WO2020162502A1 - ユーグレナによるバイオ燃料の製造方法 - Google Patents

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anaerobic
wax ester
paramylon
sample
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政宏 田茂井
重岡　成
明穂 横田
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学校法人近畿大学
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    • C10L1/00—Liquid carbonaceous fuels
    • C10L1/02—Liquid carbonaceous fuels essentially based on components consisting of carbon, hydrogen, and oxygen only
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently producing biofuel from Euglena.
  • the mobile transportation sector has a large share in the energy usage field.
  • the alternative fuel be in a liquid state because the moving body holds and moves the fuel.
  • fatty acid methyl ester fatty acid methylester, FAME
  • FAME fatty acid methylester
  • the liquid fuel obtained from these grains is basically ethanol. Since ethanol has a small combustion energy, it can be used as a fuel for automobiles, but cannot be used as a jet fuel.
  • Euglena is known to accumulate the polysaccharide paramylon synthesized by the photosynthetic reaction under aerobic conditions, and to produce wax ester having 28 carbon atoms from the polysaccharide paramylon under anaerobic conditions.
  • the wax ester is an ester of myristic acid (having 14 carbon atoms) and myristate (having 14 carbon atoms), and the amount of heat when these are burned is close to that of jet fuel.
  • Euglena since Euglena does not have a cell wall, it is easy to collect the wax ester after producing the wax ester. Furthermore, Euglena also has the characteristic that it can be cultured even in a harsh environment such as an acidic or alkaline medium in the presence of heavy metals and radiation. Also, although it is used as food only slightly, it does not compete in the direct food category. Therefore, the wax ester efficiently synthesized by Euglena has immeasurable advantages such as ease of culturing Euglena itself and energy efficiency.
  • Patent Document 1 discloses a mutant strain of wild-type Euglena in order to recover more wax ester from Euglena.
  • a mutagen is used to induce a mutation in a living Euglena cell, and the cell that has undergone the mutagenesis is stained with a fluorescent reagent that stains intracellular lipids. Then, by fluorescence-labeled cell sorting, the cells having a fluorescence intensity of a predetermined intensity or more are sorted from the stained cells, and a mutation that enriches the mutant in which the intracellular oil and fat content is increased by the mutation is collected.
  • a method for producing a Euglena rich in fat and oil which comprises performing a body concentration step and a mutant culture step of culturing the mutant.
  • a low-temperature low-oxygen treatment step of retaining the euglena and an extraction step of extracting a wax ester from the euglena are performed.
  • a manufacturing method is disclosed.
  • Patent Documents 1 to 3 disclose methods and mutant strains for obtaining Euglena with a high oil content. However, the yield at the time of recovering the wax ester from Euglena has not been examined as described below.
  • Euglena accumulates the polysaccharide paramylon in the body under aerobic conditions, and under anaerobic conditions, produces the ATP (adenosine triphosphate) from the polysaccharide paramylon as a raw material, and produces a wax ester as a metabolic product. Therefore, in order for Euglena to produce a wax ester, it is necessary to culture under anaerobic conditions.
  • ATP adenosine triphosphate
  • Euglena has the vitality to survive even in a poor environment, and even in an environment without oxygen supply, it survives calmly without exhausting the polysaccharide paramylon. As a result, about 1/3 of the polysaccharide paramylon accumulated in the body of Euglena could only be recovered as a wax ester. Therefore, there was a problem in terms of yield for commercialization.
  • the present invention has been conceived in view of the above problems, and provides a method for recovering a wax ester in a higher yield than ever, even for a wild strain of Euglena.
  • the method for producing a biofuel A step of culturing Euglena by giving sugar in an aerobic atmosphere, Giving a fatty acid having 2 to 8 carbon atoms to the Euglena in an acidic environment, Leaving the Euglena for a certain period of time,
  • the method is characterized by including a step of recovering a wax ester from the Euglena.
  • sugar is given to Euglena to increase the amount of polysaccharide paramylon accumulated in the body. That is, Euglena is cultivated in a hypernutrient state. Then, a fatty acid having a small number of carbon atoms such as propionic acid is given. This short chain fatty acid halts Euglena's oxygen breathing system. Therefore, Euglena continues to produce wax esters until it exhausts the polysaccharide paramylon in the body. As a result, almost 100% of the polysaccharide paramylon accumulated in the body can be converted into wax ester and recovered.
  • the "culture” is not affected by the weather, and can be cultured all year round if the temperature is controlled.
  • biofuel can be obtained very efficiently.
  • euglena can be cultured and biofuel can be produced even in an open-air pool culture facility where the sunlight conditions are not good.
  • Euglena can be cultured and biofuel can be produced. This is very convenient for easing the conditions of the installation site of the manufacturing plant.
  • the advantages of the Euglena biofuel production method of the present invention are immeasurable.
  • FIG. 2( a) is a graph in which the amount of paramylon in Euglena after culturing under various conditions and treatment was measured.
  • FIG. 2( b) is a graph in which the total amount of lipid in Euglena after culturing under various conditions and treatment was measured.
  • Euglena has a chloroplast, has a plant-like element that stores carbonic acid assimilation and starches in the body. On the other hand, in a lightless environment, it also has an animal element of taking in food from the outside and living. Therefore, there has been no unified view of classification since ancient times, in botany it is classified as Euglena of the Euglena plant phylum, and in Zoology it is classified as Euglena of the protozoan phylum.
  • the Euglena that can be used in the present invention is a species (including varieties) classified into the genus Euglena in both taxonomy and botany classification, as long as it produces a wax ester in the body.
  • Euglena gracilis which is widely used for research and actual business, can be preferably used.
  • euglena is fed with sugar and cultured.
  • the sugar is not particularly limited as long as it is sugar. However, molasses generated during the production of sugar can be preferably used. At this time, no particular sunlight is required. In the absence of sunlight, Euglena can ingest sugar and accumulate paramylon in the body.
  • a low carbon number fatty acid is added to Euglena that has been cultured and accumulated sugar (paramylon) in the body in an acidic environment.
  • the fatty acid those having 2 to 8 carbon atoms can be suitably used.
  • propionic acid having 3 carbon atoms can be preferably used.
  • the acidic environment is preferably pH 6 or less, and more preferably pH 2.5 to 3.5.
  • Euglena decomposes paramylon (sugar) to produce energy (ATP) in an anaerobic atmosphere, and finally produces a wax ester (myristyl myristate 28 is a main component) (wax). fermentation).
  • ATP energy
  • wax wax ester
  • fermentation oxidative ATP synthesis is performed in mitochondria, and sugar is decomposed into carbon dioxide and water to obtain energy (aerobic respiration).
  • the method for producing a biofuel using Euglena according to the present invention does not require sunlight to culture Euglena. Oxygen may not be necessary when obtaining a wax ester from Euglena. Therefore, in the method for producing a biofuel by Euglena according to the present invention, it is not necessary to consider the condition of being exposed to sunlight when installing the pool for Euglena culture.
  • a closed space such as a tank can also be used for the culture.
  • the culture solution of strain Z that has just been cultivated to the stationary phase is called “untreated sample solution”.
  • An untreated sample that has been allowed to stand for a predetermined time in an environment in which it is replaced with nitrogen is referred to as “anaerobic-only sample liquid”.
  • Propionic acid was added at concentrations of 0 mM, 0.5 mM, 1 mM, 4 mM, 8 mM, 16 mM, and the nitrogen-substituted sample was "0.5 mM sample solution”, "1 mM sample solution”, “4 mM sample solution”, “8 mM sample”. Liquid", "16 mM sample liquid”.
  • the “0 mM sample solution” is the “anaerobic only sample solution”.
  • an “anaerobic 1 mM sample solution” and an “anaerobic 4 mM sample solution” that were left to stand in a nitrogen substitution environment were prepared.
  • the horizontal axis is the concentration of propionic acid added to the untreated sample solution.
  • the vertical axis represents the fluorescence intensity (no unit) of light emitted by BODIPY.
  • the 0 mM sample solution is only when it is in an anaerobic state, which is a conventional method for extracting wax ester from Euglena. Some paramylon has been converted to wax esters.
  • the fluorescence intensity was extremely high when 1 mM and 4 mM of propionic acid were added.
  • the pH at the start of culture was 3.5.
  • Each freeze-dried sample was placed in a 5.0 mL Eppendorf tube and crushed to a powder.
  • the pulverized powders are referred to as "untreated sample powder”, “anaerobic sample powder”, “anaerobic 1 mM sample powder”, “anaerobic 4 mM sample powder”, and “4 mM sample powder”, respectively.
  • About 5 mg of each crushed sample powder was placed in a 1.5 mL Eppendorf tube, 800 ⁇ L of 100% acetone was added, and the mixture was stirred and suspended by a vortex mixer.
  • Each Eppendorf tube was centrifuged (4°C, 12,000 rpm, 10 min). 1.0 mL of 100% acetone was added to the precipitate in each Eppendorf tube, and sonication was performed for 10 to 15 minutes. Each Eppendorf tube was stirred and suspended for 10 to 15 minutes using a vortex mixer, and then centrifuged (4° C., 12,000 rpm, 10 minutes) to remove the supernatant. After the addition of acetone, ultrasonic treatment, stirring and suspension, the steps of centrifugation were repeated until the supernatant became white.
  • each Eppendorf tube was centrifuged (4°C, 12,000 rpm, 10 min) and the supernatant was removed. 1.0 mL of 1N NaOH solution was added to the precipitate of each Eppendorf tube to obtain a suspension solution which was shaken overnight. They were referred to as "untreated suspension solution”, “anaerobic only suspension solution”, “anaerobic 1 mM suspension solution”, “anaerobic 4 mM suspension solution”, and "4 mM suspension solution”, respectively.
  • Glucose (10 mg/mL) was diluted with double-distilled water (250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 ⁇ g/mL) and used for the calibration curve. Put 0.4 mL of glucose solution of each concentration in the test tube in the calibration curve, 0.2 mL of the suspension prepared above, add 0.2 mL of 1N NaOH, and dilute 2 times (4 times if necessary, After diluting 8 times), 0.4 mL of 5% phenol solution was added.
  • each organic layer was transferred to an eggplant flask and the organic solvent was removed by a rotary evaporator.
  • the lipid fixed inside the eggplant flask was dissolved with hexane and transferred to a 1.5 ml microtube. With the lid of the microtube open, the temperature was kept at about 40° C. in the draft to evaporate all hexane.
  • the respective lipids are referred to as “untreated lipid”, “anaerobic only lipid”, “anaerobic 1 mM lipid”, “anaerobic 4 mM lipid”, and “4 mM lipid”.
  • the weight of each lipid was measured and calculated as the amount of lipid per dry weight.
  • This lipid amount is the total lipid amount of Euglena in each sample liquid of "untreated sample liquid”, “anaerobic only sample liquid”, “anaerobic 1 mM sample liquid”, “anaerobic 4 mM sample liquid”, and "4 mM sample liquid”. You can think.
  • Fig. 2(b) shows the total amount of Euglena lipids (% DW) in each sample solution.
  • the horizontal axis represents the type of treatment as in FIG. 2A, and the vertical axis represents the total lipid amount (%DW).
  • the untreated Euglena had a large amount of paramylon, and the amount of lipid (wax ester) was lower than that of paramylon.
  • Euglena exposed to anaerobic atmosphere produced lipids in the same amount as the amount of paramylon.
  • the present invention can be suitably used as a method for producing biofuel from Euglena.

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Abstract

ユーグレナからワックスエステルを採取するには、嫌気雰囲気中で培養し、嫌気呼吸を行わせる。しかし、嫌気雰囲気であっても、ユーグレナは蓄積したパラミロンの全てを嫌気呼吸に使うことがない。したがって、ワックスエステルの生産効率が高くならないという課題があった。　ユーグレナを好気雰囲気で糖を与えて培養する工程と、酸性環境で前記ユーグレナに炭素数２以上８以下の脂肪酸を与える工程と、前記ユーグレナを一定時間放置する工程と、前記ユーグレナからワックスエステルを回収する工程を含むことを特徴とするバイオ燃料の製造方法では、ユーグレナの好気呼吸のサイクルを化学的に停止するので、ユーグレナは蓄積した全てのパラミロンをワックスエステルに変換する。結果、ワックスエステルの生産効率が高まる。

Description

ユーグレナによるバイオ燃料の製造方法
　本発明はユーグレナから効率的にバイオ燃料を製造する方法に関する。
　石化燃料は採掘技術の向上により埋蔵量が向上してはいる。しかし、石化燃料は、有限であるため、次のエネルギー源が模索されている。現在はそれに向けて石化燃料の代替燃料（以下単に「代替燃料」と呼ぶ。）の割合を増やすことを世界各国が試みている時代といえる。日本では２０３０年頃には、代替エネルギー比率を２５％に増加させるという目標も立てられている（経済産業省「総合エネルギー統計（２０１５年７月）」等）。
　エネルギーの利用分野で大きな割合を占めるのに、移動運輸部門がある。この部門においては、移動体は燃料を保持して移動するため、代替燃料は液体状であることが望ましい。従来の液体状の代替燃料としては、パーム油の脂肪酸メチルエステル（ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ，　ＦＡＭＥ）やサトウキビやトウモロコシなどの穀物を原料としたエタノールが知られていた。
　しかし、これらの穀物は食料としての利用と競合するため、燃料としての利用は躊躇される。また、これらの穀物から得られる液体状の燃料は、エタノールが基本である。エタノールは燃焼エネルギーが小さいため、自動車の燃料としては利用できるものの、ジェット燃料としては利用できない。
　ユーグレナは、好気条件では光合成反応によって合成した多糖パラミロンを蓄積し、嫌気条件ではその多糖パラミロンから炭素数２８とするワックスエステルを産生することが知られている。このワックスエステルは、ミリスチン酸（炭素数１４）とミリステート（炭素数１４）のエステルであり、これらが燃焼した時の熱量はジェット燃料に近いものとなる。
　また、ユーグレナは、細胞壁をもたないために、ワックスエステルを産生させた後、ワックスエステルを回収しやすい。さらに、ユーグレナは、重金属や放射線が存在している条件や、酸性若しくはアルカリ性培地といった過酷な環境でも培養が可能という特徴も有している。また、ごくわずかに食料として利用されてはいるものの、直接食料というカテゴリで競合するものではない。したがって、ユーグレナが効率よく合成するワックスエステルは、ユーグレナそのものの培養の容易さやエネルギー効率など、計り知れない長所を持っている。
　特許文献１では、ユーグレナからより多くのワックスエステルを回収するために、野生型のユーグレナの変異株が開示されている。
　また、特許文献２には、変異原を用いて、ユーグレナ生細胞の突然変異を誘発する突然変異誘発工程と、該突然変異誘発工程を経た前記細胞を、細胞内脂質を染色する蛍光試薬で染色した後、蛍光標識細胞分取により、染色した前記細胞から所定の強度以上の蛍光強度を有する前記細胞を分取して、前記突然変異で細胞内油脂含量が高められた変異体を濃縮する変異体濃縮工程と、前記変異体を培養する変異体培養工程と、を行うことを特徴とする油脂高含有ユーグレナの製造方法が開示されている。
　また、特許文献３には、炭素数２４～２６の鎖長のワックスエステルを含有するユーグレナを、該ユーグレナが増殖可能な増殖至適温度で培養する至適温度培養工程と、前記増殖至適温度よりも低い低温で、かつ酸素の供給のない条件下に、前記ユーグレナを保持する低温低酸素処理工程と、前記ユーグレナからワックスエステルを抽出する抽出工程と、を行うことを特徴とするワックスエステルの製造方法が開示されている。
特開２０１７－１８４６９８号公報 特開２０１７－１８４６９９号公報 特開２０１７－１４８００５号公報
　特許文献１乃至３は、油脂高含有ユーグレナを得るための方法および変異株を開示している。しかし、以下のように、ユーグレナからワックスエステルを回収する際の収率について検討されたものではない。
　ユーグレナは、好気条件において体内に多糖パラミロンを蓄積し、嫌気条件下では、その多糖パラミロンを原料としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を生み出し、その代謝結果物としてワックスエステルを産生する。したがって、ユーグレナにワックスエステルを産生させるためには、嫌気条件で培養する必要がある。
　しかし、ユーグレナは劣悪環境においても生存できる生命力を有しており、たとえ酸素供給のない環境であっても、多糖パラミロンを使い切ることなく、悠然と生存する。結果、ユーグレナの体内の蓄積した多糖パラミロンはその１／３程度をワックスエステルとして回収できるにすぎなかった。したがって、事業化するには、収率の点から問題があった。
　また、従来ユーグレナを培養し、多糖パラミロンを蓄積させるためには光合成を利用していた。この方法であると、天候の悪い場合や冬に日照時間が短い場所では培養（多糖パラミロンの産生）が遅くなるという問題もあった。
　したがって、ユーグレナからバイオ燃料を得て、事業化するためには、太陽光が十分に得られない場合の対策と、収率を劇的に向上させる発想が必要であった。
　本発明は、上記の課題に鑑みて想到されたものであり、野生株のユーグレナであっても、これまで以上の高収率でワックスエステルを回収する方法を提供するものである。
　より具体的に本発明に係るバイオ燃料の製造方法は、
　ユーグレナを好気雰囲気で糖を与えて培養する工程と、
　酸性環境で前記ユーグレナに炭素数２以上８以下の脂肪酸を与える工程と、
　前記ユーグレナを一定時間放置する工程と、
　前記ユーグレナからワックスエステルを回収する工程を含むことを特徴とする。
　本発明に係るユーグレナによるバイオ燃料の製造方法では、ユーグレナに糖を与えて、体内に蓄積する多糖パラミロンの量を増大させる。つまり、ユーグレナを栄養過多状態に培養する。そして、プロピオン酸といった炭素数の少ない脂肪酸を与える。この鎖長の短い脂肪酸は、ユーグレナの酸素呼吸系を停止させる。したがって、ユーグレナは体内の多糖パラミロンを使い果たすまでワックスエステルを産生し続ける。その結果、体内に蓄積させた多糖パラミロンをほぼ１００％ワックスエステルに変換させ、回収することができる。
　また、糖を与えて培養するため、光を与える必要がない。したがって、「培養」は、天気に左右されず、温度さえ管理すれば一年中培養することができる。結果、大変効率的にバイオ燃料を得ることができる。具体的には、温度さえ管理できれば、日照条件がよくない露天のプール培養施設でも、ユーグレナを培養することができ、バイオ燃料を製造することができる。さらに、培養タンクといった密閉空間でさえ、ユーグレナを培養することができ、バイオ燃料を製造することができる。これは製造工場の設置場所の条件を緩和するのに、大変好都合である。このように本発明によるユーグレナによるバイオ燃料の製造方法の利点は、計り知れない。
従属栄養培地で定常期まで培養したユーグレナにプロピオン酸を添加した時にユーグレナ細胞内の脂質をＢＯＤＩＰＹで染色した際の蛍光強度を示すグラフである。 図２（ａ）は、各種条件で培養し、処理した後のユーグレナ中のパラミロン量を測定したグラフである。図２（ｂ）は、各種条件で培養し、処理した後のユーグレナ中の総脂質量を測定したグラフである。
　以下に本発明に係るユーグレナによるバイオ燃料の製造方法について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。
　ユーグレナは、葉緑体をもち、炭酸同化作用を行い、でんぷん類を体内に蓄えるという植物的な要素をもっている。一方、光のない環境では、外部から食べ物を取り込んで生きるという動物的な要素も持っている。したがって、古来から分類の統一見解はなく、植物学では、ミドリムシ植物門のミドリムシ藻類に分類され、動物学では、原生動物門のミドリムシ類に分類されている。
　本発明で利用できるユーグレナとは、動物学、植物学何れの分類においてもユーグレナ属に分類される種（変種も含む）であって、体内にワックスエステルを産生するものであればよい。
　より具体的にはＥｕｇｌｅｎａ　ａｃｕｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｃａｕｄａｔａ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｃｈａｄｅｆａｕｄｉｉ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｄｅｓｅｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ（以下、「Ｅ．　ｇｒａｃｉｌｉｓ」という。）、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｎｕｌａｔａ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｍｕｔａｂｉｌｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｏｘｙｕｒｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｐｒｏｘｉｍａ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｓｐｉｒｏｇｙｒａ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｖｉｒｉｄｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｖｅｒｍｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅｕｇｌｅｎａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ，　Ｅｕｇｌｅｎａ　ｐｉｒｉｄｅなどが挙げられる。例えば、研究や実際の事業に、広く利用されているユーグレナ　グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ）は好適に利用することができる。
　本発明に係るユーグレナによるバイオ燃料の製造方法においては、ユーグレナに糖を与えて培養する。糖であれば特に限定されるものではない。しかし、砂糖を製造する際に発生する廃糖蜜が好適に利用できる。この際特に太陽光は必要としない。太陽光がない場合、ユーグレナは、糖を摂取して、体内にパラミロンを蓄積できるからである。
　また、培養し体内に糖分（パラミロン）を蓄積したユーグレナに酸性環境で低炭素数の脂肪酸を添加する。脂肪酸は炭素数が２以上８以下のものが好適に利用できる。特に炭素数が３のプロピオン酸は好適に利用することができる。また、酸性環境はｐＨ６以下が好適であり、ｐＨ２．５～３．５が望ましい。
　よく知られているように、ユーグレナは、嫌気雰囲気において、パラミロン（糖）を分解してエネルギー（ＡＴＰ）を生成し、最終的にワックスエステル（ミリスチルミリステート２８が主成分）を生成する（ワックス発酵）。一方、好気雰囲気においては、ミトコンドリアにおいて酸化的ＡＴＰ合成が行われ、糖を二酸化炭素と水に分解してエネルギーを得る（好気呼吸）。
　炭素数が２以上８以下の脂肪酸は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化反応を脱共役することで、ＡＴＰ合成を阻害する。したがって、脂肪酸が加えられると、ユーグレナは、好気呼吸ができず、体内に蓄積したワックスエステルが尽きるまで、ワックス発酵をせざるを得なくなる。このようにして、ユーグレナの体内に蓄積したパラミロンを全てワックスエステルに変換させる。
　このように、本発明に係るユーグレナによるバイオ燃料の製造方法では、ユーグレナを培養させるのに、太陽光を必要としない。また、ユーグレナからワックスエステルを得る際には、酸素がなくてもよい。したがって、本発明に係るユーグレナによるバイオ燃料の製造方法では、ユーグレナ培養用のプールを設置する際に、太陽光があたるという条件を考慮する必要がない。また、培養には、タンク等の密閉空間を用いることもできる。
　ＫＨ培地（従属栄養培地）で定常期まで培養したＥｕｇｌｅｎａ　ｇｒａｃｉｌｉｓ　Ｚ株（：以後単にＺ株と呼ぶ。）に、種々０ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、４ｍＭ、８ｍＭ、１６ｍＭの濃度のプロピオン酸を添加し、窒素置換後（嫌気あり）もしくはそのまま（嫌気なし）静置したものを、ＢＯＤＩＰＹ染色、パラミロン定量、総脂質抽出に用いた。
　定常期まで培養しただけのＺ株の培養液を「未処理サンプル液」と呼ぶ。未処理サンプルを窒素置換した環境に所定時間静置したものを「嫌気のみサンプル液」と呼ぶ。プロピオン酸を０ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、４ｍＭ、８ｍＭ、１６ｍＭの濃度で加え、窒素置換をしたサンプルを「０．５ｍＭサンプル液」、「１ｍＭサンプル液」、「４ｍＭサンプル液」、「８ｍＭサンプル液」、「１６ｍＭサンプル液」と呼ぶ。なお、「０ｍＭサンプル液」は、「嫌気のみサンプル液」である。
　また、１ｍＭサンプル液と４ｍＭサンプル液には、プロピオン酸を加えた後、窒素置換環境で静置された「嫌気１ｍＭサンプル液」と「嫌気４ｍＭサンプル液」を作製した。
　（１）ＢＯＤＩＰＹによる細胞内脂質の染色
　プロピオン酸を加えて２４時間後の「０ｍＭサンプル液」、「０．５ｍＭサンプル液」、「１ｍＭサンプル液」、「４ｍＭサンプル液」、「８ｍＭサンプル液」、「１６ｍＭサンプル液」の各サンプルの５００μＬを１．５ｍＬエッペンチューブにとり、希釈したＢＯＤＩＰＹを０．５μＬ加えた（終濃度１μＭ）。
　室温で１０分間静置後、１００％ＥｔＯＨで洗浄したスライドガラス上に各サンプル液を１０μＬ滴下し、ルゴール液５μＬを加え、ピペッティングでユーグレナ培養液によく混和させ、細胞の運動を停止させた。
　蛍光顕微鏡を用いて、明視野での細胞及びＢＯＤＩＰＹ染色による細胞内脂質蛍光を観察した。図１に結果を示す。
　図１を参照する。横軸は未処理サンプル液に加えたプロピオン酸の濃度である。縦軸はＢＯＤＩＰＹによる発光の蛍光強度（無単位）である。０ｍＭサンプル液は、嫌気状態だけにした場合であり、ユーグレナからワックスエステルを取り出す従来方法である。一部のパラミロンがワックスエステルに変換されている。
　一方、本発明に係るプロピオン酸を加える方法によれば、１ｍＭおよび４ｍＭのプロピオン酸を加えた場合に、蛍光強度が非常に高くなった。蛍光発光強度から類推して嫌気発酵での場合（０ｍＭサンプル液）に比べ数倍多くのワックスエステルが合成されたと考えられる。なお、培養開始時のｐＨは３．５であった。
　（２）パラミロンと細胞内脂質の染色
　次に、各サンプルにおける糖分と脂質の定量を行った。
　（２－１－１）パラミロン抽出法
　「未処理サンプル液」、「嫌気のみサンプル液」、「嫌気１ｍＭサンプル液」、「嫌気４ｍＭサンプル液」、「４ｍＭサンプル液」の各サンプル液を凍結乾燥させた。それぞれ、「未処理サンプル」、「嫌気のみサンプル」、「嫌気１ｍＭサンプル」、「嫌気４ｍＭサンプル」、「４ｍＭサンプル」と呼ぶ。各サンプルは凍結乾燥されたユーグレナである。
　凍結乾燥させた各サンプルを５．０ｍＬエッペンチューブに取り、粉末状になるまで破砕した。粉砕し粉末状になったものをそれぞれ「未処理サンプル粉」、「嫌気のみサンプル粉」、「嫌気１ｍＭサンプル粉」、「嫌気４ｍＭサンプル粉」、「４ｍＭサンプル粉」と呼ぶ。破砕した各サンプル粉末約５ｍｇを１．５ｍＬエッペンチューブに取り、１００％アセトン８００μＬ加え、ボルテックスミキサーにて攪拌・懸濁した。
　それぞれのエッペンチューブを遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）した。それぞれのエッペンチューブの沈殿物に１００％アセトン１．０ｍＬを加え、１０～１５ｍｉｎ超音波処理を行った。各エッペンチューブをボルテックスミキサーを用いて、１０～１５ｍｉｎ攪拌・懸濁後、遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。アセトンの添加、超音波処理、攪拌・懸濁後、遠心分離の工程は、上清が白くなるまで繰り返し行った。
　上清を取り除いた後、各エッペンチューブの沈殿物に１％ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕｍ　Ｄｏｄｅｃｙｌ　Ｓｕｌｆａｔｅ：ドデシル硫酸ナトリウム）溶液１．０ｍＬを加え、ボルテックスで攪拌・懸濁した後、沸騰水浴中にて５ｍｉｎ煮沸し、氷上で静置し、十分に冷ました。
　各エッペンチューブを遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、上清を取り除いた。各エッペンチューブの沈殿物に１ＮのＮａＯＨ溶液１．０ｍＬを加え、一晩振盪した懸濁溶液を得た。それぞれ「未処理懸濁溶液」、「嫌気のみ懸濁溶液」、「嫌気１ｍＭ懸濁溶液」、「嫌気４ｍＭ懸濁溶液」、「４ｍＭ懸濁溶液」とした。
　（２－１－２）フェノール硫酸法によるグルコース定量法
　次に各懸濁液中のグルコースを「フェノール硫酸法によるグルコース定量法」で定量し、各サンプル液中のＺ株が含有する糖分量を定量した。
　検量線にはグルコース（１０ｍｇ／ｍＬ）を再蒸留水で希釈（２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６２５μｇ／ｍＬ）して用いた。試験管に、検量線ではそれぞれの濃度のグルコース溶液を０．４ｍＬ、上記で作製した懸濁液では０．２ｍＬ入れ、１ＮのＮａＯＨ　０．２ｍＬを加え２倍希釈（必要に応じて４倍、８倍に希釈）した後、５％フェノール溶液０．４ｍＬを加えた。
　２．０ｍＬの濃硫酸を勢いよく加えた後、ボルテックスミキサーにてよく混合した後、３０℃で３０ｍｉｎインキュベートした。分光光度計を用いて波長４９０ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線からグルコース量（％ＤＷ：乾燥重量％）をパラミロン量とした。これらは、「未処理サンプル液」、「嫌気のみサンプル液」、「嫌気１ｍＭサンプル液」、「嫌気４ｍＭサンプル液」、「４ｍＭサンプル液」の各サンプル液中のユーグレナのパラミロン量と考えてよい。
　（２－２）総脂質抽出法
　凍結乾燥させた各サンプル粉（ユーグレナ細胞）を再蒸留水に懸濁し、１０ｍｌとした。３０ｍｌのクロロホルム／メタノール（１：２）を加え、激しく攪拌した。さらに、１０ｍｌのクロロホルム、１０ｍｌの再蒸留水を加え、激しく攪拌した。それぞれ「未処理攪拌液」、「嫌気のみ攪拌液」、「嫌気１ｍＭ攪拌液」、「嫌気４ｍＭ攪拌液」、「４ｍＭ攪拌液」と呼ぶ。
　各攪拌液を遠心分離（４℃、１２，０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）した後、有機層をパスツールピペットを用いて回収した。それぞれ「未処理有機層」、「嫌気のみ有機層」、「嫌気１ｍＭ有機層」、「嫌気４ｍＭ有機層」、「４ｍＭ有機層」と呼ぶ。
　各有機層をナスフラスコに移し、ロータリーエバポレーターにより、有機溶媒を除去した。ナスフラスコ内部に固着した脂質をヘキサンで溶解し、１．５ｍｌマイクロチューブに移した。マイクロチューブのフタを開けた状態でドラフト内で約４０℃に保温し、ヘキサンを全て気化させた。それぞれの脂質を「未処理脂質」、「嫌気のみ脂質」、「嫌気１ｍＭ脂質」、「嫌気４ｍＭ脂質」、「４ｍＭ脂質」と呼ぶ。各脂質の重量を測定し、乾燥重量当たりの脂質量として算出した。
　この脂質量は、「未処理サンプル液」、「嫌気のみサンプル液」、「嫌気１ｍＭサンプル液」、「嫌気４ｍＭサンプル液」、「４ｍＭサンプル液」の各サンプル液中のユーグレナの総脂質量と考えてよい。
　図２（ａ）には、「未処理サンプル液（「未処理」と表記）」、「嫌気のみサンプル液（「嫌気のみ」と表記）」、「嫌気１ｍＭサンプル液（「プロピオン酸１ｍＭ嫌気あり」と表記）」、「嫌気４ｍＭサンプル液（「プロピオン酸４ｍＭ嫌気あり」と表記）」、「４ｍＭサンプル液（「プロピオン酸４ｍＭ嫌気なし」と表記）」の各サンプル液中のユーグレナのパラミロン量を示す。横軸は処理の種類であり、縦軸はパラミロン量（％ＤＷ）である。
　また、図２（ｂ）には、各サンプル液中のユーグレナの総脂質量（％ＤＷ）を示す。横軸は図２（ａ）同様の処理の種類であり、縦軸は総脂質量（％ＤＷ）である。
　未処理のユーグレナはパラミロンが多く残り、脂質（ワックスエステル）量は、パラミロンの量よりも低かった。嫌気雰囲気に晒したユーグレナは、パラミロン量と同程度の脂質が産生されていた。
　一方、プロピオン酸で処理したユーグレナは、パラミロンがほとんど残っておらず、総脂質量もパラミロンの量より多かった。したがって、プロピオン酸で処理することで、ユーグレナは体内に蓄積していたパラミロンを殆ど全てワックスエステルに変換したと考えられる。
　また、プロピオン酸での処理の中でも、嫌気雰囲気下４ｍＭのプロピオン酸で処理したものが、最もパラミロン量が低く、総脂質量（ワックスエステル）量も多かった。
　図２（ａ）と図２（ｂ）の嫌気雰囲気（嫌気のみ）を参照する。無酸素状態でユーグレナを培養すると、酸素がないために、ユーグレナは無酸素呼吸を行う。その際にユーグレナは、体内の糖分をワックスエステルに変換しエネルギーを得ている（従来のワックスエステルの製造方法）。しかし、嫌気雰囲気でもパラミロン量は、十分に残存している。このことは、ユーグレナは嫌気雰囲気といえども、体内に蓄積した糖分を使い切ることができないことを意味している。
　しかし、本発明に係るユーグレナによるバイオ燃料の製造方法のように、プロピオン酸を添加すると、呼吸サイクル自体が停止されるため、ユーグレナは体内の糖分を完全に使い切らざるを得ない状況に晒され、蓄積したパラミロンをすべてワックスエステルに変換したと考えられる。
　本発明はユーグレナからバイオ燃料を製造する方法として好適に利用することができる。

Claims (2)

  1. 　ユーグレナを好気雰囲気で糖を与えて培養する工程と、
    　酸性環境で前記ユーグレナに炭素数２以上８以下の脂肪酸を与える工程と、
    　前記ユーグレナを一定時間放置する工程と、
    　前記ユーグレナからワックスエステルを回収する工程を含むことを特徴とするバイオ燃料の製造方法。
  2. 　前記脂肪酸がプロピオン酸であることを特徴とする請求項１に記載されたバイオ燃料の製造方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022220118A1 (ja) * 2021-04-12 2022-10-20 公立大学法人大阪 ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法および生産システム、並びに、ワックスエステル又はバイオ燃料組成物の製造方法および製造システム、並びに、ワックスエステル発酵促進剤

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012011421A1 (ja) * 2010-07-20 2012-01-26 株式会社ユーグレナ ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法及びワックスエステル製造方法
WO2013115288A1 (ja) * 2012-01-31 2013-08-08 株式会社ユーグレナ ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法
WO2013115137A1 (ja) * 2012-01-31 2013-08-08 Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 燃料油基材の製造方法
JP2019010054A (ja) * 2017-06-30 2019-01-24 公立大学法人大阪府立大学 ワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012011421A1 (ja) * 2010-07-20 2012-01-26 株式会社ユーグレナ ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法及びワックスエステル製造方法
WO2013115288A1 (ja) * 2012-01-31 2013-08-08 株式会社ユーグレナ ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法
WO2013115137A1 (ja) * 2012-01-31 2013-08-08 Ｊｘ日鉱日石エネルギー株式会社 燃料油基材の製造方法
JP2019010054A (ja) * 2017-06-30 2019-01-24 公立大学法人大阪府立大学 ワックスエステル高含有ユーグレナの製造方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022220118A1 (ja) * 2021-04-12 2022-10-20 公立大学法人大阪 ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法および生産システム、並びに、ワックスエステル又はバイオ燃料組成物の製造方法および製造システム、並びに、ワックスエステル発酵促進剤
JPWO2022220118A1 (ja) * 2021-04-12 2022-10-20
JP7307435B2 (ja) 2021-04-12 2023-07-12 公立大学法人大阪 ワックスエステル高含有ユーグレナの生産方法および生産システム、並びに、ワックスエステル又はバイオ燃料組成物の製造方法および製造システム、並びに、ワックスエステル発酵促進剤

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