CN117187132A - 一种产气荚膜梭菌、培养方法及应用 - Google Patents
一种产气荚膜梭菌、培养方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117187132A CN117187132A CN202311165786.8A CN202311165786A CN117187132A CN 117187132 A CN117187132 A CN 117187132A CN 202311165786 A CN202311165786 A CN 202311165786A CN 117187132 A CN117187132 A CN 117187132A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- clostridium perfringens
- culture
- clostridium
- application
- meat
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 title claims abstract description 75
- 238000012136 culture method Methods 0.000 title abstract description 5
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 claims abstract description 13
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 244000144972 livestock Species 0.000 claims abstract description 5
- 244000144977 poultry Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 12
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 10
- 229960003077 cycloserine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 claims description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000009264 composting Methods 0.000 claims description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 4
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 3
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 abstract description 12
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 abstract description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004215 spore Anatomy 0.000 description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 10
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241001470651 Clostridium perfringens ATCC 13124 Species 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 3
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001112696 Clostridia Species 0.000 description 2
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 2
- 241000193470 Clostridium sporogenes Species 0.000 description 2
- DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N D-Cycloserine Chemical compound N[C@@H]1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N D-Cycloserine Natural products NC1CONC1=O DYDCUQKUCUHJBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 2
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N [4-fluoro-2-(hydroxymethyl)phenyl]methanol Chemical compound OCC1=CC=C(F)C=C1CO VLSOAXRVHARBEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRHBOQMZUOWXQL-UHFFFAOYSA-L ammonium ferric citrate Chemical compound [NH4+].[Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O FRHBOQMZUOWXQL-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000007399 clostridium medium Substances 0.000 description 2
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005059 dormancy Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229960004642 ferric ammonium citrate Drugs 0.000 description 2
- 235000021393 food security Nutrition 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000000011 iron ammonium citrate Nutrition 0.000 description 2
- 239000004313 iron ammonium citrate Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000010815 organic waste Substances 0.000 description 2
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 2
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000002053 acidogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009604 anaerobic growth Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 210000004666 bacterial spore Anatomy 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 235000001705 insufficient nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N nitrogen dioxide Inorganic materials O=[N]=O JCXJVPUVTGWSNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003895 organic fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000010206 sensitivity analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02W—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES RELATED TO WASTEWATER TREATMENT OR WASTE MANAGEMENT
- Y02W30/00—Technologies for solid waste management
- Y02W30/40—Bio-organic fraction processing; Production of fertilisers from the organic fraction of waste or refuse
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明属于微生物领域，涉及一种产气荚膜梭菌，特别是指一种产气荚膜梭菌、培养方法及应用。本申请的产气荚膜梭菌基于其高产芽孢的能力（24h产芽孢数量为107log(CFU/mL)），本发明首次筛选得到具有高产芽孢能力的梭菌属芽孢，也为梭菌属芽孢进一步检测防控技术和杀灭机理机制深入研究的基础和前提，在实际应用中也可以更好的利用其抗逆性优势。同时，该菌种对肉品具有较强的致腐分解能力，在不合格肉品、染疫畜禽和其他问题食品的无公害处理方面具有良好的应用空间，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一种产气荚膜梭菌，特别是指一种产气荚膜梭菌、培养方法及应用。
背景技术
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,C. perfringens）是自然的共生菌群之，它是一种厌氧细菌，能够在没有氧气的环境下生长和繁殖。在营养不足条件下可产生芽孢，芽孢是一种具有独特结构的休眠体，其抗逆性极强，对辐射、热、干燥、极端pH值和高压等极端恶劣条件有很强的抵抗力，在高温肉制品生产加工过程中很难杀死，在流通销售过程中条件一旦适宜会再次萌发，快速生长繁殖造成食品腐败变质，这给肉制品企业的质量安全控制带来极大的挑战。
目前，关于细菌芽孢检测和杀灭机理机制研究多以杆菌属芽孢为主，对梭菌属芽孢的相关研究一直迟滞于杆菌属芽孢的研究，限制其深入研究的重要问题之一就是梭菌属芽孢的制备要难于杆菌属芽孢的制备，高浓度且纯净的梭菌属芽孢的获得是进行梭菌属芽孢检测防控技术和杀灭机理机制深入研究的基础和前提。并且，产气荚膜梭菌的基因序列和肉毒杆菌和生孢梭菌高度相似，但产气荚膜梭菌的实验室操作安全性高于肉毒梭菌和生孢梭菌等梭菌属芽孢。因此，高产芽孢性能产气荚膜梭菌的挖掘对于梭菌属芽孢的进一步检测防控技术研究和深度机理机制研究至关重要，为高温肉制品加工企业提高防范食品安全风险管理提供基础理论支撑，是对食品安全“四个最严”要求的贯彻落实。
另一方面，对依法检查中中发现的不合格肉品、染疫畜禽和其他问题食品等主张无公害处理方法，分别是填埋、焚烧和堆肥三种常用的方式。其中，填满和堆肥方式利用微生物对垃圾中的有机物进行代谢分解，可以将有机废物中的有机物质分解成更简单的化合物，从而减少废物对环境的污染,并能产生有机肥料，实现资源再利用。产气荚膜梭菌能够利用有机废料中的碳源，通过发酵代谢产生气体，如氮气和二氧化碳。这些气体可以增加堆肥堆的气体含量，促进有机物的降解和分解。此外，现有的产气荚膜梭菌多是作为致病菌进行预防，仅在专利CN103060239A中公开了可做为复合腐败脱色的作用；而如何进一步挖掘产气荚膜梭菌的功能，使其转有害菌为有益菌，通过筛选的腐败能力强、分解速度快的产气荚膜梭菌菌种能提高无公害处理效率，大幅度提高堆肥场地的使用效率，具有较强的应用价值。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提出一种产气荚膜梭菌、培养方法及应用。
本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了产气荚膜梭菌CCTCC M 2023198，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），分类命名：Clostridium perfringens，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为CCTCC NO：M 2023198，保藏日期：2023年2月27日。
本发明的产气荚膜梭菌C1由河南农业大学食品科学与技术学院微生物学实验室直接从涨袋腐败的盐焗鸡中分离出来，经形态学观察、生化鉴定、VITEK 鉴定和16S rDNA鉴定为产气荚膜梭菌，其生理特性表现为革兰氏染色呈阳性，杆状，两端钝圆，单个或成对分布，厌氧生长，产芽孢能力高。
第二方面，本申请还提供了大量获得产气荚膜梭菌CCTCC M 2023198的方法，步骤为：
活化培养：将-80℃条件下保存的C1菌株磁珠，在胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础培养基（Tryptose Sulfite Cycloserine Agar Base，TSC）三区划线，进行活化培养，在厌氧条件下37℃培养24~48 h，活化后的C1菌株在TSC培养基上呈现典型的黑色单菌落。
其中，TSC培养基购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，主要成分为胰胨15 g/L、大豆胨5 g/L、酵母粉5 g/L、焦亚硫酸钠1 g/L，柠檬酸铁铵1 g/L，琼脂15 g/L，pH值为7.6±0.2。
增菌培养：从活化的TSC平板上挑取典型的黑色菌落接种到10mL强化梭菌培养基（Reinforced Medium for Clostridia，RCM），37℃厌氧培养18~24 h。然后，取1mL上述培养液接种到9 mL的RCM中，37℃厌氧培养4~6 h，得到增菌液。
其中，RCM培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，主要成分为蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉10 g/L，酵母粉3 g/L，葡萄糖5 g/L，可溶性淀粉1 g/L，氯化钠5 g/L，醋酸钠3 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，琼脂0.5 g/L，pH值6.8±0.125℃。
第三方面，本发明还提供了关于所述的产气荚膜梭菌M2023198对肉品无公害处理场景中对肉品的致腐分解能力。
上述问题肉制品为不合格肉品、变质肉品或染疫畜禽。
上述的产气荚膜梭菌在提高堆肥发酵速率中的应用。
上述的产气荚膜梭菌在分解垃圾中的应用。
上述应用是基于产气荚膜梭菌的高产芽孢能力发挥作用的。
上述产气荚膜梭菌培养 24 ~72 h的芽孢数量为107~108log(CFU/mL)。
本发明具有以下有益效果：
1、本申请通过挥发性盐基氮测定（TVB-N）和腐败能力的定量测定对比确定产气荚膜梭菌CCTCC M 2023198的致腐分解能力，在处理过程中添加腐败能力强、分解速度快的产气荚膜梭菌CCTCC M 2023198的在分解处理效率，大幅度提高堆肥场地的使用效率，具有良好的潜在应用价值。
2、本申请的产气荚膜梭菌基于其高产芽孢的能力（24~72 h产芽孢数量为107~108log(CFU/mL)），本发明首次筛选得到具有高产芽孢能力的梭菌属芽孢，也为梭菌属芽孢进一步检测防控技术和杀灭机理机制深入研究的基础和前提，在实际应用中也可以更好的利用其抗逆性优势。同时，该菌种对肉品具有较强的致腐分解能力，在不合格肉品、染疫畜禽和其他问题食品的无公害处理方面具有良好的应用空间，具有广阔的市场前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为产气荚膜梭菌C1在TSC培养基上的菌落图（A）和革兰氏染色镜检图（B）。
图2为产气荚膜梭菌C1的生化鉴定结果；（A）为FTG 培养基增菌实验结果；（B）为含铁牛奶培养基实验结果；（C）为缓冲动力-硝酸盐培养基穿刺实验结果；（D）为乳糖-明胶培养基实验结果。
图3为产气荚膜梭菌C1的16S rDNA系统发育进化树。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1:产气荚膜梭菌CCTCC M 2023198的分离、筛选及鉴定
（一）分离、筛选
采集涨袋腐败的盐焗鸡样品，通过梯度稀释法进行微生物的分离和纯化。称取±样25 g放入无菌袋中，加入225 mL无菌水中，在均质机中拍打震荡2 min使样品充分分散。采用标准梯度稀释，用无菌水稀释制成10-2~10-6浓度的稀释液。取200 μL的各浓度稀释液，采用常规涂布法在胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础（TSC）平板上涂布，放置于37℃恒温培养箱内厌氧培养。24~48小时待平板上长出黑色菌落后，暂记为C1，挑取平板上的单菌落进行三次纯化培养。对纯化后的单菌落，一部分进行磁珠保存于-80℃保存，一部分在4℃进行保存为下一步鉴定使用。
（二）鉴定
1、形态学观察及生化鉴定法
本发明的产气荚膜梭菌C1在TSC培养基平板上有黑色较大圆形菌落生成，如图1A所示，经革兰氏染色可以观察到其镜检结果为革兰氏阳性杆菌，两端钝圆，单个或成对分布，如图1（B）所示；
本发明的产气荚膜梭菌C1在FTG液体培养基中有絮状物和气泡产生，如图2（A）所示；在含铁牛奶培养基中呈现“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑，如图2（B）所示；在缓冲动力-硝酸盐培养基中，菌株无动力，只沿穿刺线生长，滴加0.5mL硝酸盐还原试剂甲和0.2mL试剂乙立即出现红色，表明菌株能将硝酸盐还原为亚硝酸盐，如图2（C）所示；在乳糖-明胶培养基中，培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸，且明胶液化，如图2（D）所示，这与GB/T4789.13—2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》的实验现象一致。
2、VITEK 2 Compact鉴定法
经上述方法鉴定为产气荚膜梭菌菌株C1进一步验证，将其划线到TSC平板上分离纯化，厌氧培养24 h后，挑取单个黑色菌落划线胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）平板上，厌氧培养24 h，有白色菌落生成，表面湿润，边缘不整齐，按照梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统规定的操作调配成菌悬液，填充鉴定卡并上机检测。标准菌株ATCC13124作对照。结果显示，产气荚膜梭菌标准菌株ATCC13124的VITEK2 Compact鉴定率99.9%，菌株C1的VITEK 2 Compact鉴定率为98%。
表1 C1菌株的VITEK 2 Compact鉴定结果
如表1所示，鉴定结果是产气荚膜梭菌。
3、分子生物学鉴定法
同时，将选取的菌株C1按照Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒的操作步骤进行检测，细菌16SrDNA菌种鉴定：提取DNA，用特定引物27F（AGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增（约1500bp），PCR产物纯化测序，将得到的16SrDNA序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp 上比对（在上海生物工程股份有限公司完成）。
分子鉴定结果：经过测序获得有效基因序列长度为1376 bp（Query IDlcl|Query_30481）， GenBank登录号为A5J24EZZ013。将该基因序列与GenBank数据库中序列进行BLAST比对分析，以相似性达95％以上的标准选择参考菌株，采用MEGA 7.0软件通过Neighbor-Joining法构建 系统发育树。结果显示（图3），菌株C1与产气荚膜梭菌（Clostridiumperfringen）聚为一支，且亲缘关系最为接近，置信度较高。结合形态学、生理生化特征、16SrDNA鉴定结果，将菌株C1鉴定产气荚膜梭菌。其中，上述产气荚膜梭菌C1的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
实施例2：产气荚膜梭菌CCTCC M 2023198的培养
（一）活化
将-80℃条件下保存的C1菌株磁珠，在胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础培养基（Tryptose Sulfite Cycloserine Agar Base，TSC）三区划线，进行活化培养，在厌氧条件下37℃培养24~48 h，活化后的C1菌株在TSC培养基上呈现典型的黑色单菌落。
其中，TSC培养基购于青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，主要成分为胰胨15 g/L、大豆胨5 g/L、酵母粉5 g/L、焦亚硫酸钠1 g/L，柠檬酸铁铵1 g/L，琼脂15 g/L，pH值为7.6±0.2。
（二）增菌培养
从活化的TSC平板上挑取典型的黑色菌落接种到10mL强化梭菌培养基（Reinforced Medium for Clostridia，RCM），37℃厌氧培养18~24 h。然后，取1mL上述培养液接种到9 mL的RCM中，37℃厌氧培养4~6 h，得到增菌液。
其中，RCM培养基购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，主要成分为蛋白胨10.0 g/L，牛肉粉10 g/L，酵母粉3 g/L，葡萄糖5 g/L，可溶性淀粉1 g/L，氯化钠5 g/L，醋酸钠3 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，琼脂0.5 g/L，pH值6.8±0.125℃。
实施例3：产芽孢能力的测试
对实验室保存的两株产气荚膜梭菌标准菌株ATCC 13124和菌株CVCC 2030，以及产气荚膜梭菌菌株CCTCC M 2023198分别进行产芽孢培养。三种不同产气荚膜梭菌菌株产芽孢方法均参照本实验室之前申请的专利[CN202111421189.8]中产气荚膜梭菌芽孢的制备步骤进行操作，比较不同菌株的产芽孢能力。
由表2可知，产气荚膜梭菌菌株CCTCC M 2023198在相同培养时间内的产芽孢水平与标准菌株ATCC 13124和CVCC 2030差异显著，分离菌株C1产芽孢数量较多，培养 24 h的芽孢数量可以达到107log(CFU/mL)，而标准菌株ATCC 13124的产芽孢量仅为103log(CFU/mL)，CVCC 2030培养24 h后基本未产芽孢。延长培养时间，菌株CCTCC M 2023198在第48 h时开始产芽孢，但数量较少；菌株CCTCC M 2023198和菌株ATCC 13124的产芽孢水平保持稳定。结果表明，不同菌株的产芽孢能力不同，从实际肉制品中分离获得的菌株CCTCC M2023198更容易产生芽孢，短时间内可以快速产生大量的芽孢，具有较强的产芽孢能力，产气荚膜梭菌培养24~72 h的芽孢数量可达107~108log(CFU/mL)。
表2 不同产气荚膜梭菌在相同培养条件下不同培养时间阶段的产芽孢数量
注：1. a,b,c,d：表示同列数据中字母不同者差异显著（P<0.05）；2. x,y,z：表示同行数据中字母不同者差异显著（P<0.05）。
实施例4：菌株致腐分解能力的测定
本发明选取产气荚膜梭菌CCTCC M 2023198、产气荚膜梭菌ATCC 13124和产气荚膜梭菌CVCC 2030为研究对象，在无菌工作台里，紫外照射30 min，达到无菌的状态，将相同浓度（OD600值均为0.684）的产气荚膜梭菌CCTCC M 2023198、产气荚膜梭菌ATCC 13124和产气荚膜梭菌CVCC 2030分别接入经过紫外杀菌处理后的同批次鸡肉中进行反接加速试验，在厌氧条件下37 ℃培养72 h。参照GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》进行挥发性盐基氮（TVB-N）值的测定，并且根据公式（1）计算菌株CCTCCM 2023198的腐败能力，对比确定产气荚膜梭菌CCTCC M 2023198的致腐分解能力。结果如表3所示，因此，在无公害处理过程中添加的腐败能力强、分解速度快的产气荚膜梭菌CCTCCM 2023198能提高无公害处理效率，可以大幅度提高堆肥场地的使用效率，具有广阔的市场应用前景。
YTVB-N/(mg/CFU)=(CS-C0)/(Ns-N0) 公式（1）
式中：C0为贮藏期开始的TVB-N含量/（mg/100g）；Cs为贮藏期结束时的TVB-N含量/（mg/100g）；N0为贮藏期开始的菌落总数/（CFU/g）；Ns为贮藏期结束时的菌落总数/（CFU/g）。
表3 不同产气荚膜梭菌菌种的TVB-N产量因子
由表3可知：相较于产气荚膜梭菌ATCC 13124和产气荚膜梭菌CVCC 2030，本申请的产气荚膜梭菌CCTCCM 2023198的腐败能力强、分解肉品中蛋白质速度快，其分解速率是产气荚膜梭菌ATCC 13124的2~2.5倍，是产气荚膜梭菌CVCC 2030的3.5~4倍。因此，产气荚膜梭菌CCTCC M 2023198能促进有机物的降解和分解，具有良好的潜在应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1. 一株产气荚膜梭菌，其分类名为Clostridium perfringens，于2023年2月27年保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2023198，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
2. 根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌，其特征在于：所述产气荚膜梭菌培养24 h的芽孢数量为107log(CFU/mL)。
3.权利要求1所述的产气荚膜梭菌的大量培养方法，其特征在于，步骤为：
（1）将保存的产气荚膜梭菌菌株在胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础培养基上划线，进行活化培养；
（2）从经过步骤（1）活化培养后的胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础培养基上挑选菌落接种至强化梭菌培养基，厌氧培养后，再接种至强化梭菌培养基中扩大培养，即得产气荚膜梭菌菌液。
4. 根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌的大量培养方法，其特征在于，所述步骤（1）中活化培养的条件为厌氧条件下37℃培养24-48 h。
5. 根据权利要求3所述的产气荚膜梭菌的大量培养方法，其特征在于，所述步骤（2）中厌氧培养的温度为37℃、时间为18 h；扩大培养的条件为厌氧条件下37℃培养4-6 h。
6.权利要求1或2所述的产气荚膜梭菌在高效、无公害处理问题肉制品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述问题肉制品为不合格肉品、变质肉品或染疫畜禽。
8.权利要求1或2所述的产气荚膜梭菌在提高堆肥发酵速率中的应用。
9.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于：所述应用是基于产气荚膜梭菌的高产芽孢能力发挥作用的。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述产气荚膜梭菌培养 24-72 h的芽孢数量为107-108 log(CFU/mL)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311165786.8A CN117187132A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种产气荚膜梭菌、培养方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311165786.8A CN117187132A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种产气荚膜梭菌、培养方法及应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117187132A true CN117187132A (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=88993799
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311165786.8A Pending CN117187132A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种产气荚膜梭菌、培养方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117187132A (zh) |
-
2023
- 2023-09-11 CN CN202311165786.8A patent/CN117187132A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110387339B (zh) | 一株中间苍白杆菌b522及其应用 | |
| CN110591987B (zh) | 唾液乳杆菌358及其应用、青贮饲料添加剂、青贮饲料 | |
| CN107586743B (zh) | 一株林木根际高效溶磷巨大芽胞杆菌及应用 | |
| CN111808775B (zh) | 一株耐高温热噬淀粉芽孢杆菌及其应用 | |
| CN115975873A (zh) | 一株降解污废水中总氮的Paracandidimonas soli菌株及其应用 | |
| CN116004438B (zh) | 一种强化餐厨垃圾厌氧发酵产甲烷的菌种及其应用 | |
| CN115141770B (zh) | 一种能够降解畜禽废水中cod的特基拉芽孢杆菌h1及其应用 | |
| CN103497925B (zh) | 一株降解磺酰脲类除草剂的基因工程菌KT-puts2及其应用 | |
| CN108841743B (zh) | 寒地秸秆腐熟细菌菌株及其制备方法和应用 | |
| CN106434456A (zh) | 一种嗜热菌A.rupiensis ZQ2及其应用 | |
| CN113025507B (zh) | 复合微生物菌剂及其制备和在畜禽场高浓度废水脱臭净化中的应用 | |
| CN116286432A (zh) | 一种能够降解畜禽废水中cod的人参土芽孢杆菌h3及其应用 | |
| CN112553113B (zh) | 一株具有耐盐性的克拉夫新鞘氨醇杆菌gbw-hb1906及其应用 | |
| CN117187132A (zh) | 一种产气荚膜梭菌、培养方法及应用 | |
| CN112280714B (zh) | 一株铜绿假单胞菌8-7及其应用 | |
| CN111635877B (zh) | 一株降解木质素的无色杆菌及其在含木质素废水处理中的应用 | |
| CN111235041B (zh) | 一种红霉素降解菌rjj-62及其应用 | |
| CN111411046A (zh) | 一种深色有隔内生真菌菌剂与应用 | |
| CN105296379A (zh) | 一株假诺卡氏菌及其应用 | |
| CN114806917B (zh) | 一种溶磷菌、菌剂及其应用 | |
| CN115181691B (zh) | 一种芽孢杆菌db-q3及其应用 | |
| CN114410534B (zh) | Cloacibacterium normanense TD35菌株及其应用 | |
| CN116376707B (zh) | 一种草酸青霉菌0710-26及其应用 | |
| CN111378604B (zh) | 一种嗜热好望角放线菌及其应用 | |
| CN114058554B (zh) | 一种堆肥假单胞菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |