CN117122526A - 一种复合胜肽组合物及其在护肤品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种复合胜肽组合物及其在护肤品中的用途，该组合物由棕榈酰三肽‑1、棕榈酰四肽‑7、β‑丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺、壳聚糖、三聚磷酸钠制备的固体颗粒及在化妆品中其用途。所述固体颗粒包含的榈酰三肽‑1：棕榈酰四肽‑7：β‑丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺：壳聚糖：三聚磷酸钠的重量配比为：0.001～0.1：0.001～0.1：0.001～5：1～10:0.1～5。本发明的活性成分组分无毒，制备方法简便易行，制备条件温和，极具工业化价值。制备的亚微米固体颗粒提高了棕榈酰三肽‑1、棕榈酰四肽‑7、β‑丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的透皮吸收效果，从而提升了这三种多肽类原料在护肤类化妆品的协同抗皱功效。

Description

一种复合胜肽组合物及其在护肤品中的用途
技术领域
本发明涉及一种护肤品原料和制剂领域，具体涉及一种复合胜肽的组合物，该组合物为由棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺、壳聚糖、三聚磷酸钠固体颗粒及其作为化妆品原料在抗皱护肤品中的用途。
背景技术
棕榈酰三肽-1英文名：Palmitoyl Tripeptide-1。其他名称：Pal-GHK，曾经使用的INCI名称为棕榈酰寡肽(Palmitoyl Oligopeptide)
结构式：
序列：Pal-Gly-His-Lys-OH
分子量：578.79
分子式：C30H54N6O5
CAS注册号：147732-56-7
棕榈酰三肽-1，是三肽-1(Gly-His-Lys，GHK)棕榈酰化的衍生物。
GHK天然存在于人血浆、唾液和尿液中。在血浆中，GHK水平在20岁时约为200ng/mL(10 -7M)，但到60岁时下降至80ng/mL。GHK水平的下降与再生能力的显着下降相吻合。
棕榈酰三肽-1是一种信号肽，作用于TGF-β受体，模拟matrikine肽的作用是刺激成纤维细胞活性，从而增加真皮中基质蛋白和糖胺聚糖的合成。使表皮结构功能增强、皱纹减少。榈酰三肽-1也能防止其在暴露于UVA光后降解的能力，可以修复紫外线(UVA)损伤后的胶原蛋白。
棕榈酰三肽-1(5mg/kg)与维甲酸(500mg/kg)进行比较，发现5mg/kg的棕榈酰三肽-1与500mg/kg的维甲酸在增加胶原蛋白纤维密度和真皮高表达胶原方面的效果完全相同，但棕榈酰三肽-1不会引起皮肤过敏。棕榈酰三肽-1还可以对结缔组织重建和细胞增殖过程进行反馈调控，在皮肤修复过程中能促进生成大量的比正常生理周期下更多的皮肤修复蛋白。
棕榈酰四肽-7的英文名为Palmitoyl Tetrapeptide-7。其他名称：Pal-GQPR结构式：
序列：Pal-Gly-Gln-Pro-Arg-OH
分子量：694.9
分子式：C34H62N8O7
CAS注册号：221227-05-0
免疫球蛋白IgG是体内一种重要抗体，它的Fc片段可以调控各种白介素的释放。棕榈酰四肽-7是由IgG的Fc片段中四个氨基酸组成，可以降低老化皮肤炎症细胞因子IL-6水平，尤其在UV受损细胞中更为明显，从而达到重新维持皮肤中炎症细胞因子的平衡，实现对皮肤的护理。
体内反射共聚焦显微镜研究表明，与安慰剂相比，棕榈酰三肽-1和棕榈酰四肽-7的混合物增强了细胞外基质(ECM)结构。
专利CN1893911B，揭示了，棕榈酰三肽-1和棕榈酰四肽-7的混合物能改善可见的皮肤老化征象，包括细线纹、皱纹、毛孔增大、粗糙、干燥及其它皮肤组织缺陷如牵张痕(怀孕、创伤或其它影响造成)，由皮肤变薄、血液循环不足和组织松弛造成的眼袋和眼下的黑眼圈。
市售棕榈酰三肽-1和棕榈酰四肽-7的混合物的商品名为3000，其组成为甘油、水、丁二醇、卡波姆、吐温20、榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7和乳酸钠，其中棕榈酰三肽-1和棕榈酰四肽-7的含量约为0.01％和0.005％，/>3000加入到护肤品中的常见使用量为3％。
棕榈酰三肽-1为三肽-1(GPH)棕榈酰化的产物，棕榈酰四肽-7为四肽-7(GQPR)棕榈酰化的产物，虽然通过结构修饰提升了其脂溶性，增加了皮肤渗透性，但其并不能充分发挥其在护肤品中抗皱性能，急需一种新的载体形式，提升其透皮吸收速率，完全发挥其抗皱功效。
β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺是一种新的化妆品原料，INCI英文名为β-Alanyl HydroxyprolyIdiaminobutyroyI Benzylamide，化学名为(2S)-β-丙氨酰-L-羟脯氨酰-2，4-二氨基丁酸-苄胺。
结构式：
分子量：386.42
分子式：C19H24N5O4
β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺能够改善UV受损胶原，通过促进I型和III型胶原蛋白的合成，实现内源性增加胶原蛋白。同时能明显降低弹性蛋白酶的表达，减少弹性蛋白降解。从而起到抗皱作用。
市售β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的商品名为Erasin0003，为0.25％的溶液，在护肤品中使用添加量为50-250ppm。但是深圳维琪医药研发有限公司提供的技术资料显示，β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的透皮吸收率未超过60％，急需一种载体提升其透皮吸收效果，从而提升其生物利用度。
壳聚糖(Chitosan)是甲壳素最重要的衍生物，也是一种天然的碱性多糖，具有很好的生物相容性、生物活性以及生物降解性。生物降解的壳聚糖纳米粒也被广泛研究，壳聚糖纳米粒是集缓释靶向以及控制药物释放等多功能于一体的天然纳米药物传递系统。壳聚糖纳米粒的制备方法包括凝聚/沉淀法、离子凝胶法以及乳滴聚结法等方法，其中离子凝胶法(最早报道于Calvo P,-López C,Vila-Jato JL,Alonso MJ.Chitosan andchitosan/ethylene oxide-propylene oxide block copolymer nanoparticles asnovel carriers for proteins and vaccines.Pharm Res.1997Oct；14(10):1431-6.doi:10.1023/a:1012128907225.PMID:9358557)，采用多聚阴离子三聚磷酸钠(SodiumTripolyphosphate，TPP)与壳聚糖的氨基发生分子内或分子间的交联反应，从而形成球状凝胶的过程。
尚未见将棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7和β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺溶解于壳聚糖溶液，滴加三聚磷酸钠溶液后形成亚微米离子凝胶颗粒溶液，再经喷雾干燥制得的可作为具有抗皱功效的化妆品原料的复合胜肽固体颗粒的报道。
发明内容
本发明提供一种复合胜肽的组合物，该组合物为由棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺、壳聚糖、三聚磷酸钠组成的固体颗粒，所述组合物中各成分榈酰三肽-1：棕榈酰四肽-7：β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺：壳聚糖：三聚磷酸钠的重量配比为：0.001～1：0.001～1：0.001～5：0.05～10:0.1～5。
优选的，所述组合物中棕榈酰三肽-1:棕榈酰四肽-7:β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺:壳聚糖:三聚磷酸钠的重量配比为0.06:0.03:1:2:1。
本发明进一步提供所述组合物的制备方法，其特征在于，所述方法步骤如下：在醋酸调节pH值壳聚糖水溶液搅拌加入棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺溶解后，搅拌情况下滴加三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕继续搅拌30分钟以上后，将所得液体喷雾干燥后制得的颗粒物。
优选的，本发明所述缓释组合物的制备方法，其特征在于，所述方法步骤如下：在醋酸调节pH值为3～5的1～10％壳聚糖水溶液50～1000ml，搅拌加入0.1～3g棕榈酰三肽-1、0.05～1.5g棕榈酰四肽-7、0.5-50gβ-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺溶解后，搅拌情况下缓慢滴加0.5～5％三聚磷酸钠水溶液25～500ml，滴加完毕继续搅拌30分钟以上后，将所得液体喷雾干燥后制得的颗粒物。另一优选的，本发明所述缓释组合物的制备方法，其特征在于，所述方法步骤如下：在醋酸调节pH值为3～5的5％壳聚糖水溶液200ml，搅拌加入0.3g棕榈酰三肽-1、0.15g棕榈酰四肽-7、5gβ-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺溶解后，搅拌情况下滴加三聚磷酸钠水溶液(2.5％)200ml，滴加完毕继续搅拌30分钟以上后，喷雾干燥后制得的颗粒物。
本发明进一步包括本发明所述组合物在抗皱护肤品中的用途。
本发明进一步包括一种含有本发明所述缓释组合物的护肤品，其中所述缓释组合物在护肤品中的重量百分比为0.001～5％。
本发明的目的是解决棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺在复配后应用于护肤品中，提升这三种多肽的皮肤渗透性问题与其抗皱效果。
具体实施方式：
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为限制。
实施例1制备含有棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺、壳聚糖-三聚磷酸钠亚微米颗粒的方法
棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7来源于成都云希化工有限公司。
β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺采用深圳市维琪医药研发有限公司商品名为Erasin000的市售溶液(β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺含量为2500ppm，添加到化妆品中的溶液量为2～10％)。Erasin000溶液经旋转蒸发，乙醚沉淀，再将沉淀物真空干燥后，加入水溶解，再经C18反相高效液相制备色谱纯化，转盐、冻干制得的纯品，β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺纯度大于99.5％。
制备方法：
步骤1：在醋酸调节pH值为3的5％壳聚糖水溶液200ml，搅拌加入0.3g棕榈酰三肽-1、0.15g棕榈酰四肽-7、5gβ-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺溶解；
步骤2：搅拌情况下，缓慢滴加三聚磷酸钠水溶液(2.5％)200ml，滴加时间超过1小时，滴加完毕继续搅拌30分钟以上后，得到混悬状亚微米凝胶；
步骤3：喷雾干燥机的进风温度设定为90℃，雾化压力设定在0.8bar，出峰温度设定在60℃，将步骤2所得混悬状亚微米凝胶液体喷雾干燥后，制得的颗粒物20.45g。
实施例2制备含有棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺、壳聚糖-三聚磷酸钠亚微米颗粒的方法
步骤1:在醋酸调节pH值为4的10％壳聚糖水溶液500ml，搅拌加入3g棕榈酰三肽-1、1.5g棕榈酰四肽-7、10gβ-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺溶解.
步骤2:搅拌情况下，缓慢滴加三聚磷酸钠水溶液(2％)250ml，滴加时间超过2小时，滴加完毕继续搅拌30分钟以上后，得到混悬状亚微米凝胶；
步骤3:喷雾干燥机的进风温度设定为100℃，雾化压力设定在1.2bar，出峰温度设定在50℃，将混悬状亚微米凝胶液体喷雾干燥后，制得的颗粒物69.5g。
实施例3含棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺在壳聚糖-三聚磷酸钠的亚微米凝胶包封率的测定：
按照实施例1和实施例2的制备方法，分别重复步骤1～2制备混悬状亚微米凝胶，不进行喷雾干燥，直接取混悬液2ml采用高速离心机(上海安亭GL-16G-II高速冷冻离心机)，在12000rpm的转速下，离心30min后，取各自上清液，作为样品溶液，按照下述方法分别测定棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的含量。
棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的含量越低，代表包封率越高。
棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7的含量检测方法为：照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5μm，250*4.6mm)，以0.1％TFA水溶液为流动相A，以0.1％TFA乙腈溶液为流动相B。按下表进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml，波长：215nm。分别取棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7各10mg，以水为溶剂，配置成浓度为1mg/ml的溶液，作为对照溶液。
测定法:取配制好的上清溶液和对照品各10μl，分别注入液相色谱仪。按照外标法计算峰面积。
β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的含量检测方法：照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定。色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(5μm，250*4.6mm)，以0.1％TFA水溶液为流动相A，以0.1％TFA乙腈溶液为流动相B。按下表进行梯度洗脱，流速为每分钟1.0ml，波长：215nm。称取β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺纯品10mg左右，以水作为溶剂，配置成浓度为1mg/ml的溶液，作为对照溶液。
测定法取配制好的上清溶液和对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪。
棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺对照品为海南中和美业科技有限公司精制并进行标定。
离心后的上清液检测结果显示，实施例1和实施例2的制备方法制备的混悬状亚微米凝胶液体经高速离心后，上清液中棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺在溶液中均未检出。说明已经全部被壳聚糖-三聚磷酸钠形成的亚微米凝胶所包裹(包封率为100％)。
由此可知，实施例1和实施例2的制备方法亚微米凝胶液体再经喷雾干燥之后，棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄均已包含在颗粒物中。
实施例4制备含有棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺、壳聚糖-三聚磷酸钠亚微米颗粒的精华液
使用实施例1制备的颗粒物0.2045g作为核心抗皱功效成分，按如下配方制备100g的精华液，配方如下：
制备方法：
步骤一：清洗消毒乳化设备，备好料。
步骤二、将A相加入乳化锅内，搅拌加热85～90℃，均质使所有物料溶解分散好，保温15分钟。
步骤三：降温至45℃以下加入B相搅拌均匀后，依次加入C相搅拌分散均匀。步骤四、取样检测合格后，继续搅拌，降温到38℃左右过滤出锅，静置后灌装。
实施例5制备含有棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺对照精华液
制备未被壳聚糖-三聚磷酸钠离子凝胶包裹的棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺精华液，其配方如下
步骤一：清洗消毒乳化设备，备好料。
步骤二、将A相加入乳化锅内，搅拌加热85～90℃，均质使所有物料溶解分散好，保温15分钟。
步骤三：降温至45℃以下加入B相搅拌均匀后，依次加入C相搅拌分散均匀。
步骤四、取样检测合格后，继续搅拌，降温到38℃左右过滤出锅，静置后灌装。
实施例6由棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺、壳聚糖、三聚磷酸钠组成的亚微米固体颗粒皮肤渗透性试验取实施例4制备的精华液适量作为样品，实施例5制备的精华液适量作为对照样品，按照下述方法开展体外皮肤渗透性试验。
试验仪器为：C1820型立式改进型Franz扩散池(上海锴凯科技贸易有限公司)，TK-12D型透皮仪(上海锴凯科技贸易有限公司)。
离体猪皮的制备：巴马香猪处死后立即剪取腹部皮肤，仔细剥离皮下脂肪层和结缔组织，用生理盐水冲洗干净，置生理盐水中，低温-25℃以下冰箱保存备用。试验前自然解冻，并用生理盐水浸泡30min，用滤纸吸干，备用。扩散池中暴露的皮肤面积为3.14cm2，接受室容积为19mL。先将制得的离体皮肤于室温下解冻，固定于供给池与接受池之间，将角质层面向供给池，放入接受液[0.9％生理盐水-乙醇(4:1)混合液]，排尽接受池中的气泡使接受液液面与皮肤内层完全接触，接受池保持在32±1℃恒温水浴，池内磁力搅拌速度为400r/min，平衡15min后，更换新的接受液。
测试方法如下：取实施例4制备的配方精华液1g涂布于皮肤表面作为对照组，另取实施例5制备的配方精华液1g涂布于皮肤表面作为样品组，记录时间为0h，对照组和样品组分别于0.5h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h时间点取样200μl作为待测样品，并及时补加等体积的新鲜接收液。
每个待测样品按照实施例3中描述的榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的含量检测方法，检测待测样品中的浓度。
体外皮肤累积渗透量的计算：按公式1计算累积渗透量，公式1中19为接受池体积(ml)，0.2为取样体积(ml)，Cn为第n个取样点测得的榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的浓度(ng/ml)，Ci为第n个取样点之前某时间点的测定浓度(ng/ml)，3.14为透皮扩散面积(cm2)。
公式1：
在不同时间节点取样后，对照组和样品组的棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的体外皮肤累积渗透量测定结果如下表2～4.
表2对照组和样品组的棕榈酰三肽-1的体外皮肤累积渗透量测定结果：
对应的以各取样点的各成分累积渗透量为纵坐标-时间为横坐标，绘制渗透曲线图，结果显示，在24h后，样品组(实施例4制备的精华液)的皮肤累积渗透量为1192ng/ml，而对照组(实施例5制备的配方的精华液)皮肤累积渗透量为853ng/ml，样品组的皮肤渗透量相比对照组皮肤渗透量提升了39.74％(计算公式为：(样品组的皮肤渗透量-对照组皮肤渗透量)/对照组皮肤渗透量×100)，说明经过实施例1所制备的颗粒物，在制备成相同基质配方后，显著提升了棕榈酰三肽-1的透皮吸收效果。
表3对照组和样品组的榈酰四肽-7的体外皮肤累积渗透量测定结果：
对应的以各取样点的各成分累积渗透量为纵坐标-时间为横坐标，绘制渗透曲线图，结果显示，在24h后，样品组(实施例4制备的精华液)的皮肤累积渗透量为642ng/ml，而对照组(实施例5制备的配方的精华液)皮肤累积渗透量为463ng/ml，样品组的皮肤渗透量相比对照组皮肤渗透量提升了38.66％(计算公式为：(样品组的皮肤渗透量-对照组皮肤渗透量)/对照组皮肤渗透量×100)，说明经过实施例1所制备的颗粒物，在制备成相同基质配方后，显著提升了棕榈酰四肽-7的透皮吸收效果。
表4对照组和样品组的β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的体外皮肤累积渗透量测定结果：
对应的以各取样点的各成分累积渗透量为纵坐标-时间为横坐标，绘制渗透曲线图，结果显示，在24h后，样品组(实施例4制备的精华液)的皮肤累积渗透量为19737ng/ml，而对照组(实施例5制备的配方的精华液)皮肤累积渗透量为14135ng/ml，样品组的皮肤渗透量相比对照组皮肤渗透量提升了39.63％(计算公式为：(样品组的皮肤渗透量-对照组皮肤渗透量)/对照组皮肤渗透量×100)，说明经过实施例1所制备的颗粒物，在制备成相同基质配方后，显著提升了β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的透皮吸收效果。
上述实验证实，按照实施例3制备的颗粒，显著提升了棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺透皮吸收效果。
实施例7由棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺、壳聚糖-三聚磷酸钠亚微米颗粒的抗皱功效对比试验试验样品：样品组使用实施例4制备精华液；对照组使用实施例5制备精华液，空白组使用实施例5制备的配方，去除配方中的棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺，补充水至配方总量100％，制备精华液作为空白组。
检测仪器：Primos皮肤快速三维成像系统(美国LMl公司)；
纳入标准：选取健康志愿者90名，符合以下条件：①年龄在30～65岁之间(妊娠或哺乳期妇女除外)；②眼部有明显干纹或皱纹；③无严重系统疾病、无免疫缺陷或自身免疫性疾病者；④无活动性过敏性疾病者；⑤无体质高度敏感者；⑥近一个月内未曾使用过激素类药物及免疫抑制剂者；⑦现在或最近三个月受试部位未参加其他临床试验者。终止和剔除标准：①志愿者因个人原因要求中止试验；②志愿者产生不良反应以至无法继续试验；③志愿者依从性差，如测试中使用其他对本试验有影响的护肤品等。试验时间为2022年9月至2022年11月，历时8周。
试验方法：
1.产品使用与测试方法
1)90名志愿者，按随机双盲原则，随机分配为3组，一组30人作为样品测试组，使用实施例6制备的配方2的乳液；第二组30人作为对照组，使用实施例6制备的配方1的乳液；第三组30人为空白组，使用实施例6制备的配方3的乳液。
2)志愿者每天早晚各用1次相对应的样品连续8周，在试验期间不与其他祛皱护肤品同用。
3)在0，2，4和8周随访1次，共4次。每次测试前，受试者需用清水清洁眼部，使用不含荧光剂的纸巾擦干眼部水分，在恒温恒湿环境(20～22℃，相对湿度40％～60％)下静坐至少20min，由测量人员进行测定。
4)仪器测试方法：使用皮肤快速三维成像系统Primos测量志愿者左右眼部周围皱纹皮肤位置(具有代表性的部位)，记录粗糙度Sa值、皱纹体积。
5)受试者主观评估：90名有效志愿者每天使用产品后都填写使用日志，根据个人主观感觉对产生皮肤不良反应做出评价。
2.统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。采用t检验或秩和检验，比较0，2，4和8周时的值，并进行显著性分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义，标记为“*”；P＜0.01和P＜0.001表示差异具有极显著统计学意义，分别标记为“**”和“***”。
3.结果与分析结果
1)志愿者统计资料结果:选择符合纳入标准的志愿者90人，最终90人完成本次试验，平均年龄42岁。
2)皮肤粗糙度改善情况
皮肤粗糙度Sa值表示在测试范围内每个点的高度的算术平均值，指标数值越低，皮肤粗糙度越小，皮肤越光滑。使用皮肤快速三维成像系统测量志愿者皮肤粗糙度Sa值，结果如表4所示：
表4皮肤粗糙度测试结果
各个测试组0周时的粗糙度Sa值最高，使用实施例4制备精华液的样品组和使用实施例5制备的精华液的对照组在2，4和8周后，粗糙度Sa值呈现逐渐下降趋势；样品组和对照组第8周的粗糙度Sa值与测试前(0周)比较，改善率分别达到23.85％和18.49％，而空白组改善率仅为6.38％，具有统计学意义(P<0.05)。样品组和对照组与空白组比较，第8周粗糙度Sa值改善率分别增加了17.47％和12.11％。使用样品组和对照组的样品8周，眼部Sa值改善率持续上升，说明样品组和对照品组均有较强的改善眼部皮肤粗糙度的功效。而且样品组改善眼部皮肤粗糙度优于对照组。
3)皱纹体积测试结果
皱纹体积Wrinkle volume值表示在分析区域内皱纹的体积大小，指标数值越低，皱纹体积越小，皱纹越少。使用皮肤快速三维成像系统测量志愿者皱纹体积值，结果如表5所示
表5皱纹体积测试结果
各个测试组0周时的皱纹体积值最高，使用实施例4制备的精华液的样品组和使用实施例5制备的精华液的对照组在2，4和8周后，皱纹体积值呈现逐渐下降趋势；样品组和对照组第8周皱纹体积值与测试前(0周)比较，改善率分别达到28.1％和20.37％，空白组(不含棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺)概率仅为3.26％。与空白组比较，样品组和对照组第8周皱纹体积值改善率增加了25.25％和17.11％，且样品组显著高于对照组。使用后，眼部皱纹体积值改善率持续上升，说明含有复合胜肽的组合具有更好改善眼纹的功效。

Claims (5)

1.一种复合胜肽的组合物，该组合物为由棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺、壳聚糖、三聚磷酸钠制备的固体颗粒，其制备方法为，在醋酸调节pH值为3～5的壳聚糖水溶液搅拌加入棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺溶解后，搅拌情况下滴加三聚磷酸钠水溶液，滴加完毕继续搅拌30分钟以上后，喷雾干燥后制得的颗粒物。干燥颗粒包含的榈酰三肽-1:棕榈酰四肽-7:β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺:壳聚糖:三聚磷酸钠的重量配比为：0.001～1:0.001～1:0.001～5:1～10:0.1～5。其特征在于通过上述方法制备的固体颗粒，提高了棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7和β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的透皮吸收效果，增强了棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7和β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺协同抗皱功效，可用于抗皱护肤品中。
2.根据权利要求1所述的复合胜肽组合物，所述制备方法为：配置浓度为0.1～10％的壳聚糖溶液20～1000ml，醋酸调节pH值为3.5～4.5之间，依次加入0.001～1g棕榈酰三肽-1、0.001～1g棕榈酰四肽-7和0.001～5gβ-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺，1～3小时内滴加浓度为0.1～5％的三聚磷酸钠水溶液10～500ml，搅拌速率为1000-3000转/分钟，滴加完毕，继续搅拌10～50分钟，得到由壳聚糖和三聚磷酸钠包裹棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7和β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的混悬溶液。棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7和β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺的包封率可达95％以上，喷雾干燥后制得复合胜肽的组合物。
3.根据权利要求1所述的复合胜肽组合物，优选的棕榈酰三肽-1:棕榈酰四肽-7:β-丙氨酰羟脯氨酰二氨基丁酸苄胺:壳聚糖:三聚磷酸钠的重量配比为0.06:0.03:1:2:1。
4.根据权利要求1所述的亚微米颗粒，所得亚微米颗粒水溶液进一步采用喷雾干燥，喷雾干燥机的进风温度设定为90-110℃，雾化压力设定在0.8-12bar，出峰温度设定在50～60℃，即得复合胜肽的组合物。
5.根据权利要求1～3所述的复合胜肽的组合物在化妆品中作为抗皱原料的用途。
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