CN117164612A - 一种检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物化学领域，具体公开了一种检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针，为一种高化学选择性检测H2Sn而非H2S的纳米探针，所述纳米探针结构：小分子探针BOD‑CN包裹于由mPEG‑DSPE2000形成的胶束的疏水内腔中。BOD‑CN是在基于无掩蔽基团的策略下通过精细调控BODIPY发光体的亲电性而获得的，它能特异性地检测H2Sn且无有毒副产物。而包裹后的纳米探针不仅对H2Sn有着高化学选择性，且表现出罕见的聚集诱导双色荧光响应，通过使用这种可激活的双色荧光通道的信息互补，成功地实现了细胞内H2Sn的高完整度成像。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及一种荧光探针和其合成及应用，可实现选择性地检测H2Sn，具体地说，涉及纳米探针的合成方法和细胞成像应用。
背景技术
活性硫物种是一类含硫分子，在生物系统中发挥着重要作用。其中，硫化氢(H2S)作为活性硫物种中被广泛研究的一种气体信号分子，被认为在许多病理和生理过程中发挥重要的调节作用。相比之下，作为内源性H2S与活性氧物种/酶之间相互作用产生的衍生物，多硫化物(H2Sn；n>1)引起的关注要少得多。事实上，新的证据表明，一些之前报道的与H2S有关的生物效应实际上是由H2Sn产生或介导的，这是由于H2Sn比其它生物硫醇和H2S具有更强的亲核性和还原性。尽管H2Sn有很大的作用，但对H2Sn在生物学中确切作用机制的研究仍处于初始阶段，还有许多问题需要解决。
尽管有许多H2Sn可激活型荧光探针已经被开发出来，并且已经逐渐克服早期探针的一些局限性，但是这些设计策略主要依赖于数种H2Sn可激活的保护基团并且需要精心设计连接基团。因此，许多荧光团在基于这种掩蔽策略进行H2Sn可激活探针的设计时受到限制。同时，这种基于掩蔽基团的探针在激活时可能会产生潜在的非荧光副产物和有毒副产物，不利于H2Sn的生物成像。此外，虽然已经使用一些功能材料成功实现了多色荧光成像，并大大提高了成像质量，但是目前设计可激活型的多色发射分子探针仍然是一个巨大的挑战。毫无疑问，设计H2Sn可激活的多色荧光有机分子探针将为探索H2Sn介导的生物事件提供高性能的研究工具。
基于此背景下，本发明设计合成了一种具有特殊的可激活聚集诱导双色荧光的纳米探针，该纳米探针表现出对H2Sn的双色荧光响应，分别在588nm和750nm处开启了明亮的荧光发射，双色荧光响应使其能够基于两个不同荧光通道在活细胞中高完整地成像H2Sn。
发明内容
本发明第一个目的是提供一种检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针。
本发明第二个目的是提供一种检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针的制备方法。
本发明第三个目的是提供一种选择性检测H2Sn的纳米探针利用双色荧光响应在检测细胞中内源性多硫化氢上的应用。
本发明通过下述技术方案实现：
本发明提供了一种检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针，所述纳米探针结构：小分子探针BOD-CN包裹于由mPEG-DSPE2000形成的胶束的疏水内腔中。
BOD-CN结构如式Ⅰ所示：
本发明提供了上述纳米探针在588nm和750nm处强的近红外荧光发射，并将其用于Hela细胞中内源性H2Sn的荧光成像。
本发明所述具有选择性检测H2Sn的纳米探针，内部为染料分子BOD-CN和PEG疏水内腔，外部为PEG亲水长链。
本发明所述纳米探针利用双色荧光响应来实现不同通道的信息互补，从而提供具有更高完整度的图像。
本发明还提供所述具有选择性检测H2Sn的纳米探针的制备方法，具体制备路线为：
具体方法为：
1、化合物A的合成
BOD-CHO的合成参考专利-赵春常，张秀丽，张丽丽，王飞翼，江海沨，安建才，张帆，一种检测内源性H2S的荧光探针及其制备方法和应用，中国:专利号：ZL201410766204.6，2015-03-11，证书号：第2250092号。
2、荧光探针BOD-CN的合成
将丙二腈溶于无水乙醇中，然后加入化合物BOD-CHO。将混合物在氩气保护下搅拌加热并回流12小时。冷却至室温，后处理后得到红色固体产物BOD-CN。
3、纳米探针BOD-CN-NP的合成
BOD-CN快速加入到溶解mPEG-DSPE的2mL去离子水中，超声10分钟，然后透析，得到纳米探针溶液。
本发明还提供一种所述的具有选择性检测H2Sn的纳米探针在检测内源性H2Sn上的应用。
本发明有益的技术效果：
本发明提供的纳米探针合成方法简单，成本相对低廉，但成像性能优异，并且能够基于两个不同荧光通道的双色荧光响应在活细胞中高完整度地成像H2Sn。
附图说明
图1为小分子有机探针BOD-CN的合成路线图。
图2为纳米探针BOD-CN-NP的构建过程。
图3为小分子有机探针BOD-CN在CDCl3中的1HNMR图谱。
图4为纳米探针BOD-CN-NP的(a)透射电镜显微镜和(b)动态光散射的结构表征。
图5为小分子有机探针BOD-CN浓度为10μmol/L时对H2Sn随时间变化的紫外吸收光谱。(备注：H2Sn浓度为100μmol/L，测试溶剂为PBS/MeCN,v/v,1:1，pH＝7.4)。
图6为纳米探针BOD-CN-NP浓度为10μmol/L时对H2Sn随时间变化的紫外吸收光谱。(备注：H2Sn浓度为100μmol/L，测试溶剂为PBS，pH＝7.4)。
图7为纳米探针浓度为10μmol/L时对H2Sn随时间变化的荧光发射光谱。(备注：H2Sn浓度为100μmol/L，测试溶剂为PBS，pH＝7.4，激发波长图a为490nm,图b为为550nm,图c为670nm)。
图8为纳米探针在HeLa细胞中利用激活双色荧光来成像内源性H2Sn的效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述，本领域技术人员应当理解，所述实施例仅用于示例，而不对本发明构成任何限制。
实施例1
式Ⅰ所示小分子有机探针的合成
化合物A的合成
化合物A的合成参考专利-赵春常，张秀丽，张丽丽，王飞翼，江海沨，安建才，张帆，一种检测内源性H2S的荧光探针及其制备方法和应用，中国:专利号：ZL201410766204.6，2015-03-11，证书号：第2250092号。
荧光探针BOD-CN的合成
将20mg(0.3mmol)丙二腈溶于20mL无水乙醇中，然后加入39mg(0.1mmol)化合物BOD-CHO。将混合物在氩气保护下搅拌加热并回流12小时。冷却至室温，用30mLDCM稀释，合并有机相，用去离子水洗涤三次，无水硫酸钠干燥，减压旋蒸除去溶剂。所得粗产物通过硅胶柱色谱纯化，得到红色固体产物(26mg,61％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ＝7.68(s,1H),7.57-7.52(m,3H),7.33-7.31(dd,2H),7.04(s,1H),2.70(s,3H),2.43-2.38(q,2H),1.51(s,3H),1.08-1.04(t,3H).
图5为小分子有机探针BOD-CN浓度为10μmol/L时对H2Sn随时间变化的紫外吸收光谱。(备注：H2Sn浓度为100μmol/L，测试溶剂为PBS/MeCN,v/v,1:1，pH＝7.4)。
实施例2
纳米探针BOD-CN-NP的合成
BOD-CN(0.2mg)快速加入到溶解mPEG-DSPE(20mg)的2mL去离子水中，超声10分钟，然后透析6h后，得到纳米探针溶液。参见图4。
图4为纳米探针BOD-CN-NP的(a)动态光散射和(b)透射电镜显微镜的结构表征，证明了纳米探针的成功构建。
实施例3
将Hela细胞接种在细胞培养皿中，在实验前使其贴壁24小时，并在成像前使用PBS缓冲液(pH7.4)洗涤。将这些细胞用10μM探针孵育相应时间，在共聚焦成像前用PBS缓冲液洗涤三次。内源性激动剂或清除剂成像时，先将细胞与LPS或ZnCl2共孵育相应时间，PBS缓冲液洗涤三次，再加入探针孵育。纳米探针BOD-CN-NP直接使用细胞培养基稀释至所需浓度即可进行细胞成像。使用LeicaTCSSP8和63×水物镜进行共聚焦成像。红色通道激发波长为633nm，黄色通道激发波长为550nm。
图8为纳米探针在HeLa细胞中利用激活双色荧光来成像内源性H2Sn的效果图。说明BOD-CN-NP可以应用于活细胞内的H2Sn成像。
图6为纳米探针BOD-CN-NP浓度为10μmol/L时对H2Sn随时间变化的紫外吸收光谱。(备注：H2Sn浓度为100μmol/L，测试溶剂为PBS，pH＝7.4)。用紫外吸收光谱证明mPEG-DSPE胶束促进了BOD-CN的紧密分子堆叠，BOD-CN-NP与H2Sn响应后出现了两个新的吸收带，位置分别位于550nm和670nm。相比之下，在没有mPEG-DSPE协助时，BOD-CN在激活后仅在550nm处表现出钝且微弱的吸收(图5)。
图7为纳米探针浓度为10μmol/L时对H2Sn随时间变化的荧光发射光谱。(备注：H2Sn浓度为100μmol/L，测试溶剂为PBS，pH＝7.4，激发波长图a为490nm,图b为为550nm,图c为670nm)。证明了BOC-CN-NP可以同时使用两个不同的荧光通道来检测H2Sn。
Claims (5)
1.一种检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针，其特征在于，所述纳米探针结构：小分子探针BOD-CN包裹于由mPEG-DSPE2000形成的胶束的疏水内腔中；
所述BOD-CN结构如式Ⅰ所示：
。
2.根据权利要求1所述一种检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针，其特征在于，所述纳米染料探针内部为染料分子BOD-CN和PEG疏水内腔，外部为PEG亲水长链。
3.根据权利要求1所述一种检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针，其特征在于，所述纳米探针利用双色荧光响应来实现不同通道的信息互补，从而提供具有更高完整度的图像。
4.一种权利要求1-3任一项所述检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针的制备方法，具体制备路线为：
5.一种权利要求1-3任一项所述的检测内源性H2Sn的可激活双色荧光探针在检测内源性H2Sn上的应用。
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