CN117143988A - 一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒，本发明涉及生物技术领域。该一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒，可以提前判断阿司匹林抵抗的情况，预判心血管事件，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗，采用了Sanger法，并且Sanger法准确性高，是SNP检测的金标准，Sanger法是对DNA分子进行测序，优点是测序结果直观、便于分析，适用于已知序列的验证测序、文库筛选、克隆鉴定、pcr重测序等。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，具体为一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒。
背景技术
作为抗血小板治疗的标准药物，阿司匹林的应用非常广泛。阿司匹林可减少高危患者心肌梗死、心源性猝死及脑卒中，但在规律服用治疗剂量阿司匹林的情况下，仍有心脑血管事件的发生，被称为阿司匹林抵抗。阿司匹林抵抗可能在开始服用阿司匹林时即出现，也可能在服用一段时间后才出现。生化实验检测显示，阿司匹林抵抗的发生率在5.5%-61%，而临床荟萃分析研究也表明阿司匹林抵抗的发生率约为26%。初始检测阿司匹林抵抗的患者，继续原剂量治疗后心血管事件的发生率在两年内急剧增加。大量的研究表明，一些关键基因的变异会显著增加阿司匹林抵抗的风险，导致后续治疗过程中心血管事件发生率，患者无心血管事件生存率急剧下降：如GP1BA基因。进行阿司匹林精准用药基因检测，可以提前判断阿司匹林抵抗的情况，预判心血管事件，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗，提出一种基于Sanger测序法的GP1BA基因突变检测方法和试剂盒，可以提前判断阿司匹林抵抗的情况，预判心血管事件，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗。
但上述以及其他典型现有技术在使用时还存在一定的问题：
传统发明的方法采用的检测方式为并不是SNP检测的金标准，并且在进行观测时无法根据DNA分子进行测序，这样也会间接的导致，测序结果不够直观、不便于分析。
传统发明的方法采用的检测方式在进行检测时的观测方式并不能满足于针对DNA分子的分子观测，进而导致不易判断阿司匹林抵抗的情况，无法根据个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提出一种基于Sanger测序法的GP1BA基因突变检测方法和试剂盒，可以提前判断阿司匹林抵抗的情况，预判心血管事件，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒，包括核酸提取试剂对血液基因组DNA提取试剂盒，参照试剂盒标准操作方法提取血液中DNA，所有受检样本提取的DNA经过ThermoScientifi Multiskan go 酶标仪浓度和纯度浓度检测，OD260/280在1.8~2.0之间。
优选的，所述根据检测位点在基因组位置，软件对参考序列进行引物设计，GP1BA-E2P1-F：5' AACCCTGATGCCTTACACTCG 3'，GP1BA-E2P1-R：5' CTTGACGTCCACACCTTGCTT 3'，引物通过NCBI数据库中Primer-BLAST功能进行引物特异性验证。
优选的，所述合成后引物需要进行实验特异性验证，使用PrimeSTAR® HS DNAPolymerase对提取的基因组DNA进行PCR扩增富集，产物使用相应浓度琼脂糖凝胶进行电泳，对应产物条带与设计长度相符且条带清晰单一，PCR产物使用琼脂糖DNA回收试剂盒进行切胶纯化，琼脂糖凝胶电泳的样品上样量不少于15uL，对照体系扩增出的目的片段其电泳条带亮度用肉眼观察，应不低于DNA Marker的标准条带亮度则表示扩增效果良好，此外由DNA Marker各标准条带的浓度，如某一片段为10ng/uL，则在同样上样量的情况下，只选择亮度与该标准条带相当的目的条带进行割胶回收，如需要可借助凝胶成像系统等凝胶分析软件进行条带亮度分析。
一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的试剂盒，包括SuperTaq PCRMix添加量为12.5uL、正向引物 F添加量为1.0uL、反向引物R 添加量为1.0uL、 DNA模板添加量为1.0uL、 Sterile Water 添加量为9.5uL，所述试剂盒的总体积为25.0uL。
有益效果
本发明提供了一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒。与现有技术相比具备以下有益效果：
本发明的一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒通过采用了Sanger法，并且Sanger法准确性高，是SNP检测的金标准，Sanger法是对DNA分子进行测序，优点是测序结果直观、便于分析，适用于已知序列的验证测序、文库筛选、克隆鉴定、pcr重测序等。
本发明的一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒通过采用了Sanger法，并且通过基因的琼脂糖凝胶电泳图进行分析结果，对比传统方式更加的具有典型性，进而判断阿司匹林抵抗的情况，预判心血管事件，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗。
附图说明
图1为本发明BJP2304759 GP1BA野生型结构示意图；
图2为本发明BJP2302181 GP1BA杂合突变型结构示意图；
图3为本发明GP1BA基因的琼脂糖凝胶电泳图结构示意图。
实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-3，本发明提供一种技术方案：一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒
实施例
一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒，包括核酸提取试剂对血液基因组DNA提取试剂盒，参照试剂盒标准操作方法提取血液中DNA，所有受检样本提取的DNA经过Thermo Scientifi Multiskan go 酶标仪浓度和纯度浓度检测，OD260/280在1.8~2.0之间。
实施例
根据检测位点在基因组位置，软件对参考序列进行引物设计，GP1BA-E2P1-F：5'AACCCTGATGCCTTACACTCG 3'，GP1BA-E2P1-R：5' CTTGACGTCCACACCTTGCTT 3'，引物通过NCBI数据库中Primer-BLAST功能进行引物特异性验证。
实施例
合成后引物需要进行实验特异性验证，使用PrimeSTAR® HS DNA Polymerase对提取的基因组DNA进行PCR扩增富集，产物使用相应浓度琼脂糖凝胶进行电泳，对应产物条带与设计长度相符且条带清晰单一，PCR产物使用琼脂糖DNA回收试剂盒进行切胶纯化，琼脂糖凝胶电泳的样品上样量不少于15uL，对照体系扩增出的目的片段其电泳条带亮度用肉眼观察，应不低于DNA Marker的标准条带亮度则表示扩增效果良好，此外由DNA Marker各标准条带的浓度，如某一片段为10ng/uL，则在同样上样量的情况下，只选择亮度与该标准条带相当的目的条带进行割胶回收，如需要可借助凝胶成像系统等凝胶分析软件进行条带亮度分析。
实施例
一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的试剂盒，包括SuperTaq PCRMix添加量为12.5uL，正向引物 F添加量为1.0uL，反向引物R 添加量为1.0uL，DNA模板添加量为1.0uL，Sterile Water 添加量为9.5uL，试剂盒的总体积为25.0uL。
试剂盒的组成成分：
PCR反应循环设置：
本发明提供了一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法及其试剂盒，具体使用时：
请参阅图3为GP1BA基因的琼脂糖凝胶电泳图。
备注：Marker为2kb；从下往上依次为100bp、200bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp；1泳道为空白对照；2泳道为野生型；3泳道为突变型。
上机测序
纯化样本使用Applied Biosystems™ BigDye™ Terminator v3.1 CycleSequencing Kit处理，接着使用BigDye XTerminator™ Purification Kit Protocol进行纯化，最后使用ABI 3730XL Genetic Analyzer全自动测序仪对纯化后PCR产物进行测序。
反应体系：
反应温度：
测序结果分析：Sanger测序结果峰图清晰，杂峰不超过主峰20%，峰图序列符合参考序列，能清晰分辨检测位点基因型，且无异议。
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下。由语句“包括一个......限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素”。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (4)
1.一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法，包括核酸提取试剂对血液基因组DNA提取试剂盒，参照试剂盒标准操作方法提取血液中DNA，所有受检样本提取的DNA经过Thermo Scientifi Multiskan go 酶标仪浓度和纯度浓度检测，OD260/280在1.8~2.0之间。
2.根据权利要求1所述的一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法，其特征在于：所述根据检测位点在基因组位置，软件对参考序列进行引物设计，GP1BA-E2P1-F：5' AACCCTGATGCCTTACACTCG 3'，GP1BA-E2P1-R：5' CTTGACGTCCACACCTTGCTT 3'，引物通过NCBI数据库中Primer-BLAST功能进行引物特异性验证。
3.根据权利要求1所述的一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法，其特征在于：所述合成后引物需要进行实验特异性验证，使用PrimeSTAR® HS DNA Polymerase对提取的基因组DNA进行PCR扩增富集，产物使用相应浓度琼脂糖凝胶进行电泳，对应产物条带与设计长度相符且条带清晰单一，PCR产物使用琼脂糖DNA回收试剂盒进行切胶纯化，琼脂糖凝胶电泳的样品上样量不少于15uL，对照体系扩增出的目的片段其电泳条带亮度用肉眼观察，应不低于DNA Marker的标准条带亮度则表示扩增效果良好，此外由DNA Marker各标准条带的浓度，如某一片段为10ng/uL，则在同样上样量的情况下，只选择亮度与该标准条带相当的目的条带进行割胶回收，如需要可借助凝胶成像系统等凝胶分析软件进行条带亮度分析。
4.一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的试剂盒，适用于上述权利要求1至3中任一项所述的一种基于Sanger测序法检测人类GP1BA基因突变的方法，其特征在于：包括SuperTaq PCR Mix添加量为12.5uL、正向引物 F添加量为1.0uL、反向引物R 添加量为1.0uL、 DNA模板添加量为1.0uL、 Sterile Water 添加量为9.5uL，所述试剂盒的总体积为25.0uL。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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