CN117177768A - 6种混合液状疫苗的组合物 - Google Patents

Abstract

提供HBs抗原稳定地吸附保持于铝佐剂、作为Hib抗原的PRP稳定地结合保持于载体蛋白的、包含DPT‑IPV‑Hib‑HBs的6种混合疫苗的液状化制剂。针对白喉(Diphtheria)、百日咳(Pertussis)、破伤风(Tetanus)、小儿麻痹、流感嗜血杆菌b型(Hib)和B型肝炎(HepB)的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造方法，其包括以下的工序：(1)将白喉类毒素(D)和破伤风类毒素(T)与铝佐剂混合，生成DT佐剂的工序；(2)向通过工序(1)而得到的DT佐剂中混合B型肝炎表面(HBs)抗原，生成DT‑HBs佐剂的工序；(3)向通过工序(2)而得到的DT‑HBs佐剂中混合百日咳抗原(P)，生成DPT‑HBs佐剂的工序；(4)向通过工序(3)而得到的DPT‑HBs佐剂中混合失活小儿麻痹病毒(IPV)，生成DPT‑IPV‑HBs佐剂的工序；(5)向通过工序(4)而得到的DPT‑IPV‑HBs佐剂中添加琥珀酸磷酸缓冲液后，添加作为Hib抗原的PRP(PRP‑T缀合物)，生成DPT‑IPV‑HBs佐剂与PRP‑T缀合物的混合物的工序；以及，(6)将通过工序(5)而得到的DPT‑IPV‑HBs佐剂与PRP‑T缀合物的混合物的pH调整至5.4～5.9的工序。

Description

6种混合液状疫苗的组合物

技术领域

本发明涉及在小儿用预防接种中使用的疫苗的领域，涉及用于防御白喉(Diphtheria)、百日咳(Pertussis)、破伤风(Tetanus)、小儿麻痹、流感嗜血杆菌b型(Hib)和B型肝炎(HepB)的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造方法。

背景技术

至今为止上市了多种小儿用疫苗。除了百日咳白喉破伤风失活疫苗(DPT)、麻疹风疹混合疫苗、B型肝炎(HepB)疫苗、流行性腮腺炎疫苗、水痘疫苗之外，还要接种流感嗜血杆菌b型(Hib)疫苗、失活小儿麻痹(IPV)疫苗、肺炎球菌缀合疫苗、轮状病毒疫苗，尤其是婴儿期的接种日程极其密集。

对于近年来的小儿用疫苗，逐渐要求能够同时获得针对多种病毒、细菌等的防御能力的混合疫苗。混合疫苗通过将给药的免疫次数抑制至最小限，从而在减轻被接种者的负担、提高接种率方面也非常有效。

在日本，作为以百日咳白喉破伤风疫苗(DPT)为基础的混合疫苗，在DPT中混合有失活小儿麻痹疫苗的制品即クアトロバック(注册商标)(KMバイオロジクス公司)、テトラビック(注册商标)(一般财团法人阪大微生物病研究会)和スクエアキッズ(注册商标)(第一三共公司)已经上市。这四种混合疫苗是将用甲醛进行失活的抗原吸附于铝佐剂而得到的液剂。需要说明的是，クアトロバック和テトラビック使用使小儿麻痹病毒的弱毒株即Sabin(セービン)株失活而得到的疫苗，与此相对，スクエアキッズ使用野生(强毒)株失活得到的疫苗(Salk(ソーク)株)。从不易出现副反应的特征出发，小儿用疫苗使用铝佐剂，已知有氢氧化铝或磷酸铝。

进而，正在开发向这四种混合疫苗中添加用于Hib疫苗的Hib抗原(磷酸多核糖基核糖醇(Polyribosyl-Ribitol-Phosphate：PRP))而得到的5种混合疫苗。在包含DPT-IPV-Hib的5种混合疫苗的液剂化中，经缀合的PRP对于载体蛋白的结合保持、即脱离抑制被视作技术课题，专利文献1中公开了对其加以解决的制造方法。本文献的实施例6中并未记载具体的制造方法，但非专利文献1中存在详细的记载。首先，将百日咳抗原(P)纯化，利用福尔马林进行失活。接着，使白喉类毒素(D)吸附于铝凝胶，另行使破伤风类毒素(T)吸附于铝凝胶。接着，将小儿麻痹病毒纯化，利用福尔马林进行失活(IPV)。最终将它们混合而得到的物质是DPT-IPV佐剂，进而，通过添加将PRP缀合至破伤风类毒素(T)而得到的物质(PRP-T缀合物)，从而能够制备包含DPT-IPV-Hib的5种混合疫苗(专利文献1、非专利文献1)。

在世界范围内，作为向上述5种混合疫苗中进一步添加用于B型肝炎疫苗的B型肝炎表面(Hepatitis B surface；HBs)抗原而得到的包含DPT-IPV-Hib-HBs的6种混合疫苗，试剂盒制剂的Infanrix-Hexa(GlaxoSmithKline)、液体制剂的Hexamine/Hexyon(Sanofi)、Vaxelis(Sanofi-MSD)已经获批。Infanrix-Hexa是由将利用甲醛进行失活的DPT-IPV-HBs吸附于氢氧化铝佐剂而得到的溶液和将作为Hib抗原的PRP吸附于磷酸铝佐剂而得到的冷冻干燥品构成的试剂盒制剂。另一方面，Hexacima/Hexyon和Vaxelis是将利用甲醛或戊二醛进行失活的抗原吸附于氢氧化铝佐剂而得到的液体制剂。

专利文献2中公开了包含DPT-IPV-Hib-HBs的6种混合液状疫苗(这些抗原吸附于铝盐)。专利文献2还存在如下倾向：在将PRP吸附至铝盐的情况下，缀合至破伤风蛋白的Hib抗体效价会经时性地逐渐丧失其免疫原性。为了解决该课题，专利文献2还记载了：通过添加阴离子、尤其是磷酸根离子、碳酸根离子或柠檬酸根离子，从而能够防止Hib抗原(PRP)自羟基氧化铝脱离，维持其免疫原性。专利文献3也存在同样的记载。另一方面，专利文献4中记载了：在将HBs抗原吸附至羟基氧化铝的情况下，阴离子的添加会使HBs抗原脱附。

专利文献4中公开了液体混合疫苗的制备方法，其中，在包含羟基氧化铝、HBs抗原、与载体蛋白缀合的Hib抗原的6种混合液体疫苗中，HBs抗原吸附至羟基氧化铝，但Hib抗原未吸附。专利文献4中公开的液体混合疫苗的制备方法包括如下步骤：首先，使HBs抗原吸附至羟基氧化铝而得到HBs抗原/羟基氧化铝复合体后，至少在浓度为100mg/L的阳离子氨基酸和浓度为35～45mmol/L的磷酸根离子的存在下，将HBs抗原/羟基氧化铝复合体与Hib抗原混合。专利文献4的实施例中记载了：HBs抗原对于铝凝胶的吸附率在制备时为95～98％，在5℃保存稳定性试验中的HBs抗原的吸附率在9个月时为88～91％，在22个月时停留在降低至78～86％，另外，PRP对于铝凝胶的不吸附在制备时为20.0～22.6μg/mL，在5℃保存稳定性试验中的PRP的不吸附在9个月时为23～27.0μg/mL，在22个月时为19.9～23.9μg/mL，不怎么发生变化。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2018/074296

专利文献2：WO1999/013906

专利文献3：WO1996/037222

专利文献4：日本特开2017-203043

非专利文献

非专利文献1：クアトロバック(注册商标)的说明书

非专利文献2：Vaccine 12(8)(1994)700-706

非专利文献3：Journal ofPharmaceutical andBiomedicalAnalysis 21(6)(2000)1087-1091

非专利文献4：Journal of Microbiology and Biotechnology(2003),13(3),469-472

非专利文献5：AUTOMATED ENZYME IMMUNOASSAY SYSTEM AIA-360的产品目录

发明内容

发明要解决的课题

对于包含DPT-IPV-Hib-HBs的6种混合疫苗的液剂化而言，HBs抗原对于铝佐剂的吸附保持和抑制作为Hib抗原的PRP自载体蛋白的脱离被视作技术课题。

本发明的目的在于，提供HBs抗原稳定地吸附保持于铝佐剂、作为Hib抗原的PRP稳定地结合保持于载体蛋白的、包含DPT-IPV-Hib-HBs的6种混合疫苗的液状化制剂。

用于解决课题的手段

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果发现：通过优化最终添加磷酸浓度、pH，从而使HBs抗原稳定地吸附保持于铝佐剂且PRP稳定地结合保持，由此完成了本发明。

因此，本发明包括以下的方案。

[1]针对白喉(Diphtheria)、百日咳(Pertussis)、破伤风(Tetanus)、小儿麻痹、流感嗜血杆菌b型(Hib)和B型肝炎(HepB)的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造方法，其包括以下的工序：

(1)将白喉类毒素(D)和破伤风类毒素(T)与铝佐剂混合，生成DT佐剂的工序；

(2)向通过工序(1)而得到的DT佐剂中混合B型肝炎表面(HBs)抗原，生成DT-HBs佐剂的工序；

(3)向通过工序(2)而得到的DT-HBs佐剂中混合百日咳抗原(P)，生成DPT-HBs佐剂的工序；

(4)向通过工序(3)而得到的DPT-HBs佐剂中混合失活小儿麻痹病毒(IPV)，生成DPT-IPV-HBs佐剂的工序；

(5)向通过工序(4)而得到的DPT-IPV-HBs佐剂中添加琥珀酸磷酸缓冲液后，添加作为Hib抗原的PRP(PRP-T缀合物)，生成DPT-IPV-Hib-HBs佐剂与PRP-T缀合物的混合物的工序；以及

(6)将通过工序(5)而得到的DPT-IPV-Hib-HBs佐剂与PRP-T缀合物的混合物的pH调整至5.4～5.9的工序。

[2]根据[1]所述的方法，其中，铝佐剂为磷酸铝凝胶。

[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，铝佐剂的添加量为200～400μg/dose。

[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，在工序(5)中，按照添加磷酸浓度以最终浓度换算计成为2～8mmol/L的方式添加琥珀酸磷酸缓冲液(pH5.5)。

[5]根据[3]或[4]所述的方法，其中，铝佐剂的添加量为200μg/dose，添加磷酸浓度以最终浓度换算计为2～6mmol/L。

[6]根据[3]或[4]所述的方法，其中，铝佐剂的添加量为300μg/dose，添加磷酸浓度以最终浓度换算计为3～6mmol/L。

[7]根据[3]或[4]所述的方法，其中，铝佐剂的添加量为400μg/dose，添加磷酸浓度以最终浓度换算计为6～8mmol/L。

[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，HBs抗原对于铝佐剂的吸附率为99％以上，Hib的游离PRP含有率小于20％。

[9]6种混合疫苗的稳定的液状化制剂，其是通过[1]～[8]中任一项所述的方法制造得到的。

发明效果

根据本发明的方法，能够获得HBs抗原对于铝佐剂的吸附率为99％以上、结合于载体蛋白的Hib的游离PRP含有率小于20％的稳定的6种混合疫苗的液状化制剂。通过本发明的方法而制造的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂能够对要求预防接种的6种细菌或病毒赋予充分的抗体效价(免疫原性)。

附图说明

图1是表示本发明所述的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造方法的概要的示意图。

具体实施方式

以下，针对本发明的适合实施方式进行详细说明。其中，本发明不限定于以下的实施方式。

本发明涉及针对白喉(Diphtheria)、百日咳(Pertussis)、破伤风(Tetanus)、小儿麻痹、流感嗜血杆菌b型(Hib)和B型肝炎(HepB)的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造方法，其包括以下的工序，能够提供HBs抗原对于铝佐剂的吸附率为99％以上且结合于载体蛋白的Hib的游离PRP含有率低于20％的稳定的液状疫苗组合物：

(1)将白喉类毒素(D)和破伤风类毒素(T)与铝佐剂混合，生成DT佐剂的工序；

(2)向通过工序(1)而得到的DT佐剂中混合B型肝炎表面(HBs)抗原，生成DT-HBs佐剂的工序；

(3)向通过工序(2)而得到的DT-HBs佐剂中混合百日咳抗原(P)，生成DPT-HBs佐剂的工序；

(4)向通过工序(3)而得到的DPT-HBs佐剂中混合失活小儿麻痹病毒(IPV)，生成DPT-IPV-HBs佐剂的工序；

(5)向通过工序(4)而得到的DPT-IPV-HBs佐剂中添加琥珀酸磷酸缓冲液后，添加作为Hib抗原的PRP(PRP-T缀合物)，生成DPT-IPV-HBs佐剂与PRP-T缀合物的混合物的工序；以及

(6)将通过工序(5)而得到的DPT-IPV-HBs佐剂与PRP-T缀合物的混合物的pH调整至5.4～5.9的工序。

本发明的制造方法中，作为铝佐剂，优选使用磷酸铝凝胶。作为铝佐剂，除磷酸铝之外还已知氢氧化铝(与羟基氧化铝同义)等，为了获得HBs抗原对于铝佐剂的吸附率为99％以上且结合于载体蛋白的Hib抗原的游离PRP含有率低于20％的稳定的液状疫苗组合物，优选使用磷酸铝凝胶。另外，作为铝佐剂的添加量，可列举出200～400μg/dose的范围，但不限定于此。进而，结合于载体蛋白的PRP-T缀合物对于磷酸铝凝胶的吸附率优选为30％以下。

本发明的制造方法中，作为用于白喉(Diphtheria)、百日咳(Pertussis)、破伤风(Tetanus)、小儿麻痹、流感嗜血杆菌b型(Hib)和B型肝炎(HepB)的6种混合疫苗的各抗原，使用白喉类毒素(D)、破伤风类毒素(T)、B型肝炎表面(HBs)抗原、百日咳抗原(P)、失活小儿麻痹病毒(IPV)和作为Hib抗原的PRP，它们也可使用本领域技术人员公知的任何抗原。关于作为Hib抗原的PRP，可以使用例如PRP-T缀合物。

工序(1)：

在工序(1)中，使白喉类毒素(D)和破伤风类毒素(T)吸附至铝佐剂而生成DT佐剂。作为铝佐剂，优选如上所述地使用磷酸铝凝胶。破伤风类毒素基于WHO标准而要求超过1,000Lf(Limit offlocculation)/mgPN的纯度。另外，在欧州药典(EP：EuropeanPharmacopoeia)的Hib缀合疫苗的标准中，成为>1,500Lf/mgPN。作为破伤风类毒素的纯化方法，可使用硫酸铵沉淀、三氯乙酸沉淀、柱层析法(凝胶过滤层析、亲和层析)、盐析、透析等。

工序(2)：

在工序(2)中，向通过工序(1)而得到的DT佐剂中混合B型肝炎表面(HBs)抗原，在15-30℃下放置40-96小时，由此生成DT-HBs佐剂。

工序(3)：

在工序(3)中，向通过工序(2)而得到的DT-HBs佐剂中混合百日咳抗原(P)，生成DPT-HBs佐剂。

工序(4)：

在工序(4)中，向通过(3)而得到的DPT-HBs佐剂中混合失活小儿麻痹病毒(IPV)，生成DPT-IPV-HBs佐剂。

工序(5)：

在工序(5)中，向通过工序(4)而得到的DPT-IPV-HBs佐剂中添加琥珀酸磷酸缓冲液后，添加作为Hib抗原的PRP、例如PRP-T缀合物，生成DPT-IPV-HBs佐剂与PRP-T缀合物的混合物。在工序(5)中，添加琥珀酸磷酸缓冲液是为了根据铝佐剂的添加量来调整最终添加磷酸的浓度。即，按照添加磷酸浓度以最终浓度换算计成为2～8mmol/L的方式添加琥珀酸磷酸缓冲液(pH5.5)。例如，在铝佐剂的添加量为200μg/dose的情况下，按照添加磷酸浓度以最终浓度换算计成为2～6mmol/L的方式添加琥珀酸磷酸缓冲液(pH5.5)。在铝佐剂的添加量为300μg/dose的情况下，按照添加磷酸浓度以最终浓度换算计成为3～6mmol/L的方式添加琥珀酸磷酸缓冲液(pH5.5)。在铝佐剂的添加量为400μg/dose的情况下，按照添加磷酸浓度以最终浓度换算计成为6～8mmol/L的方式添加琥珀酸磷酸缓冲液(pH5.5)。

在本发明中，关于作为Hib抗原的PRP，可以使用使PRP与载体蛋白结合而得到的PRP缀合物。已知的是：对于Hib感染的防御而言，针对Hib的荚膜多糖体即PRP的抗体是有效的，但仅基于PRP成分的Hib疫苗呈现T细胞非依赖性，因此，对于免疫系统不成熟的出生小于18个月的婴幼儿而言效果不充分。因而，开发了使载体蛋白缀合(结合)于PRP而呈现T细胞依赖性的缀合疫苗，并对婴幼儿加以应用。

将PRP等多糖类与载体蛋白结合而得到的缀合疫苗是公知的。PRP缀合物可通过公知的结合技术来制备。例如，PRP可借助硫醚键来结合。在该结合方法中，通过利用1-氰基-4-(二甲基氨基)吡啶四氟硼酸酯(CDAP)对PRP进行活化来形成氰酸酯。如此操作而活化的PRP能够直接或者借助间隔物基团与载体蛋白的氨基结合。优选的是：通过将氰酸酯与己二胺结合，并利用伴有硫醚键形成的异源连接反应，使氨基衍生物化多糖与载体蛋白发生缀合。除上述之外，也可以通过还原氨基化方法来制备缀合物。进而，作为其它方法，可列举出将利用己二酸二酰肼(ADH)进行了衍生物化的溴化氰(CNBr)活化多糖借助碳二亚胺缩合而结合于载体蛋白的方法。另外，此处使用的PRP可以如专利文献1中记载那样地使用与天然PRP相比低分子化的PRP。

作为载体蛋白，可列举出破伤风类毒素、百日咳类毒素、白喉类毒素、白喉类毒素的基因变异体即CRM197、非荚膜型流感嗜血杆菌D抗原、髄膜炎B组的外膜蛋白质(OMP)等。对于PRP缀合物而言典型的载体蛋白为破伤风类毒素。在将破伤风类毒素用作载体蛋白的情况下，其纯度以作为WHO标准的1,000Lf/mgPN以上来使用。本发明的方法中，破伤风类毒素的纯度更高时较佳，优选为2,500～3,500Lf/mgPN。更优选为2,900～3,300Lf/mgPN。

工序(6)：

在工序(6)中，通过工序(5)而得到的DPT-IPV-Hib-HBs佐剂的pH不处于5.4～5.9的范围时，添加pH调节剂而将pH调整至5.4～5.9。为了制成HBs抗原对于铝佐剂的吸附率为99％以上且结合于载体蛋白的Hib抗原的游离PRP含有率低于20％的稳定的液状疫苗组合物，需要将最终产物的pH设为5.4～5.9的范围。在最终产物的pH不处于前述范围的情况下，无法获得期望的Hib的游离PRP含有率。

游离PRP含有率的测定可利用非专利文献2～4和专利文献4等中记载的方法来进行。本发明中的游离PRP含有率的测定利用专利文献1的实施例3中记载的方法来进行。另外，HBs抗原对于铝佐剂的吸附可利用专利文献4和非专利文献5等中记载的方法来进行。本发明中的HBs抗原对于铝佐剂的吸附量通过从HBs抗原的总含量减去上清中的HBs抗原的含量来计算。HBs抗原的总含量通过用柠檬酸等螯合剂使铝佐剂溶解，并使用东曹公司的自动酶免疫分析装置AIA-360和东曹公司的B型肝炎病毒表面抗原试剂盒来测定。另外，上清中的HBs抗原的含量如下测定：进行离心分离，将包含未被吸附的HBs抗原的上清回收，使用东曹公司的自动酶免疫分析装置和东曹公司的B型肝炎病毒表面抗原试剂盒HbsAg进行测定。关于研究稳定性时的长期保存试验的温度条件，在5±3℃下进行或者避免冷冻地在10℃以下进行。或者，可以在更高温条件下加速评价稳定性。

本发明所述的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造方法如上所述那样地通过工序(1)～(6)来进行，也可以在制造通过向DTP-IPV4种混合疫苗(沉降纯化百日咳白喉破伤风失活小儿麻痹(Sabin株)混合疫苗；例如KMバイオロジクス公司制的“クアトロバック(注册商标)”)或者在沉降纯化百日咳白喉破伤风混合疫苗(KMバイオロジクス公司)中添加失活小儿麻痹病毒(Salk-IPV)而得到的物质中添加PRP缀合物来制备的5种混合疫苗的情况下加以应用。

本发明所述的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造方法中，稳定的液状化制剂的组成条件如下所示。

铝凝胶：铝浓度为200～400μg/dose

HBs：5～10μg/dose

pH：5.4～6.2

最终添加磷酸：根据铝量进行调整

铝量为400μg/dose：6～8mM

铝量为300μg/dose：3～6mM

铝量为200μg/dose：2～6mM

(在IPV为Sabin株的情况下，在上述浓度的基础上增加1.5mM)

本发明在其它方面还提供6种混合疫苗的稳定的液状化制剂，其是通过本发明所述的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造方法而得到的。

实施例

以下，通过实施例来详细说明本发明，但本发明完全不限定于这些实施例。

[比较例1]

<使用磷酸铝凝胶进行的6种混合疫苗的制造(1)>

在DTP-IPV4种混合疫苗(沉降纯化百日咳白喉破伤风失活小儿麻痹(Sabin株)混合疫苗；KMバイオロジクス公司制的“クアトロバック(注册商标)”)或者向沉降纯化百日咳白喉破伤风混合疫苗(KMバイオロジクス公司制)中添加失活小儿麻痹病毒(IPV；Salk株)而得到的物质中，添加利用专利文献1的方法将PRP缀合至破伤风类毒素而得到的物质，由此制备5种混合疫苗。作为佐剂，使用磷酸铝佐剂。向所得5种混合疫苗中添加HBs抗原，得到包含DPT-IPV-Hib-HBs的6种混合疫苗。调查所得6种混合疫苗的HBs吸附率，结果小于10％，可知HBs抗原未吸附至佐剂。

[比较例2]

<使用磷酸铝凝胶进行的6种混合疫苗的制造(2)>

与比较例1同样操作，制备5种混合疫苗。向所得5种混合疫苗中混合使HBs抗原吸附至磷酸铝佐剂而得到的HBs疫苗，得到包含DPT-IPV-Hib-HBs的6种混合疫苗。针对所得6种混合疫苗，调查HBs抗原对于佐剂的HBs吸附率和游离PRP含有率，结果HBs抗原对于佐剂的HBs吸附率提高至96％以上，但尚不充分，游离PRP含有率也增加至25％以上。

[比较例3]

<使用磷酸铝凝胶进行的6种混合疫苗的制造>

与比较例1同样操作，制备5种混合疫苗。向所得5种混合疫苗中混合使HBs抗原吸附至磷酸铝佐剂而得到的HBs疫苗，得到包含DPT-IPV-Hib-HBs的6种混合疫苗。此时，磷酸铝含量为300μg/dose，最终添加磷酸浓度为2mmol/L。针对所得6种混合疫苗，调查HBs抗原对于佐剂的HBs吸附率和游离PRP含有率，结果HBs吸附率提高至99％以上，但游离PRP含有率增加至60％以上。

[实施例1]

<6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造>

将本发明所述的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造方法的制造路线示于图1。磷酸铝含量设为300μg/dose，如下操作来制造6种混合疫苗的稳定的液状化制剂。

白喉类毒素、破伤风类毒素对于磷酸铝凝胶的吸附：

将白喉类毒素和破伤风类毒素(白喉：600Lf/mL、破伤风：31.2Lf/mL、制备量的1/4量)与磷酸铝凝胶(最终浓度为1.8mg/mL)混合而使其吸附。将该吸附物作为沉降白喉破伤风。

HBs原液对于沉降白喉破伤风的吸附：

向上述沉降白喉破伤风中添加HBs抗原25～50μg/mL(沉降白喉破伤风的1/5量)，在15～30℃下放置40小时～96小时，使HBs吸附。

最终产物的制备：

向上述产物中添加纯化百日咳抗原(最终产物的1/3量)、小儿麻痹疫苗3价BULK(以下记作小儿麻痹；1型:2型:3型＝30:1000:1000DU(D-antigen unit)/mL、最终产物的1/10量)、琥珀酸磷酸缓冲液(pH为5.5、添加磷酸浓度以最终浓度换算计相当于4.5mmol/L；使用Sabin IPV时相当于6.0mmol/L)、Hib原药(以下记作PRP-T缀合物：利用专利文献1的方法，将PRP缀合至破伤风类毒素(T))，确认pH处于5.4～5.9的范围。在pH偏离该范围的情况下，以落入该范围内的方式使用盐酸溶液或氢氧化钠溶液来进行pH的调整。另外，对最终产物进行分析，结果PRP-T缀合物对于磷酸铝凝胶的吸附率为30％以下。

将此时得到的6种混合液状疫苗制剂(DPT-IPV-Hib-HBs)的组成示于表1。

[表1]

(注)

*铝凝胶的原材料

**在Salk IPV的情况下，1型:2型:3型为40:4:32(单位为DU/0.5mL)。

***磷酸氢二钠十二水合物

****磷酸二氢钠二水合物

[实施例2]

<pH对于游离PRP含有率的影响>

针对实施例1中得到的6种混合液状疫苗制剂(DPT-IPV-Hib-HBs)，研究pH对于游离PRP含有率的影响。将其结果示于表2。磷酸铝含量为300μg/dose。根据表2所示的结果可以明确：在37℃、2周后，pH偏离5.4～6.2的范围时，游离PRP含有率变大，表明游离加剧。

[表2]

[实施例3]

<铝含量和HBs量对于在食蟹猴中的有效性的影响>

在实施例1中发现的6种混合液状疫苗制剂(DPT-IPV-Hib-HBs)的制造方法中，为了调查铝凝胶的量和HBs的量对作为疫苗的有效性造成的影响，对食蟹猴(原产地：柬埔寨、月龄31～35个月、雌性31～37个月)进行给药。在接种后第4周进行采血，采取血清。针对所得血清，利用使用本公司制备的各疫苗抗原进行的ELISA或使用AIA-360(注册商标：东曹公司)进行的EIA来测定抗体效价。将其结果示于表3和表4。在表中，以相对于接种有已获批药物的组合的对照组(クアトロバック(注册商标：KMバイオロジクス公司)、ビームゲン(注册商标：KMバイオロジクス公司)、アクトヒブ(注册商标：サノフィパスツール公司)的同时接种)而言的比来表示。

在铝量：100μg/dose、HBs量：5μg/dose的组成中，初免(priming)后的抗体效价为对照组以上，但加强(boost)后显示出低至0.2左右的值。另一方面，在铝量为200μg/dose以上时，HBs的用量均在加强后显示出对照组比为1以上的值。关于除HBs之外的抗体效价，均与对照组为同等以上，因此，表4仅示出表3的No.3。

[表3]

[表4]

[实施例4]

<6种混合液状化制剂的稳定性的相关研究>

为了使用Salk IPV来研究实施例1中制造的6种混合液状制剂的稳定性，调查琥珀酸磷酸缓冲液(pH5.5)中的添加磷酸浓度对于HBs的吸附维持和PRP的游离抑制造成的影响。针对铝量为400μg/dose、300μg/dose和200μg/dose的情况，将其结果分别示于表5、表6和表7。此处示出的磷酸浓度是最终浓度下的添加量。在使用Sabin IPV的情况下，使添加磷酸浓度增加1.5mmol/L。

调查在37℃下保管2周后的样本的游离PRP含有率和HBs的吸附率。其结果，在满足HBs吸附率为99％以上且游离PRP含有率低于20％的条件下，铝量为400μg/dose时，添加磷酸为5～8mmol/L，铝量为300μg/dose时，添加磷酸为3～6mmol/L，铝量为200μg/dose时，添加磷酸为2～6mmol/L。

[表5]

[表6]

[表7]

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[实施例5]

<6种混合液状化制剂的HBs吸附率和游离PRP含有率的经时变化>

针对实施例1中得到的6种混合液状制剂，将在5±3℃下保管时的HBs吸附率的推移和游离PRP含有率的推移分别示于表8和表9。根据表8和表9所示的结果明确可知：按照本发明的方法而制造的6种混合液状化制剂在5±3℃下保管24个月后，HBs抗原对于铝佐剂的吸附率也为99％以上，且Hib的游离PRP含有率低于20％，是稳定的液状疫苗组合物。

[表8]

关于No.1，在9个月时结束试验。

[表9]

关于No.1，在9个月时结束试验。

产业利用性

本发明在药品领域、尤其在疫苗领域中是有用的。

Claims (9)

1.针对白喉(Diphtheria)、百日咳(Pertussis)、破伤风(Tetanus)、小儿麻痹、流感嗜血杆菌b型(Hib)和B型肝炎(HepB)的6种混合疫苗的稳定的液状化制剂的制造方法，其包括以下的工序：

(1)将白喉类毒素(D)和破伤风类毒素(T)与铝佐剂混合，生成DT佐剂的工序；

(2)向通过工序(1)而得到的DT佐剂中混合B型肝炎表面(HBs)抗原，生成DT-HBs佐剂的工序；

(3)向通过工序(2)而得到的DT-HBs佐剂中混合百日咳抗原(P)，生成DPT-HBs佐剂的工序；

(4)向通过工序(3)而得到的DPT-HBs佐剂中混合失活小儿麻痹病毒(IPV)，生成DPT-IPV-HBs佐剂的工序；

(5)向通过工序(4)而得到的DPT-IPV-HBs佐剂中添加琥珀酸磷酸缓冲液后，添加作为Hib抗原的PRP(PRP-T缀合物)，生成DPT-IPV-Hib-HBs佐剂与PRP-T缀合物的混合物的工序；以及

(6)将通过工序(5)而得到的DPT-IPV-Hib-HBs佐剂与PRP-T缀合物的混合物的pH调整至5.4～5.9的工序。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，铝佐剂为磷酸铝凝胶。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，铝佐剂的添加量为200～400μg/dose。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，在工序(5)中，按照添加磷酸浓度以最终浓度换算计成为2～8mmol/L的方式添加琥珀酸磷酸缓冲液(pH5.5)。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，铝佐剂的添加量为200μg/dose，添加磷酸浓度以最终浓度换算计为2～6mmol/L。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其中，铝佐剂的添加量为300μg/dose，添加磷酸浓度以最终浓度换算计为3～6mmol/L。

7.根据权利要求3或4所述的方法，其中，铝佐剂的添加量为400μg/dose，添加磷酸浓度以最终浓度换算计为6～8mmol/L。

8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，HBs抗原对于铝佐剂的吸附率为99％以上，Hib的游离PRP含有率小于20％。

9.6种混合疫苗的稳定的液状化制剂，其是通过权利要求1～8中任一项所述的方法制造得到的。