)-R1或R1；
L2为-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-OC(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2、-SC(＝S)R2、-C(＝S)SR2、-C(＝S)R2、-CH(OH)R2、-P(＝O)(ORe)(ORf)、-(C6-C10亚芳基)-R2、-(6元至10元亚杂芳基)-R2或R2；
R1和R2各自独立地为C5-C32烷基或C5-C32烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地为H、C1-C24烷基或C2-C24烯基；
Rc和Rf各自独立地为C1-C32烷基或C2-C32烯基；
R0为C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4元至8元杂环烷基；
G3为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
R4为C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4元至8元杂环烷基；
R5为C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4元至8元杂环烷基；
x为0、1或2；
s为0或1；并且
其中各烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、亚烷基、亚烯基、亚芳基和亚杂芳基独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，阳离子脂质为式(04-III)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
R1和R2各自独立地为C5-C32烷基或C5-C32烯基；
R0为C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4元至8元杂环烷基；
G3为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G4为C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
R3为-N(R4)R5或-OR6；
R4为C1-C12烷基、C2-C12烯基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4元至8元杂环烷基；
R5为C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基、C6-C10芳基或4元至8元杂环烷基；或R4、R5与其所连接的氮一起形成环状部分；
R6为氢、C1-C12烷基、C3-C8环烷基、C3-C8环烯基或C6-C10芳基；并且
其中各烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环烷基、芳基、亚烷基、亚烯基和环状部分独立地任选地经取代。
在一个实施方案中，所述化合物为式(04-IV)化合物：
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
在一个实施方案中，G3为C2-C4亚烷基。在一个实施方案中，G4为C2-C4亚烷基。
在一个实施方案中，R0为C1-C6烷基。在一个实施方案中，R3为-OH。在一个实施方案中，R3为-N(R4)R5。在一个实施方案中，R4为C3-C8环烷基。在一个实施方案中，R4未经取代。在一个实施方案中，R5为-CH2CH2OH。
在一个实施方案中，L1为-OC(＝O)R1、-C(＝O)OR1、-C(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc或R1；并且L2为-OC(＝O)R2、-C(＝O)OR2、-C(＝O)R2、-C(＝O)NReRf或R2。在一个实施方案中，R1和R2各自独立地为支链C6-C24烷基或支链C6-C24烯基。在一个实施方案中，R1和R2各自独立地为-R7-CH(R8)(R9)，其中R7为C1-C5亚烷基，并且R8和R9独立地为C2-C10烷基或C2-C10烯基。在一个实施方案中，R1为直链C6-C24烷基并且R2为支链C6-C24烷基。在一个实施方案中，R1为直链C6-C24烷基并且R2为-R7-CH(R8)(R9)，其中R7为C1-C5亚烷基，并且R8和R9独立地为C2-C10烷基。
在一个实施方案中，所述化合物为表4中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
表4.
在一个实施方案中，本文所提供的颗粒或组合物中所含的阳离子脂质为美国专利第US10442756B2号、第US9868691B2号和第US9868692B2号中描述的阳离子脂质，这些专利的完整教示内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，阳离子脂质为式(05-I)化合物：
或其盐或异构体，其中
l选自1、2、3、4和5；
m选自5、6、7、8和9；
M1为键或M’；
R4为未经取代的C1-3烷基或-(CH2)nQ，其中Q为OH、-NHC(S)N(R)2、-NHC(O)N(R)2、-N(R)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(R)R8、-NHC(＝NR9)N(R)2、-NHC(＝CHR9)N(R)2、-OC(O)N(R)2、-N(R)C(O)OR、-N(OR)C(O)R、-N(OR)S(O)2R、-N(OR)C(O)OR、-N(OR)C(O)N(R)2、-N(OR)C(S)N(R)2、-N(OR)C(＝NR9)N(R)2、-N(OR)C(＝CHR9)N(R)2或杂芳基，并且各n选自1、2、3、4或5；
M和M’独立地选自-C(O)O-、-OC(O)-、-C(O)N(R’)-、-P(O)(OR’)O-、-S-S-、芳基和杂芳基；并且
R2和R3均为C1-14烷基或C2-14烯基，
R8选自由C3-6碳环和杂环组成的组；
R9选自由H、CN、NO2、C1-6烷基、-OR、-S(O)2R、-S(O)2N(R)2、C2-6烯基、C3-6碳环和杂环组成的组；
各R独立地选自由C1-3烷基、C2-3烯基和H组成的组；并且
R’为直链烷基。
在一个实施方案中，所述化合物为SM102或Lipid 5：
在一个实施方案中，本文所提供的颗粒或组合物中所含的阳离子脂质为美国专利第US10166298B2号中描述的阳离子脂质，该专利的完整教示内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施方案中，阳离子脂质为式(06-I)化合物：
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2中的一者为-O(C═O)-、-(C═O)O-、-C(═O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(═O)S-、SC(═O)-、-NRaC(═O)-、-C(═O)NRa-、NRaC(═O)NRa-、-OC(═O)NRa-或-NRaC(═O)O-，并且L1或L2中的另一者为-O(C═O)-、-(C═O)O-、-C(═O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(═O)S-、SC(═O)-、-NRaC(═O)-、-C(═O)NRa-、NRaC(═O)NRa-、-OC(═O)NRa-或-NRaC(═O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地为未经取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3为C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra为H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地为C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3为H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4为C1-C12烷基；
R5为H或C1-C6烷基；并且
x为0、1或2。
在一个实施方案中，所述化合物为表5中的化合物，或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体。
表5.
应理解，如上所陈述的本文所提供的化合物的任何实施方案，以及如上所陈述的本文所提供的化合物的任何特定取代基和/或变量可独立地与化合物的其它实施方案和/或取代基和/或变量组合以形成以上未具体陈述的实施方案。此外，在列出任何特定基团或变量的取代基和/或变量的列表的情况下，应理解，可从特定实施方案和/或技术方案中删除每一个别取代基和/或变量，并且其余的取代基和/或变量列表将被认为在本文所提供的实施方案的范围内。
应理解，在本说明书中，所描绘各式的取代基和/或变量的组合仅在此类贡献产生稳定化合物时才为容许的。
5.3.3其它可离子化脂质
在一个实施方案中，本文所提供的含鞘磷脂组合物、纳米颗粒组合物或纳米颗粒包含一种或多种带电或可离子化脂质。这些带电或可离子化脂质可置换本文所述的阳离子脂质或与本文所述的阳离子脂质一起包含在内。不受理论束缚，预期纳米颗粒组合物的某些带电或两性离子脂质组分类似于细胞膜中的脂质组分，由此可改善纳米颗粒的细胞摄取。可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的例示性带电或可离子化脂质包括但不限于3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基)-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))、(2S)-2-({8-[(3β)-胆固-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z-,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))、(12Z,15Z)-N,N-二甲基-2-壬基二十一碳-12,15-二烯-1-胺、N,N-二甲基-1-{(1S,2R)-2-辛基环丙基}十七烷-8-胺。可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的额外例示性带电或可离子化脂质包括Sabnis等人，“ANovel Amino Lipid Series for mRNA Delivery:Improved Endosomal Escape andSustained Pharmacology and Safety in Non-human Primates”,Molecular Therapy，第26卷，第6期，2018年中所述的脂质(例如Lipid 5)，该文献的全文以引用的方式并入本文中。可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的额外例示性带电或可离子化脂质包括WO2010053572A9、WO2013016058A1、WO2013086373A、WO2013149140A1、WO2015184256A2、WO2015199952A1、WO2017180917A2、WO2017049245、WO2018107026A1、WO2019036008A1、WO2020061367A1、WO2020146805A1、WO2020072324A1、WO2020002525A1、US8722082B2、US9687550、US10077232B2、US10059655、US10639279B2、US20160317458A1、US20160376224A1、US20160151284A1、US20160244761A1、US20180169268A1、US2019151461A1、US20200308111A1、US20200308111A1和US20200331841A1中的任一者中描述的脂质，这些文献中的每一者的内容均以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，适合的阳离子脂质包括氯化N-[1-(2,3-二油基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)；氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP)；1,2-二油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)；1,2-二月桂酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DLEPC)；1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)；1,2-二肉豆蔻油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14:1)；N1-[2-((1S)-1-[(3-氨基丙基)氨基]-4-[二(3-氨基-丙基)氨基]丁基甲酰胺基)乙基]-3,4-二[油基氧基]-苯甲酰胺(MVL5)；双十八烷基酰胺基-甘氨酰基精四胺(DOGS)；3b-[N-(N’,N’-二甲基氨基乙基)氨甲酰基]胆固醇(DC-Chol)；溴化双十八烷基二甲基铵(DDAB)；SAINT-2,N-甲基-4-(二油基)甲基吡啶鎓；溴化1,2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-二甲基羟乙基铵(DMRIE)；溴化1,2-二油酰基-3-二甲基-羟乙基铵(DORIE)；氯化1,2-二油酰基氧基丙基-3-二甲基羟乙基铵(DORI)；二烷基化氨基酸(DILA2)(例如C18:1-norArg-C16)；氯化二油基二甲基铵(DODAC)；1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(POEPC)；1,2-二肉豆蔻油酰基-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(MOEPC)；二油酸(R)-5-(二甲基氨基)戊烷-1,2-二基酯盐酸盐(DODAPen-Cl)；二油酸(R)-5-胍基戊烷-1,2-二基酯盐酸盐(DOPen-G)；以及氯化(R)-N,N,N-三甲基-4,5-双(油酰基氧基)戊-1-胺鎓盐(DOTAPen)。具有在生理pH值下带电的头基的阳离子脂质也是适合的，诸如伯胺(例如DODAG N’,N’-双十八烷基-N-4,8-二氮杂-10-氨基癸酰基甘氨酰胺)和胍鎓头基(例如双-胍鎓-精三胺-胆固醇(BGSC)、双-胍鎓-tren-胆固醇(BGTC)、PONA和二油酸(R)-5-胍基戊烷-1,2-二基酯盐酸盐(DOPen-G))。另一适合的阳离子脂质是二油酸(R)-5-(二甲基氨基)戊烷-1,2-二基酯盐酸盐(DODAPen-Cl)。在某些实施方案中，阳离子脂质是特定对映异构体或外消旋形式，并且包括上述阳离子脂质的各种盐形式(例如氯化物或硫酸盐)。举例来说，在一些实施方案中，阳离子脂质是氯化N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP-Cl)或硫酸N-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTAP-硫酸盐)。在一些实施方案中，阳离子脂质是可离子化阳离子脂质，例如溴化双十八烷基二甲基铵(DDAB)；1,2-二亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)；2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)；4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)；1,2-二油酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODAP)；1,2-二油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DODMA)；以及吗啉基胆固醇(Mo-CHOL)。在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含两种或更多种阳离子脂质(例如两种或更多种上述阳离子脂质)的组合。
此外，在一些实施方案中，可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的带电或可离子化脂质是包含环状氨基的脂质。适于本文所公开的制剂和方法的额外阳离子脂质包括WO2015199952、WO2016176330和WO2015011633中所述的那些阳离子脂质，各案的全部内容以引用的方式整体并入本文中。此外，在一些实施方案中，可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的带电或可离子化脂质是包含环状氨基的脂质。适于本文所公开的制剂和方法的额外阳离子脂质包括WO2015199952、WO2016176330和WO2015011633中所述的那些阳离子脂质，各案的全部内容以引用的方式整体并入本文中。
5.3.4聚合物结合的脂质
在一些实施方案中，本文所提供的含鞘磷脂组合物、纳米颗粒组合物或纳米颗粒的脂质组分可包含一种或多种聚合物结合的脂质，诸如聚乙二醇化脂质(PEG脂质)。不受理论束缚，预期纳米颗粒组合物中的聚合物结合的脂质组分可改善胶体稳定性和/或减少纳米颗粒的蛋白质吸收。可与本公开结合使用的例示性聚合物结合的脂质包括但不限于PEG改性的磷脂酰乙醇胺、PEG改性的磷脂酸、PEG改性的神经酰胺、PEG改性的二烷基胺、PEG改性的二酰基甘油、PEG改性的二烷基甘油和其混合物。举例来说，PEG脂质可为PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC、PEG-DSPE、神经酰胺-PEG2000或Chol-PEG2000。
在一个实施方案中，聚合物结合的脂质是聚乙二醇化脂质。举例来说，一些实施方案包括聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)，诸如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)；聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)；PEG琥珀酸酯二酰基甘油(PEG-S-DAG)，诸如4-O-(2’,3’-二(十四烷酰氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)；聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)；或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯，诸如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基)(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
在一个实施方案中，聚合物结合的脂质以在1.0摩尔％至2.5摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质以约1.7摩尔％的浓度存在。在一个实施方案中，聚合物结合的脂质以约1.5摩尔％的浓度存在。
在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约35:1至约25:1范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100:1至约20:1范围内。
在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约35:1至约25:1范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与聚合物结合的脂质的摩尔比在约100:1至约20:1范围内。
在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式：
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地为含有10至30个碳原子的直链或支链饱和或不饱和烷基链，其中所述烷基链任选地间杂有一个或多个酯键；并且
w具有介于30至60范围内的平均值。
在一个实施方案中，R12和R13各自独立地为含有12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在其它实施方案中，平均w介于42至55范围内，例如，平均w为42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。在一些特定实施方案中，平均w为约49。
在一个实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式：
其中平均w为约49。
5.3.5结构脂质
在一些实施方案中，本文所提供的含鞘磷脂组合物、纳米颗粒组合物或纳米颗粒的脂质组分可包含一种或多种结构脂质。不受理论束缚，预期结构脂质可使纳米颗粒的两亲结构，诸如但不限于纳米颗粒的脂质双层结构稳定。可与本公开结合使用的例示性结构脂质包括但不限于胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜子固醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚和其混合物。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(诸如泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松(dexamethasone)、泼尼松(prednisone)和氢化可的松(hydrocortisone))或其组合。
在一个实施方案中，本文所提供的脂质纳米颗粒包含类固醇或类固醇类似物。在一个实施方案中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在一个实施方案中，类固醇以在39摩尔％至49摩尔％、40摩尔％至46摩尔％、40摩尔％至44摩尔％、40摩尔％至42摩尔％、42摩尔％至44摩尔％或44摩尔％至46摩尔％范围内的浓度存在。在一个实施方案中，类固醇以40摩尔％、41摩尔％、42摩尔％、43摩尔％、44摩尔％、45摩尔％或46摩尔％的浓度存在。
在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0:0.9至1.0:1.2、或1.0:1.0至1.0:1.2范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5:1至1:1范围内。在一个实施方案中，类固醇以在32摩尔％至40摩尔％类固醇范围内的浓度存在。
在一个实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0:0.9至1.0:1.2、或1.0:1.0至1.0:1.2范围内。在一个实施方案中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5:1至1:1范围内。在一个实施方案中，类固醇以在32摩尔％至40摩尔％类固醇范围内的浓度存在。
5.3.6磷脂
在一些实施方案中，本文所提供的含鞘磷脂组合物、纳米颗粒组合物或纳米颗粒的脂质组分可包含一种或多种磷脂，诸如一种或多种(聚)不饱和脂质。不受理论束缚，预期磷脂可组装成一个或多个脂质双层结构。可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的例示性磷脂包括但不限于1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二(十一烷酰基)-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-外消旋-(1-甘油)钠盐(DOPG)和鞘磷脂。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包含DSPC。在某些实施方案中，纳米颗粒组合物包含DOPE。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含DSPC和DOPE二者。
额外例示性中性脂质包括例如二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰基磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰基-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、1-硬脂酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一个实施方案中，中性脂质为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。在一个实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。
在一个实施方案中，中性脂质是磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酸(PA)或磷脂酰甘油(PG)。
此外，可形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的磷脂还包括WO2017/112865中所述的那些磷脂，该案的全部内容以引用的方式整体并入本文中。
5.3.7治疗性有效负载
根据本公开，本文所提供的含鞘磷脂组合物、纳米颗粒组合物或纳米颗粒还可包含一种或多种治疗剂和/或预防剂。这些治疗剂和/或预防剂在本公开中有时称为“治疗性有效负载”或“有效负载”。在一些实施方案中，治疗性有效负载可在活体内或活体外，使用纳米颗粒作为递送媒介物施用。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含以下作为治疗性有效负载：小分子化合物(例如小分子药物)，诸如抗癌剂(例如长春新碱(vincristine)、多柔比星(doxorubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喜树碱(camptothecin)、顺铂(cisplatin)、博莱霉素(bleomycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氨蝶呤(methotrexate)和链脲佐菌素(streptozotocin))、抗肿瘤剂(例如放线菌素D(actinomycin D)、长春新碱、长春花碱(vinblastine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)、蒽环霉素(anthracyclines)、烷基化剂、铂类化合物、抗代谢物和核苷类似物，诸如甲氨蝶呤以及嘌呤和嘧啶类似物)、抗感染剂、局麻药(例如地布卡因(dibucaine)和氯丙嗪(chlorpromazine))、β-肾上腺素性阻断剂(例如普萘洛尔(propranolol)、噻吗洛尔(timolol)和拉贝洛尔(labetalol))、抗高血压剂(例如可尼丁(clonidine)和联胺肼(hydralazine))、抗抑郁剂(例如伊米帕明(imipramine)、阿米替林(amitriptyline)和多塞平(doxepin))、抗痉挛剂(例如苯妥英(phenytoin))、抗组胺剂(例如苯海拉明(diphenhydramine)、氯菲安明(chlorpheniramine)和普敏太定(promethazine))、抗生素/抗细菌剂(例如庆大霉素(gentamycin)、塞普沙辛(ciprofloxacin)和头孢西丁(cefoxitin))、抗真菌剂(例如咪康唑(miconazole)、特康唑(terconazole)、益康唑(econazole)、异康唑(isoconazole)、布康唑(butaconazole)、克氯霉唑(clotrimazole)、艾妥可那唑(itraconazole)、制霉菌素(nystatin)、萘替芬(naftifine)和两性霉素B(amphotericin B))、抗寄生虫剂、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经传递质拮抗剂、抗青光眼剂、维生素、麻醉剂和成像剂。
在一些实施方案中，治疗性有效负载包含细胞毒素、放射性离子、化学治疗剂、疫苗、引发免疫反应的化合物和/或另一治疗剂和/或预防剂。细胞毒素或细胞毒性剂包括可能对细胞有害的任何剂。实例包括但不限于紫杉醇(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasinB)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、依米丁(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、长春新碱、长春花碱、秋水仙碱(colchicine)、多柔比星、道诺霉素(daunorubicin)、二羟基蒽二酮(dihydroxyanthracinedione)、米托蒽醌、米拉霉素(mithramycin)、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因(procaine)、丁卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔、嘌呤霉素(puromycin)、美登素类化合物(maytansinoids)，例如美登醇(maytansinol)、拉奇霉素(rachelmycin)(CC-1065)以及其类似物或同系物。放射性离子包括但不限于碘(例如碘125或碘131)、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。
在其它实施方案中，本发明纳米颗粒组合物的治疗性有效负载可包括但不限于治疗剂和/或预防剂，诸如抗代谢物(例如甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶、达卡巴嗪(dacarbazine))、烷基化剂(例如氮芥(mechlorethamine)、噻替哌(thiotepa)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、拉奇霉素(CC-1065)、霉法兰(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(例如道诺霉素(先前称为柔红霉素(daunomycin))和多柔比星)、抗生素(例如放线菌素D(dactinomycin)(先前称为放线菌素)、博莱霉素、米拉霉素和安曲霉素(anthramycin)(AMC))和抗有丝分裂剂(例如长春新碱、长春花碱、紫杉醇和美登素类化合物)。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含诸如肽和多肽之类生物分子作为治疗性有效负载。形成本发明纳米颗粒组合物的一部分的生物分子可为天然来源或合成的。举例来说，在一些实施方案中，本发明纳米颗粒组合物的治疗性有效负载可包括但不限于庆大霉素、阿米卡星(amikacin)、胰岛素、红细胞生成素(EPO)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、因子VIR、促黄体激素释放激素(LHRH)类似物、干扰素、肝素、乙型肝炎表面抗原、伤寒疫苗、霍乱疫苗以及肽和多肽。
5.3.7.1核酸
在一些实施方案中，本发明纳米颗粒组合物包含一种或多种核酸分子(例如DNA或RNA分子)作为治疗性有效负载。可包含在本发明纳米颗粒组合物中作为治疗性有效负载的核酸分子的例示性形式包括但不限于以下一种或多种：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，包括信使mRNA(mRNA)、其杂交体、RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核糖酶、催化性DNA、诱导形成三螺旋的RNA、适体、载体等。在某些实施方案中，治疗性有效负载包含RNA。可包含在本发明纳米颗粒组合物中作为治疗性有效负载的RNA分子包括但不限于短聚体(shortmer)、agomir、antagomir、反义体(antisense)、核糖酶、小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微小RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、转移RNA(tRNA)、信使RNA(mRNA)和此项技术中已知的其它形式的RNA分子。在特定实施方案中，RNA是mRNA。
在其它实施方案中，纳米颗粒组合物包含siRNA分子作为治疗性有效负载。特定来说，在一些实施方案中，siRNA分子能够选择性干扰并下调感兴趣基因的表达。举例来说，在一些实施方案中，在向有需要的受试者施用包含siRNA的纳米颗粒组合物后，siRNA有效负载使与特定疾病、病症或疾患相关的基因选择性沉默。在一些实施方案中，siRNA分子包含与编码感兴趣蛋白质产物的mRNA序列互补的序列。在一些实施方案中，siRNA分子是免疫调节性siRNA。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含shRNA分子或编码shRNA分子的载体作为治疗性有效负载。特定来说，在一些实施方案中，治疗性有效负载在施用标靶细胞后，在标靶细胞内产生shRNA。与shRNA相关的构建体和机制是相关技术中熟知的。
在一些实施方案中，纳米颗粒组合物包含mRNA分子作为治疗性有效负载。特定来说，在一些实施方案中，所述mRNA分子编码感兴趣多肽，包括任何天然或非天然存在或以其它方式修饰的多肽。由mRNA编码的多肽可具有任何大小并且可具有任何二级结构或活性。在一些实施方案中，由mRNA有效负载编码的多肽当在细胞中表达时可具有治疗效应。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含mRNA分子。在特定实施方案中，核酸分子包含至少一个编码感兴趣肽或多肽的编码区(例如开放阅读框(ORF))。在一些实施方案中，核酸分子还包含至少一个非转译区(UTR)。在特定实施方案中，非转译区(UTR)位于编码区的上游(5’端)，并且在本文中称为5’-UTR。在特定实施方案中，非转译区(UTR)位于编码区的下游(3’端)，并且在本文中称为3’-UTR。在特定实施方案中，核酸分子包含5’-UTR和3’-UTR二者。在一些实施方案中，5’-UTR包含5’-帽结构。在一些实施方案中，核酸分子包含Kozak序列(例如在5’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含poly-A区(例如在3’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含聚腺苷酸化信号(例如在3’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含稳定区(例如在3’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含二级结构。在一些实施方案中，二级结构是茎-环。在一些实施方案中，核酸分子包含茎-环序列(例如在5’-UTR和/或3’-UTR中)。在一些实施方案中，核酸分子包含一个或多个能够在剪接过程中切除的内含子区。在特定实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自5’-UTR和编码区的区域。在特定实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自编码区和3’-UTR的区域。在特定实施方案中，核酸分子包含一个或多个选自5’-UTR、编码区和3’-UTR的区域。
编码区
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含至少一个编码区。在一些实施方案中，编码区是编码单一肽或蛋白质的开放阅读框(ORF)。在一些实施方案中，编码区包含至少两个ORF，每个ORF编码一种肽或蛋白质。在编码区包含多于一个ORF的实施方案中，编码的肽和/或蛋白质可彼此相同或不同。在一些实施方案中，编码区中的多个ORF经非编码序列隔开。在特定实施方案中，隔开两个ORF的非编码序列包含内部核糖体进入位点(IRES)。
不受理论束缚，预期内部核糖体进入位点(IRES)可用作唯一的核糖体结合位点，或充当mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有多于一个功能性核糖体结合位点的mRNA分子可编码若干肽或多肽，所述肽或多肽独立地由核糖体转译(例如多顺反子mRNA)。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)。可与本公开结合使用的IRES序列的实例包括但不限于来自小RNA病毒(例如FMDV)、瘟病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的那些IRES序列。
在各个实施方案中，本公开的核酸分子编码至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或多于10种肽或蛋白质。核酸分子编码的肽和蛋白质可相同或不同。在一些实施方案中，本公开的核酸分子编码二肽(例如肌肽和鹅肌肽)。在一些实施方案中，核酸分子编码三肽。在一些实施方案中，核酸分子编码四肽。在一些实施方案中，核酸分子编码五肽。在一些实施方案中，核酸分子编码六肽。在一些实施方案中，核酸分子编码七肽。在一些实施方案中，核酸分子编码八肽。在一些实施方案中，核酸分子编码九肽。在一些实施方案中，核酸分子编码十肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约15个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约50个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约100个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约150个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约300个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约500个氨基酸的肽或多肽。在一些实施方案中，核酸分子编码具有至少约1000个氨基酸的肽或多肽。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子的长度为至少约30个核苷酸(nt)。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约35nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约40nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约45nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约50nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约55nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约60nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约65nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约70nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约75nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约80nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约85nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约90nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约95nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约100nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约120nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约140nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约160nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约180nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约200nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约250nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约300nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约400nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约600nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约700nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约800nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约900nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1100nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1200nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1300nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1400nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1600nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1700nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1800nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约1900nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约2000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约2500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约3000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约3500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约4000nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约4500nt。在一些实施方案中，核酸分子的长度为至少约5000nt。
在特定实施方案中，治疗性有效负载包含如本文所述的疫苗组合物(例如基因疫苗)。在一些实施方案中，治疗性有效负载包含能够引发针对一种或多种标靶疾患或疾病的免疫的化合物。在一些实施方案中，标靶疾患与病原体感染相关或由病原体感染引起，所述病原体诸如为冠状病毒(例如2019-nCoV)、流感病毒、麻疹病毒、人乳头瘤病毒(HPV)、狂犬病病毒、脑膜炎病毒、百日咳病毒、破伤风病毒、鼠疫病毒、肝炎病毒和结核病病毒。在一些实施方案中，治疗性有效负载包含编码病原体特有的致病性蛋白质或其抗原片段或抗原决定基的核酸序列(例如mRNA)。疫苗在施用于接种疫苗的受试者后，允许表达编码的致病性蛋白质(或其抗原片段或抗原决定基)，由此在受试者体内引发针对病原体的免疫。
在一些实施方案中，标靶疾患与细胞的赘生性生长相关或由细胞的赘生性生长引起(诸如癌症)。在一些实施方案中，治疗性有效负载包含编码癌症特有的肿瘤相关抗原(TAA)或其抗原片段或抗原决定基的核酸序列(例如mRNA)。疫苗在施用于接种疫苗的受试者后，允许表达所编码的TAA(或其抗原片段或抗原决定基)，由此在受试者体内引发针对表达TAA的赘生性细胞的免疫。
5’-帽结构
不受理论束缚，预期聚核苷酸的5’-帽结构参与核输出并增加聚核苷酸稳定性，并且结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，CBP负责细胞中的聚核苷酸稳定性，并且通过CBP与poly-A结合蛋白缔合形成成熟环状mRNA物质来引起转译能力。5’-帽结构进一步有助于在mRNA剪接期间移除5’-近端内含子。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含5’-帽结构。
核酸分子可在5’端经细胞内源性转录机构加帽，由此在聚核苷酸的末端鸟苷帽残基与5’末端转录的有义核苷酸之间产生5’-ppp-5’-三磷酸键联。接着，该5’-鸟苷酸帽可经甲基化以产生N7-甲基-鸟苷酸残基。聚核苷酸5’端的末端和/或末端前(anteterminal)转录的核苷酸的核糖还可任选地经2’-O-甲基化。通过鸟苷酸帽结构水解和裂解进行的5’-脱帽可靶向核酸分子，例如mRNA分子以进行降解。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含对由内源过程产生的天然5'-帽结构的一种或多种改变。不受理论束缚，对5’-帽的修饰可增加聚核苷酸的稳定性，增加聚核苷酸的半衰期，并且可增加聚核苷酸的转译效率。
对天然5’-帽结构的例示性改变包括产生不可水解的帽结构，以防止脱帽，由此增加聚核苷酸的半衰期。在一些实施方案中，由于帽结构水解需要裂解5’-ppp-5’磷酸二酯键联，因此在一些实施方案中，可在加帽反应期间使用经修饰的核苷酸。举例来说，在一些实施方案中，可根据制造商的说明书，将来自New England Biolabs(Ipswich,Mass.)的牛痘病毒加帽酶(Vaccinia Capping Enzyme)用于α-硫代鸟苷核苷酸以在5’-ppp-5’帽中产生硫代磷酸酯键联。可使用额外经修饰的鸟苷核苷酸，诸如α-甲基膦酸和硒代磷酸核苷酸。
对天然5’-帽结构的额外例示性改变还包括在加帽的鸟苷三磷酸(GTP)的2’位和/或3’位的修饰、糖环氧(产生碳环的氧)替代为亚甲基部分(CH2)、在帽结构的三磷酸桥部分处的修饰或在核碱基(G)部分处的修饰。
对天然5’-帽结构的额外例示性改变包括但不限于聚核苷酸5’-末端和/或5’-末端前核苷酸的核糖在糖2’-羟基上的2’-O-甲基化(如上所述)。可使用多种不同的5’-帽结构产生聚核苷酸(诸如mRNA分子)的5’-帽。可与本公开结合使用的额外例示性5’-帽结构还包括国际专利公布第WO2008127688号、第WO 2008016473号和第WO 2011015347号中描述的那些5’-帽结构，各案的全部内容以引用的方式并入本文中。
在各个实施方案中，5’-末端帽可包括帽类似物。帽类似物在本文中又称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物、或者结构或功能性帽类似物，其化学结构不同于天然(即，内源性、野生型或生理性)5’-帽，同时保留帽功能。帽类似物可按化学方式(即，非酶方式)或酶方式合成和/或连接至聚核苷酸。
举例来说，抗反向帽类似物(ARCA)帽含有经5’-5’-三磷酸酯基团连接的两个鸟苷，其中一个鸟苷含有N7-甲基以及3’-O-甲基(即，N7,3’-O-二甲基-鸟苷-5’-三磷酸-5’-鸟苷，即m7G-3’mppp-G，其可等效地称为3’O-Me-m7G(5’)ppp(5’)G)。另一未改变的鸟苷的3’-O原子与加帽聚核苷酸(例如mRNA)的5’-末端核苷酸连接。N7-和3’-O-甲基化的鸟苷提供加帽聚核苷酸(例如mRNA)的末端部分。另一例示性帽结构为mCAP，其类似于ARCA，但在鸟苷上具有2’-O-甲基(即，N7,2’-O-二甲基-鸟苷-5’-三磷酸-5’-鸟苷，即m7Gm-ppp-G)。
在一些实施方案中，帽类似物可为二核苷酸帽类似物。作为非限制性实例，二核苷酸帽类似物可在不同磷酸酯位置处用硼烷磷酸酯基(boranophosphate)或硒代磷酸酯基(phophoroselenoate)进行修饰，诸如美国专利第8,519,110号中所述的二核苷酸帽类似物，该案的全部内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，帽类似物可为此项技术中已知和/或本文所述的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物。N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸帽类似物的非限制性实例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5’)ppp(5’)G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3’-OG(5’)ppp(5’)G帽类似物(参见例如Kore等人，Bioorganic&Medicinal Chemistry 2013 21:4570-4574中所述的各种帽类似物和合成帽类似物的方法；该文献的全部内容以引用的方式并入本文中)。在其它实施方案中，可与本公开的核酸分子结合使用的帽类似物是4-氯/溴苯氧基乙基类似物。
在各个实施方案中，帽类似物可包括鸟苷类似物。有用的鸟苷类似物包括但不限于肌苷、N1-甲基-鸟苷、2’-氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
不受理论束缚，预期尽管帽类似物允许在活体外转录反应中同时进行聚核苷酸的加帽，但高达20％的转录物仍未加帽。这种情况以及帽类似物与细胞内源转录机构产生的聚核苷酸的天然5’-帽结构的结构差异可能导致转译能力减弱和细胞稳定性降低。
因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子还可使用酶在转录后加帽，以便产生更真实(authentic)的5’-帽结构。如本文所用，短语“更真实”是指一种特征在结构上或功能上密切反映或模仿内源或野生型特征。即，与现有技术的合成特征或类似物相比，“更真实”的特征更好地代表内源性、野生型、天然或生理细胞功能和/或结构，或者其在一个或多个方面胜过对应内源性、野生型、天然或生理特征。可与本公开的核酸分子结合使用的更真实的5’-帽结构的非限制性实例为相较于此项技术中已知的合成5’-帽结构(或相较于野生型、天然或生理性5’-帽结构)，尤其具有增强的与帽结合蛋白的结合、增加的半衰期、降低的对5’-核酸内切酶的敏感性和/或减少的5’-脱帽的结构。举例来说，在一些实施方案中，重组牛痘病毒加帽酶和重组2’-O-甲基转移酶可在聚核苷酸的5’-末端核苷酸与鸟苷帽核苷酸之间产生经典的5’-5’-三磷酸酯键联，其中帽鸟苷含有N7-甲基化，并且聚核苷酸的5’-末端核苷酸含有2’-O-甲基。这种结构称为帽1结构。与例如此项技术中已知的其它5’帽类似物结构相比，这种帽引起更高的转译能力、细胞稳定性和减少的细胞促炎性细胞因子的活化。其它例示性帽结构包括7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p(帽0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp(帽1)、7mG(5’)-ppp(5’)NlmpN2mp(帽2)和m(7)Gpppm(3)(6,6,2’)Apm(2’)Apm(2’)Cpm(2)(3,2’)Up(帽4)。
不受理论束缚，预期本公开的核酸分子可在转录后加帽，并且由于这种方法较为高效，因此几乎100％的核酸分子可经加帽。
非转译区(UTR)
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含一个或多个非转译区(UTR)。在一些实施方案中，UTR位于核酸分子中编码区的上游，并且被称为5’-UTR。在一些实施方案中，UTR位于核酸分子中编码区的下游，并且被称为3’-UTR。UTR的序列可与核酸分子中所发现的编码区的序列同源或异源。多个UTR可包含在核酸分子中，并且可具有相同或不同的序列和/或基因起源。根据本公开，核酸分子中UTR的任何部分(包括没有任何部分)可经密码子优化，并且任何部分可在密码子优化之前和/或之后独立地含有一个或多个不同的结构或化学修饰。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含相对于彼此为同源的UTR和编码区。在其它实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含相对于彼此为异源的UTR和编码区。在一些实施方案中，为了监测UTR序列的活性，可在活体外(例如细胞或组织培养物)或在活体内(例如向受试者)施用包含UTR和可检测探针的编码序列的核酸分子，并且可使用此项技术中已知的方法测量UTR序列的效应(例如调节表达水平、编码产物的细胞定位或编码产物的半衰期)。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)的UTR包含至少一个转译增强子元件(TEE)，所述TEE起到增加由核酸分子产生的多肽或蛋白质的量的作用。在一些实施方案中，TEE位于核酸分子的5’-UTR中。在其它实施方案中，TEE位于核酸分子的3’-UTR处。在其它实施方案中，至少两个TEE分别位于核酸分子的5’-UTR和3’-UTR处。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)可包含一个或多个拷贝的TEE序列或包含多于一个不同的TEE序列。在一些实施方案中，存在于本公开的核酸分子中的不同TEE序列可相对于彼此为同源的或异源的。
各种TEE序列是此项技术中已知的，并且可与本公开结合使用。举例来说，在一些实施方案中，TEE可为内部核糖体进入位点(IRES)、HCV-IRES或IRES元件。Chappell等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101:9590-9594,2004；Zhou等人，Proc.Natl.Acad.Sci.102:6273-6278,2005。可与本公开结合使用的额外内部核糖体进入位点(IRES)包括但不限于美国专利第7,468,275号、美国专利公布第2007/0048776号和美国专利公布第2011/0124100号，以及国际专利公布第WO2007/025008号和国际专利公布第WO2001/055369号中所述的IRES，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，TEE可为Wellensiek等人，Genome-wide profiling of human cap-independent translation-enhancingelements,Nature Methods,2013年8月；10(8):747-750的补充表1和补充表2中所述的TEE；该文献的内容以引用的方式整体并入本文中。
可与本公开结合使用的额外例示性TEE包括但不限于美国专利第6,310,197号、美国专利第6,849,405号、美国专利第7,456,273号、美国专利第7,183,395号、美国专利公布第2009/0226470号、美国专利公布第2013/0177581号、美国专利公布第2007/0048776号、美国专利公布第2011/0124100号、美国专利公布第2009/0093049号、国际专利公布第WO2009/075886号、国际专利公布第WO2012/009644号和国际专利公布第WO1999/024595号、国际专利公布第WO2007/025008号、国际专利公布第WO2001/055371号、欧洲专利第2610341号、欧洲专利第2610340号中所述的TEE序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在各个实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含至少一个UTR，其包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个或超过60个TEE序列。在一些实施方案中，核酸分子UTR中的TEE序列是同一TEE序列的拷贝。在其它实施方案中，核酸分子UTR中的至少两个TEE序列具有不同的TEE序列。在一些实施方案中，多个不同的TEE序列以一种或多种重复模式布置于核酸分子的UTR区中。仅出于说明的目的，重复模式可为例如ABABAB、AABBAABBAABB、ABCABCABC等，其中在这些例示性模式中，每个大写字母(A、B或C)代表不同的TEE序列。在一些实施方案中，在核酸分子的UTR中，至少两个TEE序列彼此为连续的(即，其间无间隔子序列)。在其它实施方案中，至少两个TEE序列由间隔子序列隔开。在一些实施方案中，UTR可包含TEE序列-间隔子序列模块，所述模块在UTR中重复至少一次、至少两次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次、至少9次或多于9次。在本段所述的任何实施方案中，UTR可为核酸分子的5’-UTR、3’-UTR或5’-UTR和3’-UTR二者。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)的UTR包含至少一个转译抑制元件，所述元件起到减少由核酸分子产生的多肽或蛋白质的量的作用。在一些实施方案中，核酸分子的UTR包含由一种或多种微小RNA识别的一个或多个miR序列或其片段(例如miR种子序列(seed sequence))。在一些实施方案中，核酸分子的UTR包含下调核酸分子的转译活性的一个或多个茎-环结构。用于抑制与核酸分子相关的转译活性的其它机制是此项技术中已知的。在本段所述的任何实施方案中，UTR可为核酸分子的5’-UTR、3’-UTR或5’-UTR和3’-UTR二者。
聚腺苷酸化(Poly-A)区
在天然RNA加工过程中，通常将长链腺苷核苷酸(poly-A区)添加至信使RNA(mRNA)分子中以增加分子的稳定性。转录后，立即将转录物的3’端裂解以释放3’-羟基。接着，poly-A聚合酶将一连串腺苷核苷酸添加至RNA中。该过程称为聚腺苷酸化，添加一个长度在100与250个残基之间的poly-A区。不受理论束缚，预期poly-A区可赋予本公开的核酸分子多个优点。
因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含一个或多个聚腺苷酸化(poly-A)区。在一些实施方案中，poly-A区完全由腺嘌呤核苷酸或其功能性类似物构成。在一些实施方案中，核酸分子在其3’端包含至少一个poly-A区。在一些实施方案中，核酸分子在其5’端包含至少一个poly-A区。在一些实施方案中，核酸分子在其5’端包含至少一个poly-A区并且在其3’端包含至少一个poly-A区。
根据本公开，在不同实施方案中，poly-A区可具有不同长度。特定来说，在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少30个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少35个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少40个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少45个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少50个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少55个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少60个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少65个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少70个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少75个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少80个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少85个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少90个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少95个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少100个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少110个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少120个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少130个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少140个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少150个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少160个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少170个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少180个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少190个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少200个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少225个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少250个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少275个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少300个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少350个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少400个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少450个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少600个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少700个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少800个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少900个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少1000个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少1100个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少1200个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少1300个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少1400个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少1500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少1600个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少1700个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少1800个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少1900个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少2000个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少2250个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少2500个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少2750个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的核酸分子的poly-A区的长度为至少3000个核苷酸。
在一些实施方案中，核酸分子中poly-A区的长度可基于核酸分子的总长度或其一部分(诸如核酸分子的编码区的长度或开放阅读框的长度等)来选择。举例来说，在一些实施方案中，poly-A区占含有poly-A区的核酸分子的总长度的约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高百分比。
不受理论束缚，预期某些RNA结合蛋白可结合至位于mRNA分子3’端的poly-A区。这些poly-A结合蛋白(PABP)可调节mRNA表达，诸如与细胞中的转译起始机构相互作用和/或保护3’-poly-A尾免于降解。因此，在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含poly-A结合蛋白(PABP)的至少一个结合位点。在其它实施方案中，在将核酸分子装载至递送媒介物(例如脂质纳米颗粒)中之前，使其与PABP形成结合物或复合物。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含poly-A-G四联体。G四联体是可由DNA和RNA中富含G的序列形成的氢键结的四个鸟苷核苷酸的环状阵列。在该实施方案中，G四联体并入poly-A区的一端。可分析所得聚核苷酸(例如mRNA)的稳定性、蛋白质产量和其它参数，包括在不同时间点的半衰期。已发现，poly-A-G四联体结构导致蛋白质产量相当于单独使用120个核苷酸的poly-A区所观察到的蛋白质产量的至少75％。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)可包含poly-A区并且可通过添加3’-稳定区来稳定。在一些实施方案中，可用于使包含poly-A或poly-A-G四联体结构的核酸分子(例如mRNA)稳定的3’-稳定区描述于国际专利公布第WO2013/103659号中，该案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在其它实施方案中，可与本公开的核酸分子结合使用的3’-稳定区包括链终止核苷，诸如但不限于3’-脱氧腺苷(虫草素(cordycepin))；3’-脱氧尿苷；3’-脱氧胞嘧啶；3’-脱氧鸟苷；3’-脱氧胸腺嘧啶；2’,3’-双脱氧核苷，诸如2’,3’-双脱氧腺苷、2’,3’-双脱氧尿苷、2’,3’-双脱氧胞嘧啶、2’,3’-双脱氧鸟苷、2’,3’-双脱氧胸腺嘧啶；2’-脱氧核苷；或O-甲基核苷；3’-脱氧核苷；2’,3’-双脱氧核苷；3’-O-甲基核苷；3’-O-乙基核苷；3’-阿拉伯糖苷，以及此项技术中已知及/或本文所述的其它替代性核苷。
二级结构
不受理论束缚，预期茎-环结构可引导RNA折叠，保护核酸分子(例如mRNA)的结构稳定性，提供RNA结合蛋白的识别位点，并且用作酶反应的底物。举例来说，miR序列和/或TEE序列的并入将改变茎-环区的形状，由此可增加和/或减少转译(Kedde等人，A Pumilio-induced RNA structure switch in p27-3’UTR controls miR-221and miR-222accessibility.Nat Cell Biol.,2010年10月；12(10):1014-20，其内容以引用的方式整体并入本文中)。
因此，在一些实施方案中，本文所述的核酸分子(例如mRNA)或其一部分可呈茎-环结构，诸如但不限于组蛋白茎-环。在一些实施方案中，茎-环结构由长度为约25个或约26个核苷酸的茎-环序列形成，诸如但不限于国际专利公布第WO2013/103659号中所述的结构，该案的内容以引用的方式整体并入本文中。茎-环序列的额外实例包括国际专利公布第WO2012/019780号和国际专利公布第WO201502667号中所述的序列，各案的内容以引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，茎-环序列包含如本文所述的TEE。在一些实施方案中，茎-环序列包含如本文所述的miR序列。在特定实施方案中，茎-环序列可包括miR-122种子序列。在特定实施方案中，核酸分子包含国际专利公布第WO2021204175号中所述的两个茎-环序列，该案的全文以引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含位于核酸分子中编码区上游(在5’端)的茎-环序列。在一些实施方案中，茎-环序列位于核酸分子的5’-UTR内。在一些实施方案中，本公开的核酸分子(例如mRNA)包含位于核酸分子中编码区下游(在3’端)的茎-环序列。在一些实施方案中，茎-环序列位于核酸分子的3’-UTR内。在一些情况下，核酸分子可含有多于一个茎-环序列。在一些实施方案中，核酸分子在5’-UTR中包含至少一个茎-环序列并且在3’-UTR中包含至少一个茎-环序列。
在一些实施方案中，包含茎-环结构的核酸分子还包含稳定区。在一些实施方案中，稳定区包含至少一个链终止核苷，其起到减慢降解并由此增加核酸分子的半衰期的作用。可与本公开的核酸分子结合使用的例示性链终止核苷包括但不限于3’-脱氧腺苷(虫草素)；3’-脱氧尿苷；3’-脱氧胞嘧啶；3’-脱氧鸟苷；3’-脱氧胸腺嘧啶；2’,3’-双脱氧核苷，诸如2’,3’-双脱氧腺苷、2’,3’-双脱氧尿苷、2’,3’-双脱氧胞嘧啶、2’,3’-双脱氧鸟苷、2’,3’-双脱氧胸腺嘧啶；2’-脱氧核苷；或O-甲基核苷；3’-脱氧核苷；2’,3’-双脱氧核苷；3’-O-甲基核苷；3’-O-乙基核苷；3’-阿拉伯糖苷，以及此项技术中已知和/或本文所述的其它替代性核苷。在其它实施方案中，茎-环结构可通过改变聚核苷酸的3’-区域来稳定，所述改变可防止和/或抑制寡聚(U)的添加(国际专利公布第WO2013/103659号，其以引用的方式整体并入本文中)。
在一些实施方案中，本公开的核酸分子包含至少一个茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号。包含至少一个茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的聚核苷酸序列的非限制性实例包括国际专利公布第WO2013/120497号、国际专利公布第WO2013/120629号、国际专利公布第WO2013/120500号、国际专利公布第WO2013/120627号、国际专利公布第WO2013/120498号、国际专利公布第WO2013/120626号、国际专利公布第WO2013/120499号和国际专利公布第WO2013/120628号中所述的序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码病原体抗原或其片段，诸如国际专利公布第WO2013/120499号和国际专利公布第WO2013/120628号中所述的聚核苷酸序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码治疗性蛋白质，诸如国际专利公布第WO2013/120497号和国际专利公布第WO2013/120629号中所述的聚核苷酸序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码肿瘤抗原或其片段，诸如国际专利公布第WO2013/120500号和国际专利公布第WO2013/120627号中所述的聚核苷酸序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
在一些实施方案中，包含茎-环序列和poly-A区或聚腺苷酸化信号的核酸分子可编码致敏性抗原或自身免疫性自身抗原，诸如国际专利公布第WO2013/120498号和国际专利公布第WO2013/120626号中所述的聚核苷酸序列，各案的内容以引用的方式整体并入本文中。
功能性核苷酸类似物
在一些实施方案中，本文所述的有效负载核酸分子仅含有选自A(腺苷)、G(鸟苷)、C(胞嘧啶)、U(尿苷)和T(胸苷)的经典核苷酸。不受理论束缚，预期某些功能性核苷酸类似物可赋予核酸分子有用的特性。在本公开的上下文中，此类有用特性的实例包括但不限于核酸分子的稳定性增加、核酸分子在诱导先天免疫反应中的免疫原性降低、由核酸分子编码的蛋白质的产量增加、核酸分子的细胞内递送和/或保留增加，和/或核酸分子的细胞毒性降低等。
因此，在一些实施方案中，有效负载核酸分子包含至少一种如本文所述的功能性核苷酸类似物。在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有至少一个针对核碱基、糖基和/或磷酸酯基的化学修饰。因此，包含至少一种功能性核苷酸类似物的有效负载核酸分子含有至少一个针对核碱基、糖基和/或核苷间键联的化学修饰。本文提供对核酸分子的核碱基、糖基或核苷间键联的例示性化学修饰。
如本文所述，有效负载核酸分子中所有核苷酸的0％至100％范围的核苷酸可以为如本文所述的功能性核苷酸类似物。举例来说，在各个实施方案中，核酸分子中的所有核苷酸中约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约25％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的核苷酸是本文所述的功能性核苷酸类似物。在这些实施方案中的任一个中，功能性核苷酸类似物可存在于核酸分子的任何位置处，包括5’-末端、3’-末端和/或一个或多个内部位置。在一些实施方案中，单个核酸分子可含有不同的糖修饰、不同的核碱基修饰和/或不同类型的核苷间键联(例如主链结构)。
如本文所述，有效负载核酸分子中一种类型的所有核苷酸(例如作为一种类型的所有含嘌呤核苷酸、或作为一种类型的所有含嘧啶核苷酸、或作为一种类型的所有A、G、C、T或U)中范围从0％至100％的核苷酸可为本文所述的功能性核苷酸类似物。举例来说，在各个实施方案中，核酸分子中一种类型的核苷酸中约1％至约20％、约1％至约25％、约1％至约50％、约1％至约60％、约1％至约70％、约1％至约80％、约1％至约90％、约1％至约95％、约10％至约20％、约10％至约25％、约10％至约50％、约10％至约60％、约10％至约70％、约10％至约80％、约10％至约90％、约10％至约95％、约10％至约100％、约20％至约25％、约20％至约50％、约20％至约60％、约20％至约70％、约20％至约80％、约20％至约90％、约20％至约95％、约20％至约100％、约50％至约60％、约50％至约70％、约50％至约80％、约50％至约90％、约50％至约95％、约50％至约100％、约70％至约80％、约70％至约90％、约70％至约95％、约70％至约100％、约80％至约90％、约80％至约95％、约80％至约100％、约90％至约95％、约90％至约100％、或约95％至约100％的核苷酸是本文所述的功能性核苷酸类似物。在这些实施方案中的任一个中，功能性核苷酸类似物可存在于核酸分子的任何位置处，包括5’-末端、3’-末端和/或一个或多个内部位置。在一些实施方案中，单个核酸分子可含有不同的糖修饰、不同的核碱基修饰和/或不同类型的核苷间键联(例如主链结构)。
核碱基的修饰
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有非经典核碱基。在一些实施方案中，核苷酸中的经典核碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶)可经修饰或置换以提供一种或多种功能性核苷酸类似物。核碱基的例示性修饰包括但不限于一个或多个取代或修饰，包括但不限于烷基、芳基、卤基、氧代、羟基、烷氧基和/或硫代取代；一个或多个稠环或开环、氧化和/或还原。
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的尿嘧啶。具有经修饰的尿嘧啶的例示性核碱基和核苷包括假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿嘧啶、6-氮杂-尿嘧啶、2-硫代-5-氮杂-尿嘧啶、2-硫代-尿嘧啶(s2U)、4-硫代尿嘧啶(s4U)、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基-尿嘧啶(ho5U)、5-氨基烯丙基-尿嘧啶、5-卤基-尿嘧啶(例如，5-碘-尿嘧啶或5-溴-尿嘧啶)、3-甲基尿嘧啶(m3U)、5-甲氧基-尿嘧啶(mo5U)、尿嘧啶5-氧基乙酸(cmo5U)、尿嘧啶5-氧基乙酸甲酯(mcmo5U)、5-羧甲基-尿嘧啶(cm5U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羟甲基-尿嘧啶(chm5U)、5-羧基羟甲基-尿嘧啶甲酯(mchm5U)、5-甲氧基羰基甲基-尿嘧啶(mcm5U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mcm5s2U)、5-氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(nm5s2U)、5-甲基氨基甲基-尿嘧啶(mnm5U)、5-甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(mnm5s2U)、5-甲基氨基甲基-2-硒代-尿嘧啶(mnm5se2U)、5-氨甲酰基甲基-尿嘧啶(ncm5U)、5-羧甲基氨基甲基-尿嘧啶(cmnm5U)、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代-尿嘧啶(cmnm5s2U)、5-丙炔基-尿嘧啶、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿嘧啶(τm5U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿嘧啶(τm55s2U)、1-牛磺酸甲基-4-硫代-假尿苷、5-甲基-尿嘧啶(m5U，即具有核碱基脱氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1ψ)、1-乙基-假尿苷(Et1ψ)、5-甲基-2-硫代-尿嘧啶(m5s2U)、1-甲基-4-硫代-假尿苷(m1s4ψ)、4-硫代-1-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3ψ)、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿嘧啶(D)、二氢假尿苷、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基-二氢尿嘧啶(m5D)、2-硫代-二氢尿嘧啶、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基-尿嘧啶、2-甲氧基-4-硫代-尿嘧啶、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、N1-甲基-假尿苷、3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿嘧啶(acp3U)、1-甲基-3-(3-氨基-3-羧基丙基)假尿苷(acp3ψ)、5-(异戊烯基氨基甲基)尿嘧啶(m5U)、5-(异戊烯基氨基甲基)-2-硫代-尿嘧啶(m5s2U)、5,2’-O-二甲基-尿苷(m5Um)、2-硫代-2’-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(mcm5Um)、5-氨甲酰基甲基-2’-O-甲基-尿苷(ncm5Um)、5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5Um)、3,2’-O-二甲基-尿苷(m3Um)和5-(异戊烯基氨基甲基)-2’-O-甲基-尿苷(inm5Um)、1-硫代-尿嘧啶、脱氧胸苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)-尿嘧啶、5-(氨甲酰基羟基甲基)-尿嘧啶、5-氨甲酰基甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-羧甲基-2-硫代-尿嘧啶、5-氰基甲基-尿嘧啶、5-甲氧基-2-硫代-尿嘧啶和5-[3-(1-E-丙烯基氨基)]尿嘧啶。
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的胞嘧啶。具有经修饰的胞嘧啶的例示性核碱基和核苷包括5-氮杂胞嘧啶、6-氮杂胞嘧啶、假异胞苷、3-甲基胞嘧啶(m3C)、N4-乙酰基胞嘧啶(ac4C)、5-甲酰基胞嘧啶(f5C)、N4-甲基-胞嘧啶(m4C)、5-甲基-胞嘧啶(m5C)、5-卤基-胞嘧啶(例如5-碘-胞嘧啶)、5-羟甲基-胞嘧啶(hm5C)、1-甲基-假异胞苷、吡咯并胞嘧啶、吡咯并假异胞苷、2-硫代胞嘧啶(s2C)、2-硫代-5-甲基胞嘧啶、4-硫代假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉林(zebularine)、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞嘧啶、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、立西啶(lysidine)(k2C)、5,2’-O-二甲基-胞苷(m5Cm)、N4-乙酰基-2’-O-甲基-胞苷(ac4Cm)、N4,2’-O-二甲基-胞苷(m4Cm)、5-甲酰基-2’-O-甲基-胞苷(fSCm)、N4,N4,2’-O-三甲基-胞苷(m42Cm)、1-硫代-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-(3-叠氮基丙基)-胞嘧啶和5-(2-叠氮基乙基)-胞嘧啶。
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的腺嘌呤。具有替代性腺嘌呤的例示性核碱基和核苷包括2-氨基-嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-卤基-嘌呤(例如2-氨基-6-氯-嘌呤)、6-卤基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-氨基-6-甲基-嘌呤、8-叠氮基-腺嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基-嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基-腺嘌呤(m1A)、2-甲基-腺嘌呤(m2A)、N6-甲基-腺嘌呤(m6A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺嘌呤(ms2m6A)、N6-异戊烯基-腺嘌呤(i6A)、2-甲硫基-N6-异戊烯基-腺嘌呤(ms2i6A)、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺嘌呤(io6A)、2-甲硫基-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺嘌呤(ms2io6A)、N6-甘氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(g6A)、N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(t6A)、N6-甲基-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(m6t6A)、2-甲硫基-N6-苏氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(ms2g6A)、N6,N6-二甲基-腺嘌呤(m62A)、N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(hn6A)、2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰基氨甲酰基-腺嘌呤(ms2hn6A)、N6-乙酰基-腺嘌呤(ac6A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、N6,2’-O-二甲基-腺苷(m6Am)、N6,N6,2’-O-三甲基-腺苷(m62Am)、1,2’-O-二甲基-腺苷(m1Am)、2-氨基-N6-甲基-嘌呤、1-硫代-腺嘌呤、8-叠氮基-腺嘌呤、N6-(19-氨基-五氧杂十九烷基)-腺嘌呤、2,8-二甲基-腺嘌呤、N6-甲酰基-腺嘌呤和N6-羟甲基-腺嘌呤。
在一些实施方案中，非经典核碱基是经修饰的鸟嘌呤。具有经修饰的鸟嘌呤的例示性核碱基和核苷包括肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m1I)、怀俄苷(wyosine)(imG)、甲基怀俄苷(mimG)、4-脱甲基-怀俄苷(imG-14)、异怀俄苷(imG2)、怀丁苷(wybutosine)(yW)、过氧怀丁苷(o2yW)、羟基怀丁苷(OHyW)、修饰不足(undermodified)的羟基怀丁苷(OHyW*)、7-脱氮-鸟嘌呤、辫苷(queuosine)(Q)、环氧辫苷(oQ)、半乳糖基-辫苷(galQ)、甘露糖基-辫苷(manQ)、7-氰基-7-脱氮-鸟嘌呤(preQO)、7-氨基甲基-7-脱氮-鸟嘌呤(preQ1)、古嘌苷(archaeosine)(G+)、7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、6-硫代-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-鸟嘌呤、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤、7-甲基-鸟嘌呤(m7G)、6-硫代-7-甲基-鸟嘌呤、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鸟嘌呤、1-甲基-鸟嘌呤(m1G)、N2-甲基-鸟嘌呤(m2G)、N2,N2-二甲基-鸟嘌呤(m22G)、N2,7-二甲基-鸟嘌呤(m2,7G)、N2,N2,7-二甲基-鸟嘌呤(m2,2,7G)、8-氧代-鸟嘌呤、7-甲基-8-氧代-鸟嘌呤、1-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2-甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟嘌呤、N2-甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m2Gm)、N2,N2-二甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m22Gm)、1-甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m1Gm)、N2,7-二甲基-2’-O-甲基-鸟苷(m2,7Gm)、2’-O-甲基-肌苷(Im)、1,2’-O-二甲基-肌苷(m1Im)、1-硫代-鸟嘌呤和O-6-甲基-鸟嘌呤。
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物的非经典核碱基可独立地为嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。举例来说，在一些实施方案中，非经典核碱基可为经修饰的腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶或次黄嘌呤。在其它实施方案中，非经典核碱基还可包括例如碱基的天然存在的和合成的衍生物，包括吡唑并[3,4-d]嘧啶；5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物；2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫代尿嘧啶；8-卤基(例如8-溴)、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤基(尤其为5-溴)、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；脱氮鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤；脱氮腺嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、3-脱氮腺嘌呤；吡唑并[3,4-d]嘧啶；咪唑并[1,5-a]1,3,5-三嗪酮；9-脱氮嘌呤；咪唑并[4,5-d]吡嗪；噻唑并[4,5-d]嘧啶；吡嗪-2-酮；1,2,4-三嗪；哒嗪；或1,3,5-三嗪。
糖的修饰
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物含有非经典糖基。在各个实施方案中，非经典糖基可为具有一个或多个取代的5碳或6碳糖(诸如戊糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、半乳糖或其脱氧衍生物)，所述一个或多个取代诸如为卤基、羟基、硫醇基、烷基、烷氧基、烯基氧基、炔基氧基、环烷基、氨基烷氧基、烷氧基烷氧基、羟基烷氧基、氨基、叠氮基、芳基、氨基烷基、氨基烯基、氨基炔基等。
一般来说，RNA分子含有核糖糖基，所述核糖糖基是含氧5元环。例示性、非限制性替代核苷酸包括置换核糖中的氧(例如，用S、Se或亚烷基，诸如亚甲基或亚乙基置换)；添加双键(例如，用环戊烯基或环己烯基置换核糖)；核糖的环收缩(例如，形成环丁烷或氧杂环丁烷的4元环)；核糖的环扩展(例如，形成具有额外碳或杂原子的6元或7元环，诸如对于失水己糖醇、阿卓糖醇(altritol)、甘露糖醇、环己基、环己烯基和吗啉基(其还具有氨基磷酸酯主链))；多环形式(例如三环和“未锁定”形式，诸如二醇核酸(GNA)(例如R-GNA或S-GNA，其中核糖由连接至磷酸二酯键的二醇单元置换)、苏糖核酸(TNA，其中核糖由α-L-苏呋喃糖基-(3’→2’)置换)和肽核酸(PNA，其中2-氨基-乙基-甘氨酸键联置换核糖和磷酸二酯主链))。
在一些实施方案中，糖基含有一个或多个碳，所述一个或多个碳具有与核糖中对应碳相反的立体化学构型。因此，核酸分子可包括含例如阿拉伯糖或L-核糖作为糖的核苷酸。在一些实施方案中，核酸分子包括至少一个其中糖是L-核糖、2’-O-甲基核糖、2’-氟核糖、阿拉伯糖、己糖醇、LNA或PNA的核苷。
核苷间键联的修饰
在一些实施方案中，本公开的有效负载核酸分子可含有一个或多个经修饰的核苷间键联(例如磷酸酯主链)。主链磷酸酯基可通过用不同取代基置换一个或多个氧原子来改变。
在一些实施方案中，功能性核苷酸类似物可包括用本文所述的另一核苷间键联置换未改变的磷酸酯部分。替代性磷酸酯基的实例包括但不限于硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate/boranophosphateester)、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。二硫代磷酸酯的两个非连接氧均经硫置换。还可通过用氮(桥连的氨基磷酸酯)、硫(桥连的硫代磷酸酯)和碳(桥连的亚甲基膦酸酯)置换连接氧来改变磷酸酯连接体。
替代性核苷和核苷酸可包括一个或多个非桥连氧经甲硼烷部分(BH3)、硫(硫代)、甲基、乙基和/或甲氧基置换。作为非限制性实例，在同一位置(例如α(alpha)、β(beta)或γ(gamma)位置)处的两个非桥连氧可经硫(硫代)和甲氧基置换。置换磷酸酯部分(例如α-硫代磷酸酯)位置处的一个或多个氧原子可通过非天然硫代磷酸酯主链键联赋予RNA和DNA稳定性(诸如针对核酸外切酶和核酸内切酶的稳定性)。硫代磷酸酯DNA和RNA具有增加的核酸酶抗性，因此在细胞环境中具有较长的半衰期。
本文描述可根据本公开使用的其它核苷间键联，包括不含磷原子的核苷间键联。
可与本公开结合使用的核酸分子(例如mRNA)、相关组合物、制剂和/或方法的额外实例还包括WO2002/098443、WO2003/051401、WO2008/052770、WO2009127230、WO2006122828、WO2008/083949、WO2010088927、WO2010/037539、WO2004/004743、WO2005/016376、WO2006/024518、WO2007/095976、WO2008/014979、WO2008/077592、WO2009/030481、WO2009/095226、WO2011069586、WO2011026641、WO2011/144358、WO2012019780、WO2012013326、WO2012089338、WO2012113513、WO2012116811、WO2012116810、WO2013113502、WO2013113501、WO2013113736、WO2013143698、WO2013143699、WO2013143700、WO2013/120626、WO2013120627、WO2013120628、WO2013120629、WO2013174409、WO2014127917、WO2015/024669、WO2015/024668、WO2015/024667、WO2015/024665、WO2015/024666、WO2015/024664、WO2015101415、WO2015101414、WO2015024667、WO2015062738、WO2015101416中所述的那些，各案的内容整体并入本文中。
5.3.8药物组合物
根据本公开，纳米颗粒组合物可整体或部分地配制成药物组合物。药物组合物可包含一种或多种纳米颗粒组合物。举例来说，药物组合物可包含一种或多种纳米颗粒组合物，所述一种或多种纳米颗粒组合物包含一种或多种不同的治疗剂和/或预防剂。药物组合物还可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂或辅助成分，诸如本文所述的那些。关于药物组合物和剂的配制和制造的一般指南可例如在Remington，The Science and Practiceof Pharmacy，第21版，A.R.Gennaro；Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,Md.,2006中获得。常规赋形剂和辅助成分可用于任何药物组合物中，除非任何常规赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的一种或多种组分不相容。如果赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的组分的组合会导致任何不希望的生物效应或其它有害效应，则赋形剂或辅助成分与纳米颗粒组合物的组分不相容。
在一些实施方案中，一种或多种赋形剂或辅助成分可构成包含纳米颗粒组合物的药物组合物的总质量或体积的大于50％。举例来说，一种或多种赋形剂或辅助成分可构成药物组合物的50％、60％、70％、80％、90％或更高百分比。在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂为至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯。在一些实施方案中，赋形剂经批准用于人类和兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂得到美国食品与药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂是医药级的。在一些实施方案中，赋形剂符合美国药典(USP)、欧洲药典(EP)、英国药典和/或国际药典的标准。
根据本公开的药物组合物中的一种或多种纳米颗粒组合物、一种或多种药学上可接受的赋形剂和/或任何额外成分的相对量将取决于所治疗受试者的身份、体格和/或状况并且进一步取决于组合物的施用途径而变化。举例来说，药物组合物可包含在0.1％与100％(wt/wt)之间的一种或多种纳米颗粒组合物。
在某些实施方案中，本公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物经冷藏或冷冻储存和/或运输(例如在4℃或更低温度下，诸如在约-150℃与约0℃之间或在约-80℃与约-20℃之间(例如约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃)的温度下储存)。举例来说，包含鞘磷脂和式01-I、01-II、02-I、02-II、03-I、03-II-A、03-II-B、03-II-C、03-II-D、04-I、04-III、04-IV、05-I和06-I(和其子式)中的任一者的化合物的药物组合物是在例如约-20℃、30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃或-80℃下冷藏储存和/或运输的溶液。在某些实施方案中，本公开还涉及一种增加包含鞘磷脂和式01-I、01-II、02-I、02-II、03-I、03-II-A、03-II-B、03-II-C、03-II-D、04-I、04-III、04-IV、05-I和06-I(和其子式)中的任一者的化合物的纳米颗粒组合物和/或药物组合物的稳定性的方法，其通过将所述纳米颗粒组合物和/或药物组合物储存于4℃或更低温度下，诸如在约-150℃与约0℃之间或在约-80℃与约-20℃之间的温度，例如约-5℃、-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-130℃或-150℃来实施。举例来说，本文所公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物在例如4℃或更低(例如约4℃与-20℃之间)的温度下稳定保持约至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少5周、至少6周、至少1个月、至少2个月、至少4个月、至少6个月、至少8个月、至少10个月、至少12个月、至少14个月、至少16个月、至少18个月、至少20个月、至少22个月或至少24个月。在一个实施方案中，制剂在约4℃下稳定保持至少4周。在某些实施方案中，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物和药学上可接受的载体，所述载体选自以下中的一种或多种：Tris、乙酸盐(例如乙酸钠)、柠檬酸盐(例如柠檬酸钠)、生理食盐水、PBS和蔗糖。在某些实施方案中，本公开的药物组合物的pH值在约7与8之间(例如6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0，或在7.5与8之间或在7与7.8之间)。举例来说，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物、Tris、生理食盐水和蔗糖，并且具有约7.5-8的pH值，其适于在例如约-20℃下储存和/或运输。举例来说，本公开的药物组合物包含本文所公开的纳米颗粒组合物和PBS，并且具有约7-7.8的pH值，其适于在例如约4℃或更低温度下储存和/或运输。在本公开的上下文中，“稳定性”、“稳定化”和“稳定的”是指本文所公开的纳米颗粒组合物和/或药物组合物在给定制造、制备、转运、储存和/或使用条件下，例如当施加应力，诸如剪切力、冷冻/解冻应力等时，对化学或物理变化(例如降解、粒径变化、聚集、包封的变化等)具有抗性。
可将纳米颗粒组合物和/或包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物施用于任何患者或受试者，包括可受益于通过将治疗剂和/或预防剂递送至一种或多种特定细胞、组织、器官或系统或其群组，诸如肾脏系统所提供的治疗效应的患者或受试者。尽管本文所提供的关于纳米颗粒组合物和包含纳米颗粒组合物的药物组合物的描述主要针对适于施用于人类的组合物，但本领域技术人员应理解，所述组合物一般适于施用于任何其它哺乳动物。为了使组合物适于施用于各种动物而对适于施用于人类的组合物的改进是众所周知的，并且有普通技术的兽医药理学家仅通过普通实验(如果有的话)即可设计和/或进行所述改进。经考虑，施用组合物的受试者包括但不限于人类、其它灵长类动物和其它哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠。
包含一种或多种纳米颗粒组合物的药物组合物可通过药理学领域中已知或以后将开发的任何方法制备。一般来说，此类制备方法包括使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合，并且接着，如果需要或必要，则将产物分成、成型成和/或包装成所需的单剂量或多剂量单元。
根据本公开的药物组合物可以散装、作为单次单位剂量和/或作为多个单次单位剂量制备、包装和/或出售。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分(例如纳米颗粒组合物)的药物组合物的离散量。活性成分的量一般等于将被施用受试者的活性成分的剂量和/或这个剂量的便利部分，诸如这个剂量的一半或三分之一。
药物组合物可制备成适合多种施用途径和方法的多种形式。举例来说，药物组合物可制备成液体剂型(例如乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂)、可注射形式、固体剂型(例如胶囊、片剂、丸剂、粉剂和颗粒剂)、用于局部和/或经皮施用的剂型(例如软膏、糊剂、乳膏、洗剂、凝胶剂、粉剂、溶液、喷雾剂、吸入剂和贴片)、悬浮液、粉剂和其它形式。
经口和非经肠施用的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液、微乳液、纳米乳液、溶液、悬浮液、糖浆和/或酏剂。除活性成分外，液体剂型还可包含此项技术中常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(尤其为棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨醇脂肪酸酯，以及其混合物。除惰性稀释剂外，经口组合物还可包含额外治疗剂和/或预防剂、额外剂，诸如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂。在供非经肠施用的某些实施方案中，将组合物与增溶剂混合，所述增溶剂诸如为CremophorTM、醇、油、改性油、二醇、聚山梨醇酯、环糊精、聚合物和/或其组合。
可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液，可根据已知技术，使用适合分散剂、润湿剂和/或助悬剂来配制。无菌可注射制剂可为在无毒非经肠可接受的稀释剂和/或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液和/或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的媒介物和溶剂包括水、林格氏溶液(U.S.P.)和等渗氯化钠溶液。无菌不挥发性油通常用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。诸如油酸的脂肪酸可用于制备可注射剂。
可注射制剂可经灭菌，例如通过经由细菌截留过滤器过滤，和/或通过掺入呈无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述灭菌剂可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中。
本公开提供向哺乳动物细胞或器官递送治疗剂和/或预防剂，在哺乳动物细胞中产生感兴趣多肽，以及治疗有需要的哺乳动物的疾病或病症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包含治疗剂和/或预防剂的纳米颗粒组合物和/或使哺乳动物细胞与所述纳米颗粒组合物接触。
6.实施例
本部分(即，部分6)中的实施例以举例说明而不是限制的方式提供。
6.1实施例1：脂质纳米颗粒制剂的制备和表征
简单地说，使指定量的脂质组分以指定摩尔比溶解于乙醇中(参见表6.2-1至6.2-3)。将mRNA稀释于10至50mM柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)中。通过使用微流体装置、介于9-30mL/min范围内的总流动速率使乙醇脂质溶液与mRNA水溶液以1:3的体积比混合来制备LNP，其总脂质:mRNA重量比为大约10:1至30:1。由此使用透析通过DPBS来移除并置换乙醇。最终，通过0.2μm无菌过滤器过滤脂质纳米颗粒。
使用Malvern Zetasizer Nano ZS(Malvern UK)，使用173°反向散射检测模式，通过动态光散射来确定脂质纳米颗粒大小。根据制造商的说明书，使用Quant-it RibogreenRNA定量分析试剂盒(Thermo Fisher Scientific,UK)来确定脂质纳米颗粒的包封效率。
为了测量脂质纳米颗粒的大小和PDI，将制剂20倍稀释于PBS中，接着将1mL转移至测量比色皿中。使用Quant-it RiboGreen RNA分析试剂盒来确定LNP EE％，分别在Tris-EDTA和0.1％ Triton中将LNP制剂稀释至0.4μg/mL。为了确定游离RNA和总RNA荧光强度，用Tris-EDTA缓冲液将ribogreen试剂稀释200倍，并以与经稀释的LNP制剂相同的体积混合。在室温下，在Molecular Devices Spectramax iD3光谱仪中使用488nm的激发波长和525nm的发射波长来测量荧光强度。基于经包封RNA荧光强度与总RNA荧光强度的比率来计算EE％。
6.2实施例2：脂质纳米颗粒制剂的物理特性
制备含有GFP基因以及如下表6.2-1至6.2-3中列出的脂质组合物的脂质纳米颗粒制剂，并根据上述方法来执行最终LNP组合物的物理表征。
表6.2-1.含有鞘磷脂的LNP的物理表征。
表6.2-2.含有不同摩尔百分率的鞘磷脂的LNP的物理表征。
表6.2-3.含有不同阳离子脂质的LNP的物理表征。
如表6.2-1至6.2-3所示，在LNP制剂中用相同摩尔百分率的鞘磷脂替换DSPC不会显著影响包封效率，但略微增加最终LNP组合物的平均粒径。如表3所示，两种不同的可离子化脂质(C1和Lipid 5，见下文)与鞘磷脂或DSPC一起使用以形成LNP制剂。
6.3实施例3：脂质纳米颗粒的微观结构
将5微升样品施加至辉光放电的400目铜网格上，该网格具有由蕾丝碳基材(TedPella)支撑的薄碳膜。吸干网格持续3s，接着使用Vitribot Mark IV(FEI)浸入液氮中。在以200kV操作的Talos Arctica显微镜(FEI)上，使用K2 Summit照相机(Gatan)在计数模式下以×36,000放大率记录影片堆叠(movie stack)。
图2B和图2C是显示本发明LRNP(制剂-1-SM)和参考LNP(制剂-1-对照)的形态的Cryo-EM图像，其使用本文所述的Cryo-EM分析进行评估和表征。图2B显示本发明LRNP制剂中的至少56％颗粒呈现半层状形态。具体来说，箭头A指向层状结构并且箭头B指向非层状电子致密结构。比例尺200nm。相比之下，图2C显示参考制剂中的至少99.9％颗粒呈现电子致密形态，在整个颗粒中具有实心深色外观。所观察到的颗粒形态的差异可能归因于本发明LRNP制剂中形成富含鞘磷脂的筏。
图5显示Cryo-EM图像，其分别显示含有10％(制剂-1-SM)、15％(制剂-4-SM)和30％(制剂-5-SM)的摩尔百分率的鞘磷脂的LNP制剂的形态。如所示，对于具有10％或15％鞘磷脂的制剂，取样视场中的大多数纳米颗粒呈现半层状形态，与图2B一致。相比之下，当鞘磷脂含量增加至30％时，取样视场中的大多数纳米颗粒转变为完全层状形态，其中围绕电子致密核形成层状层(例如，箭头指向的具有壳-核形状的颗粒)。
6.4实施例4：活体外蛋白质表达。
如上所述，制备包封绿色荧光蛋白(GFP)mRNA的脂质纳米颗粒。将Hela细胞系接种于96孔板中。使LNP制剂与10μg/mL ApoE以1:1(v/v)比率混合，接着以200ng/孔或400ng/孔浓度添加至细胞中，并孵育持续36至48小时。按照制造商的说明书，用CellTiter/>发光细胞活力分析测量GFP强度，并将不同组的荧光强度(相对光单位；RLU)绘制于图3A至图3C中，显示出每组至少五次重复实验的平均值和标准偏差(SD)。
如图3A至图3C所示，LNP组合物中所含的mRNA的活体外表达随LNP制剂而变化。具体来说，图3A显示如与含有相同摩尔百分率的DSPC而不是鞘磷脂的参考LNP组合物(制剂-1-对照)相比，当将mRNA配制于含有鞘磷脂的LNP组合物(制剂-1-SM)中时，Hela细胞中的GFP表达显著增加(达2倍)。
此外，改变LNP组合物中的鞘磷脂含量会显著影响LNP中所含的mRNA的活体外表达。具体来说，图3A显示将鞘磷脂含量从10mol％(制剂-1-SM)降低至5mol％(制剂-3-SM)使GFP表达减少一半。图3B显示，将鞘磷脂含量从10mol％(制剂-1-SM)增加至15mol％(制剂-4-SM)使GFP表达显著增强数倍。
图3C显示，由使用鞘磷脂与不同类型的阳离子脂质(包括C1和Lipid5)的组合配制的LNP组合物类似地观察到增强的活体外GFP表达。
6.5实施例5：活体内蛋白质表达。
如上所述，制备包封人类红细胞生成素(hEPO)mRNA的脂质纳米颗粒，并以0.5mg/kg剂量通过尾静脉注射全身性地施用至6-8周龄雌性ICR小鼠(Xipuer-Bikai,Shanghai)。在施用后6小时，通过CO2超剂量对小鼠实施安乐死，并采集血样用于hEPO测量。具体来说，在4℃下以5000g离心持续10分钟，由此从全血中分离血清，快速冷冻并储存于-80℃下以供分析。根据制造商的说明书，使用商业试剂盒(DEP00,R&D systems)来进行ELSA分析，由此测量血清hEPO水平。将由测试组测量的hEPO表达水平(μg/ml)绘制于图4中，显示出每组至少五次重复实验(测试动物)的平均值和标准偏差(SD)。
如所示，LNP组合物中所含的mRNA的活体内表达随LNP制剂而变化。具体来说，如与含有相同摩尔百分率的DSPC而不是鞘磷脂的参考LNP组合物(制剂-1-对照)相比，当将mRNA配制于含有鞘磷脂的LNP组合物(制剂-1-SM)中时，活体内mRNA表达显著增加(达1.5倍)。
6.6实施例6：具有不同鞘磷脂含量的LNP制剂的表征。
执行以下研究以检查LNP制剂中的鞘磷脂含量对LNP制剂中的核酸分子表达水平的可能影响。
具体来说，如实施例1所述来制备含有0至35％鞘磷脂和人类红细胞生成素(hEPO)mRNA的LNP制剂。测量最终制剂的纳米颗粒的物理特性，以确保LNP制剂的质量。
表6.6.含有不同鞘磷脂含量的LNP制剂。
以0.5mg/kg剂量通过尾静脉注射将各LNP制剂全身性地施用至6-8周龄雌性ICR小鼠(Xipuer-Bikai,Shanghai)，并采集血样用于如本文所述的hEPO测量。将由测试组测量的hEPO表达水平(μg/ml)绘制于图6中，显示出每组至少五次重复实验(测试动物)的平均值和标准偏差(SD)。
如图6所示，LNP组合物中所含的mRNA的活体内表达随鞘磷脂的摩尔百分率而变化。包含10％鞘磷脂(制剂-1-SM)或15％鞘磷脂(制剂-4-SM)的LNP在小鼠中产生最高蛋白质表达水平，并且还超过DSPC对照。将鞘磷脂的摩尔百分率从10％降低至5％会显著降低EPO表达水平。将鞘磷脂的摩尔百分率从20％增加至25％或以上也显著降低EPO表达水平。将鞘磷脂摩尔百分率进一步增加至30％以上会导致最小活体内EPO表达。图6还显示阳离子脂质(C1)的摩尔百分率影响蛋白质表达水平，与包含40％ C1的LNP(制剂-23-SM)相比，包含45％ C1的LNP(制剂-4-SM)产生较高蛋白质表达水平。
6.7实施例7：具有不同鞘磷脂分子的LNP制剂的表征。
为了进一步研究鞘磷脂尾长对如本文所述的LNP制剂的可能影响，使用具有酰胺连接的不同长度(例如，12至24个碳)的酰基链的鞘磷脂分子(表X)来配制LNP制剂，并如下所述进一步表征LNP制剂。
表X.例示性鞘磷脂化合物。
具体来说，如实施例1中所述来制备含有人类红细胞生成素(hEPO)mRNA的脂质纳米颗粒。测量最终制剂的纳米颗粒的物理特性(大小、PDI、EE％)以确保LNP制剂的质量，并概述于表6.7中。
表6.7具有不同尾长的鞘磷脂的LNP制剂和例示性(批次特异性)物理特性。
以0.5mg/kg剂量通过尾静脉注射将各LNP制剂全身性地施用至6-8周龄雌性ICR小鼠(Xipuer-Bikai,Shanghai)，并采集血样用于如本文所述的hEPO测量。将由测试组测量的hEPO表达水平(μg/ml)绘制于图7中，显示出每组至少五次重复实验(测试动物)的平均值和标准偏差(SD)。如所示，鞘磷脂尾长未以统计学显著方式影响活体内mRNA表达水平。具体来说，本研究中所测试的所有五种LNP制剂均产生高蛋白质表达水平，其中包含SM-03和SM-02的LNP制剂产生最高蛋白质表达水平。
6.8实施例8：具有不同阳离子脂质的LNP制剂的表征。
为了研究阳离子脂质对本文所述的含鞘磷脂LNP制剂的可能影响，各自使用具有如下表Y中列出的多种结构的阳离子脂质来配制具有鞘磷脂(SM-03)或具有等量的DSPC(作为对照)的LNP制剂，并如下所述进一步表征这些制剂。
表Y.阳离子脂质。
/>
/>
6.8.1研究编号1–活体外GFP表达
在本研究中，如实施例1所述来制备含有编码绿色荧光蛋白(GFP)的mRNA的脂质纳米颗粒，并评估最终制剂中的纳米颗粒的物理特性以确保LNP制剂的质量，如表6.8.1中所概述。
表6.8.1具有不同阳离子脂质的LNP制剂和例示性(批次特异性)物理特性
将Hela细胞系接种于96孔板中。在37℃下使LNP制剂与10μg/mL ApoE以1:1(v/v)比率混合持续15min，接着以400ng/孔浓度添加至细胞中，并孵育持续36至48小时。按照制造商的说明书，用CellTiter-/>发光细胞活力分析测量GFP强度，并将不同组的荧光强度(相对光单位；RLU)绘制于图8中，显示出每组至少三次重复实验的平均值和标准偏差(SD)。/>
如图8所示，对于两种所测试的阳离子脂质，如与含有等量的DSPC而不是鞘磷脂的相应对照制剂相比，含鞘磷脂组合物的平均活体外mRNA表达水平较高。特定来说，对于含有阳离子脂质C3的LNP制剂，含鞘磷脂LNP的mRNA表达显著高于相应DSPC对照制剂的mRNA表达。
6.8.2研究编号2–活体内EPO表达
在本研究中，如实施例1中所述来制备含有人类红细胞生成素(hEPO)mRNA的脂质纳米颗粒。评估最终制剂中的纳米颗粒的物理特性以确保LNP制剂的质量，如表6.8.2中所概述。
表6.8.2具有不同阳离子脂质的LNP制剂和例示性(批次特异性)物理特性。
/>
如表6.8.2所示，含有不同阳离子脂质与鞘磷脂或等量的DSPC(作为相应对照)的组合的所有脂质纳米颗粒均具有在预期范围内的粒径、PDI和包封效率。
以0.5mg/kg剂量通过尾静脉注射将各LNP制剂全身性地施用至6-8周龄雌性ICR小鼠(Xipuer-Bikai,Shanghai)，并采集血样用于如本文所述的hEPO测量。将由测试组测量的hEPO表达水平(μg/ml)绘制于图9中，显示出每组至少五次重复实验(测试动物)的平均值和标准偏差(SD)。如所示，对于每一种所测试的阳离子脂质，如与含有等量的DSPC而不是鞘磷脂的相应对照制剂相比，含鞘磷脂组合物的平均活体内mRNA表达水平较高。特定来说，对于含有阳离子脂质C1、C5至C9、C14、C16和ALC-0315的LNP制剂，含鞘磷脂LNP的mRNA表达显著高于相应DSPC对照制剂的mRNA表达。
6.9实施例9：LNP制剂中递送的核酸分子的组织特异性表达。
为了研究LNP在小鼠中的组织生物分布，如实施例1中所述来制备表6.9中列出的含有编码荧光素酶的mRNA的LNP制剂。评估最终制剂中的纳米颗粒的物理特性以确保LNP制剂的质量，如表6.9中所概述。
表6.9.用于荧光素酶mRNA生物分布研究的LNP制剂和例示性(批次特异性)物理特性。
如表6.9所示，含有不同阳离子脂质与鞘磷脂或等量的DSPC(作为相应对照)的组合的所有脂质纳米颗粒均具有在预期范围内的粒径、PDI和包封效率。
以0.5mg/kg剂量通过尾静脉注射将各制剂全身性地施用至6-8周龄雌性ICR小鼠(Xipuer-Bikai,Shanghai)。5.75小时后，对小鼠经皮下施用XenoLight D-荧光素(钾盐)，它是催化发光产生的荧光素酶的底物。随后，在15min后，通过CO2超剂量对小鼠实施安乐死。收集小鼠组织并将其置于发光成像扫描仪中以测量每个组织中的荧光素酶表达水平。将由收集组织测量的发光水平绘制于图10中，显示出每组至少三次重复实验(测试动物)的平均值和标准偏差(SD)。
如图10所示，在所检查的所有器官中，如与含有等量的DSPC而不是鞘磷脂的相应对照制剂(制剂-1B-对照)相比，含鞘磷脂LNP(制剂-1B-SM)的平均荧光素酶表达水平较高。在心脏、肾脏、肝脏和肺中，所观察到的含鞘磷脂制剂与相应DSPC对照之间的差异为统计学显著的。与所检查的其它器官相比，肝脏中的荧光素酶表达水平最高。
在心脏、肾脏、肝脏和肺中，与含有30％鞘磷脂的LNP(制剂-5-SM)相比，含有10％鞘磷脂的LNP(制剂-1B-SM)显示显著较高的荧光素酶表达水平，指示与30％相比，10％摩尔比的鞘磷脂含量更有益。
6.10实施例10：例示性合成
一般制备型HPLC方法：HPLC纯化在配备有二极管阵列检测器(DAD)的Waters 2767上，在Inertsil Pre-C8 OBD柱上，一般使用含0.1％ TFA的水作为溶剂A并且使用乙腈作为溶剂B进行。
一般LCMS方法：LCMS分析在Shimadzu(LC-MS2020)系统上进行。色谱在SunFireC18上，一般使用含0.1％甲酸的水作为溶剂A并且使用含0.1％甲酸的乙腈作为溶剂B执行。
6.10.1制备化合物02-1(即以下流程中的化合物1)。
化合物02-1：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.27-1.63(m,53H),1.97-2.01(m,2H),2.28-2.64(m,14H),3.52-3.58(m,2H),4.00-4.10(m,8H)。LCMS：Rt:1.080min；MS m/z(ESI):826.0[M+H]+。
使用相应起始材料，以与化合物02-1类似的方式制备以下化合物。
6.10.2制备化合物02-2(即以下流程中的化合物2)。
化合物02-2：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.28-1.67(m,54H),1.88-2.01(m,7H),2.28-2.56(m,18H),3.16-3.20(m,1H),3.52-3.54(m,2H),4.00-4.10(m,8H)。LCMS：Rt:1.060min；MS m/z(ESI):923.0[M+H]+。
6.10.3制备化合物02-4(即以下流程中的化合物4)。
化合物02-4：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,9H),1.26-1.32(m,34H),1.41-1.49(m,4H),1.61-1.66(m,15H),2.00-2.03(m,1H),2.21-2.38(m,8H),2.43-2.47(m,4H),2.56-2.60(m,2H),3.50-3.54(m,2H),4.03-4.14(m,8H)。LCMS：Rt:1.030min；MS m/z(ESI):798.0[M+H]+。
6.10.4制备化合物02-9(即以下流程中的化合物9)。
化合物02-9：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.28-1.30(m,33H),1.58-2.01(m,18H),2.30-2.54(m,18H),3.10-3.19(m,1H),3.52-3.68(m,8H),4.09-4.20(m,8H)。LCMS：Rt:1.677min；MS m/z(ESI):927.7[M+H]+。
使用相应起始材料，以与化合物02-9类似的方式制备以下化合物。
6.10.5制备化合物02-10(即以下流程中的化合物10)。
化合物02-10：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.90(m,12H),1.26-1.41(m,48H),1.51-1.72(m,11H),1.94-2.03(m,1H),2.29-2.32(m,6H),2.41-2.91(m,5H),3.51-3.76(m,2H),3.96-4.10(m,6H)。LCMS：Rt:1.327min；MS m/z(ESI):782.6[M+H]+。
使用相应起始材料，以与化合物02-10类似的方式制备以下化合物。
6.10.6制备化合物02-12(即以下流程中的化合物12)。
化合物02-12：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:0.86-0.89(m,18H),1.25-1.35(m,53H),1.41-1.48(m,8H),1.56-1.61(m,20H),1.95-2.01(m,2H),2.28-2.35(m,6H),2.43-2.46(m,4H),2.56-2.58(m,2H),3.51-3.54(m,2H),4.00-4.10(m,8H)。LCMS：Rt:0.080min；MS m/z(ESI):1050.8[M+H]+。
6.10.7制备化合物02-20(即以下流程中的化合物20)。
化合物02-20：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ：0.86-0.90(m,9H),1.25-1.36(m,48H),1.41-1.48(m,5H),1.60-1.62(m,8H),1.97-2.00(m,1H),2.27-2.32(m,6H),2.43-2.46(m,4H),2.56-2.59(m,2H),3.52-3.54(m,2H),4.01-4.10(m,6H)。LCMS：Rt:0.093min；MS m/z(ESI):782.6[M+H]+。
/>

Claims (54)

1.一种纳米颗粒组合物，其包含多个脂质纳米颗粒，其中所述脂质纳米颗粒包含：
(a)占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约5mol％至40mol％的鞘磷脂；
(b)阳离子脂质；
(c)类固醇；
(d)聚合物结合的脂质；以及
(e)核酸。
2.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至40mol％。
3.如权利要求2所述的纳米颗粒组合物，其中
(a)所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至30mol％；
(b)所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至25mol％；
(c)所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％；
(d)所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％；
(e)所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％；
(f)所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％；
或
(g)所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％。
4.如权利要求1至3中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约30-55mol％。
5.如权利要求4所述的纳米颗粒组合物，
(a)其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约35mol％至50mol％；
(b)其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％；
(c)其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％至50mol％；
(d)其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％；
(e)其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；
或
(f)其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约50mol％。
6.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，并且其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％。
7.如权利要求6所述的纳米颗粒组合物，其中
(a)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％，并且其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；
(b)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至15mol％，并且其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％；
(c)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％，并且其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约50mol％；
(d)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％，并且其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；
或
(e)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％，并且其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％。
8.如权利要求1至7中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％至50mol％。
9.如权利要求8所述的纳米颗粒组合物，其中
(a)所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％；
(b)所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约35mol％至45mol％；
(c)所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；
(d)所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约33.5mol％；
(e)所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％；
或
(f)所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％。
10.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10-20mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40-50mol％，并且其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％。
11.如权利要求10所述的纳米颗粒组合物，
(a)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；并且其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约33.5mol％至43.5mol％；
(b)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％；并且其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％至48.5mol％；
(c)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约50mol％，并且其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％；
(d)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；并且其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％；
(e)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％，并且其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％；
(f)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％，并且其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约33.5mol％；
(g)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％，并且其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约48.5mol％；
(h)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％，并且其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％；
或
(i)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％，并且其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％。
12.如权利要求1至11中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
13.如权利要求12所述的纳米颗粒组合物，其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％。
14.如权利要求1所述的纳米颗粒组合物，其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至20mol％，其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％至50mol％，其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约30mol％至50mol％，并且其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
15.如权利要求14所述的纳米颗粒组合物，
(a)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％；其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约50mol％；其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％；并且其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％；
(b)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％；其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％；并且其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％；
(c)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％；其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％；其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约48.5mol％；并且其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％；
(d)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％；其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％；并且其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％；
(e)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约15mol％；其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％；其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％；并且其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％；
(f)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％；其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约33.5mol％；并且其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％；
(g)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约20mol％；其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约40mol％；其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约38.5mol％；并且其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％；
(h)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约5mol％；其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约48.5mol％；并且其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％；
或
(i)其中所述鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约5mol％；其中所述阳离子脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约45mol％；其中所述类固醇占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约43.5mol％；并且其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约1.5mol％；并且其中所述纳米颗粒组合物还包含占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的约5mol％的第二磷脂；任选地，其中所述第二磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
16.如权利要求15所述的纳米颗粒组合物，其中所述鞘磷脂为鞘磷脂化合物；任选地，所述鞘磷脂选自表X中的SM-01、SM-02、SM-03、SM-04、SM-05、SM-06和SM-07。
17.如权利要求1至16中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述类固醇为胆固醇或胆固醇衍生物。
18.如权利要求1至17中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述阳离子脂质是根据选自01-I、01-II、02-I、02-II、03-I、03-II-A、03-II-B、03-II-C、03-II-D、04-I、04-III、04-IV、05-I、06-I和其子式的任一式的化合物，或者其中所述阳离子脂质是选自表1至表5中的任一者中列出的化合物的化合物。
19.如权利要求1至18中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述聚合物结合的脂质为DMG-PEG2000或DMPE-PEG2000。
20.如权利要求1至19中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸编码RNA或蛋白质；并且其中在哺乳动物细胞或哺乳动物的组织中从所述核酸表达的RNA或蛋白质的量大于从配制于参考纳米颗粒组合物中的所述核酸表达的RNA或蛋白质的量，所述参考纳米颗粒组合物不包含占存在于所述参考纳米颗粒组合物中的总脂质的约10mol％至40mol％的鞘磷脂。
21.如权利要求20所述的纳米颗粒组合物，其中所述参考纳米颗粒组合物含有1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)而不是鞘磷脂。
22.如权利要求21所述的纳米颗粒组合物，其中鞘磷脂占存在于所述纳米颗粒组合物中的总脂质的摩尔百分率与DSPC占存在于所述参考纳米颗粒组合物中的总脂质的摩尔百分率相同。
23.如权利要求21或22所述的纳米颗粒组合物，其中在所述纳米颗粒组合物与所述参考纳米颗粒组合物之间，其余内含物相同。
24.如权利要求20至23中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中与从配制于所述参考纳米颗粒组合物中的所述核酸表达的RNA或蛋白质的量相比，在哺乳动物细胞或哺乳动物的组织中从所述核酸表达的RNA或蛋白质的量增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
25.如权利要求1至24中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述核酸为mRNA。
26.如权利要求1至25中任一项所述的纳米颗粒组合物，其中所述多个脂质纳米颗粒中的至少约50％的脂质纳米颗粒具有半层状形态；任选地，其中所述多个脂质纳米颗粒中的至少约55％的脂质纳米颗粒具有半层状形态。
27.如权利要求1至26中任一项所述的纳米颗粒组合物，
(a)其中所述多个脂质纳米颗粒的平均大小为约40nm至约150nm；任选地，其中所述多个脂质纳米颗粒的平均大小为约50nm至约100nm；任选地，其中所述多个颗粒的平均大小为约95nm；
(b)其中所述核酸的包封效率为至少约50％；任选地，其中所述核酸的包封效率为至少约80％；任选地，其中所述核酸的包封效率为至少约90％；
以及/或者
(c)其中所述脂质纳米颗粒的多分散性指数(PDI)为约0至约0.25；任选地，其中所述脂质纳米颗粒的PDI小于0.1；任选地，其中所述组合物的PDI小于0.05。
28.一种在哺乳动物细胞或哺乳动物的组织中表达mRNA的方法，所述方法包括
(a)将所述mRNA配制于纳米颗粒组合物中的多个脂质纳米颗粒内，所述纳米颗粒组合物包含摩尔比为约5-40％的鞘磷脂、约30％至55％的阳离子脂质；约20％至50％的类固醇；以及约0.5％至3％的聚合物结合的脂质；
(b)将所述纳米颗粒组合物递送至所述哺乳动物细胞或所述哺乳动物；并且
其中所述递送的mRNA在所述哺乳动物细胞中或在所述哺乳动物中表达。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述纳米颗粒组合物包含
(a)摩尔比为约10-40％的鞘磷脂、约35％至50％的阳离子脂质；约30％至50％的类固醇；以及约0.5-2％的聚合物结合的脂质；
(b)摩尔比为约10-30％的鞘磷脂、约35％至45％的阳离子脂质；约35％至45％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质；
(c)摩尔比为约10％的鞘磷脂、约50％的阳离子脂质；约38.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质；
(d)摩尔比为约10％的鞘磷脂、约45％的阳离子脂质；约43.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质；
(e)摩尔比为约10％的鞘磷脂、约40％的阳离子脂质；约48.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质；
(f)摩尔比为约15％的鞘磷脂、约45％的阳离子脂质；约38.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质；
(g)摩尔比为约15％的鞘磷脂、约40％的阳离子脂质；约43.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质；
(h)摩尔比为约20％的鞘磷脂、约45％的阳离子脂质；约33.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质；
(i)摩尔比为约20％的鞘磷脂、约40％的阳离子脂质；约38.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质；
(j)摩尔比为约5％的鞘磷脂、约45％的阳离子脂质；约48.5％的类固醇；以及约1.5％的聚合物结合的脂质；
或
(k)摩尔比为约5％的鞘磷脂、约45％的阳离子脂质；约43.5％的类固醇；约1.5％的聚合物结合的脂质，以及约5％的不是鞘磷脂的第二磷脂脂质；其中任选地，所述第二磷脂为1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述鞘磷脂为鞘磷脂化合物；任选地，其中所述鞘磷脂选自表X中的SM-01、SM-02、SM-03、SM-04、SM-05、SM-06和SM-07。
31.如权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述类固醇为胆固醇或胆固醇衍生物。
32.如权利要求28至31中任一项所述的方法，其中所述阳离子脂质是根据选自01-I、01-II、02-I、02-II、03-I、03-II-A、03-II-B、03-II-C、03-II-D、04-I、04-III、04-IV、05-I、06-I和其子式的任一式的化合物，或者其中所述阳离子脂质是选自表1至表5中的任一者中列出的化合物的化合物。
33.如权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述聚合物结合的脂质为DMG-PEG2000或DMPE-PEG2000。
34.一种脂筏纳米颗粒(LRNP)，其包含
(a)鞘磷脂；以及
(b)类固醇；以及
至少一种不是鞘磷脂或类固醇的第一脂质组分；
其中所述LRNP具有异质结构，所述异质结构包含至少一个包含所述鞘磷脂和所述类固醇的液体有序(Lo)域和至少一个包含所述第一脂质组分的液体无序(Ld)区。
35.如权利要求34所述的LRNP，
(a)其中如与所述Ld区相比，所述Lo域包含较高鞘磷脂浓度；以及/或者
(b)其中如与所述Ld区相比，所述Lo域包含较高类固醇浓度。
36.如权利要求34或35所述的LRNP，其中在电子显微术下，
(a)所述Ld区为电子致密的；
(b)所述Lo域不是电子致密的；
(c)所述Lo域呈现单层或多层结构；
以及/或者
(d)所述LRNP呈现半层状形态。
37.如权利要求34至36中任一项所述的LRNP，其中如与参考颗粒相比，所述LRNP由细胞以较高水平吸收；任选地，其中所述LRNP由所述细胞内吞。
38.如权利要求37所述的LRNP，其还包含核酸。
39.如权利要求38所述的LRNP，其中所述核酸编码RNA或蛋白质；并且其中在哺乳动物细胞或哺乳动物的组织中从所述核酸表达的RNA或蛋白质的量大于从配制于核酸-脂质参考颗粒中的所述核酸表达的RNA或蛋白质的量，所述核酸-脂质参考颗粒具有与所述LRNP相同的脂质组成，除了鞘磷脂由相等摩尔百分率的第二磷脂置换。
40.如权利要求39所述的LRNP，其中所述第二磷脂为DSPC。
41.如权利要求34至40中任一项所述的LRNP，其中所述鞘磷脂占存在于所述LRNP中的总脂质的约5-40mol％。
42.如权利要求34至41中任一项所述的LRNP，其中所述类固醇占存在于所述颗粒中的总脂质的约20mol％至50mol％。
43.如权利要求34至42中任一项所述的LRNP，其中所述第一脂质组分包含
(c)阳离子脂质；以及
(d)聚合物结合的脂质。
44.如权利要求43所述的LRNP，其中所述阳离子脂质占存在于所述颗粒中的总脂质的约30mol％至55mol％。
45.如权利要求43所述的LRNP，其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述颗粒中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
46.一种纳米颗粒组合物，其包含
(a)占存在于所述组合物中的总脂质的约5-40mol％的鞘磷脂；以及
(b)类固醇；以及
至少一种不是鞘磷脂或类固醇的第一脂质组分；
其中所述组合物中的至少约50％的脂质纳米颗粒在电子显微术下具有半层状形态。
47.如权利要求46所述的纳米颗粒组合物，其中所述第一脂质组分包含
(c)阳离子脂质；以及
(d)聚合物结合的脂质。
48.如权利要求46或 47所述的纳米颗粒组合物，其中所述类固醇占存在于所述颗粒中的总脂质的约20mol％至50mol％。
49.如权利要求47所述的纳米颗粒组合物，其中所述阳离子脂质占存在于所述颗粒中的总脂质的约30mol％至55mol％。
50.如权利要求47所述的纳米颗粒组合物，其中所述聚合物结合的脂质占存在于所述颗粒中的总脂质的约0.5mol％至3mol％。
51.如权利要求46至50中任一项所述的纳米颗粒组合物，其还包含
(e)核酸。
52.一种纳米颗粒组合物，其包含(a)鞘磷脂，(b)阳离子脂质，(c)类固醇；(d)聚合物结合的脂质；以及(e)核酸，
其中所述阳离子脂质是选自表Y中的化合物的化合物。
53.一种纳米颗粒组合物，其包含(a)鞘磷脂，(b)阳离子脂质，(c)类固醇；(d)聚合物结合的脂质；以及(e)核酸，
其中所述阳离子脂质是选自表Y中的化合物的化合物；
其中所述类固醇为胆固醇；并且
其中所述聚合物结合的脂质为DMG-PEG。
54.如权利要求52或53所述的纳米颗粒组合物，其中所述鞘磷脂为鞘磷脂化合物；任选地，其中所述鞘磷脂化合物选自表X中的化合物。
CN202280024207.5A 2021-10-08 2022-10-07 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物 Pending CN117202895A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2021/122690 2021-10-08
CN2021122690 2021-10-08
CN2022117968 2022-09-09
CNPCT/CN2022/117968 2022-09-09
PCT/CN2022/123721 WO2023056914A1 (en) 2021-10-08 2022-10-07 Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117202895A true CN117202895A (zh) 2023-12-08

Family

ID=83995518

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280024207.5A Pending CN117202895A (zh) 2021-10-08 2022-10-07 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物

Country Status (8)

Country Link
EP (1) EP4203924A1 (zh)
KR (1) KR20240070580A (zh)
CN (1) CN117202895A (zh)
AR (1) AR127312A1 (zh)
AU (1) AU2022359426A1 (zh)
CA (1) CA3234156A1 (zh)
TW (1) TW202329986A (zh)
WO (1) WO2023056914A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114891808B (zh) * 2022-06-21 2023-10-27 珠海丽凡达生物技术有限公司 编码ALDH2多肽的mRNA分子、应用及mRNA药物

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU744755B2 (en) 1997-11-12 2002-03-07 Brigham And Women's Hospital The translation enhancer element of the human amyloid precursor protein gene
CA2398790A1 (en) 2000-01-28 2001-08-02 The Scripps Research Institute Methods of identifying synthetic transcriptional and translational regulatory elements, and compositions relating to same
US7468275B2 (en) 2000-01-28 2008-12-23 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
EP1604688B1 (de) 2001-06-05 2010-02-03 CureVac GmbH Stabilisierte Tumorantigen-mRNA mit erhöhtem G/C-Gehalt
DE10162480A1 (de) 2001-12-19 2003-08-07 Ingmar Hoerr Die Applikation von mRNA für den Einsatz als Therapeutikum gegen Tumorerkrankungen
WO2004002453A1 (en) 2002-06-28 2004-01-08 Protiva Biotherapeutics Ltd. Method and apparatus for producing liposomes
DE10229872A1 (de) 2002-07-03 2004-01-29 Curevac Gmbh Immunstimulation durch chemisch modifizierte RNA
DE10335833A1 (de) 2003-08-05 2005-03-03 Curevac Gmbh Transfektion von Blutzellen mit mRNA zur Immunstimulation und Gentherapie
DE102004042546A1 (de) 2004-09-02 2006-03-09 Curevac Gmbh Kombinationstherapie zur Immunstimulation
DE102005023170A1 (de) 2005-05-19 2006-11-23 Curevac Gmbh Optimierte Formulierung für mRNA
AU2006274413B2 (en) 2005-07-27 2013-01-10 Arbutus Biopharma Corporation Systems and methods for manufacturing liposomes
WO2007025008A2 (en) 2005-08-24 2007-03-01 The Scripps Research Institute Translation enhancer-element dependent vector systems
DE102006007433A1 (de) 2006-02-17 2007-08-23 Curevac Gmbh Adjuvanz in Form einer Lipid-modifizierten Nukleinsäure
JP2009544754A (ja) 2006-07-28 2009-12-17 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー ジヌクレオチドｍｒｎａキャップアナログ
WO2008014979A2 (en) 2006-07-31 2008-02-07 Curevac Gmbh NUCLEIC ACID OF FORMULA (I): GIXmGn, OR (II): CIXmCn, IN PARTICULAR AS AN IMMUNE-STIMULATING AGENT/ADJUVANT
DE102006051516A1 (de) 2006-10-31 2008-05-08 Curevac Gmbh (Basen-)modifizierte RNA zur Expressionssteigerung eines Proteins
DE102006061015A1 (de) 2006-12-22 2008-06-26 Curevac Gmbh Verfahren zur Reinigung von RNA im präparativen Maßstab mittels HPLC
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
WO2008127688A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Hart Communication Foundation Synchronizing timeslots in a wireless communication protocol
WO2009030254A1 (en) 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
CA2708766C (en) 2007-12-11 2016-02-02 The Scripps Research Institute Compositions and methods related to mrna translational enhancer elements
SG188104A1 (en) 2008-01-31 2013-03-28 Curevac Gmbh Nucleic acids comprising formula (nuglxmgnnv)a and derivatives thereof as an immunostimulating agents /adjuvants
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
WO2010037408A1 (en) 2008-09-30 2010-04-08 Curevac Gmbh Composition comprising a complexed (m)rna and a naked mrna for providing or enhancing an immunostimulatory response in a mammal and uses thereof
CN104910025B (zh) 2008-11-07 2019-07-16 麻省理工学院 氨基醇类脂质和其用途
WO2010054384A1 (en) 2008-11-10 2010-05-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids and compositions for the delivery of therapeutics
WO2010088927A1 (en) 2009-02-09 2010-08-12 Curevac Gmbh Use of pei for the improvement of endosomal release and expression of transfected nucleic acids, complexed with cationic or polycationic compounds
EP2281579A1 (en) 2009-08-05 2011-02-09 BioNTech AG Vaccine composition comprising 5'-Cap modified RNA
US20110053829A1 (en) 2009-09-03 2011-03-03 Curevac Gmbh Disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates for the transfection of nucleic acids
EP2509636B1 (en) 2009-12-07 2017-07-19 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
WO2011069529A1 (en) 2009-12-09 2011-06-16 Curevac Gmbh Mannose-containing solution for lyophilization, transfection and/or injection of nucleic acids
WO2011141704A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
EP2387999A1 (en) 2010-05-21 2011-11-23 CureVac GmbH Histidine-containing solution for transfection and/or injection of nucleic acids and uses thereof
US20130230884A1 (en) 2010-07-16 2013-09-05 John Chaput Methods to Identify Synthetic and Natural RNA Elements that Enhance Protein Translation
ES2558106T3 (es) 2010-07-30 2016-02-02 Curevac Ag Formación de complejos de ácidos nucleicos con componentes catiónicos disulfuro-reticulados para la transfección e inmunoestimulación
WO2012019630A1 (en) 2010-08-13 2012-02-16 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded protein
WO2012089225A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Curevac Gmbh Combination of vaccination and inhibition of mhc class i restricted antigen presentation
WO2012116715A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in newborns and infants
WO2012113413A1 (en) 2011-02-21 2012-08-30 Curevac Gmbh Vaccine composition comprising complexed immunostimulatory nucleic acids and antigens packaged with disulfide-linked polyethyleneglycol/peptide conjugates
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
WO2013016058A1 (en) 2011-07-22 2013-01-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel bis-nitrogen containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
US20140308304A1 (en) 2011-12-07 2014-10-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
WO2013103659A1 (en) 2012-01-04 2013-07-11 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Stabilizing rna by incorporating chain-terminating nucleosides at the 3'-terminus
EP2623121A1 (en) 2012-01-31 2013-08-07 Bayer Innovation GmbH Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and an antigen
WO2013113326A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Pharmaceutical composition comprising a polymeric carrier cargo complex and at least one protein or peptide antigen
WO2013113325A1 (en) 2012-01-31 2013-08-08 Curevac Gmbh Negatively charged nucleic acid comprising complexes for immunostimulation
WO2013120499A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly (a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded pathogenic antigen
WO2013120498A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
WO2013120500A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded tumour antigen
WO2013120497A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded therapeutic protein
SG11201405542UA (en) 2012-03-27 2014-10-30 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules
RU2658490C2 (ru) 2012-03-27 2018-06-21 Кьюрвак Аг Искусственные молекулы нуклеиновых кислот для улучшенной экспрессии белков или пептидов
SG11201405545XA (en) 2012-03-27 2014-11-27 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules comprising a 5'top utr
EP3620447B1 (en) 2012-03-29 2021-02-17 Translate Bio, Inc. Ionizable cationic lipids
WO2013174409A1 (en) 2012-05-25 2013-11-28 Curevac Gmbh Reversible immobilization and/or controlled release of nucleic acid containing nanoparticles by (biodegradable) polymer coatings
DK2958588T3 (da) 2013-02-22 2017-11-20 Curevac Ag Kombination af vaccination og hæmning af PD-1-reaktionsvejen
KR102310921B1 (ko) 2013-03-14 2021-10-13 다이서나 파마수이티컬, 인크. 음이온성 약제를 제형화하는 방법
WO2015002667A1 (en) 2013-07-01 2015-01-08 Myq, Inc. A location regulated point-of-sale system and enhancements
CN110974981A (zh) 2013-07-23 2020-04-10 野草莓树生物制药公司 用于递送信使rna的组合物和方法
KR20160043103A (ko) 2013-08-21 2016-04-20 큐어백 아게 전립선암 치료를 위한 조성물 및 백신
AU2014310935B2 (en) 2013-08-21 2019-11-21 CureVac SE Combination vaccine
SG10201801428RA (en) 2013-08-21 2018-03-28 Curevac Ag Method for increasing expression of rna-encoded proteins
BR112016003361A2 (pt) 2013-08-21 2017-11-21 Curevac Ag vacina do vírus sincicial respiratório (rsv)
MX369154B (es) 2013-08-21 2019-10-30 Curevac Ag Composición y vacuna para tratar cáncer de pulmón.
RU2712743C2 (ru) 2013-08-21 2020-01-30 Куревак Аг Вакцина против бешенства
ES2806575T3 (es) 2013-11-01 2021-02-18 Curevac Ag ARN modificado con propiedades inmunoestimuladoras disminuidas
US9365610B2 (en) 2013-11-18 2016-06-14 Arcturus Therapeutics, Inc. Asymmetric ionizable cationic lipid for RNA delivery
EP3872066A1 (en) 2013-12-19 2021-09-01 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
EP3083579B1 (en) 2013-12-19 2022-01-26 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
JP6704850B2 (ja) 2013-12-30 2020-06-03 キュアバック アーゲー 人工核酸分子
WO2015101415A1 (en) 2013-12-30 2015-07-09 Curevac Gmbh Artificial nucleic acid molecules
SG11201604198YA (en) 2013-12-30 2016-07-28 Curevac Ag Methods for rna analysis
EP3587409B8 (en) 2014-05-30 2022-07-13 Translate Bio, Inc. Biodegradable lipids for delivery of nucleic acids
ES2834556T3 (es) 2014-06-25 2021-06-17 Acuitas Therapeutics Inc Lípidos y formulaciones de nanopartículas lipídicas novedosos para la entrega de ácidos nucleicos
AU2016253972B2 (en) 2015-04-27 2020-01-02 Acuitas Therapeutics Inc. Nucleoside-modified RNA for inducing an adaptive immune response
JP7072386B2 (ja) 2015-06-29 2022-05-20 アクイタス セラピューティクス インコーポレイテッド 核酸の送達のための脂質および脂質ナノ粒子製剤
HRP20220156T1 (hr) 2015-09-17 2022-04-15 Modernatx, Inc. Spojevi i pripravci za unutarstaničnu isporuku terapeutskih sredstava
WO2018081480A1 (en) * 2016-10-26 2018-05-03 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
CN108368028B (zh) 2015-10-28 2021-09-03 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的新型脂质和脂质纳米颗粒制剂
DK3394030T3 (da) 2015-12-22 2022-03-28 Modernatx Inc Forbindelser og sammensætninger til intracellulær afgivelse af midler
US20190167811A1 (en) 2016-04-13 2019-06-06 Modernatx, Inc. Lipid compositions and their uses for intratumoral polynucleotide delivery
US20180185516A1 (en) 2016-12-09 2018-07-05 Sangamo Therapeutics, Inc. Delivery of target specific nucleases
US10383952B2 (en) 2016-12-21 2019-08-20 Arcturus Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipid for RNA delivery
CA3073020A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
JP6826014B2 (ja) 2017-09-13 2021-02-03 株式会社東芝 生分解性化合物、脂質粒子、脂質粒子を含む組成物、およびキット
WO2019089828A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lamellar lipid nanoparticles
JP7164547B2 (ja) 2017-12-27 2022-11-01 エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 カチオン性脂質
US20200331841A1 (en) 2017-12-28 2020-10-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Cationic lipids
WO2020002525A1 (en) 2018-06-27 2020-01-02 Curevac Ag Novel lassa virus rna molecules and compositions for vaccination
WO2020061367A1 (en) 2018-09-19 2020-03-26 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
JP7387745B2 (ja) 2018-10-01 2023-11-28 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 活性物質の送達のための生分解性脂質
CN113474328A (zh) 2019-01-11 2021-10-01 爱康泰生治疗公司 用于脂质纳米颗粒递送活性剂的脂质
US20230097090A1 (en) * 2019-08-14 2023-03-30 Acuitas Therapeutics, Inc. Improved lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
MX2022012630A (es) 2020-04-09 2022-11-07 Suzhou Abogen Biosciences Co Ltd Composicion de nanoparticulas lipidicas.
WO2022152109A2 (en) 2021-01-14 2022-07-21 Suzhou Abogen Biosciences Co., Ltd. Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022359426A1 (en) 2024-05-02
CA3234156A1 (en) 2023-04-13
WO2023056914A1 (en) 2023-04-13
EP4203924A1 (en) 2023-07-05
AR127312A1 (es) 2024-01-10
TW202329986A (zh) 2023-08-01
KR20240070580A (ko) 2024-05-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN114206827B (zh) 脂质纳米颗粒组合物
CN114391008B (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CN113939282A (zh) 制备脂质纳米颗粒的方法
CN111315359A (zh) 制备脂质纳米颗粒的方法
CN114206463B (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CN116615472A (zh) 聚合物缀合的脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CN118043306A (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
WO2024022263A1 (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CN116323627A (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CN117202895A (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
WO2023116804A1 (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
TW202330457A (zh) 脂質化合物和脂質奈米顆粒組合物
CN116472275A (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CN117580587A (zh) 基于源自SARS-CoV-2奥密克戎毒株的序列的冠状病毒核酸疫苗
CN116940685A (zh) 基于源自SARS-CoV-2 Beta和Delta毒株的序列的冠状病毒多价核酸疫苗
US20240218399A1 (en) Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
WO2024083171A1 (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
WO2024083172A1 (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
WO2024109798A1 (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
CN117069785A (zh) 脂质化合物和脂质纳米颗粒组合物
WO2024037578A1 (en) Composition of lipid nanoparticles
WO2024140624A1 (en) Lipid compounds and lipid nanoparticle compositions
CN117083291A (zh) 基于源自SARS-CoV-2 Delta毒株的序列的冠状病毒核酸疫苗
KR20240090186A (ko) 지질 화합물 및 지질 나노 입자 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination