CN1171743A - 新的肿瘤抑制基因,hic－1 - Google Patents

Abstract

提供编码一种新的肿瘤抑制基因,HIC－1的多核苷酸和多肽序列。也包括一种检测和HIC－1相关的细胞增殖失调的方法。HIC－1是一种标志,能用于上述失调过程中的诊断、预后和治疗方面。

Description

新的肿瘤抑制基因，HIC-1

本发明用来自国家癌症研究所基金号R01-CA43318的政府资助进行。政府在本发明中拥有一些权利。

发明背景

1.发明领域

一般来说，本发明涉及正常和肿瘤细胞中的基因表达，特别地涉及一种新的肿瘤抑制基因，HIC-1，和其基因产物。

2.相关领域描述

重组DNA技术的进展导致了正常细胞基因的发现，比如控制生长、发育和分化的原癌基因和肿瘤抑制基因。在某些情况下，这些基因调节改变而引起正常细胞表现为肿瘤生长行为。迄今为止，已知有40多种原癌基因和肿瘤抑制基因，根据其功能特性可分为不同的种类。这些基因包括，(1)生长因子和生长因子受体，(2)如在细胞质和细胞核之间的细胞内信号转导通路信使，和(3)影响基因表达和DNA复制的调节蛋白(如，转录因子)。

在人类癌症中染色体17p常有改变，通常等位缺失与位于17p 13.1的p53基因突变相一致(Vogelstein，B，等，细胞，70：523，1992)。这个基因是人类肿瘤中改变最频繁的肿瘤抑制基因之一。可是在一些肿瘤类型中，17p等位缺失高频率地发生于远离p53的区域并且不存在p53突变。例如，60％的乳腺癌缺失17p等位基因时，仅30％的这些肿瘤含p53突变(Chen L-C，等，美国国家科学院院报，88：3847，1991；Takita，K.等，癌症研究，52：3914，1992；Deng，G.等，癌症研究，54：499，1994；Cornelis，R.S.等，癌症研究，54：4200，1994)。此外，在乳腺癌的一项研究中，17p13.3等位基因的独立缺失与伴随着p53 mRNA水平的增加。

典型的人癌细胞含体细胞内改变了的基因组，其特征是关键基因的突变、扩增或缺失。此外，来自人癌细胞的DNA模板常表现为DNA甲基化的体细胞变化(E.R.Fearon，等，细胞，61：759，1990；P.A.Jones，等，癌症研究，46：461，1986；R.Holliday，科学，238：163，1987；A.DeBustros，等，美国国家科学院院报，85：5693，1988)P.A.Jones，等，癌症研究进展，54：1，1990；S.B.Baylin，等，癌细胞，3：383，1991；M.Makos，等，美国国家科学院院报，89：1929，1992；N.Ohtani-Fujita，等，癌基因，8：1063，1993)。不过，尚未确立在人类肿瘤发生中异常DNA甲基化的精确作用。DNA甲基酶从通用的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸转移甲基基团到DNA特定位点上。几种生物学功能归因于DNA中的甲基化碱基。已确立的最明显的生物学功能是保护DNA免于同种限制酶的消化。迄今为止，限制性修饰现象仅在细菌中观察到。不过，哺乳动物细胞具有一种不同的甲基酶，专一地甲基化DNA上鸟嘌呤5′邻位的胞嘧啶残基(CpG)。几种迹象表明这种甲基化在基因活性、细胞分化、肿瘤形成、X-染色体生活、基因组印记和其它主要的生物学过程中起作用(Razin，A.H.和Riggs，R.D.eds.DNA甲基化的生物化学和生物学意义，Springer-Verlag，纽约，1984)。

CpG丰富的区域，或“CpG岛”最近已在17p13.3位确认，它在人类癌症的多种普通类型中异常地过度甲基化(Makos，M.，等，美国国家科学院院报，89：1929，1992；Makos，M.等，癌症研究，53：2715，1993；Makos，M.等，癌症研究，53：2719，1993)。这种过度甲基化在脑、结肠和肾癌中与17p缺失和p53突变的时机和出现率恰好吻合。与普通非甲基化启动子区CpG岛的过度甲基化相关的沉默基因转录，已作为一种肿瘤抑制基因失活的编码区突变的替代机制。(Baylin，S.B.等，癌细胞，3：383，1991；Jones，P.A.和Buckley，J.D.，癌症研究进展，54：1-23，1 990)。该变化现在已与VHL表达缺失相关，它是一种在3p上的肾癌肿瘤抑制基因(J.G.Herman，等，美国国家科学院院报，91：9700-9704，1994)，在6q上的雌激素受体基因(Ottaviano，Y.L.等，癌症研究，54：2552，1994)和在11p上的H19基因的表达缺失相关(Steenman，M.J.C.等，自然遗传学，7：433，1994)。

对几种人类肿瘤类型来说，第二个肿瘤抑制基因可能位于染色体17p13.1上的p53基因的远端，和p53基因相互作用。需要确认肿瘤抑制基因，以便发展合适的方法学，以便在细胞中观察到异常表达时增加或降低其表达。通过在多种普通人肿瘤类型中17p13.3 CpG岛异常地过度甲基化的特征，本发明提供了这样的一个基因。HIC-1(在癌症中过度甲基化)是一种新颖的锌指转录因子基因，在正常组织中广泛表达，但在过度甲基化的肿瘤细胞(如，乳腺、肺、结肠、成纤维细胞)中低表达。p53结合位点位于HIC-15′侧翼区。野生型p53基因在只含一个突变的p53等位基因的结肠癌细胞中的过度表达，导致20倍的HIC-1表达活化。

本发明表明许多人癌显示出相对于其起源组织的HIC-1表达降低。现有技术在提供细胞增殖失调如癌症存在相关的有意义标志的局限和失败，引起能用于上述失调过程的诊断、预后和治疗的标志的需求。本发明满足了上述的需求。

发明概述

本发明基于一种新的肿瘤抑制基因，HIC-1(在癌中过度甲基化)，的创新性发现，它在多种普通人类肿瘤类型中异常过度甲基化。本发明提供一种HIC-1多肽和编码多肽的多核苷酸序列及结合多肽的抗体。

在一实施方案中，本发明提供一种诊断方法，检测在受试者组织中和HIC-1有关的细胞增殖失调，它包括用一种检测HIC-1的试剂与含HIC-1的靶细胞组分接触。上述细胞组分包括核酸和蛋白。

在另一实施方案中，本发明提供一种治疗和HIC-1有关的细胞增殖失调的方法，包括给失调的受试者服用调节HIC-1表达的治疗有效量的药物。例如，由于典型的和失调有关的HIC-1涉及HIC-1多核苷酸序列的过度甲基化，含不能甲基化的核苷酸类似物可用于治疗受试者。

此外，本发明提供一种基因治疗方法，包括将一种包含与启动子可操作地连接的编码HIC-1的核苷酸序列的表达载体导入宿主受试者细胞内。

附图简述

图1图示粘粒C-13A的一个11.0kb区域图，粘粒C-13A包含前已表明在多种肿瘤类型中具有过度甲基化的染色体17p13.3区的50kb人DNA插入片段(Makos，M.，等，美国国家科学院院报，89：1929，1992；Makos，M，等，癌症研究，53：2715，1993；Makos，M.等，癌症研究，53：2719，1993)。显示了YNZ 22探针的位置，EcoRI(E)限制性位点和一系列制备横跨该区的粘粒亚克隆的定位。

图1B是发现其被包括在图1A显示的区域中的HIC-1基因的图解和图2B显示其氨基酸序列的图解。表示的是：可能的p53结合位点；TATAA＝从转录起点40bp上游的TATA盒序列；5′UTR＝第一个不翻译的外显子；ATG＝多半为5′翻译起点；ZIN(锌指N-端)＝包括锌指转录因子Zin结构域亚族的高度保守区(图2A)的478bp外显子；具阴影线的长方形表示HIC-1的2015bp最后外显子，每一个阴影棒表示成簇位于基因3′区的5个锌指(图2B)之一；TAG＝HIC-1基因中翻译终止位点；AATAAA＝离翻译终止位点835bp发现的多腺苷化信号位点。

图1C和SEQ ID NO：1和2表示核苷酸和推导的HIC-1氨基酸序列。

图2A和SEQ ID NO：3显示HIC-1氨基酸序列。HIC-1氨基酸序列和Zin结构域锌指家族其它成员的保守N-端区比较。在圆括号中，数字表示相对于每一基因的翻译起始位点的保守区位置。最黑的阴影表示9个蛋白中至少5个相同的氨基酸位置，较浅的阴影表示在家族成员之间保守性氨基酸差异的位置。D＝果蝇；M＝鼠；H＝人。在底部氨基酸的括号代表在其它家族成员该位置未找到的在HIC-1中的一个区域。

图2B显示HIC-1基因整个编码区。显示了HIC-1两个编码外显子的推导的氨基酸序列，由概括在本文中的序列分析和表达策略确定。在3′半个蛋白中的5个锌指由阴影盒显示。

图3显示HIC-1基因表达的RNA分析。S＝脾；The＝胸腺；P＝前列腺；Te＝睾丸；O＝卵巢；SI＝小肠；B＝外周血细胞。4.4kb标记以上的带和核糖体RNA共杂交。约1.1kb带仍然未被确认，但可能是一种替代性的剪接产物，因为用来自HIC-1的锌指或3′非翻译区的探针没有检出该带。

图4A显示在各种正常和肿瘤人组织中HIC-1基因表达的RNAse保护分析。在全部试验组中，顶部星号标记为未消化的360bp HIC-1基因RNA探针的位置，该探针衍生自粘粒亚克隆600中含锌指的区域(图1A)。被保护的HIC-1片段(300bp)标记为HIC-1。图4A用10μg总RNA比较下列细胞的表达，来自2个建成的正常人成纤维细胞培养系(WI-38和IMR-90)与纤维肉瘤细胞HT1080培养系(成纤维-C)相比，来自3个不同的正常结肠样品(结肠-N)与结肠癌细胞系，CaCO2(结肠-C)相比，以及来自正常肺样品(肺-N)与人小细胞肺癌建成系，NCI-H209(肺-C)相比。

图4B显示对来自6种不同建成的乳腺癌培养系(1道MDA231；2道HS58T；3道MDA468；4道T47D；5道MCF7；6道MDA453)的10μg RNA的RNAse保护分析，其中每道普遍有HIC-1 CpG岛NotI位点的甲基化。

图4C显示来自正常胎儿脑(B)与一组非培养脑瘤(1种退行性星形细胞瘤(AA)和8种更晚期的成胶质细胞瘤(1-8道)相比较的10μg RNA的RNAse保护分析。

图5显示含β-半乳糖苷酶基因或野生型p53基因的腺病毒载体感染  进人结肠癌细胞SW480系后，如图A详示的RNAse保护分析。(非感染、正常对照人成纤维细胞(F)，未感染SW480细胞(U)，用β-半乳糖苷酶基因感染的SW480细胞(GAL)，和用p53基因感染的SW480细胞(p53))。非消化的HIC-1 GAPDH探针的位置以及HIC-1和GAPDH转录本的位置的标志恰如图4中一致准确。

发明详述

本发明提供一种新的肿瘤抑制基因，HIC-1(在癌症中过度甲基化)。HIC-1位于染色体17p13.3上，近离位于17p13.1的p53肿瘤抑制基因，其中的CpG岛在许多不同的肿瘤类型中异常甲基化。该异常甲基化的CpG岛完全包括HIC-1基因的编码区。

在第一个实施方案中，本发明提供一种基本上纯的HIC-1多肽，其基本上由图2B和SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成。HIC-1多肽的特征是具有与高度保守的N-端基序不同的氨基酸同源性，N-端基序称作Zin(锌指N-端)结构域，它存在于锌指转录因子集合的每一个成员中。此外，也含有5个那些相同蛋白3′区特征的Kruppel型Cys2-His2锌指。

在此所用的术语“基本上纯”指HIC-1多肽，它基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白纯化技术纯化HIC-1。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。HIC-1多肽的纯度也能用氨基端氨基酸序列分析测定。

本发明包括一种功能性多肽，HIC-1，和其功能性片段。在此所用的术语“功能性多肽”指的是一种多肽，它具有的生物学功能或活性通过规定的功能分析确认，与细胞中特异的生物学、形态学或表型的改变相关。HIC-1多肽的功能性片段包括保留HIC-1活性如肿瘤抑制活性的HIC-1片段。含HIC-1生物学活性的较小肽包括在本发明中。例如，生物学功能可从一个抗体分子可以结合的小至一个表位的多肽片段变化到能参与细胞内表型变化的特征性诱导或程序化的大的多肽。“功能性多核苷酸”表示一种编码在此所述的功能性多肽的多核苷酸。

HIC-1原始氨基酸序列的微小修饰，可能产生与在此所述的HIC-1多肽相比基本上等价活性的蛋白。这些修饰可考虑用定点突变产生法或自发产生。只要存在HIC-1肿瘤抑制活性，这些修饰产生的全部多肽包括在本发明之中。此外，一或多个氨基酸的缺失也能引起得到的分子结构修饰而不显著地改变其活性。这能导致具有更广用途的较小活性分子的发展。例如，有可能移去HIC-1活性不需要的氨基或羧基末端氨基酸。

本发明的HIC-1多肽也包括多肽序列的保守性变化。在此所用的术语“保守性变化”表示一个氨基酸残基被另一个生物学上相似的残基取代，保守自变化的实例包括一个疏水性残基如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一个疏水性残基，或一个极性残基取代另一个极性残基，如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或谷氨酰胺取代天冬酰胺等。术语“保守性变化”也包括在一个非取代亲本氨基酸的部位使用一个取代的氨基酸，条件是抗取代的多肽的抗体也和非取代多肽起免疫反应。

本发明也提供一种分离的多核苷酸序列，其基本由编码具有SEQ IDNO：3氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列组成。本发明的多核苷酸序列也包括5′和3′非翻译序列，例如包括调节序列。在此所用的术语“分离的”包括多核苷酸，其基本上不含天然和其相关的其它核酸、蛋白、脂类、糖类或其它物质。本发明的多核苷酸序列包括编码HIC-1的DNA、cDNA和RNA序列。不言而喻的是只要它们编码具HIC-1活性的多肽，所有编码HIC-1的全部或部分的多核苷酸也包括在本发明中。上述多核苷酸包括自然存在的、合成的和有目的操作的多核苷酸。例如，HIC-1多肽可进行定点突变。HIC-1的多核苷酸序列也包括反义序列。本发明的多核苷酸包括作为遗传密码子简并结果的序列。有20种天然氨基酸，其中大多数由多于1个密码子所指定。因此，只要由核苷酸序列编码的HIC-1多肽的氨基酸序列功能上没有改变，所有简并的核苷酸序列包括在发明中。此外，本发明也包括一种多核苷酸，其基本由编码具有SEQID NO：3氨基酸序列和至少有一个表位产生HIC-1多肽有免疫反应性抗体的多肽的多核苷酸序列。

编码HIC-1的多核苷酸包括在图1C(SEQ ID NO：1和2)的核苷酸序列和该序列互补的核酸序列。互补性序列可包括一种反义核苷酸。当序列是RNA时，图1C(SEQ ID NO：1和2)的脱氧核糖核苷酸A、G、C和T分别由核糖核苷酸A、G、C和U代替。本发明中也包括的是至少长15个碱基的上述核酸序列，的片段它足够允许片段在生理条件和中度严格条件下选择性地与编码图2B(SEQ ID NO：3)蛋白的DNA杂交。

在此特别公开的是HIC-1的DNA序列，在图1A和1B(也见图1C和SEQ ID NO：2)图解说明。转录外显子包括5个锌指，从最后一个锌指到终止位点延伸了359bp。在明显的3′非翻译区(UTR)的239bp，在通过终止位点后转录继续进行。也有自终止位点835bp位的多腺苷化信号，AATAAA。此外，在Zin结构域后和锌指外显子前，有一个共有的剪接供体和由内含子区分离的受体位点。HIC-1完整的编码区由其中在NotI N₃和N₇位点之间的富含CpG的3.0kb区的2个外显子所包括。

本发明的DNA序列能用几种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离DNA。这些技术包括但不局限于：1)用探针与基因组或cDNA文库杂交以检出同源性核苷酸序列，和2)表达文库的抗体筛选以检出共同具有结构特征的克隆DNA片段。

本发明优选的HIC-1多肽来源于哺乳动物，并且最优选的是来自人类。假如能得到合适的探针，依靠核酸杂交的筛选步骤有可能从任何生物中分离任何基因序列。与编码所研究的蛋白的部分序列对应的寡核苷酸探针，能化学合成。这需要氨基酸序列短的寡肽段必须已知。编码蛋白的DNA序列能从遗传密码子推导出来，可是必须考虑密码子的简并性。当序列有简并时，可能进行混合添加反应。这包括变性的双链DNA的异源性混合物。为上述筛选，优选杂交在单链DNA或变性的双链DNA上进行。在来源于存在有关感兴趣的多肽的极低量mRNA序列的cDNA克隆检测时，杂交特别有用。换句话说，用直接避免非特异结合的严格杂交条件，例如，靶DNA与单链探针在完全互补的混合液中杂交时，有可能使特异的cDNA克隆放射自显影显示(Wallace，等，核酸研究，9：879，1981)。

编码HIC-1的特异DNA序列产生也能用下列方法获得：1)从基因组DNA分离双链DNA序列；2)化学合成DNA序列以提供感兴趣多肽的必需密码子；和3)从真核供体细胞分离的mRNA反转录体外合成双链DNA序列。在后者的情况下，最终形成的互补mRNA的双链DNA，一般称作cDNA。

三种上面提到的用于重组步骤产生特异DNA序列中的方法中，基因组DNA分离体的分离最不常用。当由于存在内含子，希望得到哺乳动物多肽的微生物表达时，这是特别真实的情形。

当需要的多肽产物的氨基酸残基整个序列已知时，DNA序列的合成是经常选用的方法。当不知道所需多肽的氨基酸残基的整个序列时，DNA序列的直接合成是不可能的，选用的方法是cDNA序列的合成。分离感兴趣的cDNA序列的标准方法是产生自大量存在于基因表达高水平的供体细胞中的mRNA的反转录，形成质粒或噬菌体携带的cDNA文库。当结合使用聚合酶链反应技术时，即使稀少的表达产物也能克隆。在已知多肽氨基酸序列的主要部分的这些情况下，复制假定存在于靶cDNA中的序列产生标志的单链或双链DNA或RNA探针序列可用在DNA/DNA杂交方法中，该杂交方法在cDNA变性成单链形式的克隆拷贝上进行(Jay，等，核酸研究，11：2325，1983)。

可用HIC-1特异抗体对cNDA文库，如λgt11进行筛选。这样的抗体可以是多克隆或单克隆来源的，用于检测显示HIC-1 cDNA存在的表达产物。

编码HIC-1的DNA序列能通过将DNA转染进合适的宿主细胞中而体外表达。“宿主细胞”是在其中载体能繁殖，其DNA能表达的细胞。该术语也包括任何受试者宿主细胞的后代。不言而喻的是所有后代可能与亲本细胞不相同，因为可能存在复制过程中产生的突变。不过，当用术语“宿主细胞”时上述后代包括其中。稳定转染的方法意味着外源DNA继续在宿主中维持，这在本领域中是众所周知的。

在本发明中。HIC-1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”涉及本领域熟知的质粒、病毒或其它运载体，通过HIC-1遗传序列的插入或掺入操作。上述表达载体含启动子序列，其有利于宿主插入的遗传序列有效转录。表达载体通常含复制起点、启动子、和允许作转化细胞表型选择的特殊基因。在本发明中适用的载体包括但不局限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，等，基因，56：125，1987)，在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee和Nathans，生物化学杂志，263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。DNA片段能存在于操纵性连接调节元件的载体中，例如启动子(如，T7，金属硫蛋白T，或多角体蛋白启动子)。

编码HIC-1的多核苷酸序列能在原核或真核生物中表达。包括的宿主是微生物、酵母、昆虫和哺乳动物。具有真核或病毒序列的DNA序列在原核生物中表达的方法在本领域中众所周知。能在宿主中表达和复制的病毒和质粒DNA载体的生物学功能在本领域中众所周知。上述载体用于掺入本发明的DNA序列。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含HIC-1编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/遗传技术。如见曼尼阿蒂斯，等，1989，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，纽约，所述的技术。

多种宿主表达载体系统可用于表达HIC-1编码序列。这些包括但不局限于以下系统；微生物如用含HIC-1编码序列的重组细菌噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含HIC-1编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用含HIC-1编码序列的重组病毒表达载体(如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒、TMV)感染的植物细胞系统或含HIC-1编码序列的重粒质粒表达载体(如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；用含HIC-1编码序列的重组病毒表达载体(如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；或用含HIC-1编码序列的重组病毒表达载体(如，反转录病毒、腺病毒、痘苗病毒)感染的动物细胞系统，或工程化稳定表达的转化动物细胞系统。由于HIC-1未证实含有糖类，细菌表达系统和提供翻译或翻译后修饰的那些系统二者都可使用；如，哺乳动物、昆虫、酵母和植物表达系统。

依据所用的宿主/载体系统，许多合适的转录和翻译元件的任一个，包括组成性和诱导性启动子、转录增强子元件，转录终止子等，可用在表达载体中(见如，Bitter等，酶学方法153：516-544，1987)。例如当在细菌系统中克隆时，可使用诱导性启动子如细菌噬菌体γ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子)等。当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可用来自哺乳动物细胞基因组(如，金属硫蛋白启动子)的启动子，或来自哺乳动物病毒(如反转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5k启动子)的启动子。通过重组DNA或合成技术产生的启动子。也可用于提供作插入的HIC-1编码序列的转录。此外，内源的HIC-1启动子也可用于提供HIC-1的转录装置。

在细菌系统中，根据打算作表达的用途，优先选择许多表达载体。例如，当计划产生大量的HIC-1时，合乎需要的是指导容易纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。优选的是那些工程化含裂解位点有助于恢复的载体。上述载体包括但不局限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther，等，EMBO J.2：1791，1983)，在pUR278载体中HIC-1编码序列可连接到载体的lacZ编码区框中，以产生杂种-lacZ蛋白；pIN载体(Inouyt&Inouye，核酸研究，13：3101-3109，1985；Van Heeke&Shuster，生物化学杂志264：5503-5509 1989)；谷胱甘肽-S-转移酶(GST)等。

在酵母中，可用许多含组成性或诱导性启动子的载体。综述见，分子生物学现代方法，第2卷，1988，Ed，Ausubel，等，Greene Publish.Assoc.&Wiley Interscience；Ch.13；Grant等，1987，酵母的表达和分泌载体，发表在酶学方法，Eds，Wu&Grossman，31987，Acad，Press.N.Y.，Vol153，pp.516-544；Glover，1986，DNA克隆，Vol.II，IRL Press，Wash.D.C.Ch.3；和Bitter，1987，异源基因在酵母中表达，酶学方法，编辑，Berger&Kimmel，Acad.Press.N.Y.Vol.152，pp.673-684；及酵母属的分子生物学，1982，Eds.Strathern，等，冷泉港出版社，VolsI和II。可用组成性酵母启动子如ADH或LEU2或诱导性启动子如GAL(酵母克隆，Ch.3，R.Rothstein：DNA克隆，第11卷，实用方法，Ed.DM Glover，1986，IRL Press，Wash.，D.C.)。可供选择的有，可用载体促进外源DNA序列整合到酵母染色体中。

在用植物表达载体的下，HIC-1编码序列的表达可由许多启动子的任一个驱动。例如，可用病毒启动子如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等，自然310：511-514，1984)，或针对TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu等，EMBO J.6：307-311，1987)；可供选择的有，可使用植物启动子如RUBISCO的小亚单位(Coruzzi等，EMBO J.3：1671-1680，1984；Broglie等，科学224：838-843，1984)；或热休克启动子，例如大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley，等，分子细胞生物学6：559-565，1986)。这些构建体能用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化，显微注射，电穿孔等方法导入植物细胞中。这些技术的综述见，例如，Weissbach&Weissbach，1988，植物分子生物学方法，Academic Press，NY VIII节，pp421-463；和Grierson&Corey，1988，植物分子生物学，2d Ed.Blackie，伦敦，Ch.7-9。

能用于表达的选择性表达系统是昆虫系统。在这样的一个系统中，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)用作载体表达外源基因。该病毒生长在草地夜蛾的细胞中。HIC-1编码序列可克隆到病毒非必需区(如多角体蛋白基因)中，置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)控制之下。HIC-1编码序列的成功插入会导致多角体蛋白基因的失活，产生非闭合重组病毒(即，病毒缺乏由多角体蛋白基因编码的蛋白外壳)。然后这些重组病毒用于感染插入基因在其中表达的草地夜蛾细胞(例如，见Smith，等，1983，病毒学杂志，46：584：U.S.Simth专利号4,215,051)。

真核生物系统，优选的是哺乳动物表达系统允许表达的哺乳动物蛋白发生适当的翻译后修饰。拥有初级转录本的适当加工、糖基化、磷酸化和有利于基因产物分泌的细胞内机构的真核细胞，可用作宿主细胞表达HIC-1。哺乳动物细胞系是优选的。上述宿主细胞系可包括但不局限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、-293和WI38。

用于重组病毒或病毒元件以指导表达的哺乳动物细胞系统可工程化处理。例如，当使用腺病毒表达载体时，HIC-1编码序列可连接到腺病毒转录/-翻译控制复合体，例如，晚期启动子和三联前导序列上。然后这种嵌合基因通过体内或体外重组插入到腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区(如E1或E3区)插入会产生有活性的重组病毒，能在感染宿主中表达蛋白(如见Logan&Shenk，美国国家科学院院报，81：3655-3659，1984)。可供选择的是使用痘苗病毒7.5k启动子(如见Mackett，等，1982，美国国家科学院院报，79：7415-7419；Mackett，等，病毒学杂志，49：857-864，1984；Panicali等，美国国家科学院院报79：4927-493 1，1982)。特别有趣的是依赖能作染色体外因子复制的牛乳头瘤病毒的载体(Sarver，等，分子细胞生物学1：486 1981)。这种DNA进行小鼠细胞短时间内，每细胞质粒复制了约100～200拷贝。插入的cDNA转录不需要质粒整合到宿主染色体上，因而产生高水平表达。这些载体通过包括在质粒中的选择性标记，如neo基因，能用于稳定表达。可供选择的是，反转录病毒基因组能被修饰用作载体，能在宿主细胞中导入和指导HIC-1基因的表达(Cone&Mulligan，美国国家科学院院报.81：6349-6353，1984)。高水平表达也可用诱导性启动子获得，包括但不局限于金属硫蛋白IIA启动子和热休克启动子。

为重组蛋白的长期高产量的生产，优选稳定表达。不用含病毒复制起点的表达载体，宿主细胞能用由合适的表达控制元件(如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷化位点等)和可选择的标记控制的HIC-1 cDNA转化。在重组质粒中的选择性标记授与对选择的抗性，允许细胞稳定地整合质粒到其染色体上，生长形成依次被克隆的转化灶，扩大成细胞系。例如，接外源DNA导入后，工程细胞可允许在加富培养基中生长1-2天，然后转换到选择性培养基中。可用许多选择系统，包括但不局限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，等，细胞，11：223，1977)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖苷转移酶(Szybalska&Saybalski，美国国家科学院院报，48：2026，1962)，和分别能用于tk-、hgprt或ap-rt细胞细胞的腺嘌呤磷酸核糖苷转移酶基因(Lowy，等，细胞，22：817，1980)。另外，抗代谢物抗性能用作如下基因的选择基础，dhfr基因赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler，等，Natl.Acad.Sci.USA，77：3567，1980；O’Hare，等，美国国家科学院院报，78：1527，1981)；gpt基因对霉酚酸有抗性(Mulligan&Berg，美国国家科学院院报，78：2072，1981)；neo基因对氨基糖苷G-418有抗性(Colberre-Garapin，等，分子生物学杂志，150：1，1981)；和hygro基因赋予对潮霉素的抗性(Santerre，等，基因，30：147，1984)。最近，描述了另外的选择性基因，即允许细胞用吲哚代替色氨酸的trp B；允许细胞用histinol代替组氨酸的HisD(Hartman&Mulligan，美国国家科学院院报，85：8047，1988)；赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂，2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO(McConlogue L.，1987，分子生物学现代通讯，冷泉港实验室，ed)抗性的ODC(鸟氨酸脱羧酶)。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是原核生物，如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞从指数生长期后收获细胞，接着自CaCl₂法处理制备，所用的步骤在本领域众所周知。可供选择的是能用MgCl₂或RbCl。如果需要，转化也能形成宿主细胞原生质体后进行。

当宿主是真核生物，可用如下的DNA转染方法，磷酸钙共沉淀，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装质粒插入或病毒载体。真核细胞也能用编码本发明的HIC-1的DNA序列，和编码选择性表型如单纯疱疹胸苷激酶基因的第二个外来的DNA分子共转化。另-个方法是使用真核生物病毒载体，如猴病毒40(SV40)或牛乳头瘤病毒，瞬时感染或转化真核细胞，表达蛋白(见实例，真核生物病毒载体，冷泉港实验室，Gluzman编，1982)。

由本发明提供的微生物或宿主细胞表达多肽或其片段的分离和纯化，可用常用方法进行，包括制备性层析法和涉及单克隆抗体或多克隆抗体的亲和及免疫学分离法。

本发明包括和HIC-1多肽(SEQ ID NO：3)起免疫反应的抗体或其免疫反应的片段。提供了基本上由所收集的有不同表位特征的单克隆抗体组成的抗体和不同的单克隆抗体制品。单克隆抗体通过本领域技术人员熟知的方法从含该蛋白片段的抗原制得(Kohler，等，自然，256：495，1975)。在本发明中所用的术语抗体的意思包括完整分子和其片段，如能结合HIC-1上表位决定簇的Fab和F(ab′)₂。

本发明也提供检测在一受试者中和HIC-1有关的细胞增殖失调的方法，包括用一种反应或结合HIC-1的试剂，接触怀疑有与HIC-1相关失调的靶细胞组分并检测HIC-1。靶细胞组分可能是核酸，如DNA或RNA，或可能是蛋白。当组分是核酸时，典型的试剂是核酸探针或PCR引物。当细胞组分是蛋白时，典型的试剂是抗体探针。靶细胞组分可直接原位检测，或和探针接触前从其它细胞组分用本领域技术人员熟知的普通方法分离(见例如，Maniatis，等，分子克隆实验手册，冷泉港实验室，纽约，1989；分子生物学现代方法，1994，Ed.Ausubel.等，Greene Publ.Assoc&Wiley Intercience)。检测方法包括本领域技术人员熟知的DNA和RNA印迹分析，RNaes保护，免疫分析和其它检测法。

探针能检测性标记，如用同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。本领域的一般技术人员会知道结合到探针上的其它合适标志，或能用日常实验确定上述标志。

由于本发明显示HIC-1转录水平降低常是HIC-1基因过度甲基化的结果，直接测定是否HIC-1基因过度甲基化常是合乎需要的。尤其是位于基因5′调节区称为“CpG岛”的富含胞嘧啶区，一般情况下非甲基化。术语“过度甲基化”包括在HIC-1基因序列中一般情况下非甲基化的胞嘧啶的任何甲基化，甲基化能通过HIC-1多核苷酸(基因)的限制性核酸内切酶处理和例如DNA印迹分析检测。因而在本发明的一个方法中，当检测的细胞组分是DNA时，优选的限制性核酸内切酶分析是检测HIC-1基因的过度甲基化。能用的任一种限制性核酸内切酶，是其识别位点部分包括CG，当C被甲基化时其活性被抑制的种类。上述核酸内切酶的实例是甲基化敏感的限制性核酸内切酶如BssHII，MspI，NotI或HpaII单独或结合使用。其它甲基化敏感的限制性核酸内切酶会被本领域的技术人员熟知。此外，PCR能用于检测HIC-1基因的甲基化状态。基于HIC-1序列中任何编码序列区的寡核苷酸引物能用于PCR扩增DNA。

作为本发明的目的，特异针对HIC-1的抗体或核酸探针可用于检测在生物学液体或组织中存在HIC-1多肽(用抗体)或多核苷酸(用核酸探针)。基于在HIC-1序列中任何编码序列区的寡核苷酸引物能用于扩增DNA，如用PCR法。可用于任何含可检测量的HIC-1多核苷酸或HIC-1多肽抗原的样本。核苷酸也能用本领域技术人员熟知的原位RNA法分析。本发明优选的样品是心脏组织、肾、脑、结肠、乳腺、泌尿生殖组织、子宫、造血组织、前列腺、胸腺、肺、睾丸和卵巢。优选的受试者是人。

通过本发明的方法能检测的各种失调包括星形细胞瘤、退行性星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、肺癌、肾癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌和成神经细胞瘤。

本发明方法中所用的单克隆抗体适用于如在免疫测定中，用于液相或结合到固相载体上。此外，在这些免疫测定中的单克隆抗体能以各种方法检测性地标记。能用本发明单克隆抗体的免疫测定法类型的实例是以直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定法。上述免疫测定法的实例是放射免疫测定法(RIA)和三明治(免疫测量的)测定法。用本发明的单克隆抗体检测抗原能用以正向、反向或同时模式进行的免疫测定法操作，包括对生理学样品的免疫组化测定。本领域的技术人员不用过多的实验，会知道或能容易地辨别其它免疫测定形式。

术语“免疫测量测定法”或“三明治免疫测定法”包括同时三明治、正向三明治和反向三明治免疫测定法。这些术语本领域的技术人员完全明白。技术人员也会意识到根据本发明，在其它变化方法和目前已知的或将来发展的测定方式中，抗体是有用的。这些趋向包括在本发明的范围之中。

单克隆抗体能结合到许多不同的载体上，用于检测HIC-1的存在。熟知的载体实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、支链淀粉、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁性材料。载体的性质针对本发明的目的是可溶或不可溶的。本领域的技术人员会知道其它合适的载体结合单克隆抗体，或能用常规实验确定上述方法。

在进行测定时，可能合乎需要的是在温育介质中包括某些“阻断剂”(通常加标记过的可溶性抗体)。加“阻断剂”以确认非特异的蛋白、蛋白酶或对存在于实验样品中抗HIC-1免疫球蛋白的抗异嗜性免疫球蛋白不会交联，或不毁坏在固相支持物上的抗体或同位素标记的指示抗体，而产生假阳性或假阴性的结果。因而“阻断剂”的选择基本上可加到本发明所述的测定特异性中。

已经发现许多在测定中所用的那些同类或亚类(同种型)的无关(即非特异)抗体(如，IgG1、IgG2a、TgM、等)能用作“阻断剂”。“阻断剂”的浓度(一般1-100μg/μl)是重要的，以便维持合适的敏感性，而通过相互在样本中发生的互相反应蛋白抑制任何非所需的干扰。

在用单克隆抗体体内检测抗原时，给出的可检测的标记单克隆抗体是诊断有效剂量。术语“诊断有效的”意指用检测标记单克隆抗体的量为足够量，能检出单克隆抗体特异的具有HIC-1抗原的位点。所用的可检测的标记单克隆抗体的浓度应该是足够的，结果与背景相比较，对有HIC-1的那些细胞的结合是可检测的。此外，为了给出最好的靶物对背景的信号比，可检测的标记单克隆抗体从循环系统快速清除是合乎需要的。

作为一个原则，体内诊断用的可检测性标记单克隆抗体的剂量是将根据诸如年龄、性别、和个体疾病程度的因素而变化。单克隆抗体的剂量可从约0.001mg/m²～约500mg/m²变化，优选的是0.1mg/m²～约200mg/m²，最优选的约0.1mg/m²～约10mg/m²。例如，上述剂量可根据是否进行了多次注射，是否带肿瘤和本领域技术人员所知的其它因素而变化。

为体内诊断成像，可用的检测仪器类型是选择特定的放射性同位素的主要因素。所选的放射性同位素必须具有对仪器特定类型可检测的衰变类型。选择体内诊断的放射性同位素还有另一个重要因素是放射性同位素的半衰期，其足够长在靶物最大吸收的时间点上仍可检测，其足够短以使关系到宿主的损害性辐射降低到最低程度。理想的用于体内成像的放射性同位素缺乏粒子发射，但产生大量的在140-250keV范围的质子，可方便地通过普通的γ照像机检测。

作体内诊断，放射性同位素通过用中间介导性的官能基直接或间接地结合到免疫球蛋白上。常用的结合以金属离子存在的使放射性同位素到免疫球蛋白上的中间介导功能性基团是双功能螯合剂如三亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和乙二胺四乙酸(EDTA)及相似分子。能结合到本发明单克隆抗体上的金属离子的典型实例是“¹¹¹In、⁹⁷Ru、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁷²As、⁸⁹Zr和²⁰¹Tl。

本发明方法中用的单克隆抗体也能标记顺磁同位素，目的作磁共振成像(MRI)或电子自旋共振(ESR)的体内诊断。一般来说，能用任何显现诊断影像的常规方法。通常发射γ和正电子的放射性同位素用于照相机影像和作MRI的顺磁同位素。特别用于上述技术的元素包括¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Cr、和⁵⁶Fe。

本发明也提供一种治疗和HIC-1有关的细胞增殖失调的受试者的方法，包括给失调的受试者服用治疗有效量的调节HIC-1表达的药物。例如，在脑、乳腺和肾癌细胞中，HIC-1核苷酸序列与在正常细胞中表达相比是低表达的、因而有可能针对该序列设计合适的治疗或诊断技术。这样，哪里细胞增殖失调与恶性相关的HIC-1表达有联系，哪里就能用在转录或翻译水平调节HIC-1表达的核酸序列。例如在细胞增殖失调和异常细胞表型和HIC-1低表达相关的情况下，编码HIC-1的核酸序列(有义)能给失调的受试者服用。

术语“细胞增殖失调”表示恶性和非恶性细胞群体，常显得在形态学和遗传类型上与周围组织不同。例如，上述失调可能和缺乏HIC-1的表达有关。大体来说，任何病因学上与HIC-1表达有联系的失调可考虑容易受本发明调节HIC-1表达的药剂治疗。

术语“调节”设想当HIC-1低表达时抑制HIC-1多核苷酸的甲基化。当细胞增殖失调和HIC-1表达相关时，如5-氮杂胞苷的甲基化抑制试剂可导入到细胞中。可供选择的是，当细胞增殖失调和HIC-1多肽的低表达相关时，编码HIC-1多肽的有义多核苷酸序列(DNA编码链)，或和HIC-1多核苷酸操纵性连接的HIC-15′调节核苷酸序列(即，启动子)可导入到细胞中。本领域已知的脱甲基酶也能用于移去甲基化。

本发明也提供治疗由HIC-1介导的细胞增殖失调的基因治疗。通过导入合适的含HIC-1结构基因(有义)的HIC-1多核苷酸到具增殖失调的受试者细胞中，上述疗法会获得其疗效。用如嵌合病毒的重组表达载体或胶体分散系统，能获得有义HIC-1多核苷酸构建体的传送。

用于本发明方法中的多核苷酸序列可能是天然的非甲基化的序列，或供选择的在序列中被不能甲基化类似物取代的序列。优选的类似物是胞苷不能甲基化类似物如5-氮杂胞苷。其它类似物会被本领域的技术人员了解。可供选择的是，上述不能甲基化的类似物能作治疗药物，单独或同时与HIC-1的有义结构基因或操纵性地与HIC-1结构基因连接的HIC-1有义启动子，给受试者服用。

在另一实施方案中，HIC-1结构基因操纵性地与一组织特异性的异源性启动子相连，用于基因治疗。例如，HIC-1基因能连接到前列腺特异抗原(PSA)-前列腺特异启动子上，使HIC-1在前列腺组织中表达。其它组织特异的启动子会被本领域的技术人员了解。可供选择的是，另一个肿瘤抑制基因的启动子能连接到HIC-1结构基因上，用于基因治疗。

在此谈的用于基因治疗的各种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、痘苗或更优选的是RNA病毒如反转录病毒。优选的反转录载体是鼠或鸟类反转录病毒的衍生物。单个外来基因能插入反转录病毒的实例包括但不局限于：莫洛尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳头瘤病毒和劳斯肉瘤病毒(RSV)。最优选的是使用非人的灵长类反转录载体，如长臂猿白血病病毒(GaLV)，因而提供比如鼠载体更宽的宿主范围。

许多附加的反转录载体能掺入许多基因。所有这些载体能转移或掺入一个选择标记基因，结果转导细胞能被识别和产生。通过插入如编码糖、糖脂或蛋白的多核苷酸，反转录病毒载体能制成具靶物特异性。优选的靶向用靶向反转录病毒载体的抗体完成。本领域的技术人员不用过多的实验会知道或容易确认能插入反转录病毒基因组的特异多核苷酸序列，以允许含HIC-1有义或反义多核苷酸的反转录病毒载体靶物特异性传送。

由于重组反转录病毒有缺陷，为产生感染性的载体粒子它们需要帮助。例如在LTR中调节序列控制下，通过用含编码全部反转录病毒结构基因的质粒的辅助细胞系，能提供这种帮助。这些质粒缺失能使包装机制为衣壳化识别RNA转录本的核苷酸序列。有包装信号缺失的辅助细胞系包括但不局限于如Ψ2、PA317和PA12。这些细胞系产生空病毒粒子，因为没有包装基因组。如果反转录病毒载体被导入包装信号是完整的上述细胞中，但结构基因被感兴趣的其它基因取代，载体能被包装，产生载体病毒粒子。

另一个作HIC-1多核苷酸靶向传送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合物、毫微型囊、微球、珠和包括水油乳剂、微胶粒、混合微胶粒和脂质体的基于脂质的系统。本发明优选的胶质系统是脂质体。脂质体是体外和体内有用的作传送载体的人工膜泡。已表明体积范围从0.2-0.4μm的大单室泡(LUV)能包囊大量百分率的含较大大分子的水相缓冲液。RNA、DNA和完整病毒粒子能包囊在内部水之中，传送到处生物学活性态的细胞上(Fraley等，生物化学科学动态6：77，1981)。除了哺乳动物细胞，脂质体被用于在植物、酵母和细菌细胞中多核苷酸的传送。为使脂质体成为有效的基因转移载体，应具备如下特征：(1)感兴趣的基因高效率地包囊而不损害它们的生物学活性；(2)与非靶细胞比较，优先和基本上结合到靶细胞上；(3)高效率地传送载体水相内含物到靶细胞细胞质中；(4)遗传信息准确有效的表达(Mannino，等，生物技术，6：682，1988)。

脂质体的组成通常是磷脂组合，尤其是高相转变温度脂质体，一般和类固醇特别是胆固醇结合。也可用其它磷脂或其它脂类。脂质体的物理特性依赖于pH、离子强度和二价阳离子的存在。

用于脂质体生产的脂类实例包括磷脂酰化合物，如磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂类、脑苷脂类和神经节苷脂。特别有用的是双乙酰磷脂酰甘油，其脂部分含14-18碳原子，尤其含16-18的碳原子，脂部分是饱和的。用作说明的磷脂包括卵磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱和二硬脂酰磷脂酰胆碱。

脂质体的靶向依据解剖和机制因素分类。解剖学分类依据选择性水平，如器官特异性、细胞特异性和细胞器特异性。机制靶向依据是被动还是主动予以区别。被动靶向应用脂质体的自然属性，分配到器官内含窦状隙毛细血管的网状内皮系统(RES)的细胞上。另一方面，主动靶向涉及脂质体的改变，使脂质体与特异配基如单克隆抗体、糖、糖脂或蛋白偶联，或改变脂质体的组成或体积，以获得靶向到器官和细胞类型而不是天然存在的定位点。

靶向的传送系统表面可用种种方法修饰。在脂质体靶向传送系统的情况中，脂基团能掺入到脂质体脂双层中，以稳定靶向配基稳定地与脂质体双层相连。各种连接基团能用于把脂链连接到靶向配基上。

一般来说，结合到靶向传送系统表面的化合物，可能是允许靶向的传送系统寻找和“寻的”(“home in”)所需细胞的配基和受体。配基可以是感兴趣的任何化合物，能结合到如受体的另一种化合物上。

一般来说，结合到特异效应分子上的表面膜蛋白称为受体。在本发明中，抗体是优先的受体。抗体能用于靶向脂质体到特异的细胞表面配基上。例如特异地在肿瘤细胞上表达称为肿瘤相关抗原(TAAs)的某些抗原，可以开发以直接靶向含HIC-1抗体的脂质体到恶性肿瘤中。由于HIC-1基因产物不能辨别其作用的细胞类型，靶向的传送系统提供了对随机注射非特异脂质体的显著改善。优选的靶组织是人脑、结肠、乳腺、肺和肾起源的组织。许多方法能用于多克隆或单克隆抗体共价连接到脂质体双层中。抗体靶向的脂质体可包括单克隆或多克隆胶体或其片段如Fab或F(ab′)₂，只要它们有效地结合到靶细胞的抗原表位上。脂质体也可靶向到表达激素或其它血清因子受体的细胞上。

为用于上面提到的诊断研究和治疗应用，本发明也提供了试剂盒。上述的试剂盒包括划分为几部分的一个承载装置，以紧密地放一或多个容器如小瓶、管等，容器具的每一个包括用于本方法的不同组分之一。

例如，容器之一可包括是或能检测性标记的探针。上述探针可分别特异地针对靶蛋白或靶核酸的抗体或核苷酸，其中靶物指示本发明的HIC-1存在，或与其有关。试剂盒用于核酸杂交检测靶核酸的地方，试剂盒也可有含用于扩增靶核酸序列的核苷酸的容器和/或一个包括报告工具的容器，如生物素结合蛋白，如结合到报告分子上的亲和素或链霉亲和素，报告分子有如酶、florescent或放射性核苷酸标记物。

通过检测异常核苷酸的甲基化，尤其是检测在频繁等位缺失区域的CpG岛过度甲基化，本发明也提供一种辨认肿瘤抑制基因的方法。本发明显示正常非甲基化CpG岛的异常甲基化能作“突变”功能，以在肿瘤发展过程中沉默(silence)肿瘤抑制基因转录。17p.13.3过度甲基化的发生似乎与在脑、结肠和肾癌发展中，这些等位基因缺失的时间和发生率相关。本发明已表明该CpG岛包含被异常甲基化沉默的肿瘤抑制HIC-1基因。换句话说，上述CpG岛的辨认构成分离新肿瘤抑制HIC-1基因的一个重要策略。因此，经常出现肿瘤相关的等位基因缺失大致定为候选肿瘤抑制区的染色体区中，找到该异常能有利于反应基因的定位。用于检测异常核酸甲基化的普通方法在本领域中已众所周知，为了实施本发明本领域的技术人员应能相应地应用那些方法之一。

下列实施例意图是说明，而不是限制本发明。虽然这些实施例是典型的可应用的实例，本领域技术人员熟知的其它方法也可选择使用。

                    实施例

HIC-1表达在正常成年组织中是普遍的。可是，在培养肿瘤细胞和表现出与CpG岛过度甲基化相关的原发癌中，HIC-1表达降低或或缺乏。例如，在具有CpG岛过度甲基化的肿瘤包括肺、结肠、乳腺和脑肿瘤中，HIC-1表达缺乏。该表达类型与HIC-1的肿瘤抑制基因功能一致。

                  实施例1

                 材料和方法

1.粘粒DNA的亚克隆

通过在琼脂糖凝胶上分离多种限制性片段和连接这些片段到pBluescript质粒中(Stratagene)，制备粘粒C13A DNA的亚克隆(图1A)。

2.DNA测序

首先质粒DNA在有75μg/ml氨苄青霉素的2×YT肉汤中在存在10⁷-10⁸pfu/ml的VCSM13(Stratagene)(辅助噬菌体)下生长2小时，分离单链DNA。分离后，DNA用GIBCO BRL循环测序试剂盒测序。大体来说，22个碱基对引物末端标记γ-³²p，循环条件是95℃1个循环，接着是95℃10秒和65℃10秒的20个循环。反应产物在10％丙烯酰胺/8M尿素凝胶上分析。

3.DNA和RNA杂交

分离DNA和polyA+RNA的方法，走琼脂糖凝胶的条件，探针的α³²p标记，膜杂交和漂洗条件前已所述(Baylin S.B.等，癌细胞，3：383-390，1991；Jones，P.A.，等，癌症研究，54：1-23，1990；Herman，J.G.等，美国国家科学院院报，印刷中，1994；Ottaviano，Y.L.等，癌症研究，54：2552-2555，1994；Issa，J-P.，等，自然遗传学，印刷中；Steenman，M.J.C.，等，自然遗传学，7：433-439，1994；和Gish，W.等，自然遗传学，3：266-272，1993)。放射自显影照片在-70℃曝光不同时间，或者在磷影像机盒中接着曝光，用磷影像机(phosphoimager)Image Quant程序(分子动力学)分析。用T₃或T₇聚合酶体外转录图1 A所示在不同粘粒亚克隆中的DNA插入片段，完成用于某些RNA杂交的单链、α-³²P标记的RNA探针的制备。

4.RNAse保护分析

从各种粘粒亚克隆(图1A)中制备α-³²p标记的RNA探针，与RNA样本液相杂交和RNAse的杂交后消化，均用Ambion MAXIscript和RPAII试剂盒按厂家的说明操作。大体来说，8×10⁴cpm探针与10μg总RNA在45℃杂交12-15h。RNAse消化的产物在6％丙烯酰胺/8M尿素凝胶中分析。杂交探针的长度由质粒插入DNA的不同限制切口的位置决定。为估计RNA上样量，由HincII限制酶消化制备250bp的GAPDH探针，该探针在全部反应液中与RNA共杂交。

5.外显子陷阱法(trapping)

外显子陷阱法用GIBCO BRL外显子陷阱系统，按每个厂家的方案在亚克隆26(图1A)上进行。

6.细胞培养和组织样本

正常人成纤维细胞系WI-38和IMR-90及结肠癌细胞系，CaCO₂从美国典型培养物保藏中心获得(ATCC，Rockville，MD)。人小细胞肺癌NCI-H209系前已描述(Carney，D.N.，等，癌症研究新近结果，99：157-166，1985)。所有建成的乳腺癌细胞系如图5详示，用于最近的研究中(Herman，J.G.，等，美国国家科学院院报91：9700-9704，1994)，由Nancy Davidson博士惠赠。组成正常供体成纤维细胞系GM229和纤维肉瘤细胞HT1080系的肿瘤进展细胞融合系统，加上其融合产物，SFTH300和SFTH300 TR1，是来自B.Weismann博士的礼物。所有新鲜的，非培养的正常和肿瘤人组织样品按前述方法获得(Herman，J.G.等，同前；Ottaviano，Y.L.，等，同前；Issa，J-P，同前；Steeman，M.J.C.，等，同前；和Gish，W.，等，同前)

                       实施例2

                 新肿瘤抑制基因的鉴定

为表示包围异常甲基化的CpG岛区域的特性，从前已显示在肿瘤中含敏感NotI位点过度甲基化的甲基化簇的17p粘粒C-13A(Ladbetter，D.H.，等，美国国家科学院院报，86：5136，1989；El-Deiry，W.S.，等，自然遗传学，1：45-49，1992；Kern，S.E.，等，科学，252：1708，1991；Funk，W.D.，等，分子和细胞生物学，12：2866，1992)，制备一系列亚克隆(图1A)。用这些作探针进行“游动印迹”“Zoo blots”，找到三个区域(图1A：质粒CI，CII和400)，在严格条件下，这些区域能与牛和鼠DNA中限制性片段杂交。由于这些探针与人DNA和cDNA文库的高非特异杂交，可能由于该区的高GC含量，传统的部位克隆方法受到妨碍。因此，大多数11kb区(图1A)被测序，通过Grail计算机程序(Gish，W.，等，D.J.，自然遗传学，3：266，1993)分析。

图1是显示粘粒C-13A的11.0kb区域的图解，粘粒C-13A含有前已表明在多种肿瘤类型中具有过度甲基化的染色体经17p13.3区的50kb人DNA插入片段(Makos，M.，等，美国国家科学院院报，89：1929，1992；Makos，M.，等，癌症研究，53：2715，1993；Makos，M.，等，癌症研究，53：2719，1993)。显示YN22探针的位置，EcoRI(E)限制性位点和一系列制备跨越该区的粘粒亚克隆的定位。

图1B是发现HIC-1基因包括在图1A所显示的区域中的HIC-1基因的图解，而其氨基酸序列如图2B所示。表示的是：可能的p53结合位点；TATAA＝从转录起点40bp上游的TATA盒序列；5′UTR＝第一个不翻译的外显子；ATG＝多半为5′翻译起点；ZIN(锌指N-端)＝包括锌指转录因子Zin结构域亚家族的高度保守区(图2A)的478bp外显子；具阴影线的长方形表示HIC-1的2015bp最后一个外显子，每一个阴影条表示成簇位于基因3′区的5个锌指(图2B)之一；TAG＝HIC-1基因中翻译终止位点；AATAAA＝从翻译终止位点835bp找到的多腺苷化信号位点。图1C显示HIC-1的核苷酸和推导的氨基酸序列。

二个独立极好的可能编码区显示在N₃-N₇ NotI限制性位点之间(图1A)。冲击波程序(Al+Schul，S.F.，等，分子生物学杂志，215：403，1990)分析显示针对高度保守的称为Zin(锌指N端)结构域的N端基序，在独立区之一中有明显有氨基酸同源性(图1B和2A)，该基序存在于最近定义为锌指转录因子的子集合的每一成员中Harrison和Travers，EMBO J9：207，1990；di Bello，等，遗传学，129：385，1991；Numoto等，核苷酸研究：21：3767，1993；Chardin，等，核酸研究19：1431，1991)。除了Zin结构域，这些相同蛋白3′区特征性的5个Kruppel型Cys₂-His₂锌指(Ruppert，J.M.，等，分子和细胞生物学，8：3104-3113，1988)也被辨认(图1B和2B)。该新基因命名为HIC-1(在癌症中过度甲基化)。

                        实施例3

                     HIC-1的特征

RNAse保护策略，外显子陷阱法和研究和RNA印迹分析的结合用于HIC-1表达特征的描述，确定该基因的基因组结构(图1B和1C；SEQID NO：1和2)转录起点确定在位于第一个非翻译外显子之前的TATA盒序列(图1B)的40bp下游之中。假定性的ATG位点和Zin结构域位于476bp的第二个外显子中，与8种其它Zin结构域蛋白结构相比处相似的位置(图2A)。5个锌指(图1B和2B)位于2015bp最后外显子中、含有从多腺苷化信号，AATAAA，835bp上游的翻译终止位点。结构与其它Zin结构域蛋白相似的HIC-1基因(图1C和2B)，被介于NotI位点N₃和N₇之间位于富CpG3.0kb区中的三个外显子所包括(图1)。

图2A和SEQ ID NO：2显示HIC-1的氨基酸序列。HIC-1氨基酸序列与Zin结构域锌指家族其它成员的保守N端区比较。在圆括号中，数字表示相对于每一基因的翻译起始位点的保守区位置。最黑的阴影表示9个蛋白中至少5个相同的氨基酸位置，较浅的阴影表示在家族成员之间保守性氨基酸差异的位置。D＝果蝇；M＝鼠；H＝人。在底部氨基酸的括号代表在其它家族成员该位置未找到的在HIC-1中的一个区域。

图2B和SEQ ID NO：3显示HIC-1基因的整个编码区。显示了HIC-1的二个编码外显子的推导氨基酸序列，由概括在本文中的序列分析和表达策略确定。在3′半个蛋白中的5个锌指由阴影盒显示。

                         实施例4

                    HIC-1基因表达的分析

发现HIC-1是普遍性表达的基因。通过来自多种正常组织的polyA⁺RNA的RNA分析，从HIC-1 Zin结构域、锌指区和包括多腺苷化位点的3′非翻译区的探测，都识别相同的占优势的3.0kb转录本。图3显示HIC-1基因表达的RNA分析。S＝脾；The＝胸腺；P＝前列腺；Te＝睾丸；O＝卵巢；SI＝小肠；B＝外周血细胞。4.4kb标记以上的带和核糖体RNA共杂交。约1.1kb带仍然未被确认，但可能是一种替代性的剪接产物，因为用来自HIC-1的锌指或3′非翻译区的探针没有检出该带。

图4A显示在各种正常和肿瘤的人组织中HIC-1基因表达的RNAse保护分析。在全部试验组中，顶部星号标记未消化的360bp HIC-1基因RNA探针的位置，该探针衍生自粘粒亚克隆600中含锌指的区域(图1A)。被保护的HIC-1片段(300bp)标记为HIC-1。图4A用10μg总RNA比较下列细胞的表达，来自2个建成的正常人成纤维细胞培养系(WI-38和IMR-90)与纤维肉瘤细胞HT1080培养系(Fibro-C)相比，来自3个不同的正常结肠样品(结肠-N)与结肠癌细胞系CaCO₂(结肠-C)相比，来自正常肺样品(肺-N)与人小细胞肺癌建成系，NCI-H209(肺-C)相比。

图4B显示来自6种不同建成的乳腺癌培养系(1道MDA231；2道HS58T；3道MDA 468；4道T47D；5道MCF7；6道MDA453)的10μg RNA的RNAse保护分析，其中每道普遍有HIC-1 CpG岛NotI位点的甲基化。图4C显示来自正常胎儿脑(B)与一组非培养脑瘤(1种退行性星形细胞瘤(AA)和8种更晚期的成胶质细胞瘤(1-8道)的10μg RNA的RNAse保护分析。

在所有检验的成年组织中，发现3.0kb转录本特别高水平的组织是肺、结肠、前列腺、胸腺、睾丸和卵巢(图3)。用Zin结构域探针，1.1kb的转录本也可在存在替代性剪接产物的一些组织中检出(图3)。用来自质粒600的探针(图1A)的RNase保护分析(RPAZ kit-Ambion)证实了HIC-1的普遍表达，保护在培养的成纤维细胞(图4A)和非培养的结肠粘膜(图4A)、肺(图4A)、和脑(图4C)中预期大小的转录本。

通过RNAse保护分析，发现HIC-1表达在具有异常的HIC-1 CpG岛甲基化的肿瘤细胞中缺乏或降低，在结肠、肺和成纤维细胞培养癌细胞系中，前面均已显示在NotI位点3-7完全甲基化，很少或没有表达(图4A)被检测到。相同的发现在6种培养的乳腺癌中是真实的(图4B)，所有细胞显示NotI位点3-7的过度甲基化。

此外，在原发结肠肿瘤中，与相应的正常结肠比较，HIC-1表达在一种非培养人结肠息肉和3种原发结肠肿瘤中降低了2～17倍。最后，在原发非培养脑瘤中发现的HIC-1表达缺乏是在显示CpG岛过度甲基化的肿瘤中。与正常脑相比较，一例显示HIC-1 CpG岛完全甲基化型的退行性星形细胞瘤不表达该基因(图4C)。在4例可得到的DNA和RNA的成胶质细胞瘤中，2例弱表达HIC-1(图4C，1道)或根本不表达(图4C，4道)，有明显的过度甲基化等位基因，而有非甲基化等位基因的2例表达基因的量水平与附近正常脑相等(图4C，2和3道)。

对4例另外的得到其RNA的成胶质细胞瘤也进行了研究。1例弱表达HIC-1(图4C，5道)，1例没有表达(图4C，6道)及二例肿瘤表达了该基因(图4C，7-8道)。

另外，通过如下DNA分析，HIC-1过度甲基化在几种原发肿瘤和培养细胞系中进行了分析。来自对照和24小时感染细胞用EcoRI(12U/μg DNA)加NotI(20U/μg)消化的DNA的DNA分析，正确按以前研究的详细方法(Makos等，同前，1992，1993)用α-³²P标记的YNZ22(图1A)探测。膜在磷影像机上(Molecular Dynamic)成像。表1显示的结果表示在包括脑、结肠、肾、造血组织和前列腺癌和肿瘤的不同起源的多种肿瘤和细胞系中，发现HIC-1处过度甲基化状态。肿瘤和细胞系中发现HIC-1处过度甲基化状态。

                      表1

            HIC-1在肿瘤和细胞系中过度甲基化

        原发肿瘤                  培养细胞系脑瘤

          #    甲基 ％                     #    甲基  ％低级星形细胞瘤          7    7    100退形性星形细胞瘤        5    4    80多形成胶质                   神经胶质细胞瘤        8    6    75                     2    2    100

           #    甲基  ％          #    甲基    ％成神经管细胞瘤           5    4     80结肠癌息肉          6    6     100癌           8    7     90    癌    6     7      85肺癌癌           5    0     0     癌    16    12     75肾癌早期         8    4     50晚期         3    2     67    晚期  21    16     80白血病淋巴瘤        3    1     33    淋巴瘤8     5      60CML/未成熟     8    7     87AML            13   10    80AML            10   8     80乳腺癌癌           24   15    62    癌    6     6      100前列腺癌癌           17   17    100   癌    5     4      80子宫内膜癌癌           6    4     67成神经细胞瘤早/晚期       12   2     16    癌    44    100(甲基化量低)

                   实施例5

            p53和HIC-1表达的相互作用

与存在于17p13.3位的抑制基因可能和p53相互作用的假说相一致，本发明确认在HIC-1基因中5′TATA盒的4kb位有一可能的p53结合位点(图1B)。因此，HIC-1基因的p53反应用结肠癌细胞系(SW480)测试，在该细胞系中p53反应基因，WAF-1，前已表明被野生型p53的表达所诱导(EL-Deiry，等，细胞，75：817-825，1993)。该细胞系含一条17p染色体、一个突变的p53等位基因和完全甲基化的HIC-1 CpG岛。此外，细胞系SW480被外原表达的野生型p53基因严重地生长抑制(Baker，S.J.等，科学，249：912-915，1990)。

图5显示含β-半乳糖苷酶基因或野生型p53基因转染进人结肠癌细胞SW480系后，如图4详示的RNAse保护分析。(未感染的正常对照人成纤维细胞(F)，未感染的SW480细胞(U)，用β-半乳糖苷酶基因感染的SW480细胞(GAL)和用p53基因感染的SW480细胞(p53))。非消化的HIC-1和GAPDH探针的位置及HIC-1和GAPDH转录本的位置如图4准确地标出。

在该细胞系中HIC-1仅低水平表达(图5A-U)。当野生型p53基因外源性地在SW480细胞中表达时，与对照细胞相比(U和GAL)，HIC-1的表达水平上调20倍(图5-p53)。这些结果表明肿瘤抑制基因p53直接或间接地活化HIC-1的表达。我们正在工作以证实该型作用。

                  实施例概述

HIC-1在正常和肿瘤细胞中起重要作用。迄今为止至少4个其它基因被确认为p53可能的下游靶物，包括WAF1(EL-Oeiry，W.S.等，同前)，MDM2(Chen C.Y.等，美国国家科学院院报，91：2684-2688，1994)，GADD45(Kastan，M.B.等，细胞，71：587-597，1992)和BAX(Miyashita T.等，癌基因，9：1799-1805，1994)。参考Zin结构域家族其它成员的结构和特点、HIC-1可能起转录因子的作用。二个果蝇成员tram-track和广泛复合体(broad complex)，是帮助调节体节发育的转录抑制子(Harrion和Travers，EMBO J.9：207，1990；di Bello，等，遗传学，129：385，1991)。第三个果蝇蛋白GAGA似乎通过有力地阻断妨碍启动子区转录活化的核小体结构的形成(Tsukiyama，T，等，自然，367：525-532，1994)。鼠Zin结构域基因MZF5具有对c-myc和胸苷激酶启动子的体外转录抑制活性(Numoto，等，核酸研究，21：3767，1993)。最后，4个其它的人zin结构域蛋白的二个被发现为在人肿瘤中转移的组分(Chardin等，核酸研究，19：1431，1991；Hromas，等，生物化学杂志，266：14183，1991；Chen，等，EMBO J.12：1161，1993)。其次，有必要确定p53和HIC-1启动子之间的精确相互作用。

总之，本发明确认了在17p13.3位的一个新基因HIC-1，对HIC-1而言，表达类型、结构基序、染色体定位和p53反应性显示其在肿瘤发生中有重要的功能。涉及HIC-1的精确p53通路的确认将阐明该基因在正常和肿瘤细胞中的作用。最后，结果提示在肿瘤DNA中，和等位缺失区有关的过度甲基化CpG岛的确认能有利于候选的肿瘤抑制基因的定位和克隆，以及对特别的治疗方案有抗性的复发异常生长或细胞作标志作用。

前述内容意指解释而不是限制本发明的范围。确实，本领域的一般技术人员根据在此介绍的方法，不用过多的实验就能容易地预想和产生更多的实施方案。

                      序列表(1)一般信息：

(i)  申请者：约翰霍普金斯大学医学院

(ii)发明题目：新的肿瘤抑制基因，HIC-1

(iii)序列数：3

(iv)通讯地址：

    (A)地址：Fish&Richardson，P.C.

    (B)街道：4225 Executive Square，Suite1400

    (C)城市：La Jolla

    (D)州：加利福尼亚

    (E)国家：美国

    (F)邮区：92037

(v)计算机可读形式：

    (A)介质类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25

(vi)目前申请资料：

    (A)申请号：PCT/US95/

    (B)提交日期：15-11-1995

    (C)分类号：

(viii)委托人/代理人信息：

    (A)姓名：Haile，Ph.D.，Lisa A.

    (B)登记号：38，347

    (C)参考/备案号：07265/039W01

(ix)电讯信息：

    (A)电话：(619)678-5070

    (B)电传：(619)678-5099(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：4616碱基对

  (B)类型：核苷酸

  (C)链型：单

  (D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(vii)直接来源

    (B)克隆：HIC-1多核苷酸

(ix)特点：

    (A)名称/关键词：CDS

    (B)定位：1...4616

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：CCCGGCCCGC   CGGGACCGCA   GGTAACGGGC   CGCGGGGCCC   CGCGGGCCAG   GAGGGGAACG               60GGGTCGGGCG   GGCGAGCAGC   GGGCAGGGGA   GCTCAGGGCT   CGGCTCCGGG   CTCTGCCGCC              120GGATTTGGGG   GCCGCGAGGA   AGAGCTGCGA   GCCGAGGGCC   TGGGGCCGGC   GCACTCCTCC              180CGCCCTGTCT   GCAGTTGGAA   AACTTTTCCC   CAAGTTTGGG   GCGGCGGAGT   TCCGGGGGAG              240AAGGGGCCGG   GGGAGCCGCG   GAGGGAGGCG   CCGGGCCCGC   GCGTGTAGGG   CCCAGGCCGA              300GGCCGGGACG   CGGGTGGGGC   GCAGGCCCGG   GTCAGGGCCG   CAGCCGGCTG   TGCGCCGTGC              360CCGCCCGGGG   CGCTGCCCCC   TCCCTCCCCT   GGGAGCTGCG   TGGCTCCCCC   CTCCCCCCCA              420CCTGCTTCCT   GCCTCAGCCT   CCTGCCCCGA   TATAACGCCC   TCCCCGCGCC   GGGCCCGGCC              480TTCGCGCTCT   GCCCGCCACG   GCAGCCGCTG   CCTCCGCTCC   CCGCGCGGCC   GCCGCCCGGG              540CCCCGACCGA   GGGTTGACAG   CCCCCGGCCA   GGGCGGCGCC   AGGGCGGGCA   CCGCGCTCCC              600CTCCTCCGTA   TCACTTCCCC   CAACTGGGGC   AACTTCTCCC   GAGGCGGGAG   GCGCTGGTTC              660CTCGGCTCCC   TTTCTCCCTA   CTTGGGTAAA   GTTCTCCGCC   CTGAATGACT   TTTCCTGAAG              720CGGACATTTT   ACTTAAATCG   GGTAACTGTC   TCCAAAAGGG   TCACTGCGCC   TGAACAGTTT              780TCTTCTCGGA   AGCCCCAGCA   CCCAGCCAGG   TGCCCTGGGG   CGTGCAGGCC   GCCCTGGCCT              840CCCCTCCACC   GGCGGCCGCT   CACCTCCTGC   TCCTTCTCCT   GGTCCGGGCG   GGCCGGCCTG              900GGCTCCCACT   CCAGAGGGCA   GCTGGTCCTT   CGCCGGTGCC   CAGGCCGCAG   GGCTGATGCC              960CCCGCTCAGC   TGAGGGAAGG   GGAAGTGGAG   GGGAGAAGTG   CCGGGCTGGG   GCCAGGCGGC             1020CAGGGCGCCG   CACGGCTCTC   ACCCGGCCGG   TGTGTGTCCC   CGCAGGAGAG   TGTGCTGGGC             1080AGACGATGCT GGACACGATG GAGGCGCCCG GCCACTCCAG GCAGCTGCTG CTGCAGCTCA      1140ACAACCAGCG CACCAAGGGC TTCTTGTGCG ACGTGATCAT CGTGGTGCAG AACGCCCTCT      1200TCCGCGCGCA CAAGAACGTG CTGGCGGCCA GCAGCGCCTA CCTCAAGTCC CTGGTGGTGC      1260ATGACAACCT GCTCAACCTG GACCATGACA TGGTGAGCCC GGCCGTGTTC CGCCTGGTGC      1320TGGACTTCAT CTACACCGGC CGCCTGGCTG ACGGCGCAGA GGCGGCTGCG GCCGCGGCCG      1380TGGCCCCGGG GGCTGAGCCG AGCCTGGGCG CCGTGCTGGC CGCCGCCAGC TACCTGCAGA      1440TCCCCGACCT CGTGGCGCTG TGCAAGAAAC GCCTCAAGCG CCACGGCAAG TACTGCCACC      1500TGCGGGGCGG CGGCGGCGGC GGCGGCGGCT ACGCGCCCTA TGGTCGGCCG GGCCGGGGCC      1560TGCGGGCCGC CACGCCGTCA TCCAGGCCTG CTACCCGTCC CCAGTCGGGC CTCCGCCGCC      1620GCCTGCCGCG GAGCCGCCCT CGGGCCCAGA GGCCGCGGTC AACACGCACT GCGCCGAGCT      1680GTACGCGTCG GGACCCGGCC CGGCCGCCGC ACTCTGTGCC TCGGAGCGCC GCTGCTCCCC      1740TCTTTGTGGC CTGGACCTGT CCAAGAAGAG CCCGCCGGGC TCCGCGGCGC CAGAGCGGCC      1800GCTGGCTGAG CGCGAGCTGC CCCCGCGCCC GGACAGCCCT CCCAGCGCCG GCCCCGCCGC      1860CTACAAGGAG CCGCCTCTCG CCCTGCCGTC GCTGCCGCCG CTGCCCTTCC AGAAGCTGGA      1920GGAGGCCGCA CCGCCTTCCG ACCCATTTCG CGGCGGCAGC GGCAGCCCGG GACCCGAGCC      1980CCCCGGCCGC CCCAACGGGC CTAGTCTCCT CTATCGCTGG ATGAAGCACG AGCCGGGCCT      2040GGGTAGCTAT GGCGACGAGC TGGGCCGGGA GCGCGGCTCC CCCAGCGAGC GCTGCGAAGA      2100GCGTGGTGGG GACGCGGCCG TCTCGCCCGG GGGGCCCCCG CTCGGCCTGG CGCCGCCGCC      2160GCGCTACCCT GGCAGCCTGG ACGGGCCCGG CGCGGGCGGC GACGGCGACG ACTACAAGAG      2220CAGCAGCGAG GAGACCGGTA GCAGCGAGGA CCCCAGCACC GCCTGGCGGC CACCTCGAGG      2280GCTACCCATG CCCGCACCTG GCCTATGGCG AGCCCGAGAG CTTCGGTGAC AACCTGTACG      2340TGTGCATTCC GTGCGGCAAG GGCTTCCCCA GCTCTGAGCA GCTGAACGCG CACGTGGAGG      2400CTCACGTGGA GGAGGAGGAA GCGCTGTACG GCAGGGCCGA GGCGGCCGAA GTGGCCGCTG      2460GGGCCGCCGG CCTAGGGCCC CCTTTTGGAG GCGGCGGGGA CAAGGTCGCC GGGGCTCCGG      2520GTGGCCTGGG AGAGCTGCTG CGGCCCTACC GCTGCGGCTC GTGCGACAAG AGCTACAAGG            2580ACCCGGCCAC GCTGCGGCAG CACGAGAAGA CGCACTGGCT GACCCGGCCC TACCCATGCA            2640CCATCTGCGG GAAGAAGTTC ACGCAGCGTG GGACCATGAC GCGCCACATG CGCAGCCACC            2700TGGGCCTCAA GCCCTTCGCG TGCGACGCGT GCGGCATGCG GTTCACGCGC CAGTACCGCC            2760TCACCCGGAC GCACATGCGC ATCCACCCTC GCGGCGAGAA GCCCTACGAG TGCCAGGTGT            2820GCGGCGGCAA GTTCGCACAG CAACGCAACC TCATCAGCCA CATGAAGATG CACGCCGTGG            2880GGGGCGCGGC GGCGCGGCCG GGGCGCTGGC GGGCTTGGGG GGGCTCCCCG GCGTCCCCGG            2940CCCCGACGGC AAGGGCAAGC TCGACTTCCC CGAGGGCGTC TTTGCTGTGG CTCGCTCACG            3000GCCGAGCAGC TGAGCCTGAA GCAGCAGGAC AAGGCGGCCG CGACCGAGCT GCTGGCGCAG            3060ACCACGCACT TCCTGCACGA CCCCAAGGTG GCGCTGGAGA GCCTCTACCC GCTGGCCAAG            3120TTCACGGCCG AGCTGGGCCT CAGCCCCGAC AAGGCGGCCG AGGTGCTGAG CCAGGGCGCT            3180CACCTGGCGG CCGGGCCCGA CGGCGGACCA TCGACCGTTT CTCTCCCACC TAGAGCGCCC            3240CTCGCCAGCC CGCTCTGTCG CTGCTGCGCG GCCCTGGCCC GCACCCCAGG GAGCGGCGGG            3300GGCGGCGCGC AGGGCCCACT GTGCCCGGGA CAACCGCAGC GTCGCCACAG TGGCGGCTCC            3360ACCTCTCGGC GGCCTCACCT GGCCTCACTG CTTCGTGCCT TAGCTCGGGG GTCGGGGGAG            3420AACCCCGGGA CGGGGTGGGA TGGGGTAAGG GAAATTTATA TTTTTGATAT CAGCTTTGAC            3480CAAAGGAGAC CCCAGGCCCC TCCCGCCTCT TCCTGTGGTT CGTCGGCCCC CTCCCCCGGC            3540TCCGCGCTGC TCTTAGAGGG GGAGGGGTGT CACTGTCGGG GCACTCCTAG CCCTACCTCC            3600GGCCCTTGCG ACCACACCCA TTCTCACTGT GAATCTCCCC GCTGGGTCGG AGCGTCGGGC            3660AGAGTTGGGG AGTGGGGAGG GGACTGAGCC GGCCGGAGGC CCCCGCACCC CCGCTCCCAC            3720CCACCCCGGG ACTGATAATG TGAAGTTCCT CATTTTGCAC AAGTGGCACT AGCCCAGGGC            3780CAACCCTTCC TTCCTCAGTC ACCAAGGGCG GGGAGTTCTG GAGTCGGAAG GCGAAGAGCC            3840TACCACCAGG TCTCCCACTC CCGCGGTGCC CTCCCTTCCC TTCCCTGCGG CCCCGGACCA            3900TATTTATTGC ATGCGCCCCG GCGGCCCCCC ATCCCGAGCC CAGGCTGGGC TGGGCTGGAA            3960CGCGGTCTCT TTAGCTCCCT CCTCTTCGTT TGTATATTTC CTACCTTGTA CACAGCTCTT    4020CCAGAGCCGC TTCCATTTTC TATACTCGAA CCAAACAGCA ATAAAGCAGT AACCAAGGAC    4080CCCGACCCCG CTGCTCTCTT CTGCCCCTGC ACAAGGACCT GGATGCTGCG CCCGCTGGGT    4140GGAGGAGCCA GAAAGGGCCA CCCTCACACA GGTGCAGAGG CTTGGACCTG CCTCCCTCCC    4200CAGTCCCAGA AACAGATCAG CAAGAGGTCA GGTATGTTTC ATAACTAAAA ATTTATTAAG    4260GAAACAAAAC CAGTGCTGCA AACGGGACAG AAAGGAGAGC TGGGTCTCCC TCCCGACCAC    4320CCAGTCATCG GCCTTCCAGC TGGGGAGAGA ATCTTAAAGG AGAGGCCGGG GACCCTGTAC    4380TCCAAAGAGC CCAGTCTTCT GAGACTCTAG GGGACTCCTA CCCCCAAACT ACTGGCCTTG    4440GCTCCCCTAC ACGGTACCCC ATCGCTTCTG GCATAGTCCT GGGCCTCAGG GAGGGCAGAG    4500CTGCGCACCC ATCCTCCAGG CAGGCTGTGC AGTCAGGCCA TGGGCTCTGG GGTATCCCCC    4560ACTGGTCCCA TTAAGATTTG CCCCTGGCTC CACCGAAAAC CCCGTCTTCC CCTAAG        4616(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：4112碱基对

  (B)类型：核苷酸

  (C)链型：单

  (D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(vii)直接来源

  (B)克隆：HIC-1编码多核苷酸

(ix)特点：

  (A)名称/关键词：CDS

  (B)定位：1086…2726

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：CCCGGCCCGC CGGGACCGCA GGTAACGGGC CGCGGGGCCC CGCGGGCCAG GAGGGGAACG       60GGGTCGGGCG GGCGAGCAGC GGGCAGGGGA GCTCAGGGCT CGGCTCCGGG CTCTGCCGCC      120GGATTTGGGG GCCGCGAGGA AGAGCTGCGA GCCGAGGGCC TGGGGCCGGC GCACTCCTCC      180CGCCCTGTCT GCAGTTGGAA AACTTTTCCC CAAGTTTGGG GCGGCGGAGT TCCGGGGGAG      240AAGGGGCCGG GGGAGCCGCG GAGGGAGGCG CCGGGCCCGC GCGTGTAGGG CCCAGGCCGA       300GGCCGGGACG CGGGTGGGGC GCAGGCCCGG GTCAGGGCCG CAGCCGGCTG TGCGCCGTGC       360CCGCCCGGGG CGCTGCCCCC TCCCTCCCCT GGGAGCTGCG TGGCTCCCCC CTCCCCCCCA       420CCTGCTTCCT GCCTCAGCCT CCTGCCCCGA TATAACGCCC TCCCCGCGCC GGGCCCGGCC       480TTCGCGCTCT GCCCGCCACG GCAGCCGCTG CCTCCGCTCC CCGCGCGGCC GCCGCCCGGG       540CCCCGACCGA GGGTTGACAG CCCCCGGCCA GGGCGGCGCC AGGGCGGGCA CCGCGCTCCC       600CTCCTCCGTA TCACTTCCCC CAACTGGGGC AACTTCTCCC GAGGCGGGAG GCGCTGGTTC       660CTCGGCTCCC TTTCTCCCTA CTTGGGTAAA GTTCTCCGCC CTGAATGACT TTTCCTGAAG       720CGGACATTTT ACTTAAATCG GGTAACTGTC TCCAAAAGGG TCACTGCGCC TGAACAGTTT       780TCTTCTCGGA AGCCCCAGCA CCCAGCCAGG TGCCCTGGGG CGTGCAGGCC GCCCTGGCCT       840CCCCTCCACC GGCGGCCGCT CACCTCCTGC TCCTTCTCCT GGTCCGGGCG GGCCGGCCTG       900GGCTCCCACT CCAGAGGGCA GCTGGTCCTT CGCCGGTGCC CAGGCCGCAG GGCTGATGCC       960CCCGCTCAGC TGAGGGAAGG GGAAGTGGAG GGGAGAAGTG CCGGGCTGGG GCCAGGCGGC      1020CAGGGCGCCG CACGGCTCTC ACCCGGCCGG TGTGTGTCCC CGCAGGAGAG TGTGCTGGGC      1080AGACG ATG CTG GAC ACG ATG GAG GCG CCC GGC CAC TCC AGG CAG CTG          1127

  Met Leu Asp Thr Met Glu Ala Pro Gly His Ser Arg Gln Leu

    1               5                  10CTG CTG CAG CTC AAC AAC CAG CGC ACC AAG GGC TTC TTG TGC GAC GTG        1175Leu Leu Gln Leu Asn Asn Gln Arg Thr Lys Gly Phe Leu Cys Asp Val15                  20                  25                  30ATC ATC GTG GTG CAG AAC GCC CTC TTC CGC GCG CAC AAG AAC GTG CTG        1223Ile Ile Val Val Gln Asn Ala Leu Phe Arg Ala His Lys Asn Val Leu

             35                  40                  45GCG GCC AGC AGC GCC TAC CTC AAG TCC CTG GTG GTG CAT GAC AAC CTG        1271Ala Ala Ser Ser Ala Tyr Leu Lys Ser Leu Val Val His Asp Asn Leu

         50                  55                  60CTC AAC CTG GAC CAT GAC ATG GTG AGC CCG GCC GTG TTC CGC CTG GTG        1319Leu Asn Leu Asp His Asp Met Val Ser Pro Ala Val Phe Arg Leu Val

     65                  70                  75CTG GAC TTC ATC TAC ACC GGC CGC CTG GCT GAC GGC GCA GAG GCG GCT       1367Leu Asp Phe Ile Tyr Thr Gly Arg Leu Ala Asp Gly Ala Glu Ala Ala

 80                  85                  90GCG GCC GCG GCC GTG GCC CCG GGG GCT GAG CCG AGC CTG GGC GCC GTG       1415Ala Ala Ala Ala Val Ala Pro Gly Ala Glu Pro Ser Leu Gly Ala Val95                 100                 105                 110CTG GCC GCC GCC AGC TAC CTG CAG ATC CCC GAC CTC GTG GCG CTG TGC       1463Leu Ala Ala Ala Ser Tyr Leu Gln Ila Pro Asp Leu Val Ala Leu Cys

            115                 120                 125AAG AAA CGC CTC AAG CGC CAC GGC AAG TAC TGC CAC CTG CGG GGC GGC       1511Lys Lys Arg Leu Lys Arg His Gly Lys Tyr Cys His Leu Arg Gly Gly

        130                 135                 140GGC GGC GGC GGC GGC GGC TAC GCG CCC TAT GCT ATG GCG ACG AGC TGG       1559Gly Gly Gly Gly Gly Gly Tyr Ala Pro Tyr Ala Met Ala Thr Ser Trp

    145                 150                 155GCC GGG AGC GCG GCT CCC CCA GCG AGC GCT GCG AAG AGC GTG GTG GGG       1607Ala Gly Ser Ala Ala Pro Pro Ala Ser Ala Ala Lys Ser Val Val Gly

160                 165                 170ACG CGG CCG TCT CGC CCG GGG GGC CCC CGC TCG GCC TGG CGC CGC CGC       1655Thr Arg Pro Ser Arg Pro Gly Gly Pro Arg Ser Ala Trp Arg Arg Arg175                 180                 185                 190CGC GCT ACC CTG GCA GCC TGG ACG GGC CCG GCG CGG GCG GCG ACG GCG       1703Arg Ala Thr Leu Ala Ala Trp Thr Gly Pro Ala Arg Ala Ala Thr Ala

            195                 200                 205ACG ACT ACA AGA GCA GCA GCG AGG AGA CCG GTA GCA GCG AGG ACC CCA       1751Thr Thr Thr Arg Ala Ala Ala Arg Arg Pro Val Ala Ala Arg Thr Pro

        210                 215                 220GCA CCG CCT GGC GGC CAC CTC GAG GGC TAC CCA TGC CCG CAC CTG GCC       1799Ala Pro Pro Gly Gly His Leu Glu Gly Tyr Pro Cys Pro His Leu Ala

    225                 230                 235TAT GGC GAG CCC GAG AGC TTC GGT GAC AAC CTG TAC GTG TGC ATT CCG       1847Tyr Gly Glu Pro Glu Ser Phe Gly Asp Asn Leu Tyr Val Cys Ile Pro

240                 245                 250TGC GGC AAG GGC TTC CCC AGC TCT GAG CAG CTG AAC GCG CAC GTG GAG       1895Cys Gly Lys Gly Phe Pro Ser Ser Glu Gln Leu Asn Ala His Val Glu255                 260                 265                 270GCT CAC GTG GAG GAG GAG GAA GCG CTG TAC GGC AGG GCC GAG GCG GCC       1943Ala His Val Glu Glu Glu Glu Ala Leu Tyr Gly Arg Ala Glu Ala Ala

            275                 280                 285GAA GTG GCC GCT GGG GCC GCC GGC CTA GGG CCC CCT TTT GGA GGC GGC       1991Glu Val Ala Ala Gly Ala Ala Gly Leu Gly Pro Pro Phe Gly Gly Gly

        290                 295                 300GGG GAC AAG GTC GCC GGG GCT CCG GGT GGC CTG GGA GAG CTG CTG CGG       2039Gly Asp Lys Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Leu Gly Glu Leu Leu Arg

    305                 310                 315CCC TAC CGC TGC GGC TCG TGC GAC AAG AGC TAC AAG GAC CCG GCC ACG       2087Pro Tyr Arg Cys Gly Ser Cys Asp Lys Ser Tyr Lys Asp Pro Ala Thr

320                 325                 330CTG CGG CAG CAC GAG AAG ACG CAC TGG CTG ACC CGG CCC TAC CCA TGC       2135Leu Arg Gln His Glu Lys Thr His Trp Leu Thr Arg Pro Tyr Pro Cys335                 340                 345                 350ACC ATC TGC GGG AAG AAG TTC ACG CAG CGT GGG ACC ATG ACG CGC CAC       2183Thr Ile Cys Gly Lys Lys Phe Thr Gln Arg Gly Thr Met Thr Arg His

            355                 360                 365ATG CGC AGC CAC CTG GGC CTC AAG CCC TTC GCG TGC GAC GCG TGC GGC       2231Met Arg Ser His Leu Gly Leu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ala Cys Gly

        370                 375                 380ATG CGG TTC ACG CGC CAG TAC CGC CTC ACC CGG ACG CAC ATG CGC ATC       2279Met Arg Phe Thr Arg Gln Tyr Arg Leu Thr Arg Thr His Met Arg Ile

    385                 390                 395CAC CCT CGC GGC GAG AAG CCC TAC GAG TGC CAG GTG TGC GGC GGC AAG       2327His Pro Arg Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Gln Val Cys Gly Gly Lys

400                 405                 410TTC GCA CAG CAA CGC AAC CTC ATC AGC CAC ATG AAG ATG CAC GCC GTG       2375Phe Ala Gln Gln Arg Asn Leu Ile Ser His Met Lys Met His Ala Val415                 420                 425                 430GGG GGC GCG GCG GCG CGG CCG GGG CGC TGG CGG GCT TGG GGG GGC TCC       2423Gly Gly Ala Ala Ala Arg Pro Gly Arg Trp Arg Ala Trp Gly Gly Ser

            435                 440                 445CCG GCG TCC CCG GCC CCG ACG GCA AGG GCA AGC TCG ACT TCC CCG AGG       2471Pro Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Arg Ala Ser Ser Thr Ser Pro Arg

        450                 455                 460GCG TCT TTG CTG TGG CTC GCT CAC GGC CGA GCA GCT GAG CCT GAA GCA       2519Ala Ser Leu Leu Trp Leu Ala His Gly Arg Ala Ala Glu Pro Glu Ala

    465                 470                 475GCA GGA CAA GGC GGC CGC GAC CGA GCT GCT GGC GCA GAC CAC GCA CTT       2567Ala Gly Gln Gly Gly Arg Asp Arg Ala Ala Gly Ala Asp His Ala Leu

480                 485                 490CCT GCA CGA CCC CAA GGT GGC GCT GGA GAG CCT CTA CCC GCT GGC CAA       2615Pro Ala Arg Pro Gln Gly Gly Ala Gly Glu Pro Leu Pro Ala Gly Gln495                 500                 505                 510GTT CAC GGC CGA GCT GGG CCT CAG CCC CGA CAA GGC GGC CGA GGT GCT       2663Val His Gly Arg Ala Gly Pro Gln Pro Arg Gln Gly Gly Arg Gly Ala

            515                 520                 525GAG CCA GGG CGC TCA CCT GGC GGC CGG GCC CGA CGG CGG ACC ATC GAC       2711Glu Pro Gly Arg Ser Pro Gly Gly Arg Ala Arg Arg Arg Thr Ile Asp

        530                 535                 540CGT TTC TCT CCC ACC TAGAGCGCCC CTCGCCAGCC CGCTCTGTCG CTGCTGCGCG       2766Arg Phe Ser Pro Thr

    545GCCCTGGCCC GCACCCCAGG GAGCGGCGGG GGCGGCGCGC AGGGCCCACT GTGCCCGGGA     2826CAACCGCAGC GTCGCCACAG TGGCGGCTCC ACCTCTCGGC GGCCTCACCT GGCCTCACTG     2886CTTCGTGCCT TAGCTCGGGG GTCGGGGGAG AACCCCGGGA CGGGGTGGGA TGGGGTAAGG     2946GAAATTTATA TTTTTGATAT CAGCTTTGAC CAAAGGAGAC CCCAGGCCCC TCCCGCCTCT     3006TCCTGTGGTT CGTCGGCCCC CTCCCCCGGC TCCGCGCTGC TCTTAGAGGG GGAGGGGTGT     3066CACTGTCGGG GCACTCCTAG CCCTACCTCC GGCCCTTGCG ACCACACCCA TTCTCACTGT     3126GAATCTCCCC GCTGGGTCGG AGCGTCGGGC AGAGTTGGGG AGTGGGGAGG GGACTGAGCC     3186GGCCGGAGGC CCCCGCACCC CCGCTCCCAC CCACCCCGGG ACTGATAATG TGAAGTTCCT     3246CATTTTGCAC AAGTGGCACT AGCCCAGGGC CAACCCTTCC TTCCTCAGTC ACCAAGGGCG     3306GGGAGTTCTG GAGTCGGAAG GCGAAGAGCC TACCACCAGG TCTCCCACTC CCGCGGTGCC     3366CTCCCTTCCC TTCCCTGCGG CCCCGGACCA TATTTATTGC ATGCGCCCCG GCGGCCCCCC     3426ATCCCGAGCC CAGGCTGGGC TGGGCTGGAA CGCGGTCTCT TTAGCTCCCT CCTCTTCGTT     3486TGTATATTTC CTACCTTGTA CACAGCTCTT CCAGAGCCGC TTCCATTTTC TATACTCGAA     3546CCAAACAGCA ATAAAGCAGT AACCAAGGAC CCCGACCCCG CTGCTCTCTT CTGCCCCTGC     3606ACAAGGACCT GGATGCTGCG CCCGCTGGGT GGAGGAGCCA GAAAGGGCCA CCCTCACACA     3666GGTGCAGAGG CTTGGACCTG CCTCCCTCCC CAGTCCCAGA AACAGATCAG CAAGAGGTCA     3726GGTATGTTTC ATAACTAAAA ATTTATTAAG GAAACAAAAC CAGTGCTGCA AACGGGACAG     3786AAAGGAGAGC TGGGTCTCCC TCCCGACCAC CCAGTCATCG GCCTTCCAGC TGGGGAGAGA     3846ATCTTAAAGG AGAGGCCGGG GACCCTGTAC TCCAAAGAGC CCAGTCTTCT GAGACTCTAG     3906GGGACTCCTA CCCCCAAACT ACTGGCCTTG GCTCCCCTAC ACGGTACCCC ATCGCTTCTG     3966GCATAGTCCT GGGCCTCAGG GAGGGCAGAG CTGCGCACCC ATCCTCCAGG CAGGCTGTGC     4026AGTCAGGCCA TGGGCTCTGG GGTATCCCCC ACTGGTCCCA TTAAGATTTG CCCCTGGCTC     4086CACCGAAAAC CCCGTCTTCC CCTAAG                                          4112(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

  (A)长度：547个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑学：线性

(ii)分子类型：蛋白

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：Met Leu Asp Thr Met Glu Ala Pro Gly His Ser Arg Gln Leu Leu Leu1               5                  10                  15Gln Leu Asn Asn Gln Arg Thr Lys Gly Phe Leu Cys Asp Val Ile Ile

         20                  25                  30Val Val Gln Asn Ala Leu Phe Arg Ala His Lys Asn Val Leu Ala Ala

     35                  40                  45Ser Ser Ala Tyr Leu Lys Sar Leu Val Val His Asp Asn Leu Leu Asn

 50                  55                  60Leu Asp His Asp Met Val Ser Pro Ala Val Phe Arg Leu Val Leu Asp65                  70                  75                  80Phe Ile Tyr Thr Gly Arg Leu Ala Asp Gly Ala Glu Ala Ala Ala Ala

             85                  90                  95Ala Ala Val Ala Pro Gly Ala Glu Pro Ser Leu Gly Ala Val Leu Ala

        100                 105                 110Ala Ala Ser Tyr Leu Gln Ile Pro Asp Leu Val Ala Leu Cys Lys Lys

    115                 120                 125Arg Leu Lys Arg His Gly Lys Tyr Cys His Leu Arg Gly Gly Gly Gly

130                 135                 140Gly Gly Gly Gly Tyr Ala Pro Tyr Ala Met Ala Thr Ser Trp Ala Gly145                 150                 155                 160Ser Ala Ala Pro Pro Ala Ser Ala Ala Lys Ser Val Val Gly Thr Arg

            165                 170                 175Pro Ser Arg Pro Gly Gly Pro Arg Ser Ala Trp Arg Arg Arg Arg Ala

        180                 185                 190Thr Leu Ala Ala Trp Thr Gly Pro Ala Arg Ala Ala Thr Ala Thr Thr

    195                 200                 205Thr Arg Ala Ala Ala Arg Arg Pro Val Ala Ala Arg Thr Pro Ala Pro

210                 215                 220Pro Gly Gly His Leu Glu Gly Tyr Pro Cys Pro His Leu Ala Tyr Gly225                 230                 235                 240Glu Pro Glu Ser Phe Gly Asp Asn Leu Tyr Val Cys Ile Pro Cys Gly

            245                 250                 255Lys Gly Phe Pro Ser Ser Glu Gln Leu Asn Ala His Val Glu Ala His

        260                 265                 270Val Glu Glu Glu Glu Ala Leu Tyr Gly Arg Ala Glu Ala Ala Glu Val

    275                 280                 285Ala Ala Gly Ala Ala Gly Leu Gly Pro Pro Phe Gly Gly Gly Gly Asp

290                 295                 300Lys Val Ala Gly Ala Pro Gly Gly Leu Gly Glu Leu Leu Arg Pro Tyr305                 310                 315                 320Arg Cys Gly Ser Cys Asp Lys Ser Tyr Lys Asp Pro Ala Thr Leu Arg

            325                 330                 335Gln His Glu Lys Thr His Trp Leu Thr Arg Pro Tyr Pro Cys Thr Ile

        340                 345                 350Cys Gly Lys Lys Phe Thr Gln Arg Gly Thr Met Thr Arg His Met Arg

    355                 360                 365Ser His Leu Gly Leu Lys Pro Phe Ala Cys Asp Ala Cys Gly Met Arg

370                 375                 380Phe Thr Arg Gln Tyr Arg Leu Thr Arg Thr His Met Arg Ile His Pro385                 390                 395                 400Arg Gly Glu Lys Pro Tyr Glu Cys Gln Val Cys Gly Gly Lys Phe Ala

            405                 410                 415Gln Gln Arg Asn Leu Ile Ser His Met Lys Met His Ala Val Gly Gly

        420                 425                 430Ala Ala Ala Arg Pro Gly Arg Trp Arg Ala Trp Gly Gly Ser Pro Ala

    435                 440                 445Ser Pro Ala Pro Thr Ala Arg Ala Ser Ser Thr Ser Pro Arg Ala Ser

450                 455                 460Leu Leu Trp Leu Ala His Gly Arg Ala Ala Glu Pro Glu Ala Ala Gly465                 470                 475                 480Gln Gly Gly Arg Asp Arg Ala Ala Gly Ala Asp His Ala Leu Pro Ala

            485                 490                 495Arg Pro Gln Gly Gly Ala Gly Glu Pro Leu Pro Ala Gly Gln Val His

        500                 505                 510Gly Arg Ala Gly Pro Gln Pro Arg Gln Gly Gly Arg Gly Ala Glu Pro

    515                 520                 525Gly Arg Ser Pro Gly Gly Arg Ala Arg Arg Arg Thr Ile Asp Arg Phe

530                 535                 540Ser Pro Thr545

Claims (48)

1.一种基本纯的HIC-1(在癌症中过度甲基化)的多肽，其基本上由SEQ D NO：3的氨基酸序列组成。

2.一种分离的多核苷酸序列，基本上由编码具有SEQ ID NO：3氨基酸序列多肽的一种多核苷酸序列组成。

3.权利要求2的分离的多核苷酸序列，基本上由编码具有SEQ IDNO：3的氨基酸序列和具有至少一个表位使抗体对HIC-1多肽有免疫反应的多肽的一种多核苷酸序列组成。

4. 权利要求2的多核苷酸，其中核苷酸序列选自：

a)SEQ D NO：1，其中T也可能是U；

b)互补于a)的核苷酸序列；

c)a)或b)的至少长为15个碱基的片段，能选择性地与编码HIC-1的基因组DNA杂交。

5.一种含权利要求2的多核苷酸的重组表达载体。

6.一种含权利要求5的表达载体的宿主细胞。

7.一种结合SEQ ID NO：3的多肽和结合SEQ ID NO：3的免疫反应性片段的抗体。

8.权利要求7的抗体，其中抗体是多克隆的。

9.权利要求7的抗体，其中抗体是单克隆的。

10.一种检测在受试者中和HIC-1有关的细胞增殖失调的方法，包括用和HIC-1反应的试剂与含HIC-1的靶细胞组分接触、检测HIC-1。

11.权利要求10的方法，其中靶细胞组分是核酸。

12.权利要求11的方法，其中核酸是DNA。

13.权利要求11的方法，其中核酸是RNA。

14.权利要求11的方法，其中核酸是过度甲基化的。

15.权利要求10的方法，其中靶细胞组分是蛋白。

16.权利要求10的方法，其中试剂是一种探针。

17.权利要求16的方法，其中探针是核酸。

18.权利要求16的方法，其中探针是抗体。

19.权利要求18的方法，其中抗体是多克隆的。

20.权利要求18的方法，其中抗体是单克隆的。

21.权利要求16的方法，其中探针为可检测性地标记。

22.权利要求21的方法，其中标记物选自放射性同位素、生物发光化合物、化学发光化合物、荧光化合物、金属螯合物或酶。

23.权利要求10的方法，其中试剂是一种限制性核酸内切酶。

24.权利要求23的方法，其中限制性核酸内切酶是甲基化敏感的。

25.权利要求24的方法，其中限制性核酸内切酶选自MspI、HpaII、BssHII和NotI。

26.权利要求10的方法，其中细胞增殖失调有关的组织，选自脑、结肠、泌尿生殖器、肺、肾、造血组织、乳腺、胸腺、睾丸、卵巢和子宫。

27.权利要求26的方法，其中失调选自低级星形细胞瘤、退行性星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、肺癌、肾癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌和成神经细胞瘤。

28.一种治疗和HIC-1有关的细胞增殖失调的方法，包括给失调的受试者服用一种治疗有效量的调节HIC-1表达的药剂。

29.权利要求28的方法，其中药剂是一种包括HIC-1有义多核苷酸序列的多核苷酸序列。

30.权利要求29的方法，其中进一步包括的药剂是编码操纵性地与HIC-1多核苷酸序列连接的一种多核苷酸序列。

31.权利要求29的方法，其中多核苷酸序列在一表达载体中。

32.权利要求28的方法，其中与失调相关的组织选自脑、泌尿生殖器、结肠、肾、造血组织、乳腺、胸腺、睾丸、卵巢和子宫。

33.权利要求32的方法，其中失调选自低级星形细胞瘤、退行性星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、肺癌、肾癌、白血病、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌和成神经细胞瘤。

34.权利要求28的方法，其中HIC-1相关的细胞增殖失调和HIC-1核苷酸序列的过度甲基化有关。

35.一种基因治疗方法，包括向宿主受试者细胞中导入一种表达载体，其中表达载体包含与启动子可操作地连接的编码HIC-1的核苷酸序列。

36.权利要求35的方法，其中表达载体被导入离体的受试者细胞中，然后重导入受试者中。

37.权利要求35的方法，其中表达载体是一种RNA病毒。

38.权利要求37的方法，其中RNA病毒是一种反转录病毒。

39.权利要求35的方法，其中受试者是人。

40.权利要求35的方法，其中失调与HIC-1多核苷酸的过度甲基化有关。

41.一种诊断试剂盒，用于检测显示有与HIC-1核酸甲基化相关的细胞增殖失调的靶细胞组分，包括划分为几部分的载体装置，可紧密地放一或多个容器，包括首要的含检测甲基化的HIC-1核酸的探针的容器。

42.权利要求41的试剂盒，其中靶细胞组分是HIC-1多肽。

43.权利要求42的试剂盒，其中探针是一种抗体。

44.权利要求41的试剂盒，其中靶细胞组分是核酸序列。

45.权利要求44的试剂盒，其中探针是一种多核苷酸杂交探针。

46.一种鉴定肿瘤抑制基因的方法，包括在核酸样品中检测异常的核酸甲基化和鉴定基因。

47.权利要求46的方法，，其中核酸至少包括1个CpG岛核苷酸序列。

48.权利要求47的方法，其中CpG核苷酸序列是过度甲基化的。

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