CN117178052A - 高蜡酯含量的裸藻的生产方法和生产系统、以及蜡酯或生物燃料组合物的制造方法和制造系统、以及蜡酯发酵促进剂 - Google Patents

高蜡酯含量的裸藻的生产方法和生产系统、以及蜡酯或生物燃料组合物的制造方法和制造系统、以及蜡酯发酵促进剂 Download PDF

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Abstract

提供了与以往相比改善为能够更有效地促进蜡酯(WE)发酵的高WE含量的裸藻的生产方法和生产系统、以及WE或生物燃料组合物的制造方法和制造系统、以及WE发酵促进剂。一种高WE含量的裸藻的生产方法，其中，所述生产方法为如下的方法：准备裸藻，在糖的存在下于好氧条件下进行培养，在酸性环境中给予蜡酯发酵促进物质，于常温下保持规定的时间，其中，所述蜡酯发酵促进物质是选自分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2～4的一价羧酸及其盐的1种以上的化合物。

Description

高蜡酯含量的裸藻的生产方法和生产系统、以及蜡酯或生物 燃料组合物的制造方法和制造系统、以及蜡酯发酵促进剂
技术领域
本发明涉及一种与准备的裸藻(ユーグレナ)相比蜡酯(wax ester：以下也称为“WE”)含量提高的裸藻(以下也称为“高WE含量的裸藻”，意为“高蜡酯含量的裸藻”)的生产方法和生产系统、以及WE或生物燃料组合物的制造方法和制造系统、以及蜡酯发酵(以下也称为“WE发酵”)促进剂。
背景技术
生物燃料是以动物或植物等生物资源为原料的燃料。在可作为生物燃料使用的各种成分中，作为分子内的碳原子数多且燃烧时产生的热量比较大的成分，可以举出来自裸藻的WE(参照专利文献1和专利文献2)。通常，WE是碳原子数10以上的脂肪酸和碳原子数8以上的脂肪族醇的酯，即分子内的碳原子数为18以上的酯。裸藻(属名：Euglena、日文名：ミドリムシ)是一种独特的单细胞生物，兼具进行鞭毛运动的动物性质和进行光合作用的植物性质。裸藻具有能够通过根据营养条件改变细胞内的贮藏物质而在多种营养条件下生长的特性。为了有效利用该特性，进行了各种各样的研究开发。
例如，专利文献2中记载了如下的WE制造方法：在好氧条件下于27℃～35℃左右的液温下培养裸藻后，在低氧处理的同时在16℃左右进行培养后，从培养的裸藻提取WE。通过在好氧条件下的培养，裸藻细胞内生成作为多糖类的一种的裸藻糖(パラミロン，β-1,3-葡聚糖)并将其贮藏。然后，通过伴随低氧处理的培养，裸藻细胞内发生将裸藻糖分解而生物合成ATP(腺嘌呤核苷三磷酸)的代谢。作为其代谢产物，专利文献2中说明了可以在细胞内产生分子内的碳原子数为24以上且26以下的WE这一要旨。因此，作为裸藻细胞中独特的现象，在厌氧条件下在裸藻细胞中裸藻糖以不依赖于氧的方式被代谢、ATP产生的副产物以WE的形式贮藏在细胞内的反应(也被称为蜡酯发酵(WE发酵))被知晓。专利文献2中说明了优选使用3-酮脂酰CoA硫解酶(KAT)1基因的表达受到抑制的KAT1敲低裸藻这一要旨。
专利文献1中记载了如下的生物燃料制造方法：在好氧条件下向裸藻给予糖进行培养后，在酸性环境中给予丙酸，放置一定时间后，从放置的裸藻回收WE。专利文献1中说明了如下要旨：回收的WE大量含有肉豆蔻酸(碳原子数14)与肉豆蔻醇(碳原子数14)的酯，即肉豆蔻酸肉豆蔻酯(碳原子数28)，因此例如期待作为喷气燃料的替代燃料而被有效利用。另外，专利文献1中还说明了如下要旨：丙酸在裸藻细胞中抑制了好氧呼吸引起的ATP生物合成，诱导到了裸藻糖被分解且不得不进行ATP生物合成的状态，因此细胞内WE发酵被促进。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2020/162502号
专利文献2：日本特开2017-148005号公报
专利文献3：专利第6329440号
专利文献4：专利第6019305号
非专利文献
非专利文献1：M.Cramer,其他1人,Arch.Mikrobiol.,1952,第17卷,pp.384-402
非专利文献2：J.A.Schiff,其他2人,Methods Enzymol.,1971,第23卷,pp.143-162
非专利文献3：L.E.Koren,其他1人,The Journal of Protozoology,1967,第14卷,增刊,p.17
发明内容
发明所要解决的技术问题
与专利文献2中记载的制造方法相比，认为专利文献1中记载的制造方法具有如下优点。第一，具有如下优点：由于给予糖后太阳光对于裸藻的培养不是必须的，因此不受天气、日照时间的影响，如果进行温度管理则全年都可以进行培养。第二，具有如下优点：低氧处理和低温处理不是必须的，因此能够削减用于这些处理的费用、时间和精力。第三，具有如下优点：野生株的裸藻的WE收率也高，因此所使用的裸藻不限于特定的变异株等。
但是，为了将来扩大WE制造的规模，实现商业化，希望能够找到可以更有效地促进WE发酵的方法。进一步地，如果可能，优选能够开发与以往的制造方法相比省力、制造成本降低的制造方法。专利文献1中所使用的丙酸在恶臭防止法实施规则(悪臭防止法施行規則)中被指定为特定恶臭物质。因此，进一步地，如果可能，优选例如能够改善WE制造方法，使得即使在使用丙酸的情况下，使其使用量稍微减少也能够有效地促进WE发酵。
因此，本发明的技术问题在于，提供与使用裸藻的以往的蜡酯制造方法相比改善为能够更有效地促进蜡酯发酵的高蜡酯含量的裸藻的生产方法和生产系统、以及蜡酯或生物燃料组合物的制造方法和制造系统、以及蜡酯发酵促进剂。
解决技术问题的技术手段
为了解决上述技术问题，本发明的高蜡酯含量的裸藻的生产方法是包括如下工序的高蜡酯含量的裸藻的生产方法：准备裸藻的工序；在糖的存在下于好氧条件下培养所述裸藻的工序；在酸性环境中向经培养的所述裸藻给予蜡酯发酵促进物质的工序；以及于常温下将被给予了所述蜡酯发酵促进物质的所述裸藻保持规定的时间的工序，其中，所述蜡酯发酵促进物质是选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物。
本发明的高蜡酯含量的裸藻的生产方法中，所述蜡酯发酵促进物质可以是选自于由乙醛酸(也称为二羟乙酸)、乙醇酸、以及它们的盐所组成的组的1种以上的化合物。
作为所述蜡酯发酵促进物质，可以是进一步含有分子内的碳原子数为1以上且4以下的脂肪酸的物质。在此情况下，优选使相对于所述蜡酯发酵促进物质整体的所述脂肪酸的含量的摩尔比(脂肪酸的摩尔量/蜡酯发酵促进物质整体的合计摩尔量)为0.5以下。
本发明的蜡酯或生物燃料组合物的制造方法是包括如下工序的蜡酯或生物燃料组合物的制造方法：准备裸藻的工序；在糖的存在下于好氧条件下培养所述裸藻的工序；在酸性环境中向经培养的所述裸藻给予蜡酯发酵促进物质的工序；于常温下将被给予了所述蜡酯发酵促进物质的所述裸藻保持规定的时间的工序；以及从于常温下被保持了规定的时间的所述裸藻提取蜡酯的工序，其中，所述蜡酯发酵促进物质是选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物。
关于本发明的蜡酯发酵促进剂，其中，所述蜡酯发酵促进剂是用于在酸性环境中向裸藻给予的组合物，所述组合物含有选自于由分子内具有酮基或羟基且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物，所述裸藻是在糖的存在下于好氧条件下培养后的裸藻。
本发明的高蜡酯含量的裸藻的生产系统是具备如下单元的高蜡酯含量的裸藻的生产系统：在糖的存在下于好氧条件下培养裸藻的单元；在酸性环境中向经培养的所述裸藻给予蜡酯发酵促进物质的单元；以及回收裸藻的单元，所述裸藻是被给予了所述蜡酯发酵促进物质后于常温下保持了规定的时间的裸藻，其中，所述蜡酯发酵促进物质是选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物。
本发明的蜡酯或生物燃料的制造系统是具备如下单元的蜡酯或生物燃料的制造系统：在糖的存在下于好氧条件下培养裸藻的单元；在酸性环境中向经培养的所述裸藻给予蜡酯发酵促进物质的单元；回收裸藻的单元，所述裸藻是被给予了所述蜡酯发酵促进物质后于常温下保持了规定的时间的裸藻；以及从回收的所述裸藻提取蜡酯的单元，其中，所述蜡酯发酵促进物质是选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物。
有益效果
作为上述蜡酯发酵促进物质，本发明的高蜡酯含量的裸藻的生产方法中使用了选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物，因此能够使得蜡酯的收率比以往更高。另外，与使用丙酸的以往方法相比，本发明的高蜡酯含量的裸藻的生产方法通过降低价格高的丙酸的使用量，使得能够相比以往降低高蜡酯含量的裸藻的生产成本。
进而，本发明的蜡酯或生物燃料的制造方法还能够比以往的方法缩短培养时间段，因此能够降低培养成本，尽管培养时间段缩短，但能够促进蜡酯发酵，提高蜡酯的收率。这对于本发明的高蜡酯含量的裸藻的生产系统、本发明的蜡酯或生物燃料的生产系统而言也是同样的。
从更容易提高蜡酯的收率的观点出发，本发明的高蜡酯含量的裸藻的生产方法等中的蜡酯发酵促进物质例如优选为选自于由乙醛酸、乙醇酸、以及它们的盐所组成的组的1种以上的化合物。由于本发明的蜡酯发酵促进剂是含有选自于由乙醛酸、乙醇酸、以及它们的盐所组成的组的1种以上的化合物的组合物，因此能够有效地促进蜡酯发酵。
附图说明
[图1]对本发明的高蜡酯含量的裸藻的生产方法的一个示例进行说明的流程图。
[图2]对本发明的蜡酯制造方法的一个示例进行说明的流程图。
[图3]对本发明的生物燃料组合物制造方法的一个示例进行说明的流程图。
[图4]关于实验例1中含有在糖的存在下好氧培养至对数生长期的中期的纤细裸藻(ユーグレナ·グラシリス)Z株的各组，示出了由苯酚硫酸法定量的葡萄糖含量(裸藻糖含量)的测定结果的图表。n＝3。平均值±标准偏差。图表纵轴示出了在每50mL含有裸藻细胞的培养基中换算成葡萄糖的糖含量(μg/mL)，这在以下说明的图6和图8中也同样。
[图5]关于实验例1中含有在糖的存在下好氧培养至对数生长期的中期的纤细裸藻Z株的各组，示出了分子内的碳原子数为28的化合物(C28)的含量(即肉豆蔻酸肉豆蔻酯含量)的测定结果的图表。n＝3。平均值±标准偏差。图表纵轴示出了在50mL含有裸藻细胞的培养基中每1.0×106个裸藻细胞中的C28含量(μg/1.0×106个细胞)，这在以下说明的图7和图9中也同样。**意为在韦尔奇(Welch，ウェルチ)t检验(两侧)中p<0.01有显著差异，这在以下说明的图7和图9中也同样。
[图6]关于实验例2中含有在糖的存在下好氧培养至对数生长期的中期的SM-ZK株的各组，示出了由苯酚硫酸法定量的葡萄糖含量(裸藻糖含量)的测定结果的图表。n＝3。平均值±标准偏差。
[图7]关于实验例2中含有在糖的存在下好氧培养至对数生长期的中期的纤细裸藻Z株的各组，示出了C28含量的测定结果的图表。n＝3。平均值±标准偏差。*意为在韦尔奇t检验(两侧)中p<0.05有显著差异，这在以下说明的图9中也同样。
[图8]关于参考实验例中含有在糖的存在下好氧培养至稳定期的纤细裸藻Z株的各组，示出了由苯酚硫酸法定量的葡萄糖含量(裸藻糖含量)的测定结果的图表。n＝3。平均值±标准偏差。
[图9]关于参考实验例中含有在糖的存在下好氧培养至稳定期的纤细裸藻Z株的各组，示出了C28含量的测定结果的图表。n＝3。平均值±标准偏差。
具体实施方式
<高蜡酯含量的裸藻的生产方法>
本发明的高蜡酯含量的裸藻(高WE含量的裸藻)的生产方法例如如图1所示，包括：准备工序S1、好氧培养工序S2、蜡酯发酵促进物质(WE发酵促进物质)混合工序S3、蜡酯发酵(WE发酵)工序S4、以及裸藻回收工序S5。
在准备工序S1中准备裸藻的活细胞。准备的裸藻是选自于由在动物学分类上属于裸藻属(裸藻属(ミドリムシ属))的种及其变种所组成的组的1种以上的原生动物。此处的变种也包括例如通过重组、转导或转化等遗传方法得到的细胞株(变异株)。作为准备的裸藻，例如可以举出Euglena acus、Euglena caudata、Euglena chadefaudii、Euglena deses、Euglena gracilis(以下称为“纤细裸藻(ユーグレナ·グラシリス)”)、Euglenagranulata、Euglena intermedia、Euglena mutabilis、Euglena oxyuris、Euglenapiride、Euglena proxima、Euglena spirogyra、Euglena vermiformis或Euglena viridis等种。准备的裸藻无论是野生株还是变异株只要能够在其细胞内进行WE发酵即可。例如，由于可以WE发酵，准备的裸藻即使是SM-ZK株也可以，所述SM-ZK株为以纤细裸藻Z株(Euglenagracilis Z)为亲株通过链霉素处理所得的叶绿体缺陷变异株。
在准备工序S1中，也可以采集广泛分布于池、沼等淡水中的野生的裸藻，但获取已经分离的任意的裸藻细胞株效率好。从适合的培养条件被详细研究和知晓且易于培养的观点出发，准备的裸藻优选为选自于由纤细裸藻及其变异株所组成的组的1种以上的原生动物。例如，优选为选自于由纤细裸藻、纤细裸藻Z株、纤细裸藻bacillaris变种(Euglenagracilis var.bacillaris)、纤细裸藻EOD-1株(参照专利文献3，保藏编号FERM BP-11530)、以及纤细裸藻Kishu株(参照专利文献4，保藏编号FERM P-22300)所组成的组的1种以上的裸藻。从同样的观点出发，作为准备的裸藻，更优选纤细裸藻Z株。
裸藻例如也可以在池水或贮存在水塘中的自来水等中培养。从避开杂菌、有效培养的观点出发，准备工序S1中优选还准备能够培养裸藻的培养基。培养基没有特别限定，只要是在将裸藻接种并在15℃以上且35℃以下的培养基温度下保持于好氧条件的情况下，能够培养所接种的裸藻且使其生长即可。从容易应对污染的观点出发，培养基例如也可以是琼脂斜面培养基等固体培养基，但从廉价、容易制备、容易搅拌、容易高密度地培养裸藻的观点出发，优选液体培养基。
通常适合于裸藻培养的液体培养基含有维生素B12、铵盐和其他无机盐类(分子内具有磷、钾、铁、锰、钴、锌、铜、钼、或镍的化合物)，根据需要还含有其他营养素(例如糖、氨基酸等)。从适合的培养条件被详细研究和知晓且易于培养的观点出发，更优选准备以往用于裸藻培养的公知的液体培养基、或与其类似组成的液体培养基。作为公知的液体培养基，例如可以举出以下所示组成的Cramer-Myers培养基(クレイマー·マイヤー培地)(表1，参照非专利文献1)、Hutner培养基(ハットナー培地)(表2，参照非专利文献2)、或Koren-Hutner培养基(コーレン·ハットナー培地)(以下称为“KH培养基”。表3，参照非专利文献3)等。在部分变更配比的情况下，从省去在接下来的好氧培养工序S2中向培养基添加糖的时间和精力的观点出发，优选准备比公知的液体培养基增加了糖的配比量的培养基。
[表1]
Cramer-Myers培养基中组成的剩余部分是水。
[表2]
Hutner培养基中组成的剩余部分是水。
[表3]
Koren-Hutner培养基(KH培养基)中组成的剩余部分是水。
只要不违背本发明的目的，培养基中优选含有螯合剂或pH调节剂等。例如，表3中记载的EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠盐)作为螯合剂发挥作用。例如，在表1至表3所记载的配比中，磷酸盐、柠檬酸作为pH调节剂发挥作用。培养基中也可以配合含有肽的组合物、氨水。作为含有肽的组合物，例如举出蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物或玉米浸渍液(CornSteep Liquor，コーンスティープリカー)等。培养基中可以配合1种以上的游离氨基酸或其盐。从省去在接下来的好氧培养工序S2中添加糖的时间和精力的观点出发，准备的培养基优选含有糖。关于糖，只要是裸藻能够将其获取到裸藻细胞内进行代谢的水溶性糖则没有特别限制。例如，可以举出葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖或淀粉等。二糖类、淀粉被酶分解成单糖类，作为营养素被裸藻所利用。在接下来的好氧培养工序S2中，从促使裸藻产生裸藻糖的观点出发，糖优选为葡萄糖，或者，从将生产成本抑制为低价的观点出发，糖优选为淀粉、糖蜜或废糖蜜等。
在好氧培养工序S2中，在糖的存在下于好氧条件下培养所准备的裸藻，从而使裸藻糖产生并贮藏于裸藻细胞内。优选使培养基中含有的上述糖的浓度在好氧培养工序期间为1质量％以上且5质量％的范围，更优选为1.5质量％以上且3质量％以下。从将培养基保持在好氧条件的观点出发，优选在将含氧气体(例如空气)向培养基通气的同时进行培养。从有效通气的观点出发，在培养基容量为5L以下的情况下可以进行振荡培养，在培养基容量大于5L的情况下可以进行伴随鼓泡的通气培养。培养基和糖使用前面的准备工序S1的说明中例示的糖即可。从促进细胞数的增加和生成裸藻糖的观点出发，优选在好氧培养时间段的中途根据培养基中的裸藻的细胞密度在培养基中进一步添加糖。在准备并使用含有足够量的糖的培养基的情况下，也可以不向该培养基中添加糖而进行分批培养。在能够维持适合于裸藻培养的各种条件的情况下，例如在能够将培养基中的溶解氧浓度、各种营养成分的浓度等维持在一定范围内的情况下，也可以进行连续培养。
虽然也可以在太阳光照射的环境下进行培养从而使裸藻能够进行光合作用，但是由于好氧培养工序S2是在糖的存在下进行培养，因此即使在黑暗下也能够培养裸藻。从能够进行培养而不受天气影响的观点出发，优选在具有通气性的培养槽内培养裸藻，并且从避免污染的观点出发，更优选在设置有能够通气培养的密闭空间的培养槽内进行培养。培养基温度例如可以为15℃以上且35℃以下，从在裸藻的细胞内有效促进裸藻糖的贮藏的观点出发，优选为25℃以上且30℃以下。
在好氧培养工序S2中，从在随后的WE发酵工序S4中有效促进WE发酵的观点出发，优选使在糖的存在下于好氧条件下培养裸藻的时间段保持在从在该条件下培养开始到尚未达到稳定期的对数生长期的中期或后期为止的时间段内。通常，以将裸藻接种于培养基的时间点为培养开始的时间点。对数生长期是裸藻细胞的生长曲线中的细胞数呈对数增加的时期。生长曲线是可以例如通过将裸藻细胞接种到预定的培养基中，每隔一定时间测量培养基中的细胞数或细胞密度、并将所测得的细胞数或细胞密度绘制成图表而制作的曲线。稳定期是对数生长期过后生长的细胞数和死亡的细胞数达到大致平衡、看不到细胞数的增加的时期。稳定期的细胞密度(即培养基能够达到的最大的细胞密度)根据接种的裸藻株的种类、培养基的种类、糖的种类和量、培养基温度、以及照射到培养基上的光量等培养条件而不同。
本领域技术人员能够通过已知的任意指标或方法判断尚未达到稳定期的对数生长期的中期或后期。例如，可以将浊度或比生长速度作为指标来进行判断。例如，在以浊度为指标的情况下，在预定的培养条件下培养裸藻细胞时，可以以尚未接种的培养基的浊度为0％，以达到稳定期的培养基的浊度为100％，从而将培养基的相对浊度(％)作为指标进行判断。在将该相对浊度作为指标的情况下，对数生长期的中期是培养基的相对浊度大于35％且为70％以下的时间段，对数生长期的后期是培养基的相对浊度大于70％且为95％以下的时间段。浊度是培养液的浑浊程度的测定值。例如，使波长为660nm的单一波长的光入射到培养液中，利用分光光度计测定透射光。在以入射光的强度为I0、透射光的强度为I、透射层的厚度为L、吸光度为τ时，以通过公式“I＝I0Exp(-τL)”算出的吸光度τ作为培养液的浊度(OD)。
在好氧培养工序S2中，从后续在WE发酵工序S4中有效促进WE发酵的观点出发，为了使裸藻的好氧培养工序保持至对数生长期的中期或后期，在糖的存在下于好氧条件下培养裸藻的时间段与从在该条件下培养开始到稳定期为止的时间段长度相比优选保持为0.5倍以上且0.8倍以下的时间段长度。例如，如果是从裸藻细胞的培养开始到达到稳定期为止需要120小时的培养条件，则好氧培养工序S2优选使裸藻细胞的培养时间段保持在60小时以上且96小时以下的范围内。
在WE发酵促进物质混合工序S3中，在酸性环境中向经好氧培养的细胞内贮藏有裸藻糖的裸藻给予WE发酵促进物质。通过在酸性环境中给予WE发酵促进物质，裸藻细胞内的裸藻糖分解，促进分子内的碳原子数为28的化合物(以下也称为“C28”)即WE的产生。关于酸性环境，从促进WE发酵的观点出发，只要培养基的pH小于7.0即可，优选为6.0以下，更优选为3.5以下，从避免裸藻的死亡的观点出发，优选培养基的pH为2.5以上。在WE发酵促进物质混合工序S3中，例如，优选将WE发酵促进物质和pH调节剂混合于培养基中，其中，所述培养基含有完成了前面的好氧培养工序S2的裸藻，所述pH调节剂用于将培养基的pH调节为2.5以上且3.5以下。
本发明的WE发酵促进物质是选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物(A)。另外，除上述酮基、醛基或上述羟基以外，上述化合物(A)还另外具有羧基。作为该化合物(A)，例如可以举出羟基羧酸或分子内具有醛基或酮基的一价羧酸。作为上述羟基羧酸，例如可以举出乙醇酸、乳酸、2-羟基丁酸、3-羟基丁酸或γ-羟基丁酸等化合物。作为上述分子内具有醛基或酮基的一价羧酸，例如可以举出乙醛酸、丙酮酸、3-氧代丙酸、α-丁酮酸或乙酰乙酸等化合物。其中，作为上述化合物(A)，特别地，更优选使用选自于由乙醇酸、乙醛酸、以及它们的盐所组成的组的1种以上的化合物。认为这样的低分子有机化合物容易透过细胞膜等渗透到裸藻细胞内。认为裸藻细胞中在过量供给容易渗透到细胞内的低分子有机化合物的情况下，细胞内的好氧呼吸被抑制(例如反馈抑制)，为了代替好氧呼吸来获得ATP，WE发酵容易被促进。
作为WE发酵促进物质，除上述的化合物(A)以外，可以进一步添加分子内的碳原子数为1以上且4以下的脂肪酸(B)。作为上述脂肪酸(B)，例如可举出乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸或甲酸等化合物。上述脂肪酸(B)优选含有分子内具有碳原子数为1以上且3以下的直链状饱和烃基的化合物。WE发酵促进物质可以为将此处例示的化合物(A)的组中的2种以上的化合物组合使用的物质，也可以为将脂肪酸(B)的组中的2种以上的化合物组合使用的物质。另外，只要不违背本发明的目的，上述盐只要是能够在培养基的水溶液中电离的盐则没有特别限定。从在培养基中难以析出的观点出发，盐优选为钠盐或钾盐。
从容易促进WE发酵的观点出发，上述化合物(A)和上述脂肪酸(B)组合使用的情况下的WE发酵促进物质优选为乙醛酸和乙醇酸的组合、乙醛酸和丙酸的组合、或乙醇酸和丙酸的组合。与仅使用丙酸的情况相比，从促进WE发酵的同时能够降低丙酸的使用量的观点出发，也优选乙醛酸和丙酸的组合的情况、或乙醇酸和丙酸的组合的情况。从同样的观点出发，在作为WE发酵促进物质使用含有丙酸的2种以上的化合物的情况下，丙酸相对于WE发酵促进物质的摩尔比(脂肪酸的摩尔量/蜡酯发酵促进物质整体的合计摩尔量)优选为0.5以下，更优选为0.4以下。
或者，从避免因丙酸引起的臭味的问题的观点出发，在促进物质混合工序S3中，虽然在酸性环境中向经培养的所述裸藻给予WE发酵促进物质，但也可以实质上不给予丙酸。“实质上不给予”是指，即使在培养基中或细胞中含有微量的不予给予的成分，如果仅为微量的话也可以被允许(所述微量为：在本发明的内容或本质上被认定为是不会有助于WE发酵的程度的微量)。例如，在裸藻细胞内在代谢过程中可以产生微量的丙酸，但仅为不会有助于WE发酵的微量，因此在本发明中是被允许的。“实质上不给予”是指不予给予的化合物在培养基中的浓度例如为100μmol/L以下，优选为10μmol/L以下，更优选为1.0μmol/L以下。
从在裸藻细胞内有效促进WE发酵的观点出发，在WE发酵促进物质混合工序S3中，希望将WE发酵促进物质混合于培养基中以使含有裸藻的培养基中的WE发酵促进物质的含量例如为0.5mmol/L以上，优选为1.0mmol/L以上，更优选为2.0mmol/L以上，从而将WE发酵促进剂给予裸藻。从避免裸藻细胞死亡的观点出发，可以将WE发酵促进物质混合于培养基中以使含有裸藻的培养基中的WE发酵促进物质的含量例如为小于10mmol/L，优选为小于8.0mmol/L，更优选为小于6.0mmol/L，从而将WE发酵促进剂给予裸藻。例如，像使用乙醛酸和乙醇酸作为WE发酵促进物质的情况那样在相应的化合物为2种以上的情况下，含量意为2种以上的化合物的含量的合计值。优选将WE发酵促进物质和pH调节剂混合于培养基中，使得含有裸藻的培养基的组成为上述摩尔浓度比的情况。
在WE发酵工序S4中，为了在细胞内进行WE发酵，于常温下将被给予了WE发酵促进物质的裸藻保持规定的时间。在自然界中，在水面进行光合作用且内含有裸藻糖的裸藻细胞存在在阳光弱的冬季沉入水底一边进行分解裸藻糖的WE发酵一边越冬的情况，因此即使在水底的温度(4℃左右)下，只要花费时间WE发酵也会进行。另一方面，在超过35℃的高温下，裸藻细胞内的代谢容易被妨碍。为了保持常温，也可以调整含有裸藻的培养基的液温。从实现节省成本的观点出发，优选通过在外部气温为5℃以上且35℃以下的季节、地域进行WE发酵工序S4来削减调整培养基温度的成本。从促进WE发酵的观点出发，“常温”例如希望为5℃以上且35℃以下，优选为15℃以上且35℃以下，更优选为20℃以上且30℃以下。
从使各个裸藻细胞充分进行WE发酵的观点出发，WE发酵工序S4中的“规定的时间”例如为6小时以上，优选为12小时以上，更优选为24小时以上。从避免需要必要以上的长时间的观点出发，“规定的时间”例如为96小时以内，优选为72小时以内，更优选为48小时以内。对于被给予了WE发酵促进物质的裸藻，由于WE发酵促进物质，细胞内的好氧呼吸被妨碍而进行WE发酵，因此即使保持于低氧条件下也产生WE，即使保持于好氧条件下也产生WE。从削减保持于低氧条件下的处理的时间和精力、费用的观点出发，优选在空气的存在下于常温下将被给予了WE发酵促进物质的裸藻保持规定的时间。
进一步而言，在该WE发酵工序S4中，也可以在含有裸藻的培养基中使用例如用于通气培养的鼓泡装置进行氮鼓泡。氮鼓泡可以在WE发酵工序期间一直进行，但在氧难以从外部进入培养基中的环境下，也可以只进行最初的3小时等规定时间。
可以推测，通过对收容上述培养基的容器内进行减压来抑制氧量等也可以代替进行氮鼓泡而得到同样的效果。
在裸藻回收工序S5中，回收从被给予了WE发酵促进物质起于常温下保持规定的时间的裸藻。例如，用离心分离机对培养基进行离心分离以回收沉淀物(沉淀的裸藻细胞)即可。回收的裸藻与在前面的准备工序S1中准备的裸藻相比WE含量明显提高，即成为高WE含量的裸藻。
本发明的高WE含量的裸藻的生产方法在糖的存在下于好氧条件下培养裸藻后，在酸性环境中给予WE发酵促进物质并于常温下保持规定的时间，由此促进裸藻细胞中的WE发酵。通过使在糖的存在下于好氧条件下培养裸藻的时间段保持在从培养开始到裸藻的对数生长期的中期或后期为止，使得之后在常温下保持规定的时间的裸藻意外地提高了WE的收率。由此，与以往那样的包括在糖的存在下于好氧条件下培养裸藻时从培养开始培养到稳定期为止的工序的方法相比，本发明的高WE含量的裸藻的生产方法由于缩短了培养时间段，因此能够降低培养的成本，尽管培养时间段缩短，但仍可以促进WE发酵、提高WE的收率。
与仅向裸藻给予作为WE发酵促进物质的丙酸的情况相比，在给予乙醛酸或乙醇酸的情况下，WE发酵被进一步促进的机理尚不清楚。考虑到乙醛酸和乙醇酸都是乙醇酸循环中的中间产物，认为它们的添加能够使得裸藻细胞内的好氧呼吸被更有效地抑制，从而促进WE发酵。
<蜡酯的制造方法>
本发明的蜡酯制造方法(WE制造方法)例如如图2所示，包括准备工序S1、好氧培养工序S2、促进物质混合工序S3、WE发酵工序S4、裸藻回收工序S5、蜡酯提取(WE提取)工序S6。工序S1至工序S5如上述本发明的高WE含量的裸藻的生产方法中使用图1所进行的说明所述。在图2所示的WE提取工序S6中，从回收的裸藻(即高WE含量的裸藻)提取WE。用于此的具体方法只要能够提取WE，只要不违背本发明的目的则没有特别限定。例如，可以使高WE含量的裸藻的细胞破碎，进行离心分离，采集疏水性的上清液(来自裸藻的WE层)。可以根据需要对采集的上清液进行纯化，例如可以进行后述的WE提取方法。本发明的WE制造方法由于在其实施过程中实施了本发明的高WE含量的裸藻的生产方法，因此与使用裸藻的以往的WE制造方法相比，能够缩短培养时间段、降低培养成本，尽管培养时间段缩短，但仍可以促进WE发酵，提高WE的收率。来自裸藻的WE不限于有效用作生物燃料组合物的原料，例如也可以有效用作化妆品原料、肥皂、家畜饲料原料、或养鱼饲料原料等。
另外，此处说明了从裸藻提取WE的方法，但也可以不从高WE含量的裸藻提取WE，而将从培养基回收的高WE含量的裸藻的干燥体直接作为燃料使用。
<生物燃料组合物的制造方法>
本发明的生物燃料组合物的制造方法例如如图3所示，包括准备工序S1、好氧培养工序S2、促进物质混合工序S3、WE发酵工序S4、裸藻回收工序S5、WE提取工序S6、生物燃料制备工序S7。工序S1至工序S5如上述使用图1所进行的说明所述，工序S6如使用图2所进行的说明所述。在生物燃料制备工序S7中，使用来自裸藻的WE制备生物燃料组合物。例如，可以实施使用WE来制造生物燃料的公知的方法。本发明的生物燃料组合物的制造方法由于在其实施过程中实施了本发明的高WE含量的裸藻的生产方法，因此与使用裸藻的以往的生物燃料的制造方法相比，能够缩短培养时间段、降低培养成本，尽管培养时间段缩短，但仍可以促进WE发酵，提高WE的收率。
<蜡酯发酵促进剂>
从作为比丙酸更容易促进WE发酵的化合物的观点出发，本发明的蜡酯发酵促进剂(WE发酵促进剂)是含有选自于由乙醛酸、乙醇酸、以及它们的盐所组成的组的1种以上的化合物的组合物。另外，本发明的WE发酵促进剂是用于在酸性环境中向裸藻给予的组合物，所述裸藻为在糖的存在下在好氧条件下培养后的裸藻。WE发酵促进剂可以是用于在酸性环境中向裸藻给予的组合物，所述裸藻为在糖的存在下在好氧条件下培养到稳定期的裸藻。进而，从促进WE发酵的观点出发，WE发酵促进剂优选为用于在酸性环境中向裸藻给予的组合物，所述裸藻为使在糖的存在下于好氧条件下的培养保持到尚未达到稳定期的对数生长期的中期或后期的裸藻。WE发酵促进剂可以是液体制剂或固体制剂。在为固体制剂的情况下，WE发酵促进剂可采用片状、片剂、颗粒、悬浮液、糖浆或干燥粉末等形态，从而易于溶解于液体培养基中。WE发酵促进剂可以根据需要与WE发酵促进物质一起含有例如赋形剂、抗氧化剂、稀释剂、缓冲剂、着香剂或着色剂等公知的添加剂。WE发酵促进剂例如可以有效用于本发明的高WE含量的裸藻的生产方法、本发明的WE制造方法、或本发明的生物燃料组合物的制造方法中的WE发酵促进物质混合工序S3(图1至图3)中。
<高蜡酯含量的裸藻的生产系统>
本发明的高WE含量的裸藻的生产系统具备培养单元、WE发酵促进物质供给单元和回收单元。培养单元是用于在糖的存在下于好氧条件下培养裸藻的单元。作为培养单元，例如可以举出用于培养裸藻的培养槽和适合于裸藻培养的培养基的组合，从而能够实施用图1所说明的准备工序S1和好氧培养工序S2。作为培养单元，根据需要进一步优选可以混合于培养基的糖等营养素、具有用于通气培养的鼓泡装置的组合。好氧培养的时间段保持在从培养开始到裸藻的对数生长期的中期或后期为止。WE发酵促进物质供给单元是用于在酸性环境中向裸藻给予前述WE发酵促进物质的单元，所述裸藻为在糖的存在下于好氧条件下培养后的细胞内含有裸藻糖的裸藻。回收单元是用于回收从被给予了WE发酵促进物质起于常温下保持规定的时间的裸藻的单元。
<蜡酯或生物燃料组合物的制造系统>
本发明的WE制造系统在上述本发明的高WE含量的裸藻的生产系统的基础上进一步具备用于从回收的裸藻中提取WE的提取单元。作为提取单元，例如可以举出离心分离机和细胞破碎装置的组合。在纯化WE的情况下，作为提取单元优选进一步包含适于提取WE的溶剂的组合。作为适于提取WE的溶剂，例如举出丙酮。本发明的生物燃料组合物的制造系统在本发明的WE制造装置的基础上进一步具备使来自裸藻的WE与其他用于燃料的原料混合来制备生物燃料组合物的单元。
本发明也可以在不脱离其主旨的范围内根据本领域技术人员的知识进行各种改良、修正或变形的方式来实施。本发明可以在产生相同作用或效果的范围内，以将任一发明特定事项置换为其他技术的方式实施。通过以下示出实施例等对本发明进行具体说明，但本发明不限于以下实施例。
实施例
<裸藻糖定量方法>
在后述的实验例1、实验例2和参考实验例中，通过以下说明的方法从裸藻细胞提取裸藻糖并对其进行定量。将含有裸藻细胞的液体培养基(例如KH培养基)离心分离，采集沉淀物(沉淀的裸藻细胞)，向沉淀物中加入100质量％的丙酮，用涡旋混合器剧烈搅拌或用超声波破碎机处理，制备悬浮液。将该悬浮液离心分离(12000rpm，4℃，10分钟)除去上清液，向沉淀物中加入100质量％的丙酮，用涡旋混合器剧烈搅拌或用超声波破碎机处理来制备悬浮液，重复进行如上的操作直到沉淀物变成白色。向除去上清液而得到的白色沉淀物中加入1.0mL的1.0质量％的SDS(十二烷基硫酸钠)溶液，用涡旋混合器搅拌并使其悬浮，沸腾水浴5分钟，静置在冰上充分冷却。将该在冰上冷却的SDS溶液离心分离(12000rpm，4℃，10分钟)，除去上清液，用超纯水清洗沉淀物，再次离心分离(12000rpm，4℃，10分钟)，除去上清液，向沉淀物中加入1.0mL、1.0N的氢氧化钠水溶液，通过振荡一晚上直至无法目视到沉淀物为止，得到用于裸藻糖定量的悬浮液。
通过以下说明的苯酚硫酸法测定悬浮液中的裸藻糖含量。稀释用于裸藻糖定量的悬浮液，取0.2mL注入试管内，用涡旋混合器搅拌，混合0.2mL的5质量％苯酚溶液，用エッペンドルフ公司制造的Multipette(注册商标)M4猛烈地(勢いよく)加入1.0mL浓硫酸，用涡旋混合器充分搅拌，制备混合了的混合液。将该混合液于30℃保温30分钟后，以每孔200μL分注到96孔微孔板中，用微孔板读取器测量波长490nm处的吸光度。对于苯酚硫酸法的标准曲线，用超纯水稀释10mg/mL的葡萄糖水溶液，分别制备500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL以及15.625μg/mL的葡萄糖水溶液，与用于裸藻糖定量的悬浮液同样地处理各葡萄糖水溶液，测定波长490nm处的吸光度，制作标准曲线。
<蜡酯定量方法>
在后述的实验例1、实验例2和参考实验例中，通过以下说明的方法从裸藻细胞中提取WE并进行定量。将含有裸藻细胞的液体培养基(例如KH培养基)离心分离，采集沉淀物(沉淀的裸藻细胞)，添加以氯仿:甲醇:超纯水(例如Milli-Q(注册商标)水)＝10:20:8的体积比混合的溶液，用涡旋混合器剧烈搅拌或用超声波破碎机处理15分钟，进行离心分离(13000rpm，4℃，3分钟)采集上清液的操作。重复该操作3次得到的上清液成为含有高浓度WE的白色脂质溶液。例如，对1.8mL的脂质溶液中添加1.0mL的氯仿和1.0mL的超纯水，用涡旋混合器搅拌30秒，进行离心分离(13000rpm，4℃，3分钟)，除去上层的水和甲醇的混合层，采集下层的氯仿层。用真空干燥机使采集的氯仿层干燥凝固，将干燥凝固物溶解于500μL的己烷中，稀释后制备用于分析的试样液，如下使用气相色谱质谱分析仪(以下称为“GC-MS”)，对分子内的碳原子数为28的化合物(C28)(即作为WE的一种的肉豆蔻酸肉豆蔻酯)进行定量。
使用了株式会社島津製作所制造的GCMS-QP2010 Ultra作为GC-MS。使用了アジレント·テクノロジー株式会社制造的Agilent J&WGCカラム-DB-5ms(柱长30cm，内径0.25mm，膜孔0.25μm)作为用于分离的柱。将1.0μL用于分析的试料液注入用于分离的柱中，以1.16mL/分钟的流量将氦气作为载气注入用于分离的柱中。在用于分析的试料液中所含的成分的分离时，最初的1分钟将柱温度设定为100℃，然后使柱温度以10℃/分钟升温至280℃，然后使柱温度于280℃保持10分钟。将接口和离子源设定为250℃。使肉豆蔻酸肉豆蔻酯以70eV离子化，在SIM模式下以m/z＝229.2和m/z＝57.1检测并定量。使用溶解于己烷的、使シグマアルドリッチ公司制造的肉豆蔻酸肉豆蔻酯的含量成为3.0μg/mL、1.0μg/mL、0.3μg/mL或0.1μg/mL的溶液作为标准试样溶液。
<实验例1>
作为裸藻，准备了从大阪府立大学的食品代谢营养学研究室出售的用于实验的纤细裸藻Z株。于烧瓶内制备KH培养基(参见前述表3)以培养该裸藻。在烧瓶的口部装入棉栓，通过高压釜在2个气压、121℃下进行加压灭菌15分钟。将灭菌的培养基置于清洁工作台内，在培养基冷却后以不混入杂菌的方式少量添加细胞悬浮液，从而将1.0×104个细胞以上且3.0×104个细胞以下左右的裸藻细胞接种于培养基。以添加细胞悬浮液的时间点为培养开始。从培养开始，在保持于28℃以上且30℃以下的培养室内通过在黑暗下利用振荡器在80rpm左右持续振荡接种了细胞的培养基，由此在2质量％的糖的存在下于好氧条件下培养裸藻。另外，在该条件下培养的情况下，裸藻细胞要达到稳定期需要6天以上(144小时以上)的培养时间段。在实验例1中，于该条件下的好氧培养在培养开始起经过96小时(4天)时结束。即，在实验例1中，使好氧培养时间段保持至尚未达到稳定期的对数生长期的中期。
好氧培养时间段结束后，立即搅拌培养基并采集少量，滴在血球计算盘上，在液滴上贴付盖玻片。用显微镜观察，在血球计算盘上对纵1.0mm×横1.0mm的区域内的裸藻细胞数进行计数。以NN为“每1.0mm2的细胞数的平均值”，通过计算式“NC＝NN×104”计算每1.0mL培养基的细胞数NC。该计算式中的“104”是相对于1.0mm2的容量的换算值。实验例1结束好氧培养时的KH培养基中，裸藻细胞数为5.37×106个细胞/mL。另外，准备多个烧瓶，在好氧培养时间段结束后立即将KH培养基向各烧瓶中各分注50mL，所述KH培养基含有好氧培养至尚未达到稳定期的对数生长期的中期的纤细裸藻Z株。将分注的各烧瓶中的裸藻分类为以下说明的0小时组A、氮处理组A、丙酸组A、乙醇酸组A、乙醛酸组A、乙醇酸&丙酸组A、以及乙醛酸&丙酸组A中的任一种类的组。
0小时组A中，在好氧培养结束后立即用上述定量方法对裸藻细胞的裸藻糖含量和WE含量进行定量。氮处理组A中，在保持在室温28℃以上且30℃以下的培养室内，不向培养基添加WE发酵促进物质，一边向培养基供给氮气使其鼓泡一边静置24小时后，同样地对裸藻细胞的裸藻糖含量和WE含量进行定量。丙酸组A中，添加丙酸以使培养基中的丙酸浓度为4.0mmol/L，使培养基为弱酸性，一边通过棉栓使其通气一边在上述培养室内静置24小时后，同样地对裸藻细胞的裸藻糖含量和WE含量进行定量。乙醇酸组A中，除了向培养基中添加丙酸以使培养基中的乙醇酸浓度为4.0mmol/L以外，与丙酸组A相同。乙醛酸组A中，除了向培养基中添加乙醛酸以使培养基中的乙醛酸浓度为4.0mmol/L以外，与丙酸组A相同。乙醇酸&丙酸组A中，除了向培养基中添加乙醇酸和丙酸以使培养基中的乙醇酸浓度为2.0mmol/L、丙酸浓度为2.0mmol/L以外，与丙酸组A相同。乙醛酸&丙酸组A中，除了向培养基中添加乙醛酸和丙酸以使培养基中乙醛酸浓度为2.0mmol/L、丙酸浓度为2.0mmol/L以外，与丙酸组A相同。裸藻糖含量的定量结果如图4和下表4所示，C28含量的定量结果如图5和下表4所示。
[表4]
n＝3
表中，葡萄糖含量的数值和C28含量的数值分别以平均值±标准偏差示出。
如图4和表4所示，与0小时组A相比，丙酸组A中未显示裸藻糖含量的减少。另一方面，与丙酸组A相比，氮处理组A、乙醇酸组A以及乙醛酸组A的各组中的裸藻糖含量明显地少。与氮处理组A、乙醇酸组A以及乙醛酸组A的各组相比，乙醇酸&丙酸组A以及乙醛酸&丙酸组A中的裸藻糖含量分别明显地少。如图5和表4所示，与0小时组A相比，其他组的C28含量多。另外，与丙酸组A相比，氮处理组A、乙醇酸组A、乙醛酸组A、乙醇酸&丙酸组A以及乙醛酸&丙酸组A的各组中的C28含量均多。
图4、图5和表4所示的实验结果表明，与在专利文献1中合适的丙酸相比，乙醇酸和乙醛酸分别是将内含于细胞内的裸藻糖代谢而产生肉豆蔻酸肉豆蔻酯的、更容易有效地促进WE发酵的化合物。另外，表明了作为WE发酵促进物质，与仅使用4mmol/L的丙酸的情况相比，在组合使用乙醇酸和丙酸以使乙醇酸和丙酸合计为4mmol/L的情况、组合使用乙醛酸和丙酸以使乙醛酸和丙酸合计为4mmol/L的情况下，可以在减少丙酸的使用量的同时有效地促进WE发酵。
<实验例2>
与使用纤细裸藻Z株的实验例1相比，实验例2中除了变更为使用从大阪府立大学的食品代谢营养学研究室出售的SM-ZK株作为裸藻以外，其他都在与实验例1相同的条件下进行了实验。在实验例2结束好氧培养时的KH培养基中，裸藻细胞数为7.05×106个细胞/mL。在好氧培养时间段结束后立即将KH培养基向各烧瓶中各分注50mL，所述KH培养基含有好氧培养至尚未达到稳定期的对数生长期的中期的SM-ZK株。上述实验例1中制备了0小时组A、氮处理组A、丙酸组A、乙醇酸组A、乙醛酸组A、乙醇酸&丙酸组A、以及乙醛酸&丙酸组A的各组，实验例2中按照该顺序通过同样的操作制备了0小时组B、氮处理组B、丙酸组B、乙醇酸组B、乙醛酸组B、乙醇酸&丙酸组B、以及乙醛酸&丙酸组B的各组。对于在实验例2中制备的各组，裸藻糖含量的定量结果示于图6和下表5，C28含量示于图7和下表5。
[表5]
n＝3
表中，葡萄糖含量的数值和C28含量的数值分别以平均值±标准偏差示出。
如图6、图7和表5所示，使用SM-ZK株的实验例2中示出了与使用纤细裸藻Z株的实验例1同样的实验结果。因此认为，不限于纤细裸藻Z株、SM-ZK株，乙醇酸和乙醛酸分别是比丙酸更容易有效地促进WE发酵的化合物。
<实验例3>
与使好氧培养时间段保持到尚未达到稳定期的对数生长期的中期的实验例1相比，实验例3中除了变更为好氧培养至达到稳定期以外，其他都在与实验例1相同的条件下进行了实验。即，在实验例3中，在KH培养基(糖的存在下)中将纤细裸藻Z株在好氧条件下从培养开始培养到经过168小时(7天)时为止。实验例3结束好氧培养时的KH培养基中，裸藻细胞数为2.04×107个细胞/mL。因此，实验例3中，通过好氧培养至达到稳定期，裸藻细胞数与实验例1相比约为3.8倍。在好氧培养时间段结束后立即将KH培养基向各烧瓶中各分注50mL，所述KH培养基含有好氧培养至达到稳定期的纤细裸藻Z株。上述实验例1中制备了0小时组A、氮处理组A、丙酸组A、乙醇酸组A、以及乙醛酸组A的各组，实验例3中按照该顺序通过同样的操作制备了0小时组C、氮处理组C、丙酸组C、乙醇酸组C、以及乙醛酸组C的各组。对于实验例3中制备的各组，裸藻糖含量的定量结果示于图8和下表6，C28含量的定量结果示于图9和下表6。
[表6]
n＝3
表中，葡萄糖含量的数值和C28含量的数值分别以平均值±标准偏差示出。
如图9和表6所示，表明了即使是在KH培养基(糖的存在下)中于好氧条件下培养至达到稳定期的纤细裸藻Z株，乙醇酸和乙醛酸分别也是比丙酸更容易有效地促进WE发酵的化合物。将表6(实验例3)和上述表4(实验例1)相比明显的是，或者将图8(实验例3)和图4(实验例1)相比明显的是，与使好氧培养保持到对数生长期的中期的实验例1中的各组相比，进行好氧培养直到达到稳定期的实验例3的各组中由苯酚硫酸法定量的葡萄糖含量(裸藻糖含量)多出100倍左右。因此，在图8(参考实验例)和图4(实验例1)中，图表纵轴上的数值的位数不同。因此，确认了与使好氧培养保持到对数生长期的中期的情况相比，使好氧培养持续到达到稳定期，则各个裸藻细胞内内含有较多的裸藻糖。
尽管如此，意外的是，将表6(实验例3)和上述表4(实验例1)相比明显的是，或者将图9(实验例3)和图5(实验例1)相比明显的是，与使好氧培养保持到对数生长期的中期的实验例1中的各组相比，进行好氧培养直到达到稳定期的实验例3的各组中C28含量(肉豆蔻酸肉豆蔻酯含量)为0.1倍左右。换言之，可以知晓的是，将进行好氧培养直到达到稳定期的实验例3的各组与将好氧培养保持到对数生长期的中期的实验例1相比，即使在使好氧培养时间段保持到对数生长期的中期的情况下，裸藻体内的C28含量(肉豆蔻酸肉豆蔻酯含量)也变得足够高。从该结果可以知晓的是，在给予乙醇酸和乙醛酸的情况下，即使在缩短好氧培养时间段的情况下也能够得到足够高WE含量的裸藻。
虽然与以往那样进行好氧培养至稳定期的情况相比，每一个裸藻个体的WE含量变大的机理在本申请提交申请时并不明确，但推测如下。裸藻具有通过根据营养条件使细胞内的贮藏物质变化以能够在多种营养条件下生长的特性。认为作为根据裸藻细胞被暴露的环境而使根据该情况能够生成的营养素内含于细胞内从而保障饥饿环境下的裸藻的生存力的特性，该特性是在进化过程中通过突变和自然选择(自然淘汰)的反复而使裸藻细胞具备的特性。另外，在对数生长期中途的裸藻细胞中，从细胞旺盛地分裂或生长来看，认为有助于细胞数的增加和细胞的生存的代谢路径实质上没有被抑制，裸藻细胞本来具备的WE发酵能力容易充分地得到发挥。
工业实用性
本发明提供了与以往相比改善为能够更有效地促进蜡酯(WE)发酵的高WE含量的裸藻的生产方法和生产系统、以及WE或生物燃料组合物的制造方法和制造系统、以及WE发酵促进剂。

Claims (9)

1.一种高蜡酯含量的裸藻的生产方法，其中，
所述生产方法包括：
准备裸藻的工序；
在糖的存在下于好氧条件下培养所述裸藻的工序；
在酸性环境中向经培养的所述裸藻给予蜡酯发酵促进物质的工序；以及
于常温下将被给予了所述蜡酯发酵促进物质的所述裸藻保持规定的时间的工序，
其中，所述蜡酯发酵促进物质是选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物。
2.根据权利要求1所述的高蜡酯含量的裸藻的生产方法，其中，所述蜡酯发酵促进物质是选自于由乙醛酸、乙醇酸、以及它们的盐所组成的组的1种以上的化合物。
3.根据权利要求1或2所述的高蜡酯含量的裸藻的生产方法，其中，所述蜡酯发酵促进物质进一步含有分子内的碳原子数为1以上且4以下的脂肪酸。
4.根据权利要求3所述的高蜡酯含量的裸藻的生产方法，其中，所述蜡酯发酵促进物质中的所述脂肪酸的摩尔比(脂肪酸的摩尔量/蜡酯发酵促进物质整体的合计摩尔量)为0.5以下。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的高蜡酯含量的裸藻的生产方法，其中，在上述于常温下保持的工序中进行氮鼓泡。
6.一种蜡酯或生物燃料组合物的制造方法，其中，
所述制造方法包括：
准备裸藻的工序；
在糖的存在下于好氧条件下培养所述裸藻的工序；
在酸性环境中向经培养的所述裸藻给予蜡酯发酵促进物质的工序；
于常温下将被给予了所述蜡酯发酵促进物质的所述裸藻保持规定的时间的工序；以及
从于常温下被保持了规定的时间的所述裸藻提取蜡酯的工序，
其中，所述蜡酯发酵促进物质是选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物。
7.一种蜡酯发酵促进剂，其中，所述蜡酯发酵促进剂是用于在酸性环境中向裸藻给予的组合物，所述组合物含有选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物，所述裸藻是在糖的存在下于好氧条件下培养后的裸藻。
8.一种高蜡酯含量的裸藻的生产系统，其中，
所述生产系统具备：
在糖的存在下于好氧条件下培养裸藻的单元；
在酸性环境中向经培养的所述裸藻给予蜡酯发酵促进物质的单元；以及
回收裸藻的单元，所述裸藻是被给予了所述蜡酯发酵促进物质后于常温下保持了规定的时间的裸藻，
其中，所述蜡酯发酵促进物质是选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物。
9.一种蜡酯或生物燃料的制造系统，其中，
所述制造系统具备：
在糖的存在下于好氧条件下培养裸藻的单元；
在酸性环境中向经培养的所述裸藻给予蜡酯发酵促进物质的单元；
回收裸藻的单元，所述裸藻是被给予了所述蜡酯发酵促进物质后于常温下保持了规定的时间的裸藻；以及
从回收的所述裸藻提取蜡酯的单元，
其中，所述蜡酯发酵促进物质是选自于由分子内具有酮基、醛基和羟基中的至少1种且分子内的碳原子数为2以上且4以下的一价羧酸及其盐所组成的组的1种以上的化合物。
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