CN117187337A - 一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用 - Google Patents
一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117187337A CN117187337A CN202311136600.6A CN202311136600A CN117187337A CN 117187337 A CN117187337 A CN 117187337A CN 202311136600 A CN202311136600 A CN 202311136600A CN 117187337 A CN117187337 A CN 117187337A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polycosanol
- group
- oxidative stress
- evaluation method
- vitro evaluation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 title claims abstract description 21
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims abstract description 15
- CNNRPFQICPFDPO-UHFFFAOYSA-N octacosan-1-ol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCO CNNRPFQICPFDPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 229960002666 1-octacosanol Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 claims abstract description 17
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 14
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 28
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 claims description 18
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 claims description 17
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 claims description 16
- 230000035882 stress Effects 0.000 claims description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 10
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 9
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 7
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 claims 2
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000028974 hepatocyte apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 1
- 208000000112 Myalgia Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 235000013871 bee wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000012166 beeswax Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 208000013465 muscle pain Diseases 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 150000002831 nitrogen free-radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000004170 rice bran wax Substances 0.000 description 1
- 235000019384 rice bran wax Nutrition 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010497 wheat germ oil Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明提供了一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用，属于药物评价及应用技术领域。本发明首次使用普利醇(40％二十八烷醇)作为缓解肝细胞氧化应激的物质，通过一套完整的体外评价方法，最终筛选出普利醇(40％二十八烷醇)的有效处理剂量为100ppm。本发明中的体外评价方法干扰因素单一，结果准确、稳定，更利于普利醇(40％二十八烷醇)功能的评定，而且为普利醇(40％二十八烷醇)在肝脏氧化应激改善药物制备中的应用提供了理论基础。
Description
技术领域
本发明属于药物评价及应用技术领域，尤其涉及一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用。
背景技术
氧化应激(Oxidative Stress，OS)是生物体细胞在遇到种种刺激时，机体内产生高水平高活性物质，如活性氧、氮自由基等，导致机体内氧化-还原反应速率失衡，各种氧化物导致的氧化速度超出了机体抗氧化能力，最终导致氧化应激损伤人体组织，被认为是导致衰老和疾病的一个重要因素，也是肿瘤及其他一系列疾病发生的重大起因。氧化应激对机体的肝脏功能有负面作用，参与多种肝脏疾病的形成发展过程。机体发生氧化应激时，大量的氧自由基在肝细胞内蓄积，通过损伤生物大分子物质、破坏肝细胞结构、影响细胞器功能、诱发肝细胞凋亡等，对肝脏造成严重损伤，并引发多种肝脏疾病。
普利醇是天然存在的高级醇，外观为白色粉末或鳞片状晶体，可溶于有机溶剂，不溶于水，主要存在于蔗蜡、米糠蜡、小麦胚芽油、蜂蜡及虫蜡等天然产物中。多项研究表明普利醇具有良好的生物降解性，易为动物吸收及广泛分布于动物的表皮与内脏，增强新陈代谢率、降低肌肉摩擦、消除肌肉疼痛等生理功能，但其改善肝脏氧化应激研究较少，评价其缓解肝脏氧化应激的方法缺乏。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用。本发明首次使用普利醇(40％二十八烷醇)作为缓解肝细胞氧化应激的物质，通过一套完整的体外评价方法，最终筛选出普利醇(40％二十八烷醇)的有效处理剂量为100ppm。本发明中的体外评价方法干扰因素单一，结果准确、稳定，更利于普利醇功能的评定，而且为普利醇在肝脏氧化应激改善药物制备中的应用提供了理论基础。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明提供了一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法，包括以下步骤：
(1)选择适宜肝细胞；
(2)分别设置对照组、应激组和普利醇组进行处理；所述对照组、应激组和普利醇组的设置方法为：对照组中的肝细胞培养基为基础培养基，应激组中的肝细胞培养基在基础培养基的基础上添加导致氧化应激的药液，普利醇组中的肝细胞培养基在基础培养基的基础上同时添加导致氧化应激的药液和普利醇；
(3)处理完成后分别测定各处理组细胞活性、细胞凋亡率、细胞内ROS含量；
(4)当普利醇组细胞活性、细胞凋亡率、细胞内ROS含量至少达到对照组水平时，普利醇对氧化应激具有改善效果。
进一步的，所述步骤(1)中选择的是NCTC1469肝细胞系。
再进一步的，所述步骤(2)中导致氧化应激的药液为地塞米松(DEX)，在应激组和普利醇组中的添加量都为10μM；普利醇组中添加的普利醇为40％二十八烷醇含量。
更进一步的，所述步骤(2)中的基础培养基的成分组成如下表所示：
又进一步的，所述步骤(2)中的处理时间为5.5～6.5h。
更进一步的，所述步骤(2)中的处理时间为6h。
本发明还提供了一种所述体外评价方法在肝脏氧化应激改善药物筛选中的应用。
进一步的，所述应用中使用所述体外评价方法最终筛选出普利醇(40％二十八烷醇)的有效处理剂量为100ppm。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
本发明首次使用普利醇(40％二十八烷醇)作为缓解肝细胞氧化应激的物质，通过一套完整的体外评价方法，最终筛选出普利醇(40％二十八烷醇)的有效处理剂量为100ppm。本发明中的体外评价方法干扰因素单一，结果准确、稳定，更利于普利醇功能的评定，而且为普利醇在肝脏氧化应激改善药物制备中的应用提供了理论基础。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同处理组对肝细胞活性的影响对比图；
图2～图3为本发明实施例1中不同处理组对肝细胞凋亡情况的影响对比图；
图4为本发明实施例1中不同处理组对肝细胞内ROS含量的影响对比图；
图5为本发明实施例1中不同处理组对肝细胞内SOD、GSH-Px、MDA的影响对比图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。以下实施例中使用的试剂/仪器均可由市售获得，实施例中使用的方法如无特别说明，与常规使用的方法一致。
下面结合实施例，对本发明的技术方案进行进一步详细阐述。
实施例1
一、试验内容
1试验设计
购买NCTC1469肝细胞系，培养肝细胞至生长到80％密度时，随机分为3组：对照组、应激组和普利醇组。对照组肝细胞培养基为基础培养基，应激组肝细胞培养基在基础培养基的基础上添加10μM地塞米松(DEX)，普利醇组肝细胞培养基在基础培养基的基础上添加10μM地塞米松(DEX)和100ppm普利醇，处理6h后，分别测定细胞活性、细胞凋亡、细胞内ROS含量。
2试验培养基
基础培养基为高糖培养基，其具体成分组成如表1所示。在基础培养基中添加10μMDEX作为应激组培养基。在基础培养基中添加10μM DEX和100ppm普利醇(40％二十八烷醇)作为缓解应激组培养基。
表1基础培养基具体成分组成
3普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞活性的影响
将处理好的NCTC1469细胞悬浮液(100μL/孔)接种在96孔板中。将板在潮湿的培养箱中预孵育(例如，在37℃，5％CO2下)；向板的每个孔中加入10μL CCK8溶液。注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰OD读数；将培养板在培养箱中孵育1-4小时；使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
4普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞凋亡和坏死的影响
1)每个样品收集约10-100万细胞于1.5ml离心管内，离心弃上清。细胞沉淀用0.8-1毫升细胞染色缓冲液重悬。
2)加入5微升Hoechst染色液。
3)加入5微升PI染色液。
4)混匀，冰浴或4℃孵育20-30分钟。
5)用流式细胞仪检测红色荧光和蓝色荧光。
5普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞内ROS含量的影响
肝细胞处理结束后，按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10微摩尔/升。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。利用荧光酶标仪(488nm激发波长，525nm发射波长)测定其荧光强度。
6实验数据采用SPSS22.0统计软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，Duncan组间比较，结果以“平均数±标准误”表示。肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。
二、实验结果
1普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞活性的影响结果如图1所示。
结果显示：应激(DEX)处理可显著降低NCTC1469肝细胞的增殖活性(P＜0.05)，添加100ppm普利醇(40％二十八烷醇)可显著缓解DEX对肝细胞活性的抑制(P＜0.05)，且缓解程度基本达到了与对照组相当的水平。
2普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞凋亡的影响结果如图2～图3所示。
结果显示：应激(DEX)处理可显著升高NCTC1469细胞的凋亡率(P＜0.05)、降低其存活率(P＜0.05)；与DEX组相比，添加100ppm普利醇(40％二十八烷醇)可显著降低NCTC1469细胞的凋亡率(P＜0.05)、升高其存活率(P＜0.05)，且改善程度也基本达到了与对照组相当的水平。
3普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞内ROS含量的影响结果如图4所示。
结果显示：应激(DEX)处理可显著升高NCTC1469肝细胞内ROS(P＜0.05)，添加100ppm普利醇(40％二十八烷醇)可显著抑制DEX对肝细胞活性的增加(P＜0.05)，且抑制程度达到了比对照组还好的水平。
4普利醇(40％二十八烷醇)处理对肝细胞内SOD、GSH-Px、MDA的影响结果如图5所示。
结果显示：与对照组相比，应激(DEX)处理可显著降低NCTC1469肝细胞内抗氧化酶SOD、GSH-Px的活力，升高MDA的含量(P＜0.05)；添加100ppm普利醇(40％二十八烷醇)还可显著升高SOD、GSH-Px的活力，降低MDA的含量(P＜0.05)。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (8)
1.一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选择适宜肝细胞；
(2)分别设置对照组、应激组和普利醇组进行处理；所述对照组、应激组和普利醇组的设置方法为：对照组中的肝细胞培养基为基础培养基，应激组中的肝细胞培养基在基础培养基的基础上添加导致氧化应激的药液，普利醇组中的肝细胞培养基在基础培养基的基础上同时添加导致氧化应激的药液和普利醇；
(3)处理完成后分别测定各处理组细胞活性、细胞凋亡率、细胞内ROS含量；
(4)当普利醇组细胞活性、细胞凋亡率、细胞内ROS含量至少达到对照组水平时，普利醇对氧化应激具有改善效果。
2.根据权利要求1所述的体外评价方法，其特征在于，所述步骤(1)中选择的是NCTC1469肝细胞系。
3.根据权利要求2所述的体外评价方法，其特征在于，所述步骤(2)中导致氧化应激的药液为地塞米松(DEX)，在应激组和普利醇组中的添加量都为10μM；普利醇组中添加的普利醇为40％二十八烷醇。
4.根据权利要求3所述的体外评价方法，其特征在于，所述步骤(2)中的基础培养基的成分组成如下表所示：
5.根据权利要求4所述的体外评价方法，其特征在于，所述步骤(2)中的处理时间为5.5～6.5h。
6.根据权利要求5所述的体外评价方法，其特征在于，所述步骤(2)中的处理时间为6h。
7.权利要求1～6任一所述的体外评价方法在肝脏氧化应激改善药物筛选中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用中使用所述体外评价方法最终筛选出普利醇(40％二十八烷醇)的有效处理剂量为100ppm。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311136600.6A CN117187337A (zh) | 2023-09-05 | 2023-09-05 | 一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311136600.6A CN117187337A (zh) | 2023-09-05 | 2023-09-05 | 一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117187337A true CN117187337A (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=88999196
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311136600.6A Pending CN117187337A (zh) | 2023-09-05 | 2023-09-05 | 一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117187337A (zh) |
-
2023
- 2023-09-05 CN CN202311136600.6A patent/CN117187337A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103687940B (zh) | 用于间充质干细胞的处理方法及其在氧化应激相关疾病治疗中的应用 | |
| CN107569674B (zh) | 抗敏舒缓组合物及其应用 | |
| CN107714531B (zh) | 抗敏舒缓组合物及其应用 | |
| TWI693899B (zh) | 石榴發酵物及其用途 | |
| CN103153320B (zh) | 用于抵抗衰老作用的口服制剂 | |
| Hibino et al. | Commercial production of ginseng by plant tissue culture technology | |
| CN106659741A (zh) | 小尺寸干细胞的毛发生长促进功能及其用途 | |
| RathnaKumari et al. | Antibacterial efficacy of seagrass Cymodocea serrulata-engineered silver nanoparticles against prawn pathogen Vibrio parahaemolyticus and its combative effect on the marine shrimp Penaeus monodon | |
| CN101735976A (zh) | 一种用于表皮黑素细胞体外培养的培养基 | |
| CN113789286A (zh) | 一种动物双歧杆菌的发酵培养基及其应用 | |
| CN102266320B (zh) | 橙皮素的新用途 | |
| TWI819235B (zh) | 天然原料之發酵液以及其用於抑制過敏反應或提升免疫力的用途 | |
| CN108379302B (zh) | 双裂海木耳乙酸乙酯提取物在制备抗炎镇痛药物中的用途 | |
| CN109172612A (zh) | 一种基于光合细菌的防治精神障碍的生物制剂及其应用 | |
| CN109432128A (zh) | 牙髓间充质干细胞在银屑病治疗中的应用 | |
| CN104152401A (zh) | 一种适于中国人表皮黑素细胞体外培养的chmm1培养基 | |
| CN117187337A (zh) | 一种应用普利醇改善肝脏氧化应激的体外评价方法及其应用 | |
| CN107951827A (zh) | 一种含有迷迭香干细胞提取物的抗氧化护肤品及制备方法 | |
| JP2018158899A (ja) | 抗酸化系酵素群産生促進剤 | |
| Nogueira-Pedro et al. | The role of low-dose radiation in association with TNF-α on immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells | |
| CN110693880A (zh) | 一种尿石素制剂及其应用 | |
| CN105613285A (zh) | 一种快速提高丹参中迷迭香酸含量的方法 | |
| EP3903793A1 (en) | Pharmaceutical composition comprising clonal stem cell for prevention or treatment of atopic dermatitis | |
| CN105969725B (zh) | 枸杞红素的用途 | |
| Song et al. | Lactobacillus plantarum fermented Laminaria japonica alleviates UVB-induced epidermal photoinflammation via the Keap-1/Nrf2 pathway |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |