CN117137090A - 一种水解蛋黄粉复合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有富集唾液酸糖肽的水解蛋黄粉复合物及其制备方法，主要步骤包括：蛋黄粉的预处理、非特异性纯化富集、由唾液酸结构片段作为分子印迹模板分子的特异性纯化富集。所得水解蛋黄粉最高可达5wt％的唾液酸含量，显著高于现有技术的水解蛋黄粉产品。本发明唾液酸糖肽纯化富集方法效率高、成本低、适用工业化规模生产。本发明制备得到的水解蛋黄粉不但可以促进骨骼生长、预防骨质疏松，且有较好的抗菌抗病毒增强免疫力等功能。

Description

一种水解蛋黄粉复合物及其制备方法

技术领域

本发明属于食品加工领域，具体涉及一种利用蛋黄制备富集唾液酸糖肽的水解蛋黄粉的制备方法。

背景技术

水解蛋黄粉(又称酶解蛋黄粉)是被我国卫生部门批准的新资源食品，其具有易于吸收、促进钙吸收等优点，广泛用于食品领域，以及防治骨质疏松、促进骨骼生长的保健食品领域。水解蛋黄粉主要成分为蛋黄中的蛋白质水解后形成的大小不等的寡肽分子及其衍生物。寡肽的吸收消耗能量低，转运速度快，吸收速率高于游离氨基酸。因此是最佳的氨基酸补充形式。其中，水解蛋黄粉含有少量的唾液酸糖肽(又称涎酸低聚糖肽)有益组分，但是唾液酸含量通常低于0.5％(蛋黄中天然含量不足0.1％)。

唾液酸是神经氨酸的衍生物,主要包括N-葡萄糖基神经氨酸和N-乙酰神经氨酸，唾液酸及其衍生物在治疗流感、神经性疾病、炎症等方面有重要的应用价值。例如，唾液酸对流感病毒唾液酸苷酶具有抑制性，蛋黄中的唾液酸主要以唾液酸糖肽的形式存在，唾液酸糖肽是由唾液酸与一些单糖如D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNac)、L-岩藻糖(Fuc)等连接而成的低聚糖肽类物质。唾液酸及其糖肽以其特有的生理功效，受到医药界和食品保健行业的重视。

蛋黄中的唾液酸低聚糖肽(主要为天冬酰胺N-结合型复合糖链，完整的唾液酸糖肽相对分子质量约为2800-2900)属于大分子，不能有效地发挥生理效价(现有技术中通常通过酸或酶水解从而制取含唾液酸制品)。水解蛋黄粉中的唾液酸糖肽通常是由蛋白酶切断还原末端与N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)结合的肽，从而得到在GlcNAc上有1-4个不等氨基酸残基的唾液酸寡糖肽。而无肽的唾液酸寡糖链则是由糖肽酶的作用形成。

蛋黄的来源包括鸡、鹌鹑、鹅、鸭、鸵鸟和鸽子等禽类的卵。其中优选鸡蛋，蛋黄中含有大量的唾液酸糖肽。由于鸡蛋黄中的唾液酸主要以复合低聚糖的形式存在，通常通过水解加工制取。

目前从鸡蛋卵黄中分离纯化唾液酸糖肽的方法还包括非酶解法的直接提取，例如先对卵黄进行处理后，经过两遍葡聚糖凝胶G-50分离，再经G-25脱盐，离子交换柱纯化，然后经Sephadex分离后，冻干得到样品。但是步骤多，周期长，且在纯化过程中严重损耗。而采用活性炭和高效液相色谱(HPLC)进行纯化则产率低，成本高，仅适用于实验室级别少量分离。

酶法生产唾液酸低聚糖肽流程为:鸡蛋蛋黄粉脱脂-酶解-超滤-干燥。尽管酶法可以大规模得到分子量在2000以内的唾液酸糖肽，但是其制得产品中的唾液酸含量较低，通常不超过0.5％。

CN 109824762 A公开了一种大规模分离、纯化制备唾液酸糖肽的方法，包括：(1)取新鲜未受精的鸡蛋黄，经过苯酚处理，离心取上清浓缩后，冻干得唾液酸糖肽粗品；(2)取医用脱脂棉装填成棉花亲水色谱柱；(3)将唾液酸糖肽粗品的溶液加到棉花亲水色谱柱上；(4)将棉花亲水色谱柱用乙腈梯度洗脱除盐和杂质，用水将糖肽洗脱冻干得到唾液酸糖肽的纯品。从50个鸡蛋黄中，分离纯化出300mg纯度95％的唾液酸糖肽。用时两天。

CN 110003319公开了一种基于水相分离联合提取多种蛋黄蛋白质的方法及产品，方法包括：(1)取新鲜蛋黄，加入蛋黄0.5～5倍体积的水相溶液进行稀释，搅拌，静置或离心分层；获得上层组分A、中层组分B和下层组分C；水相溶液为含有质量百分浓度0.1～0.5％的多糖类物质或者2～8％的低分子多聚物的水溶液；(2)取组分A制得蛋黄低密度脂蛋白；(3)取组分B提取制得卵黄免疫球蛋白；(4)取组分C制得卵黄高磷蛋白和蛋黄高密度脂蛋白。该工艺联合提取出4种蛋黄蛋白质，但是未公开唾液酸糖肽的纯化方法。

由上述现有技术可知，无论是采用Sephadex分离，还是离子交换色谱纯化等步骤，尽管可以获得较纯的唾液酸糖肽(纯度达90％以上)，但是均具有较长的纯化周期、较低的纯化效率，无法大规模工业化生产，仅适用于实验室级别糖肽的收集。这在食品领域显然是不适用的。

因此如何高效快速地提高食品用途的水解蛋黄粉中唾液酸化糖肽的含量在目前仍是一个挑战。针对现有技术纯化步骤多，成本高，周期长，样品损失较大，上样量少等缺点，需要开发新的分离填料和手段，以建立快速高效的提高蛋黄粉中唾液酸化糖肽含量的方法。同时，开发一种成本低、周期短、步骤少、效率高的富集唾液酸糖肽的蛋黄粉制备方法尤为必要。

发明内容

针对现有技术中水解蛋黄粉唾液酸糖肽含量低，唾液酸糖肽纯化方法存在的分离步骤多、周期长、成本高、规模小等不足，本发明的首要目的是提供一种效率高、周期短、成本低、适用工业化规模的唾液酸糖肽纯化富集方法以及含有高含量唾液酸糖肽的水解蛋黄粉的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种具有富集唾液酸糖肽(分子量不大于2KD)的水解蛋黄粉复合物，其具有不低于5wt％的唾液酸含量；优选地，所得水解蛋黄粉中唾液酸糖肽具有不低于8％的含量。进一步优选地，所得水解蛋黄粉中唾液酸糖肽具有5-10wt％的含量。

可选地，所述水解蛋黄粉复合物中还可包含3-10wt％含量的麦芽糊精添加剂，以利于冲调时的分散性和稳定性。

本发明方法采用的主要步骤包括：蛋黄粉的预处理、非特异性纯化富集、特异性纯化分离。具体包括：

1)将蛋黄原料进行脱脂处理后，经木瓜蛋白酶酶解、风味蛋白酶酶解中的至少一种酶解方式；优选采用复合酶解；

2)酶解液经超滤处理后，采用选自表面修饰的介孔二氧化硅微球进行非特异性初次富集；优选地，根据唾液酸多羟基的结构特点，采用氨基功能化表面修饰的介孔二氧化硅；

3)采用分子印迹法进行固相萃取富集：由蛋黄唾液酸糖肽结构片段作为模板分子制备分子印迹聚合物，进行特异性富集纯化，得到富集唾液酸糖肽的酶解产物。其中，所述的模板分子选自唾液酸糖肽的至少一个结构特征性分子片段，所述分子片段选自N-乙酰神经氨酸(NeuAc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)。

优选地，所述的模板分子为含有上述两种分子片段的复合模板。

其中，所述的分子印迹聚合物是以上述模板分子，在功能单体和交联剂存在下采用热聚合技术制备而成。分子印迹聚合物的制备方法是本领域熟知的。

具体地，本发明的技术方案如下。

第一个方面，本发明提供一种富集唾液酸(具有高含量唾液酸)的水解蛋黄粉复合物的制备方法，包括以下步骤S1-S4：

步骤S1：对蛋黄原料进行脱脂预处理

所述蛋黄原料选自干燥的蛋黄粉或新鲜蛋黄液(不含蛋清)，或二者混合物。优选选择成本较低的鸡蛋蛋黄粉作为原料。

采用蛋黄粉为原料时，按照如下步骤进行预处理：

取烘干干燥的蛋黄粉，按照重量体积比为1g:3-8mL的比例加入有机溶剂进行搅拌，然后过滤，干燥处理以除去有机溶剂。其中所述的有机溶剂选自无水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚中的至少一种，优选无水乙醇或丙酮。

示例性地：取干燥后的蛋黄粉1kg，加无水乙醇5L在室温下搅拌2-3h，抽滤，得脱脂蛋黄滤饼，再次用3L乙醇进行搅拌1-2h，再次抽滤，将滤饼烘干干燥去除乙醇溶剂。

当采用新鲜蛋黄液为原料时，优选按照如下步骤进行预处理：

按照重量体积比为1g:1-2mL的比例向蛋黄液中加入乙醇等有机溶剂，充分搅拌。将所得混合物高速离心20-30min，倾去上清液，向所得沉淀中加入适量有机溶剂再次搅拌，然后高速离心并除去上清液，重复2-3次，得到脱脂蛋黄。

步骤S2：酶解：向脱脂后蛋黄粉中，加入适量蒸馏水溶解(固含量5-20wt％)，在合适pH下加入一种或多种蛋白酶酶解，然后灭活。具体步骤如下：

1)将上述所得脱脂蛋黄粉溶液(优选控制固含量约10-15wt％)用盐酸溶液调节pH至4.8-5.2后，搅拌条件下加入1-2wt％(基于溶液质量，下同)的木瓜蛋白酶，在58-60℃下酶解10-12h；然后调节pH至6-6.5，加入0.8-1.5wt％的风味蛋白酶，在50-52℃下继续酶解10-12h；

2)酶解后在100℃水浴加热条件灭酶12-15min，然后冷却至室温，离心(8000rpm-12000rpm)除沉淀，所得液体部分用截留分子量为4000-6000Dal的滤膜进行超滤，收集滤液，得到含有唾液酸糖肽的蛋黄粉酶解液，真空浓缩至50％体积以下。

进一步地，可冷冻干燥或喷雾干燥，得到水解蛋黄粉粗品。

采用上述复合酶处理的水解蛋黄粉，取样分析表明，唾液酸的含量占总肽的0.5-0.8％(基于脱脂蛋黄粉原料计，收率约在1.5-2mg/g)，分子量基本在2000Dal内。

步骤S3：基于非特异性纯化进行初步富集唾液酸糖肽

1)将表面修饰的介孔二氧化硅微球材料作为固相填料装入固相分离柱，对填料先用乙腈冲洗进行预处理，再用0.1％体积分数的甲酸水溶液进行平衡；将浓缩后的蛋黄酶解液或用去离子水配制的酶解蛋黄粉溶液(优选10-30％wt)上柱；

2)先用1-2倍柱体积的乙腈水溶液(乙腈体积分数70％以上)洗脱除杂，然后用去离子水作为洗脱液充分洗脱，直至洗脱液中基本不含多肽组分。收集、合并含唾液酸糖肽组分的洗脱液，减压浓缩，得到经过非特异性纯化的、初步富集唾液酸糖肽的蛋黄多肽溶液。

乙腈水溶液的淋洗洗脱主要清洗非糖肽类的大分子肽，由于富含表面羟基基团的唾液酸与氨基表面修饰的二氧化硅微球之间的较强分子间作用力，只有在后续的低浓度乙腈溶液或纯水溶液才能洗脱下来，从而达到初步富集唾液酸糖肽的目的。

该步骤中，经过初步富集，唾液酸的含量可达3％以上。

其中，所述的表面修饰的介孔二氧化硅微球为氨基表面修饰的介孔二氧化硅微球，通过如下步骤制备得到：

1)表面羟基活化：将介孔二氧化硅在稀盐酸中充分搅拌，再用去离子水清洗，将所得硅球真空干燥。

2)氨基表面修饰：取表面羟基活化处理的介孔二氧化硅微球于甲苯中超声分散，滴加氨基硅烷偶联剂，升温回流12h，然后充分洗涤产物以除掉多余的氨基硅烷和有机溶剂，放入真空干燥箱中充分干燥。

其中，所述介孔二氧化硅微球选自粒径1-10微米，优选1-5微米。更优选比表面积不低于90m²/g的那些。

步骤S4：基于特异性纯化进行二次富集唾液酸糖肽

根据蛋黄唾液酸糖肽的结构特点，采用蛋黄唾液酸糖肽分子片段作为模板分子的分子印迹法对初步富集的蛋黄多肽溶液进行二次富集，该步骤包括将初次富集溶液浓缩后上样于含有双模板分子制备的分子印迹聚合物分离柱内，然后进行洗脱。

其中，模板分子选自蛋黄唾液酸糖肽的至少一个结构特征性分子片段，所述分子片段选自N-乙酰神经氨酸(NeuAc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)。

优选地，采用上述两个分子片段构建双模板分子；即所述的双模板分子为：N-乙酰神经氨酸(NeuAc)、N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)。

其中，所述的分子印迹聚合物是以上述双模板分子，在功能单体和交联剂存在下采用热聚合技术制备而成。分子印迹聚合物的制备可按照本领域一般方法进行，其制备方法是本领域熟知的。具体地，在双模板分子存在下，采用丙烯酰胺类功能单体，在丙烯酸酯等交联剂和引发剂存在下进行热聚合反应得到相应的聚合物，洗脱去除聚合物中的模板分子从而得到分子印迹聚合物。

优选地，所述双模板分子中N-乙酰神经氨酸模板分子摩尔含量不低于50％(优选不低于60％)。

示例性地，将上述双模板分子在有机溶剂中混匀，加入功能单体丙烯酰胺；再加入交联剂(例如，N,N'-亚甲基双丙烯酰胺或乙二醇二甲基丙烯酸酯)，以及适量引发剂。超声混匀后在氮气气氛下密封反应体系，60℃下搅拌反应16-24h；反应结束后过滤，依次用去离子水、有机溶剂充分洗涤，干燥，然后用去离子水进行处理除去模板分子，并用无水甲醇充分浸泡洗涤残余模板分子、功能单体等杂质，将所得聚合物微球进行真空干燥，从而获得分子印迹聚合物。

具体地，采用分子印迹法进行二次富集的步骤如下：

1)将制备的分子印迹聚合物微球装柱，用去离子水平衡，上样(优选质量浓度不超过20％)；然后用1-2倍柱体积的75-90％乙腈水溶液洗脱除杂。然后采用去离子水充分洗脱至基本不含肽组分，214nm紫外监测，合并收集含唾液酸糖肽的洗脱液。

3)洗脱液合并后经0.45μm滤膜过滤后，减压蒸发浓缩去除有机溶剂，然后进行冷冻干燥或喷雾干燥，得到具有富集唾液酸糖肽的水解蛋黄粉固体复合物，其中，唾液酸含量不低于5wt％(优选不低于8wt％)。经干燥处理、辐照灭菌后封装。

优选地，向浓缩液中加入麦芽糊精进行乳化均质处理后喷雾干燥。优选地，所得固体产品中麦芽糊精含量为5-10wt％。

该步骤以唾液酸糖肽特征结构作为分子模板制备分子印迹聚合物，不仅克服了完整唾液酸糖肽分子量较大难以形成合适印迹的缺陷(本领域中大分子难以有效形成印迹并采用分子印迹分离)，还通过双模板分子相结合的方式提高了不同氨基酸数目(由于蛋白酶解的影响，使得唾液酸糖肽完整性受到一定程度破坏)的唾液酸糖肽的特异性纯化效率，能够在工业规模上显著提高唾液酸糖肽的富集效率。

其中，本发明水解蛋黄粉中唾液酸糖肽的分子大小可采用现有技术中已知的方法进行：例如质谱测分子量(可参见CN109824762，WO 96/0225，JPA-H8-99988)。

由于唾液酸糖肽经水解后的肽段大小不一，因此产品中唾液酸糖肽的富集程度通常以唾液酸含量进行计算。目前蛋黄产品唾液酸含量的测定方法有比色法、荧光分光光度法、液相色谱法、高效液相-质谱联用法等。

本发明采用灵敏度高、重复性好的HPLC法测定水解蛋黄产品中的唾液酸质量含量(例如可参见：张昂等，鸡蛋中唾液酸含量的测定[J]，农产品加工,2010,4:69-71)，具体色谱参数为：采用Alltima C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为1.0％四氢呋喃水溶液(含0.2％磷酸)-乙腈(92:8)，流速为1.0mL/min，柱温为35℃，紫外检测波长230nm。其中，含唾液酸糖肽的产品预先经如下衍生化步骤处理：在浓度0.5mol/L的硫酸氢钠溶液中水解30min后，以邻苯二胺为衍生化试剂，在温度80℃水浴中衍生40min。然后用HPLC检测。

另外，质谱法测定唾液酸糖肽分子量之前需进行样品纯化，示例性地，纯化过程可采用如下步骤：

1)将50-100mL水加入到50g本发明的水解蛋黄粉复合物中，充分搅拌然后以8-10krpm离心20-30min，获得上清液。将沉淀采用相同的搅拌离心操作3次，合并上清；并真空浓缩至100mL以内。将所得浓缩溶液倒入500ml乙醇中醇沉，然后以10-12k rpm离心20-30min，收集含唾液酸糖肽的沉淀，称重。

2)使用装填量20g的C18硅胶树脂柱(或葡聚糖凝胶柱)作为分离柱进行分离。取1g上述固体沉淀溶于5ml去离子水中作为上样溶液进行上样，用1-2倍柱体积75-95％体积分数的乙腈水溶液洗涤除杂后，然后用去离子水进行洗脱。214nm紫外检测洗脱液中的唾液酸糖肽类化合物(或者也可采用体积分数10％的硫酸乙醇溶液显色法)，收集并合并相应的洗脱液，然后将洗脱液浓缩后冷冻干燥，得到纯品唾液酸糖肽，可用于质谱分子量测定，其中质谱参数条件可参考CN 109824762 A。

另外，可进行称量并计算得到水解蛋黄粉中的唾液酸糖肽含量，也可用HPLC检测所得唾液酸糖肽纯度，用HPLC进行纯度检测时，柱子优选选用反向C18柱。

第二个方面，本发明提供基于上述方法得到的富集唾液酸糖肽的水解蛋黄粉复合物产品，其特征在于，唾液酸糖肽含量不低于5wt％，优选不低于8wt％，且水解蛋黄粉中的总肽分子量在5KDa以内。

第三个方面，本发明还提供所述富集唾液酸糖肽的水解蛋黄粉复合物产品在食品或医药保健品领域中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下有益效果：

1)本发明避免了现有技术中采用Sephadex系列柱层析和离子交换色谱纯化等步骤，采用成本较低的、含有大量羟基/氨基的亲水性介孔二氧化硅作为纯化富集的填料介质，通过加压的水洗脱操作即可获得初步富集唾液酸糖肽的效果，成本较低且洗脱方便，0.8-1m高度的填料柱(柱高与直径比值20-50)完全洗脱用时仅数小时，且二氧化硅介质的物料损耗低(现有技术采用脱脂棉等作为分离介质会导致大量的物料粘附性损耗)，大批量操作可以适用于工业规模。

2)本发明对脱脂预处理后的蛋黄原料进行两次酶解，不仅得到水解蛋黄，而且使得唾液酸连接的肽段变短，采用介孔二氧化硅吸附和分子印迹聚合微球介质固相萃取时富集效率更高。由于完整的唾液酸糖肽分子较大(接近3KD)，在层析分离时容易与其他大分子同时洗脱下来，导致富集效果不佳；经过酶解之后，唾液酸衍生物的分子量在500-2000之间，与表面氨基修饰的二氧化硅填料介质的分子间吸附力增强，从而相对容易地与其他肽分子尤其是大分子肽分离开来。

3)本领域周知，由于大分子结构复杂，印迹效率低，因此采用分子印迹固相萃取法具有较差的技术效果和适用性。本发明发现，尽管直接采用唾液酸糖肽难以有效形成印迹聚合物，使得无法有效固相萃取分离，但是，采用唾液酸肽段的片段结构作为分子模板形成印迹聚合物时，仍具有一定程度的富集纯化效果(尽管与小分子的分离效果具有较大差距)。基于该发现，根据蛋黄唾液酸糖肽端基分子结构片段和中间结构片段设计了双模板分子，通过较小分子片段模板形成的聚合物，提高了唾液酸糖肽的固相萃取富集效率，使得水解蛋黄组合物中的唾液酸含量最高达到8％以上。从而克服了现有技术中水解蛋黄粉的唾液酸含量较低(通常低于1％)的缺陷。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些实施方式并非对本发明的保护范围构成任何形式的限定。

制备例1

制备水解蛋黄粉粗品

1)取干燥后的褐壳鸡蛋蛋黄粉2kg，加无水乙醇9L在室温下搅拌3h，抽滤，得脱脂蛋黄滤饼，再次用4L乙醇进行搅拌2h，再次抽滤，将滤饼烘干干燥去除乙醇溶剂，得到脱脂蛋黄粉。

2)称取1kg脱脂蛋黄粉，加入9kg蒸馏水，搅拌，用1mol/L的盐酸溶液调节pH至5，再加入120g木瓜蛋白酶(20万单位/g)，60℃搅拌反应12h；调节pH至6，加入90g风味蛋白酶(3万单位/g)，在52℃下继续酶解12h；酶解后100℃灭活15min，冷却后于8000rpm离心20min，合并收集溶液。所得溶液在5000D分子截留分子量条件下超滤处理，得到淡黄色的蛋黄酶解液。酶解液50℃下真空浓缩，喷雾干燥，得到约0.45kg淡黄色的酶解蛋黄粉粗品，其中HPLC测得产品中唾液酸含量约0.72％。

制备例2

制备表面修饰的介孔二氧化硅

1)将1kg介孔二氧化硅(粒径约5μm)超声分散于0.1mol/L盐酸中，室温搅拌24h，然后用大量去离子水清洗微球，将表面羟基活化的微球放入100℃真空干燥箱中充分干燥，备用。

2)取上述表面羟基活化处理的介孔二氧化硅微球于3L甲苯中超声分散15min，在氮气气氛下滴加3-氨丙基三甲氧基硅烷200g，升温回流约12h，回流反应完毕后用二氯甲烷充分洗涤除去氨基硅烷和甲苯溶剂，真空干燥箱中充分干燥，备用。

制备例3

制备分子印迹聚合物

将总计50mmol双模板分子NeuAc、GlcNAc(其中N-乙酰神经氨酸:N-乙酰葡萄糖胺摩尔比＝7:3)在2.5L的DMSO溶剂中搅拌混匀，加入0.8mol功能单体丙烯酰胺以及2mol N,N'-亚甲基双丙烯酰胺交联剂，以及25g偶氮二异丁腈。超声混匀后置换氮气气氛，密封反应体系，于60℃和200rpm下恒速搅拌反应24h；反应结束后，过滤，依次用去离子水、丙酮充分洗涤，干燥，然后用去离子水浸泡洗涤进行脱除模板分子，再用无水甲醇充分浸泡以洗涤残余模板分子、功能单体等有机物，最后将所得聚合物微球于50℃下进行真空干燥，获得双模板分子构建的印迹聚合物，粒径约30-50μm。

实施例1

1)将上述制备例方法得到的表面修饰的介孔二氧化硅微球材料作为填料装入高度80cm的分离柱，对装柱填料先用乙腈冲洗进行预处理，再用0.1％体积分数的甲酸水溶液进行平衡；将上述制备例得到的酶解蛋黄粉粗品0.2kg用去离子水配制成约15wt％的溶液，分批上柱；

2)先用2倍柱体积的乙腈水溶液(乙腈体积分数80％)洗脱除杂，然后用去离子水作为洗脱液充分洗脱，直至洗脱液中基本不含多肽组分。214nm紫外监测，收集、合并含唾液酸糖肽组分的洗脱液，得到经过初步富集唾液酸糖肽的水解蛋黄溶液，真空蒸发浓缩至约10wt％。HPLC测得初步富集后的唾液酸含量约4.1wt％。

3)二次富集：将按照上述制备例方法得到的NeuAc-GlcNAc双模板分子印迹聚合物微球装柱，高度60cm，用去离子水平衡后，原料分批上样；然后用1.5倍柱体积的75％乙腈水溶液洗脱除杂。除杂后采用去离子水充分洗脱至基本不含肽组分，214nm紫外监测洗脱液，合并收集含唾液酸糖肽的洗脱液。

4)洗脱液合并后经0.45μm滤膜过滤除菌后，减压蒸发浓缩，然后进行喷雾干燥，得到具有富集唾液酸糖肽的水解蛋黄粉固体复合物约13.8g，其中，HPLC测得唾液酸含量8.3wt％。经干燥处理、辐照灭菌后封装保存。

实施例2

1)将上述制备例方法得到的表面修饰的介孔二氧化硅微球材料作为填料装入高度0.6m的分离柱，对装柱填料先用乙腈冲洗进行预处理，再用0.1％体积分数的甲酸水溶液进行平衡；将上述制备例得到的酶解蛋黄粉粗品0.1kg用去离子水配制成约18wt％的溶液，分批上柱；

2)先用2倍柱体积的乙腈水溶液(乙腈体积分数85％)洗脱除杂，然后用去离子水作为洗脱液充分洗脱，直至洗脱液中基本不含多肽组分。214nm紫外监测，收集、合并含唾液酸糖肽组分的洗脱液，得到经过初步富集唾液酸糖肽的水解蛋黄溶液，真空蒸发浓缩至约10wt％。

3)二次富集：将按照上述制备例3方法得到的NeuAc-GlcNAc双模板分子印迹聚合物微球装柱，高度50cm，用去离子水平衡后原料分批上样；然后用2倍柱体积的75％乙腈水溶液洗脱除杂。除杂后采用去离子水充分洗脱至基本不含肽组分，214nm紫外监测洗脱液，合并收集含唾液酸糖肽的洗脱液。

4)洗脱液合并后经0.45μm滤膜过滤除菌后，减压蒸发浓缩，然后进行冷冻干燥，得到具有富集唾液酸糖肽的水解蛋黄粉固体复合物约7.2g，其中，HPLC测得复合物中唾液酸含量约7.6wt％。经干燥处理、辐照灭菌后封装保存。

实施例3

步骤1)-3)按照实施例1进行；

4)待洗脱液合并后经0.45μm滤膜过滤除菌后，减压蒸发浓缩，向浓缩液中加入麦芽糊精进行乳化均质处理后喷雾干燥。所得水解蛋黄粉固体产品中麦芽糊精含量约为7.8wt％。经干燥处理、辐照灭菌后封装保存。

对比例

该对比例不采用分子印迹萃取二次富集步骤，且采用普通二氧化硅填料，步骤如下：

1)将未经表面处理的普通介孔二氧化硅微球材料作为填料装入高度80cm的分离柱，对装柱填料先用乙腈冲洗进行预处理，再用0.1％体积分数的甲酸水溶液进行平衡；将上述制备例1得到的酶解蛋黄粉粗品0.1kg用去离子水配制成约15wt％的溶液，分批上柱；

2)先用2倍柱体积的乙腈水溶液(乙腈体积分数80％)洗脱除杂，然后用去离子水作为洗脱液充分洗脱，直至洗脱液中基本不含多肽组分。收集、合并含唾液酸糖肽组分的洗脱液，真空蒸发浓缩然后喷雾干燥，得到水解蛋黄粉固体，HPLC测得唾液酸含量1.7wt％。

以上实施例并非限制本发明的技术方案，本领域的普通技术人员可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，这些修改或者替换并不脱离本发明技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种富集唾液酸的水解蛋黄粉复合物的制备方法，所述水解蛋黄粉复合物中唾液酸含量不低于5wt％；所述制备方法包括将蛋黄原料进行脱脂处理、酶解处理从而获得酶解液的步骤；其特征在于，还包括以下步骤：

1)将酶解液经超滤处理后，采用表面修饰的介孔二氧化硅微球进行非特异性初次富集；优选地，采用氨基功能化表面修饰的介孔二氧化硅；

2)采用分子印迹法进行固相萃取富集：由蛋黄唾液酸糖肽结构片段作为模板分子制备分子印迹聚合物，进行特异性富集纯化，从而得到富集唾液酸糖肽的水解蛋黄粉复合物；其中，所述的模板分子选自蛋黄唾液酸糖肽的至少一个结构特征性分子片段，所述结构特征性分子片段选自N-乙酰神经氨酸或N-乙酰葡萄糖胺；

优选地，所述水解蛋黄粉复合物的制备还包含添加麦芽糊精的步骤，基于复合物总重计，添加量为3-10wt％。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：

步骤S1：对蛋黄原料进行脱脂预处理

所述蛋黄原料选自干燥的蛋黄粉或新鲜蛋黄液，优选蛋黄粉；采用有机溶剂进行脱脂；

步骤S2：向脱脂后蛋黄粉中加入适量蒸馏水溶解得到5-20wt％的溶液，在合适pH下加入至少一种蛋白酶进行酶解；酶解后加热灭酶，冷却至室温，离心除沉淀，所得液体用截留分子量为4000-6000D的超滤滤膜进行超滤，收集滤液，得到含有唾液酸糖肽的蛋黄粉酶解液，真空浓缩；进一步地，可进行冷冻干燥或喷雾干燥，以得到水解蛋黄粉粗品；

步骤S3：初步富集唾液酸糖肽

1)将表面修饰的介孔二氧化硅微球材料作为固相填料装入固相分离柱，对填料先用乙腈冲洗进行预处理，再用甲酸水溶液进行平衡；将浓缩后的上述步骤得到的蛋黄酶解液上柱；

2)先用1-2倍柱体积的乙腈水溶液洗脱除杂，其中乙腈溶液体积分数70％以上，然后用去离子水作为洗脱液充分洗脱；收集、合并含唾液酸糖肽组分的洗脱液，减压浓缩，得到初步富集唾液酸糖肽的蛋黄多肽溶液；

步骤S4：二次富集唾液酸糖肽

将上述初次富集唾液酸糖肽的蛋黄多肽溶液浓缩后，上样于基于双模板分子制备的分子印迹聚合物微球填料的分离柱内，进行固相萃取；先用1-2倍柱体积的75-90％乙腈水溶液洗脱除杂，然后采用去离子水充分洗脱；

其中，所述的双模板分子为N-乙酰神经氨酸、N-乙酰葡萄糖胺；

优选地，所述双模板分子中N-乙酰神经氨酸模板分子摩尔含量不低于60％。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S4具体操作如下：

1)将分子印迹聚合物微球装柱后用去离子水平衡，上样；然后用1-2倍柱体积的75-90％乙腈水溶液洗脱除杂；采用去离子水充分洗脱至基本不含肽组分，合并收集含唾液酸糖肽的洗脱液；

其中，所述分子印迹聚合物是在双模板分子存在下，采用丙烯酰胺类功能单体，在交联剂和引发剂存在下进行热聚合反应制备得到；

2)洗脱液合并后经0.45μm滤膜过滤，减压蒸发浓缩去除有机溶剂，然后进行冷冻干燥或喷雾干燥，得到具有富集唾液酸糖肽的水解蛋黄粉固体复合物，其中，唾液酸含量不低于5wt％。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中酶解的具体操作如下：

将含量10-15wt％的脱脂蛋黄粉溶液用盐酸溶液调节pH至4.8-5.2后，搅拌条件下加入基于溶液质量1-2％的木瓜蛋白酶，在58-60℃下酶解10-12h；然后调节pH至6-6.5，加入0.8-1.5wt％的风味蛋白酶，在50-52℃下继续酶解10-12h。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中表面修饰的介孔二氧化硅微球通过如下步骤制备得到：

1)表面羟基活化：将介孔二氧化硅在稀盐酸中充分搅拌，再用去离子水清洗，将所得硅球真空干燥；

2)氨基表面修饰：取表面羟基活化处理的介孔二氧化硅微球于甲苯中超声分散，滴加氨基硅烷偶联剂，升温回流12h，然后充分洗涤产物以除掉多余的氨基硅烷和有机溶剂，放入真空干燥箱中充分干燥。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中对蛋黄原料进行脱脂预处理步骤如下：

1)取干燥的蛋黄粉，按照重量体积比为1g:3-8mL的比例加入有机溶剂进行搅拌，然后过滤，干燥处理以除去有机溶剂；其中所述的有机溶剂选自无水乙醇、丙酮、乙醚、石油醚中的至少一种；

2)当采用新鲜蛋黄液为原料时，按照如下步骤进行预处理：

按照重量体积比为1g:1-2mL的比例向蛋黄液中加入有机溶剂，充分搅拌；将所得混合物高速离心20-30min，倾去上清液，向所得沉淀中加入适量有机溶剂再次搅拌，然后高速离心并除去上清液，重复2-3次，得到脱脂蛋黄。

7.根据权利要求1-6任一项所述方法制备得到的水解蛋黄粉复合物。

8.权利要求7所述的水解蛋黄粉复合物，其特征在于，其中唾液酸含量不低于5wt％。

9.权利要求8所述的水解蛋黄粉复合物，其特征在于，还含有麦芽糊精添加剂。

10.权利要求7-9所述的水解蛋黄粉复合物在食品领域中的应用。