CN117187084A - 一种黑曲霉重组表达担子真菌漆酶的方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种黑曲霉重组表达担子真菌漆酶的方法，属于微生物学和生物工程技术领域。本发明以黑曲霉MA70.15为实验菌株，系统探索了原生质体制备中的酶解液组成、菌丝培养方式、酶解时间、酶解温度和菌株培养时间对原生质体制备的影响，获得了一种高效制备黑曲霉原生质体的方法，使原生质体的数目提升了约5倍，数目达到2.2×106个/mL。在上述基础上，利用聚乙二醇介导法将质粒转入到黑曲霉原生质体中，转化子数目提升约4倍，实现了黑曲霉原生质体的高效遗传转化。通过启动子优化，实现了灰盖鬼伞漆酶Lcc9的有效表达，酶活约150U/L。本发明将进一步促进黑曲霉表达系统的发展。
Description
技术领域
本发明涉及一种黑曲霉重组表达担子真菌漆酶的方法，属于微生物学和生物工程技术领域。
背景技术
黑曲霉(Aspergillus niger)是一种丝状真菌，广泛分布于自然界。黑曲霉的生长条件简单，具有宽泛的生长温度与pH条件，可以在6～47℃与pH 1.4～9.8的范围内生长。黑曲霉是一种被美国食品药物监督管理局认证为GRAS范围的安全菌种，可应用于食品等行业中。黑曲霉因具有卓越的蛋白分泌能力以及生长繁殖能力，一个多世纪以来，其逐渐被开发为一个多用途的细胞工厂，已普遍应用于工业发酵中生产各种产物。
与常用的微生物表达系统如大肠杆菌(Escherichia coli)、毕赤酵母(Pichiapastoris)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等相比，黑曲霉系统具有独特的优点。目的蛋白在大肠杆菌中重组表达时易产生包涵体，并且多为胞内表达，收集蛋白需破碎菌体，杂蛋白较多；毕赤酵母在大多发酵中需要由甲醇进行诱导表达，而甲醇属于有毒试剂，不利于食品级产品的生产；酿酒酵母中糖基化情况较复杂，并且胞外蛋白较少；枯草芽孢杆菌表达系统是较安全的食品表达系统并且可进行胞外产酶，但是重组菌株中质粒不稳定。相比之下，基于黑曲霉为底盘细胞的表达系统具备以下优点：(1)安全性良好可进行食品级产品的发酵；(2)具有出色的蛋白翻译后加工能力及分泌能力；(3)黑曲霉对目的蛋白的加工方式更似哺乳动物，选择低蛋白背景的黑曲霉为宿主可进行单一胞外蛋白的分泌，为后续蛋白分离纯化省去繁琐步骤。
尽管利用黑曲霉表达系统生产重组蛋白具有巨大的潜力，但其也存在较多不足与难点。其中，黑曲霉因其转化效率低造成难以实现分子遗传操作，严重限制了黑曲霉高效表达系统的开发及应用。目前，黑曲霉常用的转化方法包括电转化、农杆菌介导法和聚乙二醇(PEG)介导法。这些方法各有其优缺点，电转化法操作转化子获得率低；农杆菌介导转化的效率较高但是耗时较长，且引入的外源DNA拷贝数通常较低；聚乙二醇介导法是目前在黑曲霉中应用最广泛的方法，该方法用原生质体作为转化的受体细胞，获得纯合子的概率更高，整个转化流程用时较短。原生质体的制备原理为，利用外界高渗溶液使细胞失水而缩减，而细胞壁由于其纤维结构而不改变大小，从而产生“质壁分离”，再通过酶解作用破坏细胞壁，最终使原生质体释放出来。不同株系的黑曲霉因基因组信息的差异造成其形态差异明显，细胞壁成分也有所不同，所以制备其原生质体的最佳条件也存在着很大差异。由于黑曲霉细胞壁组成较为复杂，目前人们多倾向于使用复合酶进行处理，但不同黑曲霉菌种在制备原生质体时所需酶和种类不同，而且所需酶浓度、酶解液配比、菌丝的菌龄、酶处理的温度和时间、培养方法及其它因素也存在着差异。另外，造成黑曲霉遗传转化效率低的一个重要原因是原生质体处于感受状态的比例小。因此，优化原生质体制备过程中条件,从而保证制备的原生质体质量及增加处于感受状态的原生质体比例，对提高黑曲霉转化效率，开发黑曲霉菌株具有重要意义。
漆酶是一类可以催化酚类和非酚类化合物氧化的含铜多酚氧化酶，因催化底物范围宽、以水为唯一产物等优势，被认为是“绿色”的生物催化剂，具有重要应用价值。漆酶广泛分布在植物、真菌、昆虫、细菌以及地衣和海绵动物中，但是真菌和细菌依然是漆酶的主要来源，目前已发现的漆酶超过80％来源于真菌。真菌漆酶相比较于细菌漆酶具有氧化还原电势高、比活力高、底物范围广等优势，然而由于真菌漆酶发酵制备周期长、表达量低等特点，限制其在部分工业领域的应用。此外真菌漆酶主要在酸性条件下发挥最佳活性，当pH值＞7时活性基本为零，因此发现在中碱性条件下具有高效催化活力的真菌漆酶并实现其高效制备对拓展漆酶的应用至关重要。
发明内容
本发明提供了一种重组黑曲霉，所述重组黑曲霉表达了灰盖鬼伞菌来源的漆酶，所述灰盖鬼伞菌来源的漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的同源度高于85％的序列。
在本发明的一种实施方式中，编码所述灰盖鬼伞菌漆酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示或或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的同源度高于85％的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述重组黑曲霉是以pC3为表达载体，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PcitA启动子过表达了灰盖鬼伞菌漆酶。
在本发明的一种实施方式中，所述重组黑曲霉是以黑曲霉MA70.15为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述黑曲霉MA70.15公开于Guo S X,Yao G F,Ye HR,etal.Functional Characterization of a Cystathionineβ-Synthase Gene inSulfur Metabolism and Pathogenicity of Aspergillus niger in PearFruit.Journal of Agricultural and Food Chemistry.2019,67(16):4435-4443。
本发明还提供了一种上述重组黑曲霉的构建方法，所述方法为，将携带灰盖鬼伞菌漆酶的表达载体转化至黑曲霉原生质体中。
本发明以黑曲霉MA70.15为实验菌株，通过对酶解液组成、菌丝培养方式、酶解时间和酶解温度及菌株培养时间等因素的优化，确立了一种黑曲霉原生质体高效制备方法。在上述基础上，将重组质粒基于PEG介导法转入到黑曲霉原生质体中，经原生质体再生后获得转化株，从而确立了一种高效的黑曲霉遗传转化方法。
本发明提供了一种上述黑曲霉原生质体的制备及转化方法，具体包括：
(1)原生质体制备；
(2)遗传转化(将表达载体转化至黑曲霉原生质体转化)。
在本发明的一种实施方式中，所述原生质体制备方法包括活化菌株，培养菌丝，收集菌丝，加入酶解液进行酶解，收集原生质体并进行纯化。
在本发明的一种实施方式中，所述将表达载体转化至黑曲霉原生质体转化方法为基于聚乙二醇(PEG)介导原生质体的转化，包括将原生质体悬液、重组质粒与PEG缓冲溶液混合冰浴后，再加入PEG缓冲溶液、渗透压稳定剂和软琼脂培养基，混合后转移至再生培养基，得到转化株，挑取转化株至筛选平板进行筛选。
在本发明的一种实施方式中，所述菌株活化培养方法为：将放置于-80℃冰箱保存的黑曲霉菌甘油管保藏物适当稀释后,涂布至PDA固体培养基(额外补充10mM尿嘧啶)，28℃培养3～5d，使其充分产孢。
在本发明的一种实施方式中，所述菌丝的培养与收集方式为：取已活化的长满孢子的平板，切取4块菌丝块接种到液体YPD培养基(额外补充10mM尿嘧啶)中，于28-32℃，180-220rpm下培养24～60h。
使用垫有双层滤纸的布氏漏斗抽滤，至菌体干燥。然后菌体分别用灭菌去离子水洗2次，0.8M NaCl溶液洗2次，抽滤至菌体干燥。
在本发明的一种实施方式中，所述酶解方法为：用干净药勺刮下菌体，收集到三角瓶或者EP管中，称重，加入酶解液，于水浴摇床中进行酶解。
在本发明的一种实施方式中，所述的菌丝与酶解液的比例(w/v)为1～1.5：10；所述酶解时间为1.5～4h；所述酶解液组分(w/v)为：纤维素酶1～3％，溶壁酶0.5～1.5％，溶菌酶0.2～0.6％，蜗牛酶0.5～1.5％，NaCl 0.6～0.9M，80～120mM pH 6.0的磷酸钠缓冲液10％；所述酶解条件温度为：30～37℃。
在本发明的一种实施方式中，所述原生质体的收集与纯化方法为：用擦镜纸过滤酶解液，离心，弃上清，收集原生质体。加入渗透压稳定剂，重悬原生质体，离心，收集原生质体。加入适量渗透压稳定剂，吹吸，重悬原生质体，得到原生质体悬液。
在本发明的一种实施方式中，所述的遗传转化方法为：吸取原生质体悬液150～200μL(1×104～1×106个/mL)至离心管，加入重组质粒(4～10μg)和PEG缓冲溶液，冰浴15～40min后，加入PEG缓冲溶液，室温放置5～30min。
在本发明的一种实施方式中，所述的原生质体再生方法为：将转化混合溶液、渗透压稳定剂和软琼脂培养基混合后转移至再生培养基，28℃正置培养4到7天，得到转化株，
在本发明的一种实施方式中，所述转化子的筛选方式为：挑取转化子至筛选平板进行筛选。涉及到的筛选平板组分(w/v)包括：葡萄糖1.5-3％，NaNO3 0.2-0.4％，KCl 0.1-0.3％，MgSO4·7H2O 0.04-0.06％，KH2PO4 0.05-0.15％，FeSO4·7H2O 0.001％，琼脂粉1.5-2％，以及ABTS 0.4-0.6mM，CuSO4 0.05-0.15mM。
在本发明的一种实施方式中，所述用于活化培养的固体平板为PDA固体平板，1L的培养基包含组分：土豆150-250g，葡萄糖15-25g，琼脂15-20g，需要额外补加10mM尿嘧啶。
在本发明的一种实施方式中，所述液体培养基为YPD培养基，1L的培养基包含组分：蛋白胨15-25g，酵母提取物5-15g，葡萄糖15-25g，需要额外补加10mM尿嘧啶。
在本发明的一种实施方式中，所述渗透压稳定剂组分包含：CaCl2 40-60mM，山梨醇1.0-1.4mM，Tris-HCl 8-12mM，pH 7.5。
在本发明的一种实施方式中，所述PEG缓冲液组分包含：PEG 4000 40-80％(w/v)，CaCl240-60mM，Tris-HCl 5-15mM，pH 7.5。
在本发明的一种实施方式中，高渗软琼脂培养基组分(w/v)为：蔗糖30-35％，NaNO30.2-0.4％，KCl 0.1-0.3％，MgSO4·7H2O 0.02-0.07％，KH2PO4 0.1-0.2％，FeSO4·7H2O0.001-0.003％，琼脂粉1％。
在本发明的一种实施方式中，所述的再生培养基组分同高渗软琼脂培养基，区别在于琼脂粉添加量(w/v)为1.5-2％。
在本发明的一种实施方式中，所述的筛选培养基组分(w/v)包含：葡萄糖1.5-3％，NaNO30.2-0.4％，KCl 0.1-0.3％(w/v)，MgSO4·7H2O 0.04-0.06％，KH2PO4 0.05-0.15％，FeSO4·7H2O0.001％，琼脂粉1.5-2％，以及ABTS 0.4-0.6mM，CuSO4 0.05-0.15mM。
本发明提供了上述重组黑曲霉在制备灰盖鬼伞菌来源的漆酶中的应用。
有益效果
(1)采用本发明方法，以黑曲霉为出发材料，通过对酶解液组成、菌丝培养方式、酶解时间和酶解温度及菌株培养时间等因素的优化，确立黑曲霉原生质体制备方法，较优化前黑曲霉原生质体的数目增加约5倍，数目达到2.2×106个/mL，转入重组质粒，转化子数目提升近4倍，提升了黑曲霉转化效率。
(2)采用本发明方法，通过启动子优化，获得启动子PcitA，使得漆酶表达情况从定性与定量检测均检测不到漆酶活性提升到到定性显著观察到漆酶活性与定量检测漆酶活性为150U/L，实现了灰盖鬼伞漆酶Lcc9在黑曲霉中的有效表达。
附图说明
图1为本发明构建的漆酶表达载体pC3-G3示意图。
图2为本发明构建的漆酶表达载体pC3-G3的验证结果；其中A为：菌落PCR鉴定，1～4分别为：转化子1、转化子2、转化子3、转化子4；B为：质粒酶切验证，1～2分别为：转化子2、转化子3。
图3为本发明重组黑曲霉G3-AT18的平板显色结果与活性蛋白胶结果；其中A为：重组黑曲霉G3-AT18在含有ABTS的平板上的显色情况，B为：重组黑曲霉G3-AT18摇瓶发酵上清的活性蛋白胶结果。
图4为原生质体制备的优化，其中：A为本发明酶解液组成对原生质体制备的影响；1～5分别表示酶解液组分1、酶解液组分2、酶解液组分3、酶解液组分4、酶解液组分5；B为本发明菌丝培养方式对原生质体制备的影响，1为：固体平板培养，2为液体摇瓶培养；C为本发明酶解时间对原生质体制备的影响；D为本发明酶解温度对原生质体制备的影响；E为本发明菌丝培养时间对原生质体制备的影响。
图5为本发明重组黑曲霉C2-AT2的平板显色结果与摇瓶发酵结果；其中A为：重组黑曲霉C2-AT2在含有ABTS的平板上的显色情况，B为：重组黑曲霉C2-AT2摇瓶发酵上清的漆酶活性变化曲线；C为：重组黑曲霉C2-AT2摇瓶发酵上清的活性蛋白胶结果。
具体实施方式
下列实施例中的实施方法，如无特别说明，均为常规方法。
在本发明的一种实施方式中，所述黑曲霉MA70.15公开于Guo S X,Yao G F,Ye HR,etal.Functional Characterization of a Cystathionineβ-Synthase Gene inSulfur Metabolism and Pathogenicity of Aspergillus niger in PearFruit.Journal of Agricultural and Food Chemistry.2019,67(16):4435-4443。下述实施例中所涉及的合成基因PUC57-lcc9、PUC57-TtrpC、PUC57-PgpdA-ANU、PUC57-PalcA、PUC57-PpkiA、PUC57-Pcdna1、PUC57-PmbfA、PUC57-PsucA、PUC57-PcitA、均是以市售载体骨架和相应的基因组成，均是送去公司合成的。
下述实施例中所涉及的培养基及溶液如下：
PDA固体培养基(1L)：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，根据需要额外补加10mM尿嘧啶。
YPD培养基(w/v)：蛋白胨2％，酵母提取物1％，葡萄糖2％，根据需要额外补加10mM尿嘧啶。
高渗固体CD培养基(1L)：蔗糖34％(w/v)，NaNO3 0.3％(w/v)，KCl 0.2％(w/v)，MgSO4·7H2O 0.05％(w/v)，KH2PO4 0.1％(w/v)，FeSO4·7H2O 0.001％(w/v)，琼脂粉1.5-2％(w/v)。
高渗CD软琼脂培养基(w/v)：蔗糖34％，NaNO3 0.3％，KCl 0.2％，MgSO4·7H2O0.05％，KH2PO4 0.1％，FeSO4·7H2O 0.001％，琼脂粉1％。
筛选培养基(w/v)：葡萄糖2％，NaNO3 0.3％，KCl 0.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，KH2PO40.1％，FeSO4·7H2O 0.001％，琼脂粉1.5-2％，以及ABTS 0.5mM，CuSO4 0.1mM。
STC缓冲液：无水CaCl2 50mM，山梨醇1.2M，Tris-HCl 10mM，pH 7.5。
PEG缓冲液：PEG 4000 60％(w/v)，CaCl2 50mM，Tris-HCl 10mM，pH 7.5。
发酵培养基：70mM NaNO3，7mM of KCl，200mM of K2HPO4，2mM of MgSO4，葡萄糖4％(w/v)，微量元素(1000×母液：76mM of ZnSO4，25mM of MnCl2，18mM of FeSO4，7.1mMof CoCl2，6.4mM of CuSO4，6.2mM of Na2MoO4，and 174mM of EDTA)。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
漆酶酶活：漆酶活力测定采用ABTS法进行，具体为取950μL酒石酸钠缓冲液(100mmol/L，pH 4.0)，加入33μL 15mmol/L ABTS和适当稀释的酶液17μL，充分混匀后30℃水浴3min，冰浴30s终止反应，在λ＝420nm波长下测定反应液的光吸收值。
漆酶活力计算公式：E(U/L)＝OD420×稀释倍数×555.56。
漆酶表达情况：通过活性-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)检测发酵液中的漆酶表达情况。具体操作步骤：将稀释一定倍数的发酵液上清液与2×上样缓冲液混匀后，点样10μL至活性胶胶孔内，于VE-180A微型垂直电泳槽中80V电压电泳30min后，120V继续电泳3h。取下活性胶并于100mmol/L pH 4.0酒石酸钠缓冲液(0.5mmol/L ABTS)中室温孵育。
实施例1：含有灰盖鬼伞菌来源的漆酶的表达载体的构建
重组质粒pC3-G3是在载体pC3的基础上进行构建，所述载体pC3公开于Guo S X,Yao G F,Ye H R,et al.Functional Characterization of a Cystathionineβ-SynthaseGene in Sulfur Metabolism and Pathogenicity of Aspergillus niger in PearFruit.Journal of Agricultural and Food Chemistry.2019,67(16):4435-4443。重组质粒pC3-G3在载体pC3基础上，插入同源臂(用以定点整合至葡糖淀粉酶位点)与漆酶lcc9表达框，同时将筛选标记pyrG调整至上下游同源臂区间以内。重组质粒pC3-G3的载体结构示意图见图1。
具体步骤如下：
分别获得上游同源臂、启动子、lcc9、终止子、pyrG和下游同源臂六个元件，将获得的上述六个片段通过融合PCR得到一个长片段，利用诺唯赞公司的一步克隆试剂盒(CloneExpress II One step Cloning Kit)与线性化之后的pC3片段进行同源重组连接。上下游同源臂分别通过引物F1/R1和F2/R2以黑曲霉MA70.15的基因组为模板通过PCR获得。引物F1/R1和F2/R2的序列见表3；上下游同源臂见表1，PCR体系见表2。
表1：上下游同源臂
表2：PCR反应体系
PCR条件：94℃预变性，10min；98℃变性，30s，55℃退火，15s，72℃延伸，1min，30个循环；72℃，10min。PCR产物进行胶回收。
Lcc9的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，通过引物F3/R3以合成基因PUC57-lcc9为模板通过PCR获得，lcc9序列如SEQ ID NO.2所示。引物F3/R3的序列见表3。介导Lcc9表达的启动子Pgpd序列如SEQ ID NO.4所示，通过引物F4/R4以合成基因为模板通过PCR获得。引物F4/R4的序列见表3。终止子TtrpC序列(SEQ ID NO.5)通过引物F5/R5以合成基因PUC57-TtrpC为模板通过PCR获得。引物F5/R5的序列见表3。pyrG为pC3载体上已有序列，通过引物F6/R6以质粒pC3为模板通过PCR获得。引物F6/R6的序列见表3。
表3：引物序列
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| F3 | TCGCTTTCCAGGTCAAAGCAATGTCCTTCCGCTCCCTGC |
| R3 | TAAATCATTAGGGGGTGGGGACGATCTGG |
| F4 | ATCATTACACCTCAGCACCGCGGGAAGAAGAATTCA |
| R4 | GGAAGGACATTGCTTTGACCTGGAAAGCGA |
| F5 | CCCCACCCCCTAATGATTTAATAGCTCCATGTCAACAAG |
| R5 | GAGATCCATAGGATCCTAGAAAGAAGGATTACCTCTAAACAAGTG |
| F6 | TCTAGGATCCTATGGATCTCAGAACAATATACC |
| R6 | AACAATGTCCGTGGGGTGGTGGGAAATCTTGT |
| F1 | TCCCTTACTCGGTACCCGGGCCTCTCGTATGCAGAGGAAATCTC |
| R1 | CGGTGCTGAGGTGTAATGATGCTGG |
| F2 | ACCACCCCACGGACATTGTTTGGCCCC |
| R2 | ATTGTGCCGTGTTAGAGTAGACGCTGCTGGCAGAGGTCT |
所采用的融合PCR分为两步，第一步在无引物的情况下利用各元件之间的同源序列进行重组融合，融合PCR体系见表4；第二步利用引物F1/R2对第一步的重组产物进行PCR大量扩增。载体pC3的线性化是通过反向PCR实现的，引物F7/R7的序列见表5。
表4：融合PCR反应体系
PCR条件：94℃预变性，5min；98℃变性，30s，55℃退火，15s，72℃延伸，1min 49s，15个循环；72℃，10min。PCR产物进行胶回收。
表5：引物序列
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| F7 | CTACTCTAACACGGCACAATTATCCA |
| R7 | CCCGGGTACCGAGTAAGGG |
融合片段与线性化的载体pC3的连接体系见表6。
表6：一步克隆连接体系
| 组分 | 用量 |
| 融合片段 | 2μL |
| 线性化载体 | 1μL |
| 5×CE II Buffer | 4μL |
| Exnase II | 2μL |
| ddH2O | Up to 20μL |
连接条件：37℃反应30min。
由图2可知：通过菌落PCR、酶切验证与测序表明已成功构建重组载体pC3-Pgpd-lcc9(简称pC3-G3)。
实施例2：重组黑曲霉的构建及漆酶的表达
(1)原生质体的制备
a.菌株的活化培养
将放置于-80℃冰箱保存的黑曲霉菌MA70.15甘油管保藏物适当稀释后，涂布至PDA固体培养基(额外补充10mM尿嘧啶)，28℃培养3～5d。
b.菌丝体的培养(液体培养方法)
取已活化的长满孢子的平板，切取4块菌丝块接种到YPD液体培养基(额外补充10mM尿嘧啶)中，28-32℃，180-220rpm培养48h。
c.菌丝体的收集
使用垫有双层滤纸的布氏漏斗抽滤，至菌体干燥。然后菌体分别用20mL的灭菌去离子水洗2次，0.8M NaCl溶液洗2次，抽滤至菌体干燥。用干净药勺刮下菌体，收集到三角瓶或者EP管中，称重。
d.菌丝体的酶解
按照菌丝与酶解液的比例为1：10(w/v)加入酶解液，放置在37℃，100rpm水浴摇床中进行酶解，酶解时间为3h。
其中酶解液为：纤维素酶2％，蜗牛酶1％，NaCl 0.8M，100mM，pH6.0的磷酸钠缓冲液10％(v/v)。
e.原生质体的收集
分别用4层擦镜纸(光面)过滤酶解液，收集原生质体，然后再用0.8M NaCl冲洗酶解液的试管及擦镜纸。4℃，3000～4000rpm离心10min，弃上清，分别收集采用不同酶解液得到的原生质体。
f.原生质体的纯化
加入渗透压稳定剂STC缓冲液，用去尖枪头轻轻吹吸，重悬原生质体，4℃，3000～4000rpm离心10min，收集原生质体。该步骤重复一次。加入适量渗透压稳定剂STC缓冲液，用去尖枪头轻轻吹吸，重悬原生质体，得到原生质体悬液。
(2)原生质体的转化
分别吸取原生质体悬液150～200μL至2mL离心管，然后加入20μL重组质粒pC3-G3(4～10μg)和50μL PEG缓冲溶液，上下颠倒轻轻混匀，每隔10min上下颠倒混匀一次，冰浴30min后，加入1.5mL的PEG缓冲溶液，室温放置25min。
(3)原生质体的再生
在10mL离心管中加入2.5mL的STC缓冲液和5mL的高渗CD软琼脂培养基，混匀后，将原生质体转化混合液转移至10mL离心管中，用预冷的5mL去尖枪头混匀后分别吸5mL至两个高渗固体CD培养基上，轻轻转动平板，使软琼脂在平板上均匀的展开，28℃，正置，培养4 -7天。
(4)转化子的筛选与鉴定
挑取再生平板上的转化株，得到重组黑曲霉菌株MA70.15/pC3-G3，菌株命名为G3-AT18，将转化株接种至筛选培养基上，在28℃条件下培养2-3天后，观察菌株生长情况与显色情况；
结果显示，其在平板上不显色，表明未检测到漆酶活性。
(5)重组黑曲霉的摇瓶发酵
将获得的重组菌G3-AT18涂布于PDA固体平板上，培养3～5天后，待其充分产孢后，加入含0.05％吐温80的生理盐水溶液，刮取孢子，制备成孢子悬液。将新鲜孢子悬液接种至发酵培养基中(1×105spores/mL)，30℃，200rpm培养7天。每日取发酵液样品1mL，12000×g离心5min，取上清保存于4℃冰箱中，发酵上清液用来测定漆酶活力与漆酶表达情况(图3)。
漆酶表达情况：将发酵液上清液与2×上样缓冲液混匀后，点样10μL至活性胶胶孔内，于VE-180A微型垂直电泳槽中80V电压电泳30min后，120V继续电泳3h。取下活性胶并于100mmol/L pH 4.0酒石酸钠缓冲液(0.5mmol/L ABTS)中室温孵育。
结果显示，未检测到漆酶活性，活性胶也无显色条带，表明未检测到漆酶的表达。
实施例3：黑曲霉转化效率的提高
下述实施例通过对酶解液组成、菌丝培养方式、酶解时间和酶解温度及菌株培养时间等因素的优化，对实施例2中的黑曲霉原生质体进行优化，具体步骤如下：
1、酶解液的组成对原生质体制备的影响
(1)菌株的活化培养
将放置于-80℃冰箱保存的黑曲霉菌MA70.15甘油管保藏物适当稀释后，涂布至PDA固体培养基(额外补充10mM尿嘧啶)，28℃培养3～5d。
(2)菌丝体的培养(液体培养方法)
取已活化的长满孢子的平板，切取4块菌丝块接种到YPD液体培养基(额外补充10mM尿嘧啶)中，28-32℃，180-220rpm培养48h。
(3)菌丝体的收集
使用垫有双层滤纸的布氏漏斗抽滤，至菌体干燥。然后菌体分别用20mL的灭菌去离子水洗2次，0.8M NaCl溶液洗2次，抽滤至菌体干燥。用干净药勺刮下菌体，收集到三角瓶或者EP管中，称重。
(4)菌丝体的酶解
按照菌丝与酶解液的比例为1：10(w/v)加入酶解液，放置在30℃，100rpm水浴摇床中进行酶解，酶解时间为3h。
其中酶解液分别为：酶解液组分1、酶解液组分2、酶解液组分3、酶解液组分4、酶解液组分5；筛选最优的酶解液成分：所述酶解液组分1为：纤维素酶2％，NaCl 0.8M，100mMpH6.0的磷酸钠缓冲液10％(v/v)；酶解液组分2为：纤维素酶2％，蜗牛酶1％，NaCl 0.8M，100mM pH6.0的磷酸钠缓冲液10％(v/v)；酶解液组分3为：纤维素酶2％，溶壁酶1％，NaCl0.8M，100mM pH6.0的磷酸钠缓冲液10％(v/v)；酶解液组分4为：纤维素酶2％，蜗牛酶1％，溶壁酶1％，NaCl 0.8M，100mM pH6.0的磷酸钠缓冲液10％(v/v)；酶解液组分5为：纤维素酶2％(w/v)，溶壁酶1％(w/v)，溶菌酶0.5％(w/v)，蜗牛酶1％(w/v)，NaCl 0.8M，100mMpH6.0的磷酸钠缓冲液10％(v/v)。
(5)原生质体的收集
分别用4层擦镜纸(光面)过滤酶解液，收集原生质体，然后再用0.8M NaCl冲洗酶解液的试管及擦镜纸。4℃，3000～4000rpm离心10min，弃上清，分别收集采用不同酶解液得到的原生质体。
(6)原生质体的纯化
加入渗透压稳定剂STC缓冲液，用去尖枪头轻轻吹吸，重悬原生质体，4℃，3000～4000rpm离心10min，收集原生质体。该步骤重复一次。加入适量渗透压稳定剂STC缓冲液，用去尖枪头轻轻吹吸，重悬原生质体，得到原生质体悬液；结果如图4中的A所示。
结果显示，不同成分的酶解液对原生质体的制备有影响。霉菌细胞壁的结构及组成复杂，仅选择单一的酶组份，无法制备出原生质体。酶解液组分5的效果最优，即酶解液(w/v)为纤维素酶2％，溶壁酶1％，溶菌酶0.5％，蜗牛酶1％时，制备出的原生质体数目可以达到近1×106个/mL。
2、菌丝培养方式对原生质体制备的影响
参照步骤1的方法进行菌株的活化培养，获得活化后的菌株。
(1)菌丝体的培养
分为液体培养和固体平板培养两种，其中，液体培养参照步骤1中菌丝的液体培养方法。
固体平板培养：取步骤1得到的已活化的长满孢子的平板，加入含0.05％吐温80的生理盐水溶液，刮取孢子，制备成孢子悬液。涂布至铺有玻璃纸的PDA固体平板上，28℃培养24h。
(2)菌丝体的收集
参照步骤1中通过液体培养后收集菌丝的方法收集液体培养的菌丝。
固体平板培养的菌丝无需抽滤、洗涤，可以直接用于酶解。用干净药勺刮下菌体，收集到三角瓶或者EP管(灭菌)中，称重。
参照步骤1进行菌丝体的酶解、原生质体的收集与纯化，其中，酶解液选择酶解液组分纤维素酶2％(w/v)，溶壁酶1％(w/v)，溶菌酶0.5％(w/v)，蜗牛酶1％(w/v)，NaCl0.8M，100mM pH6.0的磷酸钠缓冲液10％(v/v)；结果如图4中的B所示。
结果显示，不同培养方式的菌丝体对原生质体的制备有影响。通过液体培养获得的菌丝体为菌球，结构疏松，固体平板上获得的菌丝，结构致密，在玻璃纸上盘结为厚实片状结构，去壁降解难度增加，表明菌丝体形态结构更直接地影响菌丝体的去壁酶解效率。因此，液体培养方法更适合菌丝体的培养，通过液体培养获得的菌丝体，制备出的原生质体数目可以达到近1×106个/mL。
3、酶解时间对原生质体制备的影响
具体实施方式同步骤1，区别在于，调整步骤(4)菌丝体的酶解为：
按照菌丝与酶解液的比例为1：10(w/v)加入酶解液，放置在30℃，100rpm水浴摇床中进行酶解；酶解时间依次为1.5、2、2.5、3、3.5和4h。
其中，酶解液组分为：纤维素酶2％(w/v)，溶壁酶1％(w/v)，溶菌酶0.5％(w/v)，蜗牛酶1％(w/v)，NaCl 0.8M，100mM pH6.0的磷酸钠缓冲液10％(v/v)；分别检测制备出的原生质体数；结果如图4中的C所示。
结果显示，不同酶解时间对原生质体的制备有影响。菌丝酶解时间过短，菌丝酶解不充分；菌丝酶解时间过长，制备出的原生质体膜会受到损伤。酶解时间为3h，制备出的原生质体数目可以达到近1×106个/mL。
4、酶解温度对原生质体制备的影响
具体实施方式同步骤1，区别在于，调整步骤(4)菌丝体的酶解为：
按照菌丝与酶解液的比例为1：10(w/v)加入酶解液，分别将酶解温度设置为30、34和37℃，置于100rpm水浴摇床中进行酶解，酶解时间为3h。其中，酶解液组分为：纤维素酶2％(w/v)，溶壁酶1％(w/v)，溶菌酶0.5％(w/v)，蜗牛酶1％(w/v)，NaCl 0.8M，100mM pH6.0的磷酸钠缓冲液10％(v/v)；分别检测制备出的原生质体数；结果如图4中的D所示。
结果显示，不同酶解温度对原生质体的制备有影响。不同的温度影响酶的活性，进而影响酶去壁结果。酶解温度为37℃，制备出的原生质体数目可以达到近2.2×106个/mL。
5、菌丝培养时间对原生质体制备的影响
参照步骤1的方法进行菌株的活化培养。
(1)菌丝体的培养
取已活化的长满孢子的平板，切取4块菌丝块接种到YPD液体培养基(额外补充10mM尿嘧啶)中，28～32℃，180～220rpm培养；培养时间分别为24、36、48和60h。
参照步骤1的方法进行菌丝体的收集。
(2)菌丝体的酶解
按照菌丝与酶解液的比例为1：10(w/v)加入酶解液，放置在37℃，100rpm水浴摇床中进行酶解，酶解时间为3h；其中，酶解液组分为：纤维素酶2％(w/v)，溶壁酶1％(w/v)，溶菌酶0.5％(w/v)，蜗牛酶1％(w/v)，NaCl 0.8M，100mM pH6.0的磷酸钠缓冲液10％(v/v)；分别检测制备出的原生质体数；结果如图4中的E所示。
结果显示，不同菌株培养时间对原生质体的制备有影响。菌龄通过影响菌丝体形态结构更直接地影响菌丝体的去壁酶解效率。菌株培养时间为48h，制备出的原生质体数目可以达到近2.2×106个/mL。
实施例4：对黑曲霉原生质体进行优化后的重组黑曲霉的构建及漆酶的表达
具体参照实施例3的步骤4进行原生质体的制备(其中，设置酶解温度为37℃)，参照实施例2步骤(2)和(3)进行原生质体的转化与再生。
(1)转化子的筛选与鉴定
挑取再生平板上的转化株，得到重组黑曲霉菌株MA70.15/pC3-G3，菌株命名为G3-2AT1(与优化前的菌株G3-AT18相区分)，观察菌株生长情况与显色情况。
结果显示，其在平板上不显色，表明未检测到漆酶活性。
(2)重组黑曲霉的摇瓶发酵
将获得的重组菌G3-2AT1涂布于PDA固体平板上，培养3～5天后，待其充分产孢后，加入含0.05％吐温80的生理盐水溶液，刮取孢子，制备成孢子悬液。将新鲜孢子悬液接种至发酵培养基中(1×105spores/mL)，30℃，200rpm培养7天。取发酵液样品1mL，12000×g离心5min，取上清保存于4℃冰箱中，发酵上清液用来测定漆酶活力。
结果显示，优化黑曲霉原生质体的制备后，原生质体的数目提升约5倍，转化子的数目提升约4倍，提高了转化效率，但是没有检测到漆酶活性，未实现漆酶的表达。
实施例5：启动子的优化对于漆酶的表达的影响
具体步骤如下：
(1)载体骨架的获得
载体骨架片段是使用引物F8/R8从实施例1中构建的表达载体pC3-G3获得的，所述引物序列如表7所示，PCR体系见表8。
表7：引物序列
| 引物 | 序列(5’-3’) |
| F8 | ATGTCCTTCCGCTCCCTGC |
| R8 | TGCTGAGGTGTAATGATGCTGG |
表8：PCR反应体系
PCR条件：94℃预变性，10min；98℃变性，30s，55℃退火，15s，72℃延伸，10min，30个循环；72℃，10min。PCR产物进行胶回收。
(2)启动子片段的获得
通过引物F9/R9至F15/R15以合成基因PUC57-PgpdA-ANU、PUC57-PalcA、PUC57-PpkiA、PUC57-Pcdna1、PUC57-PmbfA、PUC57-PsucA、PUC57-PcitA为模板通过PCR获得(PgpdA-ANU、PalcA、PpkiA、Pcdna1、PmbfA、PsucA启动子序列依次如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.11及PcitA启动子序列如SEQ ID NO.3所示)，所述引物序列如表9所示。
表9：引物序列
(3)含有不同启动子的表达载体的获得
分别制备得到不同的启动子PgpdA-ANU、PalcA、PpkiA、Pcdna1、PmbfA、PsucA、PcitA片段，利用诺唯赞公司的一步克隆试剂盒(CloneExpress II One step Cloning Kit)与线性化之后的pC3-G3片段进行同源重组连接，替换lcc9前的启动子Pgpd序列。
启动子片段与线性化的载体pC3-G3的连接体系见表10。
表10：一步克隆连接体系
| 组分 | 用量 |
| 启动子片段 | 2μL |
| 线性化载体 | 1μL |
| 5×CE II Buffer | 4μL |
| Exnase II | 2μL |
| ddH2O | Up to 20μL |
连接条件：37℃反应30min。
分别构建得到表达载体pC3-PgpdA-ANU-lcc9(简称pC3-G4)、pC3-PalcA-lcc9(简称pC3-A1)、pC3-PpkiA-lcc9(简称pC3-P1)、pC3-Pcdna1-lcc9(简称pC3-C1)、pC3-PmbfA-lcc9(简称pC3-M1)、pC3-PsucA(-lcc9简称pC3-S1)、pC3-PcitA-lcc9(简称pC3-C2)。
(4)含有不同启动子的重组黑曲霉的获得
具体参照实施例4进行原生质体的制备和原生质体的转化与再生。
分别挑取再生平板上的转化株至筛选平板上，观察菌株生长情况与显色情况。最终分别制备得到重组黑曲霉菌株MA70.15/pC3-G4、MA70.15/pC3-A1、MA70.15/pC3-P1、MA70.15/pC3-C1、MA70.15/pC3-M1、MA70.15/pC3-S1、MA70.15/pC3-C2，分别命名为：G4-AT4、A1-AT45、P1-AT1、C1-AT2、M1-2AT4、S1-AT3、C2-AT2(MA70.15/pC3-PcitA-lcc9)。
(5)含有不同启动子的重组黑曲霉的摇瓶发酵
分别将步骤(4)获得的重组菌G4-AT4、A1-AT45、P1-AT1、C1-AT2、M1-2AT4、S1-AT3、C2-AT2涂布于PDA固体平板上，培养3～5天后，待其充分产孢后，加入含0.05％吐温80的生理盐水溶液，刮取孢子，制备成孢子悬液。将新鲜孢子悬液接种至发酵培养基中(1×105spores/mL)，30℃，200rpm培养7天。每日取发酵液样品1mL，12000×g离心5min，取上清保存于4℃冰箱中，发酵上清液用来测定漆酶活力与漆酶表达情况，结果如图5和表11所示。
表11：不同重组黑曲霉漆酶活力与漆酶表达情况
| 重组黑曲霉 | 漆酶活力 |
| G4-AT4 | 未检测到 |
| A1-AT45 | 未检测到 |
| P1-AT1 | 未检测到 |
| C1-AT2 | 未检测到 |
| M1-2AT4 | 未检测到 |
| S1-AT3 | 未检测到 |
| C2-AT2 | 150U/L |
图5中的A显示，重组黑曲霉C2-AT2在含有ABTS的平板上显现出绿色，表明有漆酶活性。图5中的B显示(以原始底盘细胞黑曲霉MA70.15为对照，)，随培养天数的增加，漆酶活性呈现上升趋势，在D6达到最高，酶活约150U/L。
结果表明，进行启动子优化后，获得启动子PcitA(SEQ ID NO.3)，获得的菌株C2-AT2可检测到漆酶活性，约150U/L，活性胶有显色条带，表明实现了漆酶的有效表达。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种重组黑曲霉，其特征在于，所述重组黑曲霉表达了灰盖鬼伞菌来源的漆酶，所述灰盖鬼伞菌来源的漆酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示或与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的同源度高于85％的序列。
2.根据权利要求1所述的重组黑曲霉，其特征在于，编码所述灰盖鬼伞菌漆酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示或与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的同源度高于85％的序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组黑曲霉，其特征在于，所述重组黑曲霉是以pC3为表达载体，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的PcitA启动子过表达了灰盖鬼伞菌漆酶。
4.根据权利要求3所述的重组黑曲霉，其特征在于，所述重组黑曲霉是以黑曲霉MA70.15为表达宿主。
5.权利要求1所述的重组黑曲霉的构建方法，其特征在于，将携带灰盖鬼伞菌漆酶的表达载体转化至黑曲霉原生质体中，制备得到的；
所述黑曲霉原生质体制备方法包括：活化菌株、培养菌丝、收集菌丝、加入酶解液进行酶解、收集原生质体并进行纯化；
所述将表达载体转化至黑曲霉原生质体转化方法为基于聚乙二醇(PEG)介导原生质体的转化，包括将原生质体悬液、重组质粒与PEG缓冲溶液混合后，再加入PEG缓冲溶液、渗透压稳定剂和软琼脂培养基，混合后转移至再生培养基并进行转化子筛选。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述酶解液组成为：纤维素酶1～3％(w/v)，溶壁酶0.5～1.5％(w/v)，溶菌酶0.2～0.6％(w/v)，蜗牛酶0.5～1.5％(w/v)，NaCl0.6～1.0M，80～120mM，pH 5.5～6.5的磷酸钠缓冲液10％(v/v)；优选的，所述培养菌丝为，取已活化的长满孢子的平板，切取4块菌丝块接种到YPD液体培养基中，28～32℃，180～220rpm培养36～60h。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述酶解的时间为2.5～4h，菌丝与酶解液的比例按照质量体积比为(0.5～1.5)：10；优选的，酶解的温度为30℃～37℃。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述转化子筛选的方法为：混合后转移至再生培养基，培养4-7d，得到转化株，挑取转化株至筛选培养基进行筛选；优选的，所述再生培养基组分(w/v)包含：蔗糖30-35％，NaNO3 0.2-0.4％，KCl 0.1-0.3％，MgSO4·7H2O0.02-0.07％，KH2PO4 0.1-0.2％，FeSO4·7H2O 0.001-0.003％；
优选的，所述筛选培养基组分(w/v)包含：葡萄糖1.5-3％，NaNO3 0.2-0.4％，KCl 0.1-0.3％(w/v)，MgSO4·7H2O 0.04-0.06％，KH2PO4 0.05-0.15％，FeSO4·7H2O 0.001％，琼脂粉1.5-2％，以及ABTS 0.4-0.6mM，CuSO4 0.05-0.15mM。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于，所述的渗透压稳定剂组分包含：CaCl240-60mM，山梨醇1.0-1.4mM，Tris-HCl 8-12mM；
所述的PEG缓冲液组分包含：PEG 4000 40-80％(w/v)，CaCl2 40-60mM，Tris-HCl 5-15mM。
10.权利要求1～4任一项所述的重组黑曲霉在制备灰盖鬼伞菌漆酶中的应用。
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