CN117143773A - 一种草莓用根腐病生防菌、菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种草莓用根腐病生防菌、菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域,具体涉及一种草莓用根腐病生防菌、菌剂及其制备方法和应用。该生防菌为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis),其命名为DH18,2023年8月11日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 20231430。该贝莱斯芽胞杆菌能够用于制备具有促生功能的草莓用根腐病生防菌剂及微生物复合肥料,利用该贝莱斯芽胞杆菌与草莓的特异亲和性使其稳定定殖在草莓根际,能够稳定发挥促生和根腐病防治效果。

Description

一种草莓用根腐病生防菌、菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物促生技术领域,具体涉及一种具有促生功能的草莓用根腐病生防菌、菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
草莓(Fragaria ananassa Duch.)属蔷薇科草莓属多年生草本植物,是我国重要的经济作物。但是,由于草莓栽培过程中低温,高湿,长期连作的特点以及不合理的施肥方式,导致种植土壤理化性质恶化,病原菌数量累积。其中根腐病是威胁草莓产业健康发展的主要病害之一,严重影响草莓产量和品质,对我国草莓产业造成巨大的经济损失。
草莓根腐病是一种危害严重的土传病害,致病菌种类多且存在时间长,在草莓的整个种植期间均可引起发病,具有突发性和毁灭性的特点,一旦发生便很难防治,给草莓生产带来巨大损失。
目前采用的防治方法主要以优化草莓轮作方式以及化学防治为主。但使用农药等化学药剂会引起土传致病菌的耐药性,导致防治效果不理想,长期使用化学药剂不仅会导致草莓品质的下降,还会导致土壤酸化、养分流失和土壤板结等问题。近年来,大量使用农药防治作物病害产生的农药残留问题以及相关食品安全问题非常突出,因此利用拮抗微生物及其活性物质防治作物病害的优点逐渐显现。
目前已有研究将芽胞杆菌作为微生物菌剂用于田间,以预防草莓根腐病。专利CN113980836A、CN112877235A分别公开了一种用于防治草莓根腐病的贝莱斯芽胞杆菌。但是,由于普通使用的微生物菌剂无法在草莓根部稳定定殖,无法充分发挥其生防效果,限制了生防菌剂的应用。
因此开发出一种与草莓具有特异亲和性并且能够稳定定殖的微生物菌剂,并将其应用于草莓根腐病的绿色防控中,有利于推动草莓产业的可持续发展。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的之一在于提供一种贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis),其命名为DH18,2023年8月11日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 20231430。
本发明的目的之二在于提供一种生防菌剂,所述生防菌剂包括如上所述的贝莱斯芽胞杆菌DH18。
优选的,所述生防菌剂为液态菌剂,该液态菌剂由贝莱斯芽胞杆菌DH18发酵而成。
优选的,所述液态菌剂中活菌数在1×108-9×108CFU·mL-1范围内。
本发明的目的之三在于提供如上所述的生防菌剂的制备方法,包括以下步骤:
S1.菌种活化,将DH18菌株接入LB液体培养基,28~30℃培养16~18h,得到活化菌液;
S2.发酵培养,将步骤S1中活化菌液,以体积比3~5%接种量接种于180mL LB液体培养基中,置于摇床28~30℃,180~200r·min-1振荡培养16~18h,即制得所述生防菌剂。
本发明的目的之四在于提供一种微生物复合肥料,其包括如上所述的贝莱斯芽胞杆菌DH18及与所述贝莱斯芽胞杆菌DH18相容性良好的辅料。
优选的,所述辅料包括发酵底物、土壤肥料学上允许的有机和/或无机肥料、缓释吸附载体中的任意一种或多种的组合。
其中,发酵底物可以是支持贝莱斯芽胞杆菌DH18繁殖的固体或液体发酵培养物;土壤肥料学上允许的有机和/或无机肥料包括从来源区分的农家肥、化肥,或从功能上区分的底肥、基肥,或从成分上区分的大、中、微量元素肥等;缓释吸附载体包括生物炭、菌菇渣、秸秆、大豆粕等。
本发明的目的之五在于提供如上所述的生防菌剂或微生物复合肥料在促进草莓生长和/或防治草莓根腐病中的应用。
本发明的目的之六在于提供一种促进草莓生长和/或防治草莓根腐病的方法,该方法为对草莓施用有效量的如上所述的生防菌剂,或对草莓施用如上所述的微生物复合肥料。
优选的,使用如上所述的液态生防菌剂对草莓进行浇根,所述生防菌剂每亩施用量为20~25L。
本发明的有益效果在于:
1、本发明提供的贝莱斯芽胞杆菌DH18与草莓具有特异亲和性,可长期定殖于草莓根部发挥根腐病的防治作用以及对草莓生长的促进作用。草莓根部可产生凝集素,凝集素是非免疫来源的蛋白质或糖蛋白,可与细菌细胞壁上的多糖结合。本发明提供的DH18菌株具有草莓凝集素亲和性,可与草莓凝集素发生凝集反应。DH18菌株在凝集素介导下长期定殖在草莓植株根部,能稳定地发挥对草莓根腐病的防治以及对草莓植株的促生效果。
2、本发明使用的DH18菌株具有溶解难溶态磷能力,可增加土壤中速效磷含量。
DH18菌株溶磷机理主要是:1)菌株在代谢过程中分泌乙酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸,降低土壤pH值,并且与Fe3+、Al3+、Ca2+等离子螯合,从而溶解难溶性无机磷酸盐;2)菌株呼吸作用释放的CO2,可降低环境pH值,从而溶解难溶性无机磷酸盐。
3、本发明的DH18菌株还具有产吲哚乙酸(IAA)的能力。吲哚乙酸是一种重要的植物生长素,能够调节、促进植物芽、茎、根的生长,影响植物器官建成。
4、利用DH18菌株制备液态菌剂,菌剂施入土壤中用量为20~25L/亩。据统计,目前种植草莓农药的施用量为75kg/亩,其他微生物农药的使用量为50~60L/亩,本发明提供的微生物菌剂在草莓种植过程中可替代农药使用,且用量大大降低,节约能源消耗,具有广阔的应用前景。
5、使用微生物菌剂替代农药,不仅能改善土壤养分保护生态环境,提高种植的草莓品质及安全性,同时也避免了致病菌产生抗药性。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
菌株的筛选
选取健康的草莓植株,将草莓根部连土整体挖出,除去较大土块及其它无用残渣,以获得完整根系及根际土壤。分别取各个样品的根际土壤1g于含有制霉菌素的无菌生理盐水中,置于摇床160r·min-1振荡0.5h,即得根际土壤菌悬液。取1mL上述菌悬液至9mL含有制霉菌素的无菌生理盐水中,梯度稀释至10-7浓度。在LB平板上进行稀释涂布,并对生长形态差异的菌落分别纯化。
活化分离自健康草莓根际土壤中的细菌,平板对峙培养法测定细菌菌株对草莓根腐病原菌尖孢镰刀菌的拮抗作用,具体实施方法为在PDA培养基平板中央接直径为5mm的草莓根腐病原菌菌丝块,在对称位置点接细菌菌株,对照组只接病原菌菌丝块,28℃恒温培养5d后,测量菌落直径,计算抑菌率。
挑取抑菌率较大的菌株至LB平板,多次划线纯化,以获得纯系拮抗菌株。
在LB液体培养基中接种筛选获得的拮抗菌株,恒温振荡培养至对数生长期。在载玻片中央滴加25μL菌悬液,并于等体积草莓凝集素混匀,室温下静置0.5h,晾干染色后在显微镜下观察反应现象。
挑取出现凝集反应的菌株,获得草莓亲和性拮抗菌株,本申请使用的DH18即为用此筛选方法获得的一株草莓亲和性根腐病拮抗菌株。
上述LB培养基配方为:蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、琼脂15g、蒸馏水1000mL。
抑菌率计算公式为:抑菌率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100%
经平板对峙实验结果表明,菌株DH18对草莓根腐病原菌尖孢镰刀菌抑制率为36.9%。
实施例2
菌株的鉴定
结合形态学观察,生理生化试验和16S rRNA基因序列比对分析鉴定DH18菌株种属。
根据《常见细菌系统鉴定手册》对DH18菌株进行生理生化特性检测。其中形态学试验包括革兰氏染色;生理生化试验包括淀粉水解试验、接触酶试验、VP试验、甲基红(M-R)试验、明胶液化试验、葡萄糖氧化发酵试验、产H2S试验,结果见表1。
将DH18菌株16S rRNA基因序列提交到NCBI数据库进行BLAST比对,结合生理生化试验结果判定菌属,并进一步采用16S与gyrB基因联合建树确定DH18菌株属于贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis),DH18菌株16S rRNA基因序列见序列表。
表1DH18菌株部分生理生化特性
实施例3
DH18菌株产IAA和解磷能力测定
将DH18菌株以2%接种量接种至有氮液体培养基中,于28℃、160r·min-1振荡培养5d,离心去沉淀,取上清,按照1:2的比例加入相应的Sackowski’s混合液,在暗处25℃混合反应30min,以不接菌的有氮培养液作为空白对照,测定530nm处的吸光值,计算DH18菌株产IAA水平。
Sackowski’s显色液:1mL 0.5mol·L-1FeCl3溶液加入到50mL 35%HClO4溶液中,混合均匀。
有氮液体培养基配方:蔗糖10.0g、K2HPO4 2.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl0.1g、酵母膏0.5g、CaCO3 0.5g、蒸馏水400mL,pH7.0。
将DH18菌株以2%接种量接种至难溶性无机磷Ca3(PO4)2液体培养基中,于28℃、160r·min-1振荡培养7d。吸取1mL发酵液,8000r·min-1离心10min,取10μL上清液,加入1mL钼锑抗显色剂,蒸馏水定容至10mL,混匀后静置15min,测定700nm处的吸光度值。
难溶性无机磷Ca3(PO4)2液体培养基配方:葡萄糖10g、Ca3(PO4)2 5g、KCl0.3g、、(NH4)2SO4 0.5g、NaCl 0.3g、MgSO4·7H2O 0.03g、MnSO4·4H2O 0.03g、蒸馏水1000mL、pH7.2。
DH18菌株对难溶性磷的溶解能力及产IAA能力见表2。由表2可见DH18菌株对难溶性磷溶解能力较强,并具有较高的产IAA能力,表明DH18菌株具有促进植物生长的潜力。
表2DH18菌株促生长特性
实施例4
盆栽试验
1.菌剂的制备
将DH18菌株接入5mL LB液体试管中,28℃培养16h后,以体积比3%种量接种于装有180mL的LB液体培养基中,置于摇床28℃,180r·min-1振荡培养16-18h,制得DH18液态菌剂。
2.盆栽试验
试验分成两组,一组为施DH18菌剂的实验组,另一组为未施菌剂的对照组。每组设10个重复。将草莓幼苗栽种于育苗盘中,缓苗2d后向其根部接入2mL DH18菌剂。并在施菌10d后对草莓植株的株高、全株鲜重、根长、地上鲜重、根鲜重、地上干重、根干重进行测定。结果见表3。
表3盆栽实验中DH18菌剂对草莓生长的影响
注:*表示处理间差异显著(p<0.05),**表示处理间差异极显著(p<0.01)。
由表3可见,施加DH18菌剂的实验组,其株高较未施菌剂的对照组提高了32.37%,达显著水平(p<0.05),全株鲜重、根长、地上部鲜重、根鲜重分别较未施菌剂的对照组提高了91.97%、82.36%、87.70%和126.67%,达极显著水平(p<0.05)。
实施例5
田间试验
本实施例5使用的菌剂制备方法同实施例4。
试验分成两组,一组为施DH18菌剂的实验组,另一组为未施菌剂的对照组。每组设20个重复。草莓幼苗于育苗盘中培养,在其根部接入10mL稀释后的DH18菌剂,当幼苗移栽至田间时,每棵植株根部补施20mL稀释后的DH18菌剂。移栽60d时测定实验组和对照组的株高、茎粗、叶柄长、叶片长、叶片宽、叶面积、冠茎以及匍匐茎数量。结果见表4。
表4田间实验中DH18菌剂对草莓生长的影响
注:*表示处理间差异显著(p<0.05),**表示处理间差异极显著(p<0.01)。
由表4可见,施加DH18菌剂的实验组,其茎粗、叶柄长、叶片宽、叶面积、冠茎以及匍匐茎数量分别较未施菌剂的对照组提高了44.20%、63.90%、9.19%、12.52%、26.29%和27.01%,达极显著水平(p<0.01)。结果表明,施加DH18菌剂能显著促进草莓植株生长。
实施例6
菌剂在防治草莓根腐病中的应用
试验分成两组,一组为施菌剂的实验组,另一组为未施菌剂的对照组。移栽后对实验组中每株草莓幼苗根部施入20mL稀释后菌液。待草莓生长60d后记录草莓的发病情况和防治效果。结果如表5。
计算公式如下:
发病率(%)=发病株数/种植的总株数
防治效果(%)=(对照组病情指数-处理组病情指数)/对照组病情指数×100
表5不同处理对草莓根腐病发病率的影响
由表5可见,对照组的发病率,病情指数分别为35.50%,32.50,施加DH18菌剂的实验组的发病率,病情指数分别为3.10%,2.20,远低于对照组,防治效果为93.20%,说明DH18菌剂高效稳定,对病原菌拮抗性强,应用于草莓根腐病的防治过程,菌株能够稳定定殖,有效降低草莓根腐病的发病率,有效改善草莓的生长状况。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种贝莱斯芽胞杆菌(Bacillus velezensis),其命名为DH18,2023年8月11日保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 20231430。
2.一种生防菌剂,其特征在于,所述生防菌剂包括如权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DH18。
3.如权利要求2所述的生防菌剂,其特征在于,所述生防菌剂为液态菌剂,该液态菌剂由贝莱斯芽胞杆菌DH18发酵而成。
4.根据权利要求3所述的生防菌剂,其特征在于,所述液态菌剂中活菌数在1×108-9×108CFU·mL-1范围内。
5.一种如权利要求2或3所述的生防菌剂的制备方法,其特征在于,所述生防菌剂的制备方法如下:
S1.菌种活化,将DH18菌株接入LB液体培养基,28~30℃培养16~18h,得到活化菌液;
S2.发酵培养,将步骤S1中活化菌液,以体积比3~5%接种量接种于180mL LB液体培养基中,置于摇床28~30℃,180~200r·min-1振荡培养16~18h,即制得所述生防菌剂。
6.一种微生物复合肥料,其特征在于,包括如权利要求1所述的贝莱斯芽胞杆菌DH18及与所述贝莱斯芽胞杆菌DH18相容性良好的辅料。
7.如权利要求6所述的微生物复合肥料,其特征在于,所述辅料包括发酵底物、土壤肥料学上允许的有机和/或无机肥料、缓释吸附载体中的任意一种或多种的组合。
8.权利要求2-4任一项所述的生防菌剂或权利要求6-7任一项所述的微生物复合肥料在促进草莓生长和/或防治草莓根腐病中的应用。
9.一种促进草莓生长和/或防治草莓根腐病的方法,其特征在于,对草莓施用有效量的如权利要求2-4任一项所述的生防菌剂,或对草莓施用如权利要求6或7所述的微生物复合肥料。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,使用如权利要求3或4所述的生防菌剂对草莓进行浇根,所述生防菌剂每亩施用量为20~25L。
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