CN101419186B - 一种具有白藜芦醇分子印迹的自组装电极及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有白藜芦醇分子印迹的自组装电极，该电极由ITO玻璃、硅氧烷单分子层和厚度为0.1～1μm的白藜芦醇分子印迹层按顺序覆盖构成，所述的硅氧烷单分子层以γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷为硅烷化试剂通过自组装方法形成；所述的白藜芦醇分子印迹层通过热引发聚合形成的具有白藜芦醇印迹空间的聚合物；所述印迹层通过聚合物中的交联剂的烯键和γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷中的烯键反应形成共价键与硅氧烷单分子层连接。本发明电极对白藜芦醇具有很好的识别选择性，可用于白藜芦醇的高灵敏度和高选择性的快速电化学检测。

Description

一种具有白藜芦醇分子印迹的自组装电极及其制备方法

技术领域

本发明涉及物质的测量方法，具体涉及借助于测定材料的化学性质来分析材料的方法。 

背景技术

白藜芦醇是植物体内天然的二苯乙烯多酚物质，具有明显的抗菌、抗炎、抗癌、抗血栓、抗高血脂等作用，白藜芦醇在虎杖、桑椹、葡萄皮、葡萄酒以及花生中均有存在。目前，国内外对白藜芦醇的测定普遍采用高效液相色谱法，但往往需要对提取液或葡萄酒进行一些预处理，如将提取液减压浓缩或将葡萄酒采用固相萃取法进行富集等，尤其对葡萄和葡萄酒中白藜芦醇的测定，由于二苯乙烯类化合物结构极为相近，白藜芦醇顺-反异构体具有不同的吸收光谱，它们对火焰离子检测器、电子捕获器的响应不同，所以在用高效液相色谱、气相色谱等方法测定时往往需要一些仪器联用，如GC-MS以及HPLC-MS法等。这些方法存在着仪器价格昂贵、分析成本高、操作过程复杂并且容易受基体干扰等缺点，而采用固相萃取法或有机溶剂萃取法对样品进行预处理，则造成这些方法的取样量大、样品测试时间较长、样品回收率低，并且要使用对人体和环境有害的有机溶剂，操作烦琐。 

电化学传感器具有分析简便、灵敏、快速的特点，采用电化学方法测定白藜芦醇主要是在普通的银电极或玻碳电极上利用白藜芦醇的电氧化、还原行为进行测定。郑建斌等人采用的三电极系统(303A型静汞电极为工作电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极，对电极为铂丝电极)，在详细研究白藜芦醇的电还原行为的基础上建立了测定虎杖药材中自藜芦醇的微分脉冲伏安法【郑建斌，张宏芳，张秀琦，等.高等学校化学学报，2006，27(9)：1635～1639】；董社英等人采用三电极系统(铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，银盘电极为工作电极)，考察了白藜芦醇在银电极上的吸附伏安行为，并对葡萄酒中白藜芦醇的含量进行了测定【董社英，郑建斌，宁艳利.高等学校化学学报[J]，2003，24(3)：428-430】。最近有文献报道采用碳糊电极或者对碳糊电极进行修饰后来测定白藜芦醇[Adria′n Marcelo Granero，aHe′ctor Ferna′ndez，a Elizabeth Agostini，et al.Electroanalysis 20，2008，No.8，858-864][Hongfang Zhang，Lifeng Xu，Jianbin Zheng.Talanta 71(2007)19-24]，但这些方法均是利用了酚类物质的氧化还原性，具有此性质的其它酚类物质也可发生此反应，因此，存在选择性不好、电极不易再生、重现性差等不足。 

分子印迹技术是高分子领域中的具有广泛应用前景的前沿技术。分子印迹聚合物具有很高的预定选择性，独特的化学、物理稳定性，制备简单，可重复使用等优点，将分子印迹聚合物用作识别元件构建新一代的电化学传感器，与常规和传统的传感器介质相比，对被分离 物或分析物具有高度的选择性和专一性。早期的分子印迹电化学传感器，主要是直接在电极(如Au电极、玻碳电极等)表面涂渍分子印迹层，信号传输慢，电极灵敏度和选择性差，聚合物溶胀造成识别位点降低，模板分子的洗脱困难，而且这种印迹层往往容易从电极表面剥落，再生和可逆性差[Shuangyan Huana，Hui Chua，Chenxu Jiao，et al.Analytica ChimicaActa.2004，506：31-39][M.C.Blanco-Lo′pez，M.J.Lobo-Cástan~o′n，A.J.Miranda-Ordieres，Biosensors and Bioelectronics 18(2003)353-362]采用修饰过的自组装单层膜作为分子识别元件，通过化学反应将印迹层连接在传感器的表面，可以增强检测信号的强度和灵敏度，而且可以增大膜层电极表面的结合力。ITO玻璃表面具有-OH，可以发生硅烷化试剂自组装[Heiko Hillebrandt and Motomu Tanaka.J.Phys.Chem.B 2001，105，4270-4276]，而且自组装层再与模板分子进行印迹反应，从而形成印迹层于电极表面。目前，文献报道较多的是采用溶胶-凝胶法在ITO玻璃表面制备分子印迹电化学传感器，SharonFireman-Shoresh等制备了多巴的分子印迹传感器，并且研究了其对D-和L-多巴的选择性响应问题[Sharon Fireman-Shoresh，Iva Turyan，Daniel Mandler，David Avnir，and SharonMarx.Langmuir 2005，21，7842-7847]，还有文献报道了多巴胺印迹的ITO溶胶一凝胶膜，研究其选择性响应的问题，并用于多巴胺的测定[Na Gao，Zhiai Xu，Fuan Wang，Shaojun Dong.Electroanalysis 19，2007，No.16，1655-1660]。但是，方法存在稳定性及重现性不好等不足。到目前为止，尚未见有文献报道白藜芦醇分子印迹电化学传感器的制备及应用。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有白藜芦醇分子印迹的自组装电极。 

本发明解决上述技术问题的技术方案是： 

一种具有白藜芦醇分子印迹的自组装电极，该电极由ITO玻璃、硅氧烷单分子层和厚度为0.1～1μm的白藜芦醇分子印迹层按顺序覆盖构成，所述的硅氧烷单分子层由γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷构成，其中硅氧烷分子中的Si与ITO玻璃导电面上的羟基结合形成Si-O键；所述的白藜芦醇分子印迹层是由以白藜芦醇为模板分子，以丙烯酸、丙烯酰胺或4-乙烯基吡啶为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)作为交联剂，以偶氮二异丁腈为引发剂在40～60℃下通过热引发聚合形成的具有白藜芦醇印迹空间的聚合物，该聚合物中的交联剂的烯键和γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷中的烯键反应形成共价键与硅氧烷单分子层连接。 

本发明电极中，所述的功能单体优选丙烯酰胺，以丙烯酰胺为功能单体得到的聚合物吸附性更好，这与在极性溶剂中酰胺比羧酸能形成更强的氢键有关，因此形成的聚合物更为稳定，空间结构也能保留的更好；交联剂优选三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯，以三羟甲基丙烷三甲 基丙烯酸酯作为交联剂聚合形成的三维立体孔穴对模板分子的选择性识别能力最好；聚合温度优选40℃，在40℃下聚合制得的电极选择性及灵敏性最好，这与白藜芦醇的热敏性有一定关系。 

本发明所述电极的制备过程如图1所示，具体方法由以下步骤组成： 

(1)将ITO玻璃放入丙酮中超声处理15min，再将其放入体积比为1∶1的1mol/L的NaOH和乙醇的混合溶液中超声处理15min，然后依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水冲洗；将冲洗后的ITO玻璃在KOH溶液中超声处理15min，再放入含质量分数为0.14％的γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，60℃水浴硅烷化反应24h后取出，用甲醇冲洗三次，氮气吹干，得硅烷化的ITO玻璃； 

(2)将摩尔比为1∶6的模板分子和功能单体溶解于溶剂中，于4℃冰箱中放置6h，再加入相当于功能单体摩尔量1～5倍的交联剂以及相对于模板分子、功能单体及交联剂总质量1％的引发剂，通入氮气除氧后将硅烷化的ITO玻璃置于其内，密封此容器，浸泡1小时后置于真空度为-0.09～0.005Mpa，温度为60℃下的环境下加热聚合，当聚合溶液接近固化时，迅速取出ITO玻璃，转入空容器中通氮除氧，然后封口，在40℃～60℃下真空加热24～72小时，得白藜芦醇分子印迹聚合物电极前驱体； 

(3)将所述白藜芦醇分子印迹聚合物电极前驱体放入浓度为0.2M，pH为7.4的PBS中，用循环伏安法在-0.2～1.2V之间扫描，直到没有白藜芦醇的信号为止，即可； 

步骤(2)中所述的溶剂是乙腈、甲醇中的一种或两种。 

本发明所述的电极采用导电性好、价廉易得、具有可控表面积且操作方便的ITO玻璃作为电极的基体，但是白藜芦醇在未经硅烷化修饰的ITO玻璃电极表面的吸附很弱，产生的氧化峰电流很小，且分子印迹聚合物层与ITO玻璃的直接附着也不牢固，导致对白藜芦醇的灵敏度低以及电极本身的稳定性差。因此本发明人在ITO玻璃导电面修饰一层含碳碳双键的硅氧烷单分子层，硅氧烷分子通过共价键的作用与ITO玻璃表面结合，同时也以共价键的方式与印迹层结合(注：在热引发聚合的过程中，硅氧烷的碳碳双键也参与了自由基共聚反应，使白藜芦醇分子印迹聚合物以共价键的键合到硅氧烷单分子层上)，不仅增加了印迹层与ITO玻璃电极结合的牢固程度，并且由于硅烷化试剂中的酰氧基团与白藜芦醇的-OH可通过氢键作用从而使白藜芦醇与本发明电极的结合位点增多，同时控制印迹层的厚度在0.1～1μm，减少聚合物对信号传输的阻碍，使白藜芦醇在本发明电极上的响应增强，从而提高检测的灵敏度。 

本发明电极的印迹层是通过热引发聚合形成的具有白藜芦醇印迹空间的聚合物，但是常规的热引发聚合法通常对聚合在ITO电极表面的印迹聚合物层厚度难以控制，往往印迹层比 较厚，容易导致信号传输受阻。本发明所提供的制备方法首先将硅烷化的ITO玻璃放在混合溶液中加热聚合，观察溶液的变化，当发现溶液开始聚合时，迅速将ITO玻璃电极从聚合溶液中取出，转入空试管中通氮除氧，用胶赛封口后继续在40℃～60℃下真空加热24～72小时。研究表明，预聚合的时间与印迹层厚度存在一定的关系。因此，通过控制预聚合的时间，可以很好地控制印迹层厚度。另外，白藜芦醇具有一定的热敏性，我们的研究表明，溶液在较高的温度(60℃)下已经开始发生聚合后，将ITO玻璃转移出来后，将聚合温度稍渐低(40℃)，发现所得印迹传感器的印迹效果很好。而且，常规的热引发聚合法通常采用溶剂加热回流来洗脱模板分子，效率低，需要时间长，往往需要24～48小时，并且模板分子洗脱不干净。由于模板分子主要是通过氢键作用与印迹层中的功能单体连接，通过电化学循环伏安扫描，模板分子被氧化成另一物质，与功能单体之间的氢键作用消失，从而可以使模板分子从印迹层洗脱下来，正是基于这种原理，本发明提供的制备方法采用了电化学循环伏安法对模板分子进行洗脱，需时短(仅需1分钟)，效率高，对模板分子洗脱完全，不存在常规溶剂萃取法长时间洗脱造成的聚合物溶胀而使印迹孔穴变形的影响，电极的重现性、选择性好，能特异性识别反式白藜芦醇，且具有很高的灵敏度，可用于检测反式白藜芦醇。 

本发明还提供一种检测白藜芦醇的方法，该方法是采用三电极体系检测白藜芦醇，其中工作电极是本发明所述的具有白藜芦醇分子印迹的自组装电极，参比电极是Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极，具体过程是：将工作电极放入待检溶液中，采用微分脉冲伏安法在-0.2～1.2V电位范围内扫描，根据氧化峰的峰高对白藜芦醇进行定量测定，该方法的线性范围为0.002～0.2mmol/L。本发明电极的清洗与活化只需要在PBS(0.2M，pH7.4)中用循环伏安方法扫描1分钟，方法简便，且电极可反复使用，使用50次以后，仍然具有良好的重现性。 

本发明所提供的检测白藜芦醇的方法可直接对混合样品中的白藜芦醇进行选择性测定，不需要使用高效液相色谱等昂贵的分析仪器，也不需要对样品进行减压浓缩和萃取等处理，整个测定过程只需1分钟即可完成(高效液相色谱法需30分钟左右)，具有操作简单，响应快，选择性好，线性范围宽，灵敏度高等特点。 

为了更好地理解本发明所述的具有白藜芦醇分子印迹的自组装电极，下面将通过具体实验来证明本发明的技术效果。 

一、灵敏度试验 

1、实验材料： 

ITO玻璃：购自秦皇岛耀华玻璃股份有限公司。 

硅烷化ITO玻璃电极：将ITO玻璃放入丙酮中超声处理15min，再将其放入体积比为1∶1的1mol/L的NaOH和乙醇的混合溶液中超声处理15min，然后依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏 水冲洗；将洗好的ITO玻璃在KOH溶液中超声处理15min，再放入含质量分数为0.14％的γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，60℃水浴硅烷化反应24h后取出，以甲醇冲洗三次，氮气吹干，即得。 

2、实验方法：将ITO玻璃电极、硅烷化ITO玻璃电极分别放入含0.002mM白藜芦醇的PBS(0.2M，pH7.4)中，用CH I 220A电化学工作站记录相应的微分脉冲伏安图。 

3、实验结果： 

结果如图2所示。从图2可以看出，白藜芦醇在未经硅烷化修饰的ITO玻璃电极表面的吸附很弱，产生的氧化峰电流很小(如图2b)，而在经硅烷化修饰后的ITO玻璃电极表面，其峰电流信号大大增强(如图2a)。结果表明ITO玻璃表面经硅烷化处理后，增加了基体与白藜芦醇的结合位点，从而使响应信号增大。因此，可以看出，将ITO玻璃硅烷化可起到两方面的作用：一是通过共价键的作用与ITO玻璃表面结合，同时也以共价键的方式与白藜芦醇分子印迹聚合物结合，从而增加了印迹层与ITO玻璃结合的牢固度，二是提供更多的结合位点，使物质在ITO玻璃上的响应增强，从而增强信号的强度，提高检测的灵敏度。 

二、特异性试验 

1、实验材料 

本发明所述电极(简称：MIP-Si-ITO)：如实施例1、2或3方法制备； 

非印迹聚合物膜电极(NMIP-Si-ITO)：与本发明所述电极相比，该电极除不具备白藜芦醇印迹空间外，其余组成与本发明电极相同，其制备方法除不加模板分子外，其余与本发明所述电极MIP-Si-ITO相同。 

2、实验方法： 

(1)实施例1所得电极和非印迹聚合物膜电极对白藜芦醇响应的比较： 

将MIP-Si-ITO和NMIP-Si-ITO分别放入含0.002mM白藜芦醇的PBS(0.2M，pH7.4)中，用CHI 220A电化学工作站记录相应的微分脉冲伏安图。 

(2)本发明所述电极对与白藜芦醇具有相似结构的底物的伏安吸附行为： 

双酚A(BPA)和白藜芦醇甙(POL)分别在实施例2所得电极的响应实验： 

将MIP-Si-ITO分别放入含0.02mM双酚A(BPA)和白藜芦醇甙(POL)的PBS(0.2M，pH7.4)中，采用微分脉冲伏安法在-0.2～1.2V电位范围内扫描，用CH I 220A电化学工作站记录相应的微分脉冲伏安图。 

白藜芦醇(RES)、双酚A(BPA)和白藜芦醇甙(POL)三者的混合物在实施例3所得电极上的响应实验：将MIP-Si-ITO放入含有0.02mM白藜芦醇(RES)、0.02mM双酚A(BPA)和0.02mM白藜芦醇甙(POL)三种物质的PBS(0.2M，pH7.4)中，采用微分脉冲伏安法在-0.2～ 1.2V电位范围内扫描，用CH I 220A电化学工作站记录相应的微分脉冲伏安图。 

3、实验结果： 

(1)实施例1所得电极和非印迹聚合物膜电极对白藜芦醇响应的比较实验的结果如图3所示，白藜芦醇在MIP-Si-ITO电极上的氧化峰电流比在NMIP-Si-ITO电极上的大，表明电化学响应信号主要来自于留在电极上的与模板分子相匹配的空穴，而不是由电极上的非特定吸附所产生，表明MIP-Si-ITO对模板分子具有选择性的吸附响应行为。 

(2)双酚A(BPA)和白藜芦醇甙(POL)在实施例2所得电极上的伏安吸附行为如图4所示，BPA和POL在MIP-Si-ITO电极上的氧化峰电流信号很小，而白藜芦醇有较大响应，表明本发明MIP-Si-ITO电极对白藜芦醇具有良好的选择性响应。RES，POL和BPA三者的混合物在实施例3所得电极上的响应如图5所示，三者的混合溶液在MIP-Si-ITO的氧化峰右移和RES的氧化峰重合，进一步说明电极对白藜芦醇具有选择性的识别作用。 

图1是白藜芦醇分子印迹自组装电极制备过程示意图，其中(a)Pre-assembly预组装，(b)Surface modification of an ITO electrode with γ-MPS.γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷修饰ITO电极，(c)polymerize聚合，(d)Removal of RES from the MIP film.洗脱模板分子。 

图2是白藜芦醇在Si-ITO表面(a)及ITO玻璃表面(b)的微分脉冲伏安图。 

图3是RES在MIP-Si-ITO电极上的微分脉冲伏安图(a)RES在NMIP-Si-ITO电极上的微分脉冲伏安图(b)(其中RES浓度：0.002mM) 

图4(a)是BPA(0.02mM)在MIP-Si-ITO电极上的微分脉冲伏安图，(b)POL(0.02mM)在MIP-Si-ITO电极上的微分脉冲伏安图。 

图5中a是RES(0.02mM)在MIP-Si-ITO电极上的微分脉冲伏安图，图5中b是RES(0.02mM)，BPA(0.02mM)和POL(0.02mM)三者的混合溶液在MIP-Si-ITO电极上的微分脉冲伏安图。 

图6用循环伏安法洗脱MIP-Si-ITO上的RES。(在0.2M，PH为7.4的磷酸缓冲溶液中扫速为：50mV s^-1)。 

图7是白藜芦醇对照品溶液在MIP-Si-ITO电极上的微分脉冲伏安图(在0.2M，PH为7.4的磷酸缓冲溶液中，扫速：4mV s^-1)，其中各编号所表示白藜芦醇的浓度为(a)0，(b)0.002，(c)0.004，(d)0.006，(e)0.008，(f)0.01，(g)0.02mM。 

图8是氧化峰电流与白藜芦醇浓度的标准曲线图。 

以下实施例所使用的电极是直接购买的商品化ITO玻璃经切割处理。 

制备例 

例1 

1、将ITO玻璃电极放入丙酮中超声15min，再将其放入NaOH(1M)和乙醇(体积比为1∶1)的混合溶液中超声15min。然后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水冲洗。将洗好的ITO玻璃在KOH溶液中超声15min。再放入质量分数为0.14％的γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，60℃水浴硅烷化反应24h后取出，以甲醇冲洗三次，氮气吹干。 

2、称取0.038g(0.17mmol)白藜芦醇溶于2mL乙腈中，依次加入0.071g(1mmol)功能单体丙烯酰胺，0.673g(3.4mmol)交联剂EDMA和0.01g(0.06mmol)引发剂AIBN充分混匀，通氮气5min后再超声波脱气10min。然后将经上述硅烷化处理了的ITO玻璃电极放入此混合液中，密封此容器，放入真空干燥箱中于真空度为-0.08MPa温度为60℃下加热聚合。仔细观察溶液变化，当聚合溶液接近固化时(约30分钟后)，打开容器，迅速取出ITO玻璃，转入空试管中通氮除氧，用胶赛封口后继续在40℃下真空加热20h。真空度为-0.08MPa。 

3、将该ITO玻璃电极放入在0.2M、PH为7.4的磷酸缓冲溶液中，用循环伏安法在-0.2-1.2V之间扫描，直到没有白藜芦醇的信号为止，如图6所示。 

经膜厚测量仪Filmetrics F20检测，上述方法所得电极的印迹层厚度为500nm。 

例2 

1、将ITO玻璃电极放入丙酮中超声15min，再将其放入NaOH(1M)和乙醇(体积比为1∶1)的混合溶液中超声15min。然后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水冲洗。将洗好的ITO玻璃在KOH溶液中超声15min。再放入质量分数为0.14％的γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，60℃水浴硅烷化反应24h后取出，以甲醇冲洗三次，氮气吹干。 

2、称取0.038g(0.17mmol)白藜芦醇溶于2mL乙腈中，依次加入0.071g(1mmol)功能单体丙烯酰胺，0.914g(2.27mmol)交联剂TRIM和0.01g(0.06mmol)引发剂AIBN充分混匀，通氮气5min后再超声波脱气10min。然后将经上述硅烷化处理了的ITO玻璃电极放入此混合液中，密封此容器，放入真空干燥箱中于真空度为-0.08MPa温度为60℃下加热聚合。仔细观察溶液变化，当聚合溶液接近固化时(约15分钟后)，打开容器，迅速取出ITO玻璃电极，转入空试管中通氮除氧，用胶赛封口后继续在40℃下真空加热20h。真空度为-0.08MPa。 

3、将该ITO玻璃电极放入0.2M、PH为7.4的PBS中，用循环伏安法在-0.2-1.2V之间扫描，直到没有白藜芦醇的信号为止。 

经膜厚测量仪Filmetrics F20检测，上述方法所得电极的印迹层厚度为100nm。 

例3 

1、将ITO玻璃电极放入丙酮中超声15min，再将其放入NaOH(1M)和乙醇(体积比为1∶ 1)的混合溶液中超声15min。然后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水冲洗。将洗好的ITO玻璃在KOH溶液中超声15min。再放入质量分数为0.14％的γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，60℃水浴硅烷化反应24h后取出，以甲醇冲洗三次，氮气吹干。 

2、称取0.038g(0.17mmol)白藜芦醇溶于2mL乙腈中，依次加入0.056g(1mmol)功能单体丙烯酸，0.673g(3.4mmol)交联剂AIBN和0.01g(0.06mmol)引发剂AIBN充分混匀，通氮气5min后再超声波脱气10min。然后将经上述硅烷化处理了的ITO玻璃电极放入此混合液中，密封此容器，放入真空干燥箱中于真空度为-0.08MPa温度为60℃下加热聚合。仔细观察溶液变化，当聚合溶液接近固化时(约1小时后)，打开容器，迅速取出ITO玻璃电极，转入空试管中通氮除氧，用胶赛封口后继续在40℃下真空加热20h。真空度为-0.08MPa。 

3、将该ITO玻璃电极放入0.2M、PH为7.4的PBS中，用循环伏安法在-0.2-1.2V之间扫描，直到没有白藜芦醇的信号为止。 

经膜厚测量仪Filmetrics F20检测，上述方法所得电极的印迹层厚度为1μm。 

例4 

1、将ITO玻璃电极放入丙酮中超声15min，再将其放入NaOH(1M)和乙醇(体积比为1∶1)的混合溶液中超声15min。然后分别用丙酮、乙醇、二次蒸馏水冲洗。将洗好的ITO玻璃在KOH溶液中超声15min。再放入质量分数为0.14％的γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，60℃水浴硅烷化反应24h后取出，以甲醇冲洗三次，氮气吹干。 

2、称取0.038g(0.17mmol)白藜芦醇溶于2mL甲醇中，依次加入0.105g(1mmol)功能单体4-乙烯基吡啶，0.673g(3.4mmol)交联剂EDMA和0.01g(0.06mmol)引发剂AIBN充分混匀，通氮气5min后再超声波脱气10min。然后将经上述硅烷化处理了的ITO玻璃电极放入此混合液中，密封此容器，放入真空干燥箱中于真空度为-0.08MPa温度为60℃下加热聚合。仔细观察溶液变化，当聚合溶液接近固化时(约40分钟后)，打开容器，迅速取出ITO玻璃电极，转入空试管中通氮除氧，用胶赛封口后继续在60℃下真空加热20h。真空度为-0.08MPa。 

3、将该ITO玻璃电极放入0.2M、PH为7.4的PBS中，用循环伏安法在-0.2-1.2V之间扫描，直到没有白藜芦醇的信号为止。 

经膜厚测量仪Filmetrics F20检测，上述方法所得电极的印迹层厚度为800nm。 

应用例 

例5 

1、对照品储备液的制备：精密称取白藜芦醇10mg，置100mL容量瓶中，甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，得含白藜芦醇0.1mg.mL-1，的对照品储备液，备用。 

2、供试品溶液的的制备： 

红葡萄酒：将红葡萄酒样品经微孔滤膜过滤处理后进行测定。 

虎杖提取液：将虎杖药材粉碎过60目筛得药材粉末，准确称取该药材粉末1g，用6.00mL甲醇溶解，于40℃恒温水浴超声2h，冷却，滤至10mL容量瓶中，残渣加少量甲醇洗涤，将洗涤液并入滤液中，用甲醇定容，振荡均匀。 

3、标准曲线的绘制：精密吸取对照品储备液30μL，60μL，90μL，120μL，150μL，300μL，放入7m1的PBS中，制成不同浓度的对照品溶液。然后采用三电极体系进行扫描，其中工作电极为例1所制备的具有白藜芦醇分子印迹的自组装电极，参比电极是Ag/AgCl电极，对电极为铂丝电极，在-0.2～1.2V范围内进行微分脉冲扫描，扫描结果如图7所示。以氧化峰电流的峰高I为纵坐标，对照品进样浓度c(mmol/L)为横坐标绘制标准曲线(见图8)，计算回归方程。 

结果表明，在实验条件下，微分脉冲极谱图上峰电流I在0.002～0.2mmol/L范围内与白藜芦醇的浓度呈线性关系，线性回归方程为 

I＝-8.612-7.6647×c 

r＝0.9965 

检出限达8×10^-8mol/L。 

4、样品测定 

将白藜芦醇样品溶液分别按与标准曲线相同的条件进行微分脉冲扫描，根据氧化峰电流的峰高计算样品溶液中白藜芦醇的含量，结果见表1，其中红葡萄酒中白藜芦醇的含量测定结果与高效液相色谱法测定的结果一致[周春山，向海艳，肖建波，等.药物分析杂志.2005，25(5)：534-536]。 

表1 

样品名称	反式白藜芦醇  含量	RSD/  ％	加标量  /mg.g-1	加标后测  得量	回收率/％
						虎杖	2.20mg/g	1.9	1.0mg/g	3.05mg/g	99.3
红葡萄酒	2.0mg/L	1.8	1.0mg/L	3.12mg/L	104.0

Claims (4)

1.一种具有白藜芦醇分子印迹的自组装电极，该电极由ITO玻璃、硅氧烷单分子层和厚度为0.1～1μm的白藜芦醇分子印迹层按顺序覆盖构成，其中，

所述的硅氧烷单分子层由γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷构成，其中硅氧烷分子中的Si与ITO玻璃导电面上的羟基结合形成Si-O键；

所述的白藜芦醇分子印迹层是由以白藜芦醇为模板分子，以丙烯酸、丙烯酰胺或4-乙烯基吡啶为功能单体，以乙二醇二甲基丙烯酸酯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯作为交联剂，以偶氮二异丁腈为引发剂在40～60℃下通过热引发聚合形成的具有白藜芦醇印迹空间的聚合物，该聚合物中的交联剂的烯键和γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷中的烯键反应形成共价键与硅氧烷单分子层连接。

2.如权利要求1所述的电极，其特征在于所述的功能单体是丙烯酰胺。

3.如权利要求1所述的电极，其特征在于所述的交联剂是三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。

4.权利要求1、2或3所述具有白藜芦醇分子印迹的自组装电极的制备方法，该方法由以下步骤组成：

(1)将ITO玻璃放入丙酮中超声处理15min，再将其放入体积比为1∶1的1mol/L的NaOH和乙醇的混合溶液中超声处理15min，然后依次用丙酮、乙醇和二次蒸馏水冲洗；将冲洗后的ITO玻璃在KOH溶液中超声处理15min，再放入含质量分数为0.14％的γ-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷的甲苯溶液中，60℃水浴硅烷化反应24h后取出，用甲醇冲洗三次，氮气吹干，得硅烷化的ITO玻璃；

(2)将摩尔比为1∶6的模板分子和功能单体溶解于溶剂中，于4℃冰箱中放置6h，再加入相当于功能单体摩尔量1～5倍的交联剂以及相对于模板分子、功能单体及交联剂总质量1％的引发剂，通入氮气除氧后将硅烷化的ITO玻璃置于其内，密封此容器，浸泡1小时后放入真空干燥箱中于真空度为-0.09～0.005MPa温度为60℃下加热聚合，当聚合溶液接近固化时，迅速取出ITO玻璃，转入空容器中通氮除氧，然后封口，在40℃～60℃下真空加热24～72小时，得反式白藜芦醇分子印迹聚合物电极前驱体；

(3)将所述白藜芦醇分子印迹聚合物电极前驱体放入浓度为0.2M，pH为7.4的PBS中，用循环伏安法在-0.2～1.2V之间扫描，直到没有白藜芦醇的信号为止，即可；

步骤(2)中所述的溶剂是乙腈、甲醇中的一种或两种。

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