CN117187437A - 一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物及其应用。本发明依据柑橘相关弹状病毒的病毒RNA依赖的RNA聚合酶基因(RNA‑dependent RNA polymerase,L)区域，设计了特异性扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1‑2所示。该引物可快速、精准、灵敏检测柑橘相关弹状病毒。
Description
技术领域
本发明属于植物病毒检测技术领域，具体涉及一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物及其应用。
背景技术
柑橘相关弹状病毒(Citrus-associated rhabdovirus,CiaRV)首先在西番莲、柑橘和结香中被发现报道。该病毒主要通过嫁接、扦插等无性繁殖方式在柑橘以及西番莲中传播(尚未证实存在媒介昆虫)。目前研究结果显示，柑橘在感染CiaRV后未表现明显症状，西番莲和结香则分别表现为黄斑以及褪绿黄斑等叶片症状。
CiaRV为负链RNA病毒，属弹状病毒科，细胞质弹状病毒属，其基因组结构与其他植物弹状病毒相似，包含五种典型的结构蛋白。通过比较了CiaRV的基因组序列，最终在分类上将其归入番木瓜细胞质弹状病毒。
研究显示，植物弹状病毒具有感染多种草本和木本植物的能力，在感染植物后会对寄主植物造成一定损害，最终给农业生产带来巨大的经济损失。
柑橘和西番莲均是我国重要的经济作物。作为柑橘原产地之一，我国柑橘的产量和面积均居世界第一。近年来，我国的西番莲种植面积也随着国内外对西番莲的需求不断增长而扩大。随着柑橘与西番莲种植面积的扩大，病毒病发生、传播和扩散的风险也不断扩大。由于柑橘和西番莲在生产上常采用嫁接和扦插等方式育苗，因此该病毒也可能通过以上途径进行大范围或远距离传播。
目前对于CiaRV的致病机制及其对柑橘以及西番莲的影响尚不明确，为了预防和控制病毒的发生与传播，建立相关病毒的快速检测方法，加强病毒的早期检测，对于及时制定有效的防治措施具有重要意义。
实时荧光定量PCR(Real Time Quantitative PCR，RT-qPCR)是病毒检测中应用最广泛的技术之一，该方法快速、准确，且具有较高的检测灵敏度等优点。其灵敏度较普通RT-PCR高100倍，能对未知样品进行定量分析，为病毒的早期检测及防控预警提供相应的技术支撑。但该方法在CiaRV病毒检测方面的应用，国内外至今尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何检测甜瓜内源病毒、或如何检测待测植物样本是否感染柑橘相关弹状病毒。为了解决上述技术问题，本发明依据CiaRV的病毒RNA依赖的RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNA polymerase,L)区域，设计了特异性扩增引物，可快速、精准、灵敏检测该病毒。
本发明第一方面，提供一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1-2所示。
本发明第二方面，提供所述引物在如下a1或a2中的应用：
a1、检测柑橘相关弹状病毒；
a2、制备检测柑橘相关弹状病毒的制剂。
进一步的，a1是指：
检测待测植物材料是否感染柑橘相关弹状病毒；或
检测待测病毒是否为柑橘相关弹状病毒。
本发明第三方面，提供一种检测植物材料是否感染柑橘相关弹状病毒的方法，包括以下步骤：
b1、采用权利要求1所述的引物对所述植物材料的核酸进行PCR扩增；
b2、根据所述扩增的产物确定所述植物材料是否感染柑橘相关弹状病毒。
进一步的，所述植物材料为柑橘或西番莲的叶片。
进一步的，所述核酸为所述植物材料的总RNA。
进一步的，所述PCR为RT-qPCR。
更进一步的，所述RT-qPCR总体系为20μL：FastStart Essential DNA GreenMaster 10μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，模板cDNA 1μL，RNase-free ddH2O 8μL补足体系至20μL。
更进一步的，所述RT-qPCR反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性10s；60℃退火10s，72℃延伸10s，45个循环。
进一步的，PCR结束后进行实时荧光定量检测，得到熔解曲线，熔解曲线分析在66℃-96℃，每升高0.5℃检测1次荧光信号，所得溶解曲线在81℃时为单一峰，说明植物材料感染柑橘相关弹状病毒，反之则没有感染或植物材料感染柑橘相关弹状病毒的浓度没有达到检测限。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明首次提供了专用于CiaRV病毒检测的实时荧光定量PCR检测方法。本发明选取的扩增靶序列是CiaRV病毒编码的RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(RNA-dependent RNApolymerase,L)基因，本发明中采用的引物能够准确、灵敏、快速的检测柑橘相关弹状病毒。
附图说明
图1为实施例1的CiaRV四对qPCR引物扩增产物电泳图谱。
图2为实施例1的CiaRV四对qPCR引物扩增曲线。
图3为实施例2的稀释不同倍数的样品cDNA的扩增曲线。
图4为实施例2的稀释不同倍数的样品cDNA扩增产物电泳图谱。
图5为实施例3的稀释不同倍数的质粒标准品的扩增曲线(a)和溶解曲线(b)。
图6为实施例4的CiaRV qPCR标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明根据CiaRV的病毒RNA依赖的RNA聚合酶基因(RNA-dependent RNApolymerase,L)区域，设计了特异性扩增引物，
用于定量检测检测鉴定CiaRV的特异性引物序列为：
CiaRV-F8(SEQ ID NO.1)：5＇-GAATCTCCCGCATATAGTGG-3＇；
CiaRV-R8(SEQ ID NO.2)：5＇-GGTACCTACTGAGTTTAACGC-3＇。
另外设计了F5/R5、F6/R6和F7/R7三组引物作为对照。
CiaRV-F5(SEQ ID NO.3)：5＇-GACTCATCTTAAAGACACGG-3＇
CiaRV-R5(SEQ ID NO.4)：5＇-CTCGAGCATACTTCACGTAG-3＇
CiaRV-F6(SEQ ID NO.5)：5＇-TTTGCCTTGTTTGAACTCCC-3＇
CiaRV-R6(SEQ ID NO.6)：5＇-CGTTCCTTATCAATAGCCGTG-3＇
CiaRV-F7(SEQ ID NO.7)：5＇-CATTCTGCTATACGACCTC-3＇
CiaRV-R7(SEQ ID NO.8)：5＇-TATCATGGAGTACACGACCAG-3＇。
实施例1：待测植物材料检测
1、模板RNA的提取
模板RNA的提取操作参照诺维赞RNA-easy Isolation Reagent说明书，具体步骤如下：
(1)称取0.1g左右新鲜干净感染CiaRV的柑橘或西番莲叶片至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状；
(2)将研磨成粉的样品转移至1.5mL无酶离心管中，加入500μL RNA-easyIsolation Reagent，剧烈振荡使样品充分裂解；
(3)向上述裂解液中加入2/5体积的RNase-free ddH2O(每500μL RNA-easyIsolation Reagent使用200μL)，上下颠倒混匀，室温静置5min；
(4)12000rpm室温离心15min，取640 4L上清液于1.5mL无酶离心管中,加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min；
(5)12000rpm室温离心15min，弃去上清，加入700清，加入m上乙醇(RNase-freeddH2O配制)，轻弹管底，悬浮沉淀，并上下颠倒数次；
(6)8000rpm室温离心3min，弃去上清；
(7)重复步骤5和6一遍；
(8)瞬时离心10s，用10离心；移液枪吸出多余乙醇后室温放置晾干，加入适量RNase-free ddH2O溶解沉淀，用移液枪吹打，使RNA沉淀充分溶解；
(9)总RNA采用Nanodrop 2000检测其浓度和纯度，-20℃保存。
2、cDNA的制备
(1)在无酶PCR管中配制反转录预混液，反应体系如下：6N Primer 1μL，dNTPs(2.5mM)1μL，模板RNA 3μL，RNase-free ddH2O 5μL，反应液的总体积为10μL；
(2)将上述反应管放于PCR仪器反应槽中，设定程序：65℃解链5min，0℃3min。
(3)再向上述预混液中加入配制好的反转录反应液，反应液体系为：transcription buffer 4μL，RNase Inhibitor(40U/μL)0.5μL，RTase M-MLV(RNase H-)1μL，RNase-free ddH2O 4.5μL；
(4)将上述混合液置于PCR仪器反应槽中，设定程序：30℃，10min；42℃，1h；70℃15min，反应所得cDNA，保存于-20℃以备用。
3、实时荧光定量PCR扩增反应体系
实时荧光定量PCR反应体系总体系为20体系：FastStart Essential DNA GreenMaster 10μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，模板cDNA 1μL，RNase-free ddH2O补足体系至20μL。
4、实时荧光定量PCR扩增反应程序
95℃预变性10min，95℃变性10s，60℃退火10s，72℃延伸10s，45个循环。
如图1-2所示，四对引物分别进行RT-PCR与RT-qPCR扩增，扩增结果显示F8/R8扩增效率最好，因此将F8/R8作为CiaRV qPCR检测引物。
实施例2：CiaRV RT-qPCR引物扩增灵敏度分析
将CiaRV感病叶片RNA模板反转录后调整cDNA浓度至100ng/μL，以该cDNA为模板进行10倍梯度稀释后用RT-qPCR引物(F8/R8)进行PCR扩增，结果如图3-4所示，该qPCR引物与常规PCR法相比，其灵敏度提高了100倍。
实施例3：溶解曲线和扩增曲线的建立
1)选取GenBank中CiaRV分离株PF1(MT302541)RNA依赖的RNA聚合酶基因序列进行克隆，经测序分析确认得到阳性菌液后进行质粒提取，测定质粒浓度后稀释至1.375ng/μL，起始拷贝数为1.276×109copies/μL，将其作为质粒标准品，10倍梯度稀释后进行RT-qPCR扩增，体系和程序同实施例1。
2)步骤1)的PCR程序结束后仪器自动进行实时荧光定量检测，得到熔解曲线和扩增曲线。熔解曲线分析：66℃～96℃，每升高0.5℃检测1次荧光信号。
结果如图5所示，该引物最低可检测到浓度为1.276×103copies/μL的质粒模板。
实施例4：标准曲线的建立
选取GenBank中CiaRV分离株PF1(MT302541)RNA依赖的RNA聚合酶基因序列进行克隆，经测序分析确认得到阳性菌液后进行质粒纯化。纯化所得CiaRV质粒经紫外可见分光光度计(NanoDrop 2000C)检测浓度和纯度，并根据摩尔定律计算质粒拷贝数。起始拷贝数为1.276×109copies/μL，将其作为质粒标准品，10倍梯度稀释。1.276×101～1.276×109copies/μL质粒为模板进行定量PCR，每一浓度设定3个重复，制作标准曲线。
如图6所示，线性方程为：y＝-3.4529x+42.276，标准曲线斜率为-3.4529，决定系数R2＝0.9948，说明该引物的重复性较好。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ IDNO.1-2所示。
2.权利要求1所述引物在如下a1或a2中的应用：
a1、检测柑橘相关弹状病毒；
a2、制备检测柑橘相关弹状病毒的制剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，a1是指：
检测待测植物材料是否感染柑橘相关弹状病毒；或
检测待测病毒是否为柑橘相关弹状病毒。
4.一种检测植物材料是否感染柑橘相关弹状病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
b1、采用权利要求1所述的引物对所述植物材料的核酸进行PCR扩增；
b2、根据所述扩增的产物确定所述植物材料是否感染柑橘相关弹状病毒。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述植物材料为柑橘或西番莲的叶片。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述核酸为所述植物材料的总RNA。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR为RT-qPCR。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RT-qPCR总体系为20μL：FastStartEssential DNAGreen Master 10μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5μL，模板cDNA 1μL，RNase-free ddH2O 8μL补足体系至20μL。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述RT-qPCR反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性10s,60℃退火10s，72℃延伸10s，45个循环。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR结束后进行实时荧光定量检测，得到熔解曲线，熔解曲线分析在66℃-96℃，每升高0.5℃检测1次荧光信号，所得溶解曲线在81℃时为单一峰，说明植物材料感染柑橘相关弹状病毒，反之则没有感染或植物材料感染柑橘相关弹状病毒的浓度没有达到检测限。
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| CN202211071410.6A Pending CN117187437A (zh) | 2022-09-02 | 2022-09-02 | 一种用于检测柑橘相关弹状病毒的引物及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117187437A (zh) |
-
2022
- 2022-09-02 CN CN202211071410.6A patent/CN117187437A/zh active Pending
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