CN117123188A - 一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法及其应用 - Google Patents

一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新型蛋白质分子印迹薄膜技术领域，特别涉及一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法该制备方法包括以下步骤：S1:基材预处理；S2制备组装液；S3：蛋白质分子印迹薄膜组装。本发明通过MPC分子并用于CRP蛋白质分子印迹薄膜的制备中，制备的蛋白质印迹分子不仅仅能够降低空间因素对蛋白质分子运动的阻碍作用，使得蛋白分子在材料表面吸附与解吸过程更加便利，以提高蛋白分子的传输效率。且本发明利用MPC分子印迹在单层膜和薄层表面，对于CRP蛋白质具有较强的结合能力和选择性，使得其在生物传感器更加灵敏与稳定。

Description

一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及新型蛋白质分子印迹薄膜技术领域，特别涉及一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法及其应用。
背景技术
蛋白在细胞和生物体的生命活动过程中起着十分重要的作用。许多蛋白是疾病标志物和治疗靶标，抗体更是在生物研究和疾病诊疗方面起到非常重要的作用，但是抗体价格昂贵、结构易变，并且不能循环利用。现在迫切需要价格低廉、性能稳定和可重复利用，且能承受复杂条件的生物材料。分子印迹是制备对某一特定分子具有空间结构选择性识别能力的聚合物的技术。功能单体和模板分子在交联剂作用下形成分子印迹聚合物，除去模板分子，留下与模板分子形状、尺寸和功能基团互补的孔穴，该聚合物具有识别和结合目标分子能力。蛋白分子印迹制备人工抗体，显示优异的化学、力学和热稳定性，能够代替昂贵的生物抗体，用于蛋白分离和提取以及生物传感，是一种非常具有前景的既经济、稳定，又可循环利用的人工生物材料。
C-反应蛋白(CRP)产生于肝脏，可以引发对侵入细胞的免疫调理作用和吞噬作用。由于发生炎症时，血清中CRP浓度急剧升高，CRP已经作为健康的一个一般标记物。在正常人血液中其含量极低，通常低于1μg/mL，在急性心肌梗死、组织损伤、炎症、感染或肿瘤破坏时浓度迅速升高，达到100μg/mL甚至更高，它作为心血管疾病的指示剂引起了广泛的研究兴趣。当前检测人类CRP的方法主要是结合共价连接到珠的单克隆抗体，并分析抗原抗体结合所引起的凝血浊度。由于抗体价格昂贵，因此，制备CRP印迹材料显得非常重要。
5-(1,2-二硫烷基-3-基)-N-(1-羟基-11-氧代-3,6,9-三氧代-12-氮杂十八烷-18-基)戊酰胺(DHAP)，该分子是含有一个低聚乙二醇(OEG)端基和两个酰胺基的二硫化物分子，OEG末端部分能够抵抗非特异性蛋白质结合，并且链中引入的酰胺基团不仅可以在蛋白质结合位点上发挥作用，而且可以加强相邻DHAP分子之间的相互作用，以形成印迹空腔。基于DHAP分子在形成蛋白印迹膜时具有的优点，并结合CRP和磷酸胆碱较高的结合亲和性和明确的多键结构，本专利首先合成磷酸胆碱为端基的短链硫醇分子，然后与DHAP相结合作为蛋白印迹自组装单层膜的组分，在镀金基片表面构筑蛋白印迹自组装单层膜。本专利技术实现了靶向CRP的灵敏和无标记检测，为人们提供一种理想的人工生物材料，用于蛋白分子识别的生物传感器。在智能生物材料可控组装和生物传感器制备方面开辟一条新的路线。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的目的是提供一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法及其应用，通过该方法制备的蛋白质分子印迹薄膜通过MPC分子并用于CRP蛋白质分子印迹薄膜的制备中，制备的蛋白质印迹分子不仅仅能够降低空间因素对蛋白质分子运动的阻碍作用，使得蛋白分子在材料表面吸附与解吸过程更加便利，以提高蛋白分子的传输效率。且本发明利用MPC分子印迹在单层膜和薄层表面，对于CRP蛋白质具有较强的结合能力和选择性，使得其在生物传感器更加灵敏与稳定。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1.基材预处理：将金极片在氧化铝研磨纸上进行打磨，然后用分别依次用硝酸和水混合液、水、无水乙醇进行超声波清洗，最后用纯氮气干燥，得到清洗后的金极片；
S2.制备组装液：将MPC分子、CRP蛋白、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠、Ga+进行混合，冰水水浴30min，然后加入DHAP混合，CRP蛋白通过Ca+与MPC分子进行配位作用结合，制得组装液；
S3.蛋白质分子印迹薄膜组装：将S1所述清洁后的金极片浸入S2所述组装液中，在4℃黑暗的环境下进行蛋白质模板、DHAP、MPC组装10-12h，然后使用洗脱缓冲液在室温下进行洗脱0.5-1h，得到CRP印迹自组装单层膜。
优选的，所述MPC分子的制备原料为：3-噻吩乙醇、三乙胺、2-氯-1，3，2-二氧杂磷杂环戊烯、三甲胺，摩尔质量比为：8.97:30:14.9:13.2。
优选的，所述MPC分子的制备方法如下：
S201.将3-噻吩乙醇和三乙胺溶解于二氯甲烷中，并在冰浴中冷却。加入2-氯-1,3,2-二氧杂磷杂环戊烯-2-氧化物到反应溶液中。在冰浴温度下搅拌反应溶液1h，然后将其在室温下继续搅拌过夜，促使反应进行；
S202.将反应溶液进行真空浓缩，以去除溶剂，并得到残留物。用氯仿稀释残留物，并通过玻璃过滤器过滤溶液。再次进行真空浓缩，以浓缩滤液。将粗产物利用洗脱溶剂经过柱层析快速分离，得到粘性油状产物；
S203.将粘性油状物溶解于乙腈中，放入压力瓶中。将三甲胺加入反应溶液中。在60℃下搅拌反应混合物24小时。最后，通过还原反应得到固体MPC分子。
优选的，所述洗脱溶剂为乙烷与乙酸乙酯的混合溶液，质量比为：1:3。
优选的，所述氧化铝研磨纸打磨金极片步骤为：将金极片依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化硅研磨纸进行打磨。
优选的，所述制备所用原料MPC分子、CRP蛋白质、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠、Ga+、DGAP的摩尔质量比为：2：10:10:150：5：10。
优选的，所述Ca+为钙离子溶液，为氯化钙溶液、碳酸钙溶液其中的一种。
优选的，所述洗脱缓冲液为组成成分为：质量比为：1:1:15的EDTA、NaCl、Tris-HCl混合溶液。
蛋白质分子印迹薄膜在蛋白分子识别的传感器和蛋白分离、富集与检测上的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过MPC分子并用于CRP蛋白质分子印迹薄膜的制备中，制备的蛋白质印迹分子不仅仅能够降低空间因素对蛋白质分子运动的阻碍作用，使得蛋白分子在材料表面吸附与解吸过程更加便利，以提高蛋白分子的传输效率。且本发明利用MPC分子印迹在单层膜和薄层表面，对于CRP蛋白质具有较强的结合能力和选择性，使得其在生物传感器更加灵敏与稳定。
附图说明
图1为本发明蛋白质分子印迹薄膜制备方法流程图；
图2为本发明的MPC分子合成反应图；
图3为本发明CRP印迹单层膜电极洗脱蛋白前后以及加入模板蛋白后的CV曲线；
图4为本发明CRP印迹薄膜电极加入不同浓度的CRP后的DPV曲线；
图5为本发明CRP印迹薄膜电极分别加入不同蛋白后的DPV电流变化情况。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
蛋白质分子印迹薄膜的制备：
印迹单层膜在修饰前，金基片用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3粉在研磨纸上打磨，然后分别用硝酸和水(V/V＝1:1)混合溶液、水、无水乙醇超声。最后用纯氮气干燥。10μLMPC(2mM)、50uLCRP(100μg/mL，10mM Tris-HCl，150mM NaCl，pH 8.0)、50μL Ca2+(5mM)先混合，冰水浴中30min，然后加入10μL的DHAP(10mM)混合，CRP通过Ca2+与MPC配位作用结合，将清洁后的金电极浸入上述混合溶液中，4οC下在黑暗中进行蛋白质模板、DHAP、MPC共组装10-12小时。DHAP优先结合到金基片表面MPC结合蛋白周围的空白区域，然后使用洗脱缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM EDTA，150mM NaCl，pH 8.0)室温下洗脱30min-1h，得到CRP印迹自组装单层膜。
MPC分子的合成：
和三乙胺(TEA，4.20mL，30.0mmol)溶于二氯甲烷(25mL)中，并在冰浴中冷却，然后加入2-氯-1,3,2-二氧杂磷杂环戊烯-2-氧化物(COP)(1.40mL，14.9mmol)。将反应溶液在冰浴温度下搅拌1h，并在室温下搅拌过夜。真空浓缩后，用氯仿稀释所得残留物，并通过玻璃过滤器过滤。滤液在真空中浓缩，粗产物通过快速柱色谱分离，用己烷/乙酸乙酯(1∶3)洗脱，得到1.03g粘性油状1(49％产率)。在压力瓶中，将溶于乙腈(10mL)中的化合物1(1.03g，4.40mmol)冷却至-20℃，并加入三甲胺(1.24mL，13.2mmol)。将反应混合物在60℃下搅拌24h，并还原得到0.35gMPC分子
对比例1
对比例1与实施例1存在以下区别，区别仅在于：对比例1中将实施例1中蛋白质分子印迹薄膜的制备原料中不添加CRP蛋白，其余组分、用量及其制备过程与实施例1相同，所制备出的印迹膜为非印迹自组装单层膜。
1.印迹单层膜检测CRP原理
利用电化学方法(以铁氰化钾作为电活性探针)实时研究蛋白印迹自组装单层膜的电化学识别和传感性能。铁氰化钾容易进入由DHAP和MPC构成的印迹孔穴，到达电极表面，产生稳定的电流信号。CRP由五个相同的未糖基化的多肽亚单元组成，这些亚单元通过非共价键连结成环状五聚体，每个亚单元拥有一个依靠Ca2+结合磷酸胆碱的位点。CRP的每个亚单元与磷酸胆碱结合常数为1.6×105M-1。所有的磷酸胆碱结合位点均在CRP五聚体表面，结合的磷酸胆碱几乎垂直于五聚体平面。基于磷酸胆碱和CRP较高的结合亲和性和明确的多键结构，当溶液中加入模板蛋白CRP后，CRP与金电极表面修饰的MPC上的磷酸胆碱结合，通过表面分子印迹方法制备的CRP分子印迹薄膜孔穴被模板蛋白占据，铁氰化钾到达电极表面受阻，穿过印迹孔穴的铁氰化钾的量减少，电流信号减弱，由电流信号和模板蛋白浓度存在的内在关系，实现特异性结合蛋白的定量检测。
2.电化学测试参数
电化学测量中的示差脉冲伏安法(DPV)、循环伏安法(CV)用CHI 660E电化学工作站测试(上海辰华)，采用三电极体系：2mm金圆盘工作电极、饱和甘汞参比电极(SCE)和Pt丝对电极。从0.6V到-0.2V扫描。DPV测试参数：脉冲振幅50mV、脉冲周期0.5s、静置时间2s和灵敏度10-5A/V。测试前，电解质溶液用氮气吹5min。印迹/非印迹电极放入电解质溶液中，电解质溶液为含有2.5mM Fe(CN)6 4-/3-和0.1M KCl的10mM的PBS(pH7.4)。
3.蛋白分子印迹单层膜性能测试
摩尔比DHAP/MPC ΔiMIP ΔiNIP ΔiMIP/ΔiNIP
1:1 7.05 1.72 4.10
2:1 6.26 1.48 4.23
5:1 6.03 1.20 5.03
10:1 5.26 1.16 3.29
20:1 3.56 1.10 3.27
电化学响应定义为加入蛋白前后DPV还原峰电流的变化(Δi)，本发明在制备蛋白印迹薄膜时，改变DHAP与MPC的摩尔比，开展了不同的实施例操作实验。DHAP与MPC加入量的不同，将会影响制备的蛋白印迹空穴的大小，对蛋白形状选择性具有一定的影响。当长链分子DHAP比例较小时，形成的空穴较大，对于印迹电极与非印迹电极，添加蛋白前后的电流变化Δi更明显，当DHAP比例较大时，形成的空穴较小，蛋白不容易进入空穴，因此添加蛋白前后的电流变化Δi不明显。当DHAP/MPC摩尔比等于5:1时，ΔiMIP/ΔiNIP有最大值5.03，因此制备CRP印迹薄膜时，选择DHAP/MPC等于5:1的摩尔比。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的技术人员而言，可容易的实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (9)

1.一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1.基材预处理：将金极片在氧化铝研磨纸上进行打磨，然后用分别依次用硝酸和水混合液、水、无水乙醇进行超声波清洗，最后用纯氮气干燥，得到清洗后的金极片；
S2.制备组装液：将MPC分子、CRP蛋白、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠、Ga+进行混合，冰水水浴30min，然后加入DHAP混合，CRP蛋白通过Ca+与MPC分子进行配位作用结合，制得组装液；
S3.蛋白质分子印迹薄膜组装：将S1所述清洁后的金极片浸入S2所述组装液中，在4℃黑暗的环境下进行蛋白质模板、DHAP、MPC组装10-12h，然后使用洗脱缓冲液在室温下进行洗脱0.5-1h，得到CRP印迹自组装单层膜，即CRP蛋白质分子印迹薄膜。
2.根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述MPC分子的制备原料为：3-噻吩乙醇、三乙胺、2-氯-1，3，2-二氧杂磷杂环戊烯、三甲胺，摩尔质量比为：8.97:30:14.9:13.2。
3.根据权利要求2所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述MPC分子的制备方法如下：
S201.将3-噻吩乙醇和三乙胺溶解于二氯甲烷中，并在冰浴中冷却。加入2-氯-1,3,2-二氧杂磷杂环戊烯-2-氧化物到反应溶液中。在冰浴温度下搅拌反应溶液1h，然后将其在室温下继续搅拌过夜，促使反应进行；
S202.将反应溶液进行真空浓缩，以去除溶剂，并得到残留物。用氯仿稀释残留物，并通过玻璃过滤器过滤溶液。再次进行真空浓缩，以浓缩滤液。将粗产物利用洗脱溶剂经过柱层析快速分离，得到粘性油状产物；
S203.将粘性油状物溶解于乙腈中，放入压力瓶中。将三甲胺加入反应溶液中。在60℃下搅拌反应混合物24小时。最后，通过还原反应得到固体MPC分子。
4.根据权利要求3所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述洗脱溶剂为乙烷与乙酸乙酯的混合溶液，质量比为：1:3。
5.根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述氧化铝研磨纸打磨金极片步骤为：将金极片依次用1.0、0.3、0.05μm的氧化硅研磨纸进行打磨。
6.根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述制备所用原料MPC分子、CRP蛋白质、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠、Ga+、DGAP的摩尔质量比为：2：10:10:150：5：10。
7.根据权利要求1所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述洗脱缓冲液为组成成分为：质量比为：1:1:15的EDTA、NaCl、Tris-HCl混合溶液。
8.根据权利要求1、6所述的一种蛋白质分子印迹薄膜的制备方法，其特征在于：所述Ca+为钙离子溶液，为氯化钙溶液、碳酸钙溶液其中的一种。
9.根据权利要求1～7任意意向所述蛋白质分子印迹薄膜在蛋白分子识别的传感器和蛋白分离、富集与检测上的应用。
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