CN117187109A - 一种尼泊尔葡萄球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种尼泊尔葡萄球菌及其应用，属于微生物技术领域。该尼泊尔葡萄球菌保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为：CGMCC No.27272，保藏日期为：2023年05月06日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为尼泊尔葡萄球菌，命名为：QIMR‑Fn‑1。本发明所提供的尼泊尔葡萄球菌在所公开的虾露快速酿造的酿造方式的基础上能够进一步简化生产工艺，降低生产成本，同时提高发酵速率，鲜味更加显著且安全可控，与传统的外加酶发酵方式相比，具有成本低、口感丰富等优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体地说，尤其涉及一种尼泊尔葡萄球菌及其应用。
背景技术
鱼露、虾露是以海产品为优质氮源经长期发酵获得的食品，由于其特有的海鲜风味，常常被用作提鲜的调味品和调味汁，拥有较广的消费市场。现有的鱼露、虾露通过将海产品与大量盐混合发酵得到，经过长时间的发酵/熟化，海产品中的蛋白质一方面由其自身的自溶酶降解，一方面由在高盐环境下、多种微生物共同参与下，嗜盐菌对原料虾中的蛋白质、脂肪等进行分解发酵。但是，鱼露、虾露发酵时间长且发酵过程容易受所涉及的微生物种类及状态影响，且各种细菌的污染通常伴随令人难以接受的风味。
传统自然发酵的方式发酵缓慢且极容易受环境的影响导致菌群变化，因此针对传统鱼露、虾露发酵时间长、产品质量不稳定等技术难题，找到一种可以高密度接种在快速增菌提高发酵速率的同时改变发酵过程中菌落结构以保持菌群相对稳定的菌种显得极为重要，可在一定程度上降低生产成本、提高生产效率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种尼泊尔葡萄球菌，另一目的是提供该尼泊尔葡萄球菌的应用，以弥补现有技术的不足。
本发明提供了一种嗜盐、发酵产鲜味物质的菌种，用于传统酿造调味品的发酵，实现发酵产品质量控制。
为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种尼泊尔葡萄球菌，保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为： CGMCC No.27272，保藏日期为：2023年05月06日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为尼泊尔葡萄球菌Staphylococcus nepalensis，命名为：QIMR-Fn-1。
进一步的，所述尼泊尔葡萄球菌是一株能够发酵产生强烈鲜味物质的尼泊尔葡萄球菌属Staphylococcus nepalis；革兰氏阳性，酸性和兼性环境下均可生长，在含1-15 wt%NaCl的培养基中可生长，在pH 5-10的培养基中可生长；形成的菌落呈圆形，单个或葡萄状排列，湿润，边缘光滑，乳白色或淡黄绿色；所述尼泊尔葡萄球菌发酵能够产生乳酸。
本发明所提供的菌株QIMR-Fn-1对盐的耐受范围是1% - 15%，这在调味品酿造过程中具有巨大优势。
所述尼泊尔葡萄球菌能够应用于发酵反应中。
所述尼泊尔葡萄球菌在制备发酵制品中的应用。
进一步的，所述尼泊尔葡萄球菌在制备酿造调味品中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果是：
本发明所提供的尼泊尔葡萄球菌有以下特点：
（1）对盐耐受能力强，能在高盐环境下生长、代谢、繁殖；（2）可适应较低pH值的生长环境，在发酵过程中受偏酸性环境的影响较弱；（3）以海鲜为原料进行发酵时，产生大量Glu、Asp，为产品提鲜，发酵产生IMP、GMP，为产品提鲜，发酵产生乳酸，为产品增香、增味。
传统鱼露、虾露的酿造过程一般需要几个月甚至半年的时间以达到质量及风味要求，本发明所提供的尼泊尔葡萄球菌QIMR-Fn-1在专利名称为《一种磷虾虾露与酱油一体化生产方法》所公开的虾露快速酿造的酿造方式的基础上能够进一步简化生产工艺，降低生产成本，同时提高发酵速率，鲜味更加显著且安全可控，与传统的外加酶发酵方式相比，具有成本低、口感丰富等优点。
附图说明
图1是QIMR-Fn-1经革兰氏染色后的电镜图。
图2是虾露发酵过程中添加QIMR-Fn-1对乳酸含量影响的对比图。
图3是虾露发酵过程中添加QIMR-Fn-1对IMP含量影响的对比图。
图4是虾露发酵过程中添加QIMR-Fn-1对GMP含量影响的对比图。
图5是虾露发酵过程中添加QIMR-Fn-1对AMP含量影响的对比图。
图6是虾露发酵过程中添加QIMR-Fn-1对Glu含量影响的对比图。
图7是虾露发酵过程中添加QIMR-Fn-1对Asp含量影响的对比图。
实施方式
下面结合实施例对本发明所述的技术方案作进一步地描述说明。
实施例
一种高蛋白酶活性的尼泊尔葡萄球菌（菌株QIMR-Fn-1）的分离方法，包括以下步骤：
以市场上购买经自然发酵的虾酱作为筛选样本，用PBS缓冲液进行梯度稀释（0、10-1、10-2、10-3、10-4），然后涂布至LB平板中，于37℃培养箱倒置培养；
待平板中长出菌落后，选择形态大小不一的菌落做好标记，于LB液体培养基中进行单独培养；
制作不同菌株密度与OD值关系的曲线，并利用上述曲线根据OD值将菌株的密度统一至108 CFU/mL；
将南极磷虾打浆后，添加一倍质量的水，分别加入经密度统一后的菌液同时制作对照，于37℃、220 rpm/min的摇床发酵；
发酵10天后，根据发酵液的风味、液化率、氨基酸态氮含量等选择发酵速率最快且鲜味最强的菌株进行菌种特性试验及鉴定。
实施例
尼泊尔葡萄球菌QIMR-Fn-1的特性试验
菌种耐盐特性验证
配置盐浓度为3%、5%、7%、10%、12%、15%、20%含盐量的LB液体培养基并灭菌；
将活化的菌液以1%的接种量接种至LB液体培养基中，于37℃，220 rpm/min的摇床培养12小时；
通过菌液是否浑浊判定QIMR-Fn-1是否能于该盐浓度下生长。
结果显示：QIMR-Fn-1在盐浓度为15%的LB液体培养基中，在37℃、220 rpm/min的培养条件下能够迅速生长繁殖。
菌种耐酸碱特性验证
（1）以盐酸和氢氧化钠调节pH以配置pH 3、pH 5、pH 7、pH 10、pH 12的LB液体培养基并灭菌；
（2）将活化的菌液以1%的接种量接种至LB液体培养基中，于37℃，220 rpm/min的摇床培养12小时；
（3）通过菌液是否浑浊判定QIMR-Fn-1是否能于该pH下生长。
结果显示：QIMR-Fn-1在pH 5-pH 10的LB液体培养基中，在37℃、220 rpm/min的培养条件下能够生长繁殖。
菌种革兰氏染色验证
将已活化的QIMR-Fn-1菌液在LB平板中进行划线，挑取单克隆进行革兰氏染色；
制片：在载玻片中滴一滴生理盐水，用接种环取QIMR-Fn-1平板上的单克隆于生理盐水中进行涂片，干燥后，于酒精灯上方固定（温度不宜过热）；
初染：滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）染色1min，水洗，并干燥；
媒染：用碘液覆盖约1min，水洗；
脱色：用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色20 s，立即水洗，并干燥；
复染：用番红液复染约2min，水洗。
镜检：干燥后，用油镜观察。菌体被染成蓝紫色的是革兰氏阳性菌，被染成红色的为革兰氏阴性菌（如图1所示）。
实施例3：尼泊尔葡萄球菌QIMR-Fn-1基因组的提纯与测序
QIMR-Fn-1样品使用Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒进行基因组的提取；
PCR扩增使用细菌菌种鉴定通用引物27F，序列5’→3’为AGTTTGATCMTGGCTCAG，扩增序列16S rDNA，长度1500bp左右；
1％琼脂糖电泳，150V、100mA 20min电泳观察，PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，PCR产物用PCR引物直接测序；
16SrDNA 序列在核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp 上比对；
使用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中基于BLASTP 算法的非冗余（NR）蛋白质数据库，Pfam (https://pfam.xfam.org/sear ch/sequence) 数据库以及PDB(http://www.rcsb.org/) 数据库进行比对， 选取score 最高的比对结果（E-value ≤10-5 ; id-entity>40%; coverage>40%）进行筛选整合，得到该菌株基因组最终注释信息。
经基因组测序，QIMR-Fn-1序列见序列表SEQ No.1所示。
实施例
一种虾露的快速酿造方式，具体步骤如下：
（1）将发酵菌种QIMR-Fn-1进行活化、扩繁，通过梯度稀释、平板计数等方式确定菌液OD值与菌种密度的关系曲线；
（2）根据菌体密度与OD值的关系曲线，将菌体密度统一至108 CFU/mL；
（3）将磷虾洗净后，充分搅碎，称取100 g分装至250 mL锥形瓶中，加入100 mL水，搅拌均匀后，加入10%的食用盐，充分混匀；以106 CFU/g的接种量将QIMR-Fn-1接种至搅碎并拌盐的磷虾中，同时设置对照组-空白实验（即其他操作相同，用等量的水代替QIMR-Fn-1菌液），每组制作两个平行；用封口膜封口后，于37℃、220 rpm/min摇床发酵；
（4）发酵15天后将样品于8000 rpm/min离心20 min，取上清液即为最终的发酵虾露；
（5）0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、15 d分别于无菌环境下取样并测定氨基酸态氮、总氮、液化率及风味的变化，其中氨基酸态氮、总氮、挥发性盐基氮、含盐量测定方式分别按照《GB 5009.235-2016》中比色法，《GB 5009.5-2016》中凯氏定氮法；液化率以均质发酵样品离心后，取清夜，m（清夜）/m（样品）*100 -1进行计算；
（6）测定发酵过程中有机酸、核苷酸及游离氨基酸的变化情况。
表1 虾露发酵过程中添加QIMR-Fn-1在总氮、氨基酸态氮及液化率方面对发酵产生的影响
从总氮、氨基酸态氮、液化率以及感官评价四个角度表征发酵结果，其中总氮表示的是南极磷虾来源的水不溶性蛋白质经发酵过程分解为水溶性蛋白质的情况，氨基酸态氮表示经发酵过程蛋白质转化为短肽、氨基酸的量，液化率表示南极磷虾匀浆自溶分解及发酵分解的程度，感官评价从整体风味层面展示发酵过程对虾露口感及气味的影响。GB/T42463-2023 鱼露质量通则中规定鱼露氨基酸态氮（以N计）≥ 0.40 g/100 mL，GB 18186-2000酿造酱油中规定氨基酸态氮（以N计）≥0.80 g/100 mL即为特级酱油。由上表可得，与传统鱼露、虾露长达几个月甚至半年的酿造时间相比，在CN 202310420293.8 一种磷虾虾露与酱油一体化生产方法所公开的虾露快速酿造的酿造方式的基础上进行优化，添加QIMR-Fn-1发酵仅在第7天达到特级酱油的标准，发酵第15天氨基酸态氮达到1.1 g/100mL，在CN 202310420293.8 一种磷虾虾露与酱油一体化生产方法所公开的短时、高品质的虾露酿造方式的基础上进一步将氨基酸态氮含量提升了将近10%，酿造的虾露品质得到了极大地提升。
图2-图6是该实施例中虾露发酵过程中乳酸以及鲜味物质含量的对比。添加QIMR-Fn-1的发酵液中从第1天就检测到乳酸的形成（对照组则需3天），说明添加QIMR-Fn-1可以促进虾类发酵液对乳酸的积累。IMP是呈鲜味的核苷酸，发酵过程中IMP含量变化趋势不稳定，与对照组相比，添加QIMR-Fn-1的发酵液在最终IMP积累方面变化不大。GMP是一种呈鲜味的核苷酸，其含量呈现先上升后下降再上升的趋势。与对照组相比，添加QIMR-Fn-1的发酵液在最终GMP积累上有明显优势。AMP与鲜味相关，发酵过程中AMP变化趋势不稳定。与对照组相比，添加QIMR-Fn-1的发酵液在最终AMP积累上略有优势。Glu是呈鲜味的游离氨基酸，其含量在发酵过程中持续上升，与对照组相比，添加QIMR-Fn-1的发酵液在最终Glu积累上有明显优势。Asp是呈鲜味的游离氨基酸，其含量在发酵过程中持续上升，与对照组相比，添加QIMR-Fn-1的发酵液在最终Asp积累上有明显优势。
由上述结果可以看出，所述尼泊尔葡萄球菌能够在前期优化的高品质速酿虾露的基础上，QIMR-Fn-1的耐盐、耐酸碱性为其在虾露发酵过程中的快速生长、代谢，促进发酵进程奠定基础；QIMR-Fn-1发酵高产乳酸、谷氨酸、天冬氨酸为虾露提鲜、增香奠定基础；高密度接种QIMR-Fn-1通过改变物料初始微生物密度及结构，进而影响发酵速率及方向，从而形成风味不同的虾露。
在上述实施例的基础上，本发明继续对其中涉及到的技术特征及该技术特征在本发明中所起到的功能、作用进行详细的描述，以帮助本领域的技术人员充分理解本发明的技术方案并且予以重现。
最后，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (7)
1.一种尼泊尔葡萄球菌，其特征在于，该尼泊尔葡萄球菌保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心 （CGMCC），保藏号为： CGMCC No.27272，保藏日期为：2023年05月06日，保藏地址为：中国北京市中国科学院微生物研究所，邮编：100101，分类命名为尼泊尔葡萄球菌Staphylococcus nepalensis，命名为：QIMR-Fn-1。
2.如权利要求1所述的尼泊尔葡萄球菌，其特征在于，该尼泊尔葡萄球菌是尼泊尔葡萄球菌属Staphylococcus nepalis，革兰氏阳性；形成的菌落呈圆形，单个或葡萄状排列，湿润，边缘光滑，乳白色或淡黄绿色；，酸性和兼性环境下均能够生长。
3.如权利要求1所述的尼泊尔葡萄球菌，其特征在于，该尼泊尔葡萄球菌在含1-15wt%NaCl的培养基中生长；在pH 5-10的培养基中生长。
4.如权利要求1所述的尼泊尔葡萄球菌，其特征在于，该尼泊尔葡萄球菌发酵能够产生乳酸。
5.权利要求1所述的尼泊尔葡萄球菌在发酵过程中的应用。
6.权利要求1所述的尼泊尔葡萄球菌在制备发酵制品中的应用。
7.权利要求1所述的尼泊尔葡萄球菌在制备酿造调味品中的应用。
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