CN117136297A - 比色生物传感器、其制备方法及利用其的抗生素敏感性检查方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及比色生物传感器、其制备方法及利用其的抗生素敏感性检查方法，更具体地，本发明中可以制备包含含有聚二乙炔与水凝胶高分子(海藻酸盐、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG‑DA)等)的多孔水凝胶结构物以及微生物营养源的比色生物传感器，可以将其应用在能够实施测定并示出优秀的灵敏度(sensitivity)的微生物检测用比色生物传感器或微生物的抗生素敏感性检查方法中。

Description

比色生物传感器、其制备方法及利用其的抗生素敏感性检查 方法
技术领域
本发明涉及比色生物传感器、其制备方法及利用其的抗生素敏感性检查方法。
背景技术
比色生物传感器为可以在细胞水平(cellular level)或生物体内水平(in vivolevel)中利用比色变化或带有荧光的纳米物质的特性检测信号来在数据分析方面提供更方便且有效的信息的物质或装置。
作为这样的生物传感器的传感器物质，聚二乙炔(polydiacetylene，PDA)具有易于在水溶液相中合成的优点，由于脱氧核糖核酸(DNA)、蛋白质、碳水化合物及离子等生物学上重要的目标物质大部分带有亲水性，因此有利于将其用作传感器物质。并且，已知聚二乙炔无需使用附加的溶剂或引发剂，通过紫外线(UV)刺激就变色为蓝色，通过外部的物理、化学、生物学刺激变色为红色。
另一方面，用来筛选能够抑制微生物的生长的抗生素的检查称为抗生素敏感性检查，这是选择能够对微生物使用的抗生素种类的直接且重要的检查。并且，在对患者处方适当的抗生素时，可以考虑处方方法及次数、费用、副作用来给出适当处方。在利用敏感性结果的情况下，可以减少凭经验处方抗生素时可能产生的治疗费用增加和保护者的失望感，在获得细菌耐药性和减少并发症的同时提供缩减患者的康复期间的机会。
最为普遍的抗生素敏感性检查有圆片扩散法(disk diffusion technique)和肉汤稀释法(broth dilution technique)。然而，这些方法需要经过培养细菌数天并鉴定细菌后测定浊度的过程，这样的过程具有耗时长并需要许多劳动力的缺点。
因此，需要开发能够实时测定，缩短时间并减少劳动力来克服现有抗生素敏感性检查法的问题的方法。
于是，本发明人制备包含含有的聚二乙炔及水凝胶高分子(海藻酸盐、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)等(etc.))的多孔水凝胶结构物以及微生物营养源的比色生物传感器，着眼于将其应用为能够实时测定并能够示出优秀的灵敏度(sensitivity)的微生物检测用比色生物传感器或微生物的抗生素敏感性检查方法，从而完成本发明。
发明内容
技术问题
本发明即考虑上述问题而提出，本发明的目的在于，制备包含含有聚二乙炔及水凝胶高分子(海藻酸盐、聚乙二醇二丙烯酸酯等)的多孔水凝胶结构物以及微生物营养源的比色生物传感器，将其应用于能够实施测定并能够示出优秀的灵敏度的微生物的抗生素敏感性检查方法中。
本发明所要解决的问题不限定于上述体积的问题，本发明所属技术领域的普通技术人员可以通过下述记载明确理解未提及的或其他问题。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供包含由水凝胶高分子与聚二乙炔形成的多孔水凝胶结构物以及微生物营养源(nutrient source)的比色生物传感器。
上述微生物营养源可以被封装在上述多孔水凝胶结构物的内部。
上述微生物营养源可以以包裹上述多孔水凝胶结构物表面的壳形式形成。
上述水凝胶高分子可以为选自由海藻酸盐,琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)、聚乙烯醇(PVA)及聚丙烯酰胺(PAM)组成的组中的一种以上。
上述微生物营养源可以为选自由LB(Luria-Berani broth)肉汤、LB琼脂(agar)培养基、胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptic Soy Broth；TSB)培养基、乳酸杆菌(Lactobacilli)MRS培养基、R2A培养基(MB-R2230)、M-H(Mueller Hinton)培养基及包含酪蛋白水解物(casamino acid)的培养基组成的组中的一种以上。
上述比色生物传感器可以通过颜色变化来检测微生物。
上述微生物可以为选自由细菌(bacterium)、霉菌(fungus)、海藻(alga)、从原生动物(protozoan)及后生动物(metazoan)分离的细胞组成的组中的一种以上。
并且，本发明提供抗生素敏感性检查方法，包括在本发明的比色生物传感器及抗生素的存在下培养微生物的步骤。
若上述比色生物传感器没有比色变化，则可以判断为上述微生物对上述抗生素具有敏感性，若上述比色生物传感器有比色变化，则可以判断为上述微生物对上述抗生素具有耐药性。
并且，本发明提供包含本发明的比色生物传感器及抗生素的抗生素敏感性检查用试剂盒。
并且，本发明提供比色生物传感器的制备方法，包括：步骤(a)，获得包含聚二乙炔溶液、水凝胶高分子及微生物营养源的水凝胶前驱液；步骤(b)，向氯化钙溶液滴加上述水凝胶前驱液来获得水凝胶结构物；以及步骤(c)，向上述水凝胶结构物照射200nm至300nm波长的紫外线。
上述水凝胶前驱液中的上述水凝胶高分子的浓度可以为1.0％(w/v)至15.0％(w/v)。
上述聚二乙炔溶液的浓度可以为0.5mM至5mM。
上述氯化钙溶液的浓度可以为0.5％(w/v)至20.0％(w/v)。
上述比色生物传感器可以包含由上述水凝胶高分子与聚二乙炔形成的多孔水凝胶结构物及上述微生物营养源，上述微生物营养源可以被封装在上述多孔水凝胶结构物的内部，或者上述微生物营养源可以以包裹上述多孔水凝胶结构物表面的壳形式形成。
发明的效果
根据本发明，可以制备包含含有聚二乙炔及水凝胶高分子的多孔水凝胶结构物以及微生物营养源的比色生物传感器，可以将其应用于能够实施测定并能够示出优秀的灵敏度的微生物的抗生素敏感性检查方法中。
本发明的效果不限定于上述效果，而应理解为包括能够从本发明的详细说明或发明要求保护范围中记载的结构推论的所有效果。
附图说明
图1为示出通过本发明一实施例的比色生物传感器检测微生物的过程的图像(比色生物传感器：微生物培养(Incubation with bacteria)前蓝色→微生物培养后红色)。
图2为示出根据本发明的一实施例制备分层形态(Layered form)((a)部分)及封装形态(Encapsulated form)((b)部分)的比色生物传感器的过程的图像(聚二乙炔-海藻酸盐珠(PDA-Alginate Beads)：蓝色，LB：黄色，聚二乙炔-海藻酸盐-LB珠(PDA-Alginate-LB Beads)：蓝色)。
图3为示出根据本发明的一实施例制备的分层形态((a)部分)及封装形态((b)部分)的比色生物传感器的图像。
图4为示出LB肉汤(broth)培养基位于封装形态的比色生物传感器的外部((a)部分)及内部((b)部分)时的灵敏度差异的实验结果的图像(T1：0h，T2：6h，T3：12h，T4：18h，T5：24h)。
图5为有关利用封装形态的比色生物传感器的抗生素敏感性实验结果的图像。
具体实施方式
以下，参照附图更为详细地说明本发明的实施例。本发明的实施例可以变形为多种形态，本发明的范围不应解释为限定于下述实施例。本实施例仅为向本发明所属技术领域的普通技术人员更为完整地说明本发明而提供。因此，附图中要素的形状为更为明确的说明而夸张。
以往，普遍进行抗生素敏感性检查有圆片扩散法和肉汤稀释法。然而，这些方法需要经过培养细菌数天并鉴定细菌后测定浊度的过程，这样的过程具有耗时长并需要许多劳动力的缺点。
因此，需要开发能够实时测定，缩短时间并减少劳动力来克服现有抗生素敏感性检查法的问题的方法。
为了解决上述问题，本发明中制备包含含有聚二乙炔及水凝胶高分子的多孔水凝胶结构物以及微生物营养源的比色生物传感器，将其应用于能够实施测定并能够示出优秀的灵敏度的微生物的抗生素敏感性检查方法中。
比色生物传感器
本发明提供包含由水凝胶高分子与聚二乙炔形成的多孔水凝胶结构物及微生物营养源的比色生物传感器。
根据本发明的一实施例，上述比色生物传感器可以通过颜色变化来检测微生物。具体地，在将上述比色生物传感器与微生物一同培养的情况下，传感器(内部)中包含的微生物营养源向外部扩散，微生物利用其作为生长源来实现增殖。作为随着这样的微生物增殖而产生的代谢产物的生物分子(biomolecule)通过多孔水凝胶结构物的气孔渗透到水凝胶内部来刺激聚二乙炔，从而可以诱导比色生物传感器的颜色变化。参照图1，可以确认上述比色生物传感器在微生物培养前带有蓝色，微生物培养进行后，通过前述的颜色变化机制变色为红色。
更具体地，上述微生物，尤其是细菌具有通过识别周围环境的生长源来生长的特性。即，细菌可以向生长源所在的方向聚集来生长。本发明中利用这样的特性，以使细菌在距作为传感器物质的聚二乙炔最近的位置生长的方式在水凝胶中包含能够起到生长源作用的营养源和聚乙二炔。
并且，聚二乙炔具有如下特征：随着表面发生的多种刺激(温度、pH、电/物理刺激等)引起内部的结构变化，并随之发生由蓝色变为红色的颜色变化。据此，可以随着细菌生成的代谢产物中的一部分与聚二乙炔表面的相互作用带来的刺激引起颜色变化。
这样的颜色变化可以通过肉眼确认，也可以通过图像处理装置以数值的方式来分析。因此，可以通过颜色变化来检测有无微生物及微生物的增殖速度。
更具体地，上述比色生物传感器可以通过由蓝色向红色的变色现象检测有无微生物及微生物的增殖速度。上述比色生物传感器可以带有蓝色，如前所述，可以通过与微生物的培养过程中从微生物中生成的生物分子示出变色为红色的现象。
根据本发明的一实施例，上述水凝胶高分子可以为选自由海藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇及聚丙烯酰胺组成的组中的一种以上，但不限定于此。具体地，上述水凝胶高分子可以为海藻酸盐，在此情况下可以显出更为优秀的颜色变化灵敏度。
根据本发明的一实施例，上述多孔水凝胶结构物可以为球形，但不限定于此，具体地，可以为珠形态。
根据本发明的一实施例，上述微生物营养源可以以包裹上述多孔水凝胶结构物表面的壳形式形成(参照图3的(a)部分)。在此情况下，微生物更容易接近微生物营养源，从而具有提高对微生物的灵敏度的效果。
根据本发明的一实施例，上述微生物营养源可以被封装在上述多孔水凝胶结构物的内部(参照图3的(b)部分)。在此情况下，奇异的是，确认到与微生物营养源包裹上述结构物表面的情况相比，进一步提高对微生物的灵敏度。
上述微生物营养源可以为选自由LB肉汤、LB琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基、乳酸杆菌MRS培养基、R2A培养基(MB-R2230)、M-H培养基及包含酪蛋白水解物的培养基组成的组中的一种以上。具体地，上述微生物营养源可以为LB培养基。更具体地，上述微生物营养源可以为由胰蛋白胨、酵母提取物及氯化钠(NaCl)组成的LB肉汤培养基，或者混合胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠及琼脂的LB琼脂培养基，但不限定于此。上述微生物营养源不限定于上述种类，只要是能够用作所要检测的目标微生物的生长源的，就可以不受限制地使用。
上述微生物可以为选自由细菌、霉菌、海藻、从原生动物及后生动物分离的细胞组成的组中的一种以上，但不限定于此。更具体地，上述微生物可以为作为代表性革兰氏阴性菌(Gram-negative bacteria)的大肠杆菌(Escherichia)属、假单胞菌(Pseudomonas)属的细菌，可以为作为代表性革兰氏阳性菌(Gram-positive bacteria)葡萄球菌(Staphylococcus)属或肠球菌(Enterococcus)属(genus)的细菌。
根据本发明的一实施例，本发明的培养可以在灭菌水中进行。培养微生物时所需的培养基成分包含在本发明的营养源中，存在于上述多孔水凝胶结构物的内部或外部，因此，微生物的培养无需其他培养基，可以在灭菌水中进行，但不限定于此。
上述培养是为获得所要检测的微生物的增殖(Proliferation)而进行的。用于微生物培养的技术及条件，尤其是关于各微生物，用于本发明的微生物增殖的适当的营养培养基、最佳的生长温度，例如许多成为哺乳动物病原体的许多细菌所需的37℃以及所需的其他条件是本发明所属技术领域中广为人知的。各微生物的培养时间根据生长速度及传代时间(generation time)，即，微生物分裂为2个后代微生物所需的时间的不同而不同。通常，上述培养时间为72小时、48小时或小于24小时。并且，上述培养在能够获得所需的信息时马上中止，即，在能够获得检测、定量或对抗生素的敏感性时马上中止。
比色生物传感器的用途
本发明提供抗生素敏感性检查方法，包括在本发明的比色生物传感器及抗生素的存在下培养微生物的步骤。
上述抗生素敏感性(antibiotic susceptibility)也称为抗生素灵敏性，是指相关微生物(菌株)通过特定抗生素收到繁殖抑制等影响，根据现有抗生素敏感性检查法，将处理抗生素时处理抗生素的部分周围不生成菌的情况称为具有敏感性。作为一例，抗生素敏感性检查结果可以分为敏感性、中度敏感性(中度耐药性)及抵抗性(耐药性)。为了治疗因微生物引起的感染症，应使用具有敏感性的抗生素，这表示判读为上述敏感性(susceptible)的菌株的感染可以使用建议剂量的抗菌剂治疗该菌种、该部位的感染，中度敏感性(或者中度耐药性，intermediate susceptible)表示对于试验菌株的抗菌剂的最低抑菌浓度与血中或组织浓度相似，因此表示治疗效果比对于敏感性菌株的情况低，是指在尿液等抗菌剂浓缩的部位被感染时或以最大剂量给药能够大量给药的药剂时才有治疗效果，而抵抗性(或者耐药性，resistant)表示以普通剂量给药时无法以血中浓度来治疗。
根据本发明的一实施例，若上述比色生物传感器没有比色变化，则可以判断为上述微生物对上述抗生素具有敏感性，若上述比色生物传感器有比色变化，则可以判断为上述微生物对上述抗生素具有抵抗性。
具体地，如前所述，在将上述比色生物传感器与微生物一同培养的情况下，传感器(内部)中包含的微生物营养源向外部移动，微生物利用其作为生长源来实现增殖。作为通过这样的微生物增殖生成的代谢产物的生物分子通过多孔水凝胶结构物的气孔渗透到水凝胶内部来刺激聚二乙炔，从而可以诱导比色生物传感器的颜色变化。
在此情况下，当上述生物传感器周边部存在抗生素时，显出对上述抗生素的敏感性的微生物的增殖被中断，不生成作为代谢产物的生物分子，其结果为无法观察到上述比色生物传感器的比色变化。相反，显出对上述抗生素的耐药性(耐药性)微生物的增殖得以进行而生成作为代谢产物的生物分子，其结果为可以观察到上述比色生物传感器的比色变化。
如上所述，可以通过利用本发明的比色生物传感器来提供能够实施测定且能够示出优秀的灵敏度的微生物的抗生素敏感性检查方法。
根据本发明的一实施例，上述抗生素可以为选自由青霉素类抗生素、糖肽(glycopeptide)类抗生素、喹诺酮类抗生素、头孢菌素类抗生素、四环素类抗生素、磺胺类抗生素、聚醚类抗生素及肽类抗生素组成的组中的一种以上，但不限定于此。具体地，上述抗生素青霉素类及糖肽类抗生素。
并且，本发明提供包含本发明的比色生物传感器及抗生素的抗生素敏感性检查用试剂盒。具体地，上述比色生物传感器可以提供为可以确认目标物质(微生物等)对特定抗生素的敏感性或抵抗性的通常的试剂盒。
作为一具体例，上述抗生素敏感性检查用试剂盒可以分别单独包括放入或处理上述比色生物传感器的孔培养板以及抗生素，或者可以为放入或处理上述比色生物传感器与抗生素的孔培养板。在此情况下，构成试剂盒的各孔中可以包含互不相同浓度的上述抗生素，例如，可以将以0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL等不同浓度包含各种检查对象抗生素的培养基放入构成上述试剂盒的各孔中。上述培养基的量根据构成多孔培养板的单独孔的容积的不同而不同，通常，可以平均每孔中放入200μl，但不限定于此。
构成上述试剂盒的各孔还可以包含灭菌水。如前所述，培养微生物时所需的培养基成分包含在的本发明的营养源中来存在于上述多孔水凝胶结构物内部或外部，因此，无需其他培养基来用于微生物的培养，可以在灭菌水中进行培养，但不限定于此。
比色生物传感器的制备方法
本发明提供比色生物传感器的制备方法，包括：步骤(a)，获得包含聚二乙炔溶液、水凝胶高分子及微生物营养源的水凝胶前驱液；步骤(b)，向氯化钙溶液滴加上述水凝胶前驱液来获得水凝胶结构物；以及步骤(c)，向上述水凝胶结构物照射200nm至300nm波长的紫外线。
根据本发明的一实施例，上述步骤(a)为准备用于形成水凝胶结构物的水凝胶前驱液步骤，可以通过混合聚二乙炔溶液、水凝胶高分子及微生物营养源来进行。
上述水凝胶前驱液内上述水凝胶高分子的浓度可以为1.0％(w/v)至15.0％(w/v)、5.0％(w/v)至13.0％(w/v)或8.0％(w/v)至10.0％(w/v)。在上述水凝胶高分子的浓度为1.0％(w/v)以上的情况下，凝胶的形成能力优秀，在浓度为15.0％(w/v)以下的情况下，对于球形的多孔水凝胶结构物的形态保存能力优秀，粘度适当，因此具有易于操作的效果。奇异的是，在保持上述水凝胶高分子的浓度范围的情况下，即使以多种方式调节聚二乙炔溶液及微生物营养源的混合比例，仍可以保持上述临界效果。
上述聚二乙炔溶液的浓度可以为0.5mM至5mM、0.5mM至4mM或1.0mM至3mM。上述聚二乙炔溶液的浓度可以给上述步骤(b)中获得水凝胶结构物的过程带来影响，在上述聚二乙炔溶液的浓度范围内，具有易于形成水凝胶结构物的效果。
上述氯化钙溶液的浓度可以为0.5％(w/v)至20.0％(w/v)、0.5％(w/v)至10.0％(w/v)、0.5％(w/v)至5.0％(w/v)或0.5％(w/v)至1.5％(w/v)。在上述氯化钙溶液的浓度范围内，具有进一步提高生成的比色生物传感器的灵敏度的效果。
根据本发明的一实施例，上述步骤(b)为通过上述水凝胶前驱液与上述氯化钙的反应来获得凝胶化的水凝胶结构物的步骤，为了不使滴加的液滴凝聚，可以利用磁棒同时进行搅拌上述氯化钙溶液的过程。
根据本发明的一实施例，在上述步骤(b)之后，还可以进行使用蒸馏水洗涤上述凝胶化完毕的水凝胶结构物的过程。
根据本发明的一实施例，上述步骤(c)可以为向上述水凝胶结构物照射200nm至300nm、230nm至280nm、240nm至270nm或250nm至260nm波长的紫外线来获得带有蓝色的比色生物传感器的步骤。在照射上述波长范围的紫外线的情况下，能够易于进行向蓝色的变色。
上述比色生物传感器可以包含由上述水凝胶高分子与聚二乙炔形成的多孔水凝胶结构物及上述微生物营养源，上述微生物营养源可以被封装在上述多孔水凝胶结构物内部，或者上述微生物营养源以包裹上述多孔水凝胶结构物表面的壳形式形成，但其形态不限定于此。
只要不相互矛盾，本发明的比色生物传感器、其用途及其制备方法中提及的事项同样适用。
以上说明仅利用一实例来说明本发明的技术思想，本发明所属技术领域的普通技术人员可以在不脱离本发明的本质特性的范围内进行多种修正及变形。因此，本发明中说明的实施例仅用于说明本发明的技术思想，而非出于限定的目的，本发明的技术思想不限定于这些实施例。本发明的保护范围应由发明要求保护范围来解释，与之同等范围内的所有技术思想都应解释为包括在本发明的权利范围内。
以下，通过实施例更为详细地说明本发明。
实施例
实施例1.制备封装形态的比色生物传感器
混合3mM的聚二乙炔(Polydiacetylene)溶液、海藻酸盐(相对于水凝胶前驱液的9％(w/v))及LB肉汤(broth)培养基来准备水凝胶前驱液。通过注射器针头向装满1％(w/v)的氯化钙(CaCl2)溶液的烧杯滴加(dripping)上述水凝胶前驱液。为了不使上述滴加的液滴凝聚，利用磁棒持续搅拌氯化钙溶液使水凝胶前驱液与氯化钙反应来凝胶化(gelation)为凝胶(gel)形态。从氯化钙溶液中拿出凝胶化完毕的水凝胶结构物并使用蒸馏水洗涤后，照射254nm波长的紫外线来将上述水凝胶结构物内部的聚二乙炔的颜色变化为蓝色，从而制备封装形态的比色生物传感器(参照图2的(b)部分及图3的(b)部分)。
实施例2.制备分层形态的比色生物传感器
混合3mM的聚二乙炔溶液与海藻酸盐(相对于水凝胶前驱液的9％(w/v))来准备水凝胶前驱液。通过注射器针头向装满1％(w/v)的氯化钙溶液的烧杯滴加上述水凝胶前驱液。为了不使上述滴加的液滴凝聚，利用磁棒持续搅拌氯化钙溶液使水凝胶前驱液与氯化钙反应来凝胶化为凝胶形态。从氯化钙溶液中拿出凝胶化完毕的水凝胶结构物并使用蒸馏水洗涤后，照射254nm波长的紫外线来将上述水凝胶结构物内部的聚二乙炔的颜色变化为蓝色。然后，使用吸管向凝胶化完毕的水凝胶结构物滴加疏水性液相的LB琼脂培养基来以薄膜形态覆盖。涂层的LB琼脂培养基由于低的温度而马上凝固，最终制备以分层(layered)的形态具有细菌生长源的比色生物传感器(参照图2的(a)部分及图3的(a)部分)。
实验例1.敏感性灵敏度比较实验
对于LB肉汤培养基位于封装形态的比色生物传感器外部(图4的(a)部分)及内部(图4的(b))的情况，进行传感器的敏感性灵敏度比较实验，结果如图4所示。
具体地，在通过上述实施例1制备封装形态的比色生物传感器时，准备为不包含LB肉汤培养基或包含LB肉汤培养基的形态。在装有不包含LB培养基的生物传感器的孔中装满108CFU/mL的大肠杆菌和LB培养基(图4的(a)部分)。在装有包含LB培养基的生物传感器的孔中装满108CFU/mL的大肠杆菌(图4(b)部分)。为了构成相同的实验条件，以相同的浓度准备LB肉汤培养基。为了诱导大肠杆菌的生长及由其带来的生物传感器的颜色变化，在37℃的条件下培养并分别在0小时、6小时、12小时、18小时以及24小时拍摄各孔培养板的照片来观察颜色变化。
参照图4，在LB肉汤培养基包含在生物传感器内部的情况下(图4(b)部分)，与不包含在生物传感器内部的情况(图4的(a)部分)相比，可以确认聚二乙炔的颜色变化更快。具体地，参照图4(b)部分，在LB肉汤培养基位于比色生物传感器内部的情况下，从6小时(T2)后开始出现颜色变化(蓝色→红色)，但参照图4的(a)部分，在LB肉汤培养基位于比色生物传感器外部的情况下，18小时(T4)后才出现颜色变化(蓝色→红色)。由此可以判断，大肠杆菌识别到生物传感器内部的LB肉汤培养基来在生物传感器表面生长，由此释放的生物分子更易于向生物传感器内部移动，从而更快的诱导聚二乙炔的颜色变化。
实验例2.抗生素敏感性检查试验
进行上述实施例1中制备的封装形态的比色生物传感器的抗生素敏感性检查实验，结果如图5所示。
具体地，将上述实施例1中制备的封装形态的比色生物传感器放入包含2μg/mL、4μg/mL的氨苄青霉素(ampicillin)的孔(图5的B部分、图5的C部分)以及包含0.25μg/mL、2μg/mL、4μg/mL的万古霉素(vancomycin)抗生素的孔(图5的D部分、图5的E部分、图5的F部分)中。并且，为了抗生素敏感性试验，向各孔中加入106CFU/mL的对氨苄青霉素具有抵抗性而对万古霉素具有敏感性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin ResistantStaphylococcus Aureus，MRSA)。为了比较实验，还准备只装有比色生物传感器和细菌的孔(图5的A部分)以及只装有比色生物传感器的孔(图5的G部分)。为了诱导耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长及由其引起的生物传感器的颜色变化，在37℃的条件下培养并分别在0小时、5小时、6小时、7小时、9小时、12小时、13小时以及15小时拍摄各孔培养板的照片来比较颜色变化。
参照图5，在只培养比色生物传感器与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的情况下，7小时后开始出现颜色变化(蓝色→红色)(图5的A部分)。相反，在没有抗生素和细菌的情况下，经过15小时(t＝15)后仍未出现颜色变化(图5的G部分)。在放入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和比色生物传感器的空中与2μg/mL的氨苄青霉素一同培养的情况下，9小时后开始出现颜色变化(蓝色→红色)(图5的B部分)，在与4μg/mL的氨苄青霉素一同培养的情况下，13小时(t＝13)后开始出现颜色变化(蓝色→红色)(图5的C部分)。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌具有对氨苄青霉素抗生素的抵抗性，因此可以判断在一同培养的情况下引起比色生物传感器的颜色变化。然后，在放入耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和比色生物传感器的孔中与0.25μg/mL的万古霉素一同派样的情况下，9小时(t＝9)后开始出现颜色变化(蓝色→红色)(图5的D部分)，但在与2μg/mL、4μg/mL的万古霉素一同培养的情况下，不出现颜色变化(图5的E部分、图5的F部分)。将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌与万古霉素抗生素一同培养时，从2μg/mL的浓度开始不出现颜色变化，因此可以判断对万古霉素抗生素从2μg/mL的浓度开始具有敏感性。
因此，可以确认本发明的比色生物传感器可以在能够实施测定并示出优秀的灵敏度的微生物检测用比色生物传感器或微生物的抗生素敏感性检查方法中有效使用。
以上的详细说明为例示本发明。并且，前述内容仅示出本发明的优选实施形态来说明，本发明可以在多种其他组合、变更及环境中使用。即，可以在本说明书中公开的本发明的概念的范围、与著述的公开内容同等的范围和/或本发明所属技术领域的技术或指示的范围内进行变更或修正。著述的实施例是在说明用于实现本发明的技术思想的最佳形态，还可以在本发明的具体应用领域及用途中根据要求进行多种变更。因此，以上本发明的详细说明不是出于要以公开的实施形态来限定本发明。并且，随附的发明要求保护范围也应解释为还包括其他实施形态。

Claims (15)

1.一种比色生物传感器，其特征在于，包含：
由水凝胶高分子与聚二乙炔形成的多孔水凝胶结构物；以及
微生物营养源。
2.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，上述微生物营养源被封装在上述多孔水凝胶结构物的内部。
3.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，上述微生物营养源以包裹上述多孔水凝胶结构物表面的壳形式形成。
4.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，上述水凝胶高分子为选自由海藻酸盐、琼脂糖、壳聚糖、聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇及聚丙烯酰胺组成的组中的一种以上。
5.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，上述微生物营养源为选自由LB肉汤、LB琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基、乳酸杆菌MRS培养基、R2A培养基、M-H培养基及包含酪蛋白水解物的培养基组成的组中的一种以上。
6.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，上述比色生物传感器通过颜色变化来检测微生物。
7.根据权利要求1所述的比色生物传感器，其特征在于，上述微生物为选自由细菌、霉菌、海藻、从原生动物及后生动物分离的细胞组成的组中的一种以上。
8.一种抗生素敏感性检查方法，其特征在于，包括在权利要求1至7中任一项所述的比色生物传感器及抗生素的存在下培养微生物的步骤。
9.根据权利要求8所述的抗生素敏感性检查方法，其特征在于，
若上述比色生物传感器没有比色变化，则判断为上述微生物对上述抗生素具有敏感性，
若上述比色生物传感器有比色变化，则判断为上述微生物对上述抗生素具有耐药性。
10.一种抗生素敏感性检查用试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至7中任一项所述的比色生物传感器。
11.一种比色生物传感器的制备方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，获得包含聚二乙炔溶液、水凝胶高分子及微生物营养源的水凝胶前驱液；
步骤(b)，向氯化钙溶液中滴加上述水凝胶前驱液来获得水凝胶结构物；以及
步骤(c)，向上述水凝胶结构物照射200nm至300nm波长的紫外线。
12.根据权利要求11所述的比色生物传感器的制备方法，其特征在于，上述水凝胶前驱液中的上述水凝胶高分子的浓度为1.0％(w/v)至15.0％(w/v)。
13.根据权利要求11所述的比色生物传感器的制备方法，其特征在于，上述聚二乙炔溶液的浓度为0.5mM至5mM。
14.根据权利要求11所述的比色生物传感器的制备方法，其特征在于，上述氯化钙溶液的浓度为0.5％(w/v)至20.0％(w/v)。
15.根据权利要求11所述的比色生物传感器的制备方法，其特征在于，
上述比色生物传感器包含上述由水凝胶高分子与聚二乙炔形成的多孔水凝胶结构物以及上述微生物营养源，
上述微生物营养源被封装在上述多孔水凝胶结构物的内部，或者上述微生物营养源以包裹上述多孔水凝胶结构物表面的壳形式形成。
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