CN117143987A - 一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法及其试剂盒，包括以下步骤：S1、DNA提取，首先通过采样器对对血液基因组DNA进行提取，受检样本提取的DNA经过Thermo Scientifi Multiskan go进行酶标仪浓度和纯度浓度检测，OD260/280为1.8~2.0；S2、引物设计，然后根据检测位点在基因组位置，在NCBI数据库中获取参考序列，对参考序列进行引物设计，引物通过NCBI数据库中Primer‑BLAST功能进行引物特异性验证；S3、PCR扩增，引物特异性验证需要对提取的基因组DNA进行PCR扩增富集，本发明涉及生物技术领域，该基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法及其试剂盒，通过Sanger测序法检测人类LTC4S的方法可以提前判断阿司匹林抵抗的情况，预判心血管事件，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体为一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法及其试剂盒。
背景技术
作为抗血小板治疗的标准药物，阿司匹林的应用非常广泛，可减少高危患者心肌梗死、心源性猝死及脑卒中。阿司匹林是慢性荨麻疹的诱因之一，研究表明LTC4S基因（c.-444A>C）与部分患者服用阿司匹林后出现荨麻疹相关，AC和CC型的携带者提示较高荨麻疹风险。
有研究表明，进行相关研究后认为 LTC4S 启动子上的 rs730012 c.-444A>C多态性与阿司匹林致敏的产生有关联，敏感患者中C等位基因频率更高，关联密切度在不同种族间存在差异，有研究在患者人群中也进行了验证，LTC4S 启动子上的 rs730012 c.-444A>C多态性对阿司匹林致敏的显著影响，即 AC 基因型相对于AA 基因型患者发生药物致荨麻疹的风险高2.762倍，CC基因型相较AA基因型患者发生药物致荨麻疹的风险高4.296倍，进行阿司匹林精准用药基因检测，可以提前判断阿司匹林抵抗的情况，预判心血管事件，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗。
但上述方法无法提前判断阿司匹林抵抗的情况，预判心血管事件，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗的问题。
发明内容
解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法及其试剂盒，解决了无法提前判断阿司匹林抵抗的情况，预判心血管事件，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗的问题。
技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法，包括以下步骤：
S1、DNA提取，首先通过采样器对对血液基因组DNA进行提取，受检样本提取的DNA经过Thermo Scientifi Multiskan go（全波长扫描多功能读数仪） 进行酶标仪浓度和纯度浓度检测，然后再进行OD260/280的吸光光度比值；
S2、引物设计，然后根据检测位点在基因组位置，在NCBI数据库中获取参考序列，对参考序列进行引物设计，引物通过NCBI数据库中Primer-BLAST功能进行引物特异性验证；
S3、PCR扩增，引物特异性验证需要对提取的基因组DNA进行PCR扩增富集。
优选的，所述S1步骤中OD260/280 为1.8~2.0。
优选的，所述S2步骤参考序列通过Oligo 7软件对参考序列进行引物设计，其设计如下；
LTC4S-PCR-F：5'CACCACTTCCTGCTTGTTCGTG3'；
LTC4S-PCR-R：5'TGCATGGAACCCCTACAACGACT3'。
优选的，所述S2步骤中PCR扩增富集操作如下：
第一，首先PCR产物使用相应浓度琼脂糖凝胶进行电泳，对应产物条带与设计长度相符且条带清晰单一；
第二，然后PCR产物通过琼脂糖DNA回收试剂盒进行切胶纯化。
优选的，所述琼脂糖凝胶电泳的样品上样量不少于15uL，对照体系扩增出的目的片段其电泳条带亮度用肉眼观察，不低于DNA Marker(分子标记)的标准条带亮度,则表示扩增效果良好,。
优选的，所述标准条带亮度为5-10ng/uL。
本发明还公开了一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的试剂盒，包括SuperTaq PCR Mix、正向引物 F 、反向引物R、DNA模板和Sterile Water。
本发明提供了一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法及其试剂盒。与现有技术相比具备以下有益效果：
（1）、该基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法及其试剂盒，通过Sanger测序法检测人类LTC4S的方法可以提前判断阿司匹林抵抗的情况，预判心血管事件，从而采取个体化的抗血小板治疗，实现精准治疗。图1为本发明Sanger测序LTC4S野生结果图；
图2为本发明Sanger测序LTC4S杂合突变型结果图；
图3为本发明LTC4S基因的琼脂糖凝胶电泳图。
实施方式
对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2，本发明实施例提供一种技术方案：一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的试剂盒，包括SuperTaq PCR Mix、正向引物 F 、反向引物R、DNA模板和Sterile Water。
试剂盒的组成成分：
本发明实施例还提供一种技术方案：一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法，包括以下步骤：
S1、DNA提取，首先通过采样器对对血液基因组DNA进行提取，受检样本提取的DNA经过Thermo Scientifi Multiskan go（全波长扫描多功能读数仪） 进行酶标仪浓度和纯度浓度检测，然后再进行OD260/280的吸光光度比值，其中OD260/280 为1.8~2.0；S2、引物设计，然后根据检测位点在基因组位置，在NCBI(美国生物技术信息中心)数据库中获取参考序列，对参考序列进行引物设计，引物通过NCBI数据库中Primer-BLAST功能进行引物特异性验证；
S3、PCR扩增，引物特异性验证需要对提取的基因组DNA进行PCR扩增富集。
所述S2步骤参考序列通过Oligo 7软件对参考序列进行引物设计，其设计如下；
LTC4S-PCR-F：5'CACCACTTCCTGCTTGTTCGTG3'；
LTC4S-PCR-R：5'TGCATGGAACCCCTACAACGACT3'。
进一步的，所述S2步骤中PCR扩增富集操作如下：
第一，首先PCR产物使用相应浓度琼脂糖凝胶进行电泳，对应产物条带与设计长度相符且条带清晰单一；
第二，然后PCR产物通过琼脂糖DNA回收试剂盒进行切胶纯化，琼脂糖凝胶电泳的样品上样量不少于15uL。
对照体系扩增出的目的片段其电泳条带亮度用肉眼观察，不低于DNA Marker(分子标记)的标准条带亮度,则表示扩增效果良好,所述标准条带亮度为5-10ng/uL。
此外由DNA Marker各标准条带的浓度，如某一片段为10ng/uL,则在同样上样量的情况下,只选择亮度与该标准条带相当的目的条带进行割胶回收(浓度低于10ng/uL的目的条带不进行割胶回收),如需要可借助凝胶成像系统自带的软件或者Quantity-one等凝胶分析软件进行条带亮度分析。
PCR反应循环设置:
请参阅图3，LTC4S基因的琼脂糖凝胶的DNA Marker(分子标记)为2kb；从下往上依次为100bp、200bp、500bp、750bp、1000bp和2000bp、7泳道为空白对照、8泳道为野生型、9泳道为突变型。
上机测序：
在S2步骤中参考序列进行测序，首先纯化样本使用Applied Biosystems™BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（货号：4337458）处理，接着使用BigDye XTerminator™ Purification Kit Protocol进行纯化（货号：4374408），最后使用ABI 3730XL Genetic Analyzer（货号：A41046）全自动测序仪对纯化后PCR产物进行测序。
反应体系如下表：
反应温度如下表：
测序结果分析；
Sanger测序结果峰图清晰，杂峰不超过主峰20%，峰图序列符合参考序列，能清晰分辨检测位点基因型，且无异议。
同时本说明书中未作详细描述的内容均属于本领域技术人员公知的现有技术。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、DNA提取，首先通过采样器对对血液基因组DNA进行提取，受检样本提取的DNA经过Thermo Scientifi Multiskan go进行酶标仪浓度和纯度浓度检测，然后再进行OD260/280的吸光光度比值；
S2、引物设计，然后根据检测位点在基因组位置，在NCBI数据库中获取参考序列，对参考序列进行引物设计，引物通过NCBI数据库中Primer-BLAST功能进行引物特异性验证；
S3、PCR扩增，引物特异性验证需要对提取的基因组DNA进行PCR扩增富集。
2.根据权利要求1所述的一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法，其特征在于：所述S1步骤中OD260/280 为1.8~2.0。
3.根据权利要求1所述的一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法，其特征在于：所述S2步骤参考序列通过Oligo 7软件对参考序列进行引物设计，其设计如下；
LTC4S-PCR-F：5'CACCACTTCCTGCTTGTTCGTG3'；
LTC4S-PCR-R：5'TGCATGGAACCCCTACAACGACT3'。
4.根据权利要求1所述的一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法，其特征在于：所述S2步骤中PCR扩增富集操作如下：
第一，首先PCR产物使用相应浓度琼脂糖凝胶进行电泳，对应产物条带与设计长度相符且条带清晰单一；
第二，然后PCR产物通过琼脂糖DNA回收试剂盒进行切胶纯化。
5.根据权利要求4所述的一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳的样品上样量不少于15uL，对照体系扩增出的目的片段其电泳条带亮度用肉眼观察，不低于DNA Marker的标准条带亮度,则表示扩增效果良好。
6.根据权利要求5所述的一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的方法，其特征在于：所述标准条带亮度为5-10ng/uL。
7.一种基于Sanger测序法检测人类LTC4S基因突变的试剂盒，其特征在于：包括SuperTaq PCR Mix、正向引物 F 、反向引物R、DNA模板和Sterile Water。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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