CN117120476A - 对结构无序序列具有特异性的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于产生和/或获得特异性结合部分的方法，所述特异性结合部分针对内在无序蛋白质(IDP)和/或内在无序蛋白质结构域，在动物中，特别是在哺乳动物中，内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域趋于免疫惰性且缺乏免疫原性。本发明还涉及此类特异性结合部分，特别是抗体和/或其抗原结合片段，其特异性结合结构无序和/或内在无序的序列，特别是富含Pro/Ala的序列(PAS)。这些结合部分、抗体、抗原结合片段是首创的，因为它们结合/识别无序肽或多肽片段，也包含在此类“内在无序蛋白质”中，特别是PAS多肽。本发明的结合部分、抗体、抗原结合片段非限制性地特别适用于诊断环境以及研究工具。本发明涉及一种用于产生和/或获得特异性结合部分的方法，所述特异性结合部分针对内在无序蛋白质(IDP)和/或内在无序蛋白质结构域，在动物中，特别是在哺乳动物中，内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域趋于免疫惰性且缺乏免疫原性。本发明还涉及此类特异性结合部分，特别是抗体和/或其抗原结合片段，其特异性结合结构无序和/或内在无序的序列，特别是富含Pro/Ala的序列(PAS)。这些结合部分、抗体、抗原结合片段是首创的，因为它们结合/识别无序肽或多肽片段，也包含在此类“内在无序蛋白质”中，特别是PAS多肽。本发明的结合部分、抗体、抗原结合片段非限制性地特别适用于诊断环境以及研究工具。

Description

对结构无序序列具有特异性的抗体
本发明涉及一种用于产生和/或获得特异性结合部分的方法，所述特异性结合部分针对内在无序蛋白质(IDP)和/或内在无序蛋白质结构域，在动物中，特别是在哺乳动物中，该内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域趋于免疫惰性且缺乏免疫原性。本发明还涉及此类特异性结合部分，特别是抗体和/或其抗原结合片段，其特异性结合结构无序和/或内在无序的序列，特别是富含Pro/Ala的序列(PAS)。这些结合部分、抗体、抗原结合片段是首创的，因为它们结合/识别无序肽或多肽片段，正如也包含在此类“内在无序蛋白质”中的，特别是PAS多肽。本发明的结合部分、抗体、抗原结合片段非限制性地特别适用于诊断环境以及研究工具。
本发明特别地并且在一个具体实施方案中涉及一种产生抗原结合分子的方法，所述抗原结合分子优选地是抗体或其抗原结合片段，其针对内在无序肽/蛋白质和/或内在无序肽/蛋白质结构域，所述方法包括包括用抗原对非人类哺乳动物进行免疫的步骤，其中所述抗原是免疫佐剂与一种或多种P/A肽的缀合物，其中每种P/A肽独立地是由约5至约100个氨基酸残基组成的肽，其中所述肽的至少60％的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，并且其中保护基团RN连接至所述肽的N末端氨基。
本发明还涉及特定结构定义的杂交瘤，其包含编码本发明特异性结合部分/抗体/抗体片段和/或编码所述本发明特异性结合部分/抗体/抗体片段的可变区(如可变重链序列和/或可变轻链序列)和/或互补决定区(CDR)的核酸序列。本发明还涉及编码本发明抗体的CDR和/或轻链可变区或重链可变区的核酸分子，以及包含所述核酸分子的载体。本发明还涉及包含本发明载体的宿主细胞，以及产生本发明结合部分/抗体/抗体片段的方法，包含在合适条件下培养本发明宿主细胞和/或本发明杂交瘤，并分离所产生的结合部分/抗体/抗体片段。因此，本发明还涉及表达本发明结合部分/抗体/抗体片段的杂交瘤和/或宿主细胞。
此外，本发明涉及可通过本发明的方法获得的结合部分/抗体/抗体片段，涉及一种组合物，所述组合物包含至少一种本发明的结合部分、抗体或抗原结合片段、本发明的杂交瘤和/或宿主细胞、本发明的核酸分子、本发明的载体、本发明的杂交瘤/宿主细胞或通过本发明的方法产生的结合部分、抗体或抗原结合片段。本发明还涉及本发明的结合部分、抗体或抗原结合片段用于检测、定量和/或辨别内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域(特别是PAS序列和/或包含PAS序列的分子)的用途。此类检测、定量或辨别也可以在根据本发明的生物样品上进行，例如在血液或血浆样品上，或者在脑脊液、眼睛玻璃体、组织切片等样品上进行。本发明还提供了用于PAS蛋白修饰的(PASylated)生物制品的临床前和临床开发的研究工具和/或诊断试剂。本文还提供了用于筛选从用此类PAS蛋白修饰的生物制剂治疗的受试者(特别是人类患者)获得的生物样品的手段和方法，，所述生物制剂即包含生物活性(蛋白质)药物和包含例如小的残基Pro、Ala和Ser或者仅Pro和Ala的富含Pro/Ala的序列(PAS)的药物缀合物。所述药物缀合物不限于蛋白质药物或生物制剂，还可以包含“小分子”药物和化学药物以及碳水化合物药物和核酸药物。
本发明还涉及本发明的结合部分、抗体或抗原结合片段用于制备诊断装置、实验室用途、包含临床前或临床开发的研究和/或开发、纯化方法等中的手段的用途。例如，本发明的结合部分、抗体或抗原结合片段可用于基于基质的蛋白质/肽纯化或固定。尤其是，可以用本文提供的发明化合物，如发明的抗体或其抗原结合片段，来制备用于纯化内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域(特别是PAS序列和/或包含PAS序列的分子)的亲和基质。
在本说明书中，引用了多篇文献，包括专利申请和制造商手册。尽管这些文献的公开内容被认为与本发明的可专利性无关，但其全部内容通过引用并入本文。更具体地，所有参考文献都通过引用并入，就如同每篇单独的文献都被具体地且单独地指明通过引用并入一样。
内在无序蛋白质或蛋白质结构域(IDP)在自然界中很常见，并在信号转导和蛋白质运输中发挥重要作用，例如，如同突触囊泡磷酸酶(synaptojanin)或RelA的转录激活结构域(Snead和Eliezer，2019；Tantos等，2012年；Wright和Dyson，2015)。此类IDP在多种病原体中也很丰富，因此是防治传染病的潜在靶标(Feng等，2006)。与结构蛋白的特异性相互作用相反，无序肽或多肽片段(也包含在IDP中)的性质通常对免疫系统产生同源抗体构成挑战，这是一种被病原体利用来逃避免疫应答的特征(Giri等，2016；Goh等，2016)。
抗原主要是蛋白质或肽，其表面表位作为特异性抗体识别的相互作用点。表位通常分为两类：(i)由其一级结构定义的线性表位；以及(ii)构象表位，其中关键氨基酸在氨基酸序列中是不连续的，但在(结构定义的)三维折叠中非常接近(Barlow等，1986)。长期以来，一直认为表位主要是不连续的(Barlow等，1986)；实际上，最近的分析表明，构象表位约占天然蛋白质中所有B细胞表位的90％(Huang和Honda，2006)。
尽管已经详细分析了无序蛋白质之间的相互作用(Fong等，2009；Meszaros等，2007年；Uversky，2019)，只有少数研究解决了无序蛋白质抗原与结构确定的结合配偶体(如抗体)之间复合物形成的结构方面(Fassolari等，2013；MacRaild等，2016)。一般而言，肽形成与抗体的界面，该界面由氢键主导，通常涉及肽主链，并且它们倾向于以比蛋白质更平面的方式结合(London等，2010)。此外，与折叠抗原相比，IDP呈现更小的表位，并且在每一接触残基的自由能增加方面似乎更有效(MacRaild等，2016年)。蛋白质抗原的结构分析表明，无序表位中的残基比构象表位中的残基更可能参与氢键和盐桥(MacRaild等，2016)。更具体地，如现有技术所假设的，与肽的界面通常富含大的疏水侧链，如Phe、Leu、Trp、Tyr和Ile，其充当结合的热点(London等，2010)。
在过去十年中，人工结构无序多肽在药物生物技术领域中深受关注，在该领域中，它们作为聚乙二醇(PEG，一种高度亲水的化学聚合物)的功能替代物被用于调整蛋白融合配偶体或药物缀合物的体内性质(Schellenberger等，2009；Schlapschy等，2013)。例如，药理活性蛋白质或肽或(“小”)分子与包含三种小氨基酸Pro、Ala和/或Ser的长多肽的缀合，即所谓的PAS蛋白修饰通过延迟肾滤过显著扩大了流体动力体积并延长了血浆半衰期(Binder和Skerra，2017)。因此，开发了富含Pro/Ala的序列(PAS)多肽作为聚乙二醇(PEG)的生物替代物，以产生具有延长的血浆半衰期的生物药物。非常类似化学大分子PEG，重组PAS多肽是构象无序的，并且在水中表现出高溶解度。实际上，由于没有任何带电或明显的疏水侧链，这些生物合成聚合物代表了IDP的一种极端情况。
如上所述，方法依赖于构象无序的多肽链，其具有扩大的流体动力学体积，包含富含Pro/Ala的序列(PAS)，即小残基Pro、Ala和Ser或者仅Pro和Ala。这些PAS序列是亲水的、不带电的生物聚合物，其生物物理性质非常类似于PEG，其与药物的化学结合是延长血浆半衰期的既定方法。与PEG相反，PAS多肽已被描述为能够在遗传水平上与治疗性蛋白质或肽简单融合，允许在大肠杆菌或其它宿主细胞中产生完全活性的治疗性蛋白质，并避免体外偶联或修饰步骤(Binder和Skerra，2017)。此外，富含Pro/Ala的序列(PAS)/PAS多肽是可生物降解的，因此避免了器官蓄积，同时在血清中表现出稳定性并且没有毒性。实际上，技术的另一个优点是提供了免疫惰性的PAS多肽，因此对医学和治疗用途非常有利。然而，缺乏免疫原性也是本领域中没有描述针对此类内在无序蛋白质(IDP)和/或内在无序蛋白质结构域的抗体的原因。然而，此类特异性抗体是期望的，特别是作为研究工具以及在诊断情景中，包括患者分层和/或治疗应答的监测。
因此，本发明潜在的技术问题是提供用于制备结合部分(特别是抗体和/或抗体片段)的手段和方法，该结合部分特异性结合内在无序蛋白质或蛋白质结构域，特别是具有扩大的流体动力学体积的无序多肽链，其包含氨基酸残基Pro和Ala和/或Pro、Ala和Ser(PAS)。
这个技术问题由本文提供的实施例和所附权利要求来解决。
在第一个实施方案中，本发明涉及一种产生抗原结合分子、优选抗体或其抗原结合片段的方法，其针对内在无序肽/蛋白质和/或内在无序肽/蛋白质结构域，所述方法包括用抗原对非人类哺乳动物进行免疫的步骤，其中所述抗原是免疫佐剂与一种或多种P/A肽的缀合物，其中每种P/A肽独立地是由约5至约100个氨基酸残基组成的肽，其中所述肽的至少60％的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，并且其中所述肽的N末端氨基连接一个保护基团RN。
在本发明的上下文中，如实施例中所示，发明人惊奇地发现，当PAS多肽与免疫佐剂/高免疫原性载体蛋白诸如KLH(优选形成分子量大于约5兆道尔顿(5MDa)的蛋白复合物)缀合时，与本文公开的免疫方案组合，可以在非人类哺乳动物中，特别是在小鼠中引发PAS定向的抗体应答。这是意想不到的，并且通过本文公开的手段和方法是可能的。通常认为与免疫佐剂的结合提供了另外的T细胞表位，因此也增加了缀合物的肽部分的免疫原性。因此，认为免疫系统产生特异性结合这些肽的抗体的能力增加了。然而，先前已在用于本发明的相同BALB/c小鼠品系中显示(Schlapschy等，2013)，PAS部分与蛋白质部分如人IFNα2b缀合并重复免疫小鼠，即使使用弗氏佐剂作为免疫增强剂(加强剂)，也根本不会导致产生PAS特异性抗体，而是导致产生IFNα2b特异性抗体。类似地，在用PAS-hGH反复处理的小鼠血浆样品中，在蛋白质印迹上可检测到与人生长激素(hGH)部分具反应性的IgG，但与融合到其它蛋白质的PAS序列没有交叉反应性，这表明PAS多肽本身没有免疫原性(Schlapschy等，2013)。实际上，这种完全缺乏PAS(即使当融合到蛋白质部分时)导向的免疫原性，也是PAS蛋白修饰技术的关键特征，这可直接归因于小的且生物化学惰性的氨基酸Pro、Ala和Ser的性质，或构成此类PA(S)肽的Pro和Ala的性质。
现有技术假设与肽的界面通常富含大的疏水侧链，如Phe、Leu、Trp、Tyr和Ile(包含在用于与载体蛋白缀合的肽中)，其充当结合的热点(London等，2010)。相反，因此令人惊讶的是，本发明的创造性结合部分的附加晶体结构揭示了Ala在PA(S)肽识别中特别相关且前所未知的作用。这特别令人惊讶，因为PA(S)肽中包含的所有氨基酸都具有免疫/化学惰性侧链，并且没有任何可能形成强疏水和/或静电相互作用的带电和/或明显的疏水侧链。此外，PA(S)(多)肽在生理条件下的随机卷曲行为对与结合蛋白如抗体形成复合物时无序到有序的转变造成了相当大的熵成本。这也通过使用PAS蛋白修饰的抗体片段的大量体内成像研究以及涉及重复蛋白质给药的临床前动物实验而得到证实，其中既没有检测到任何与非靶组织或器官的非特异性结合，也没有检测到PAS特异性免疫应答(Bolze等，2016；Harari等，2014；Mendler等，2015；Richter等，2020)。总之，这些PAS特异性序列/结构特征因此对产生PA(S)特异性抗体提出了独特且显著的挑战，这通过本文公开的本发明方法和肽/抗原得以克服。相应的说明性P/A肽/抗原也在下文进行描述。
本发明在一个具体实施方案中涉及一种产生特异性结合部分的方法，所述特异性结合部分特别是抗原结合分子，其针对内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域或肽，所述方法包括用抗原对非人类哺乳动物进行免疫的步骤，
其中所述抗原是免疫佐剂与一种或多种P/A肽的缀合物，
其中每种P/A肽独立地是肽RN-(P/A)-RC，
其中(P/A)是由约5至约100个氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中(P/A)中至少60％的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，其中(P/A)包含至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基，
其中RN是连接至(P/A)的N末端氨基的保护基团，
其中RC是经由其氨基与(P/A)的C末端羧基结合的氨基酸残基，并且在其氨基和羧基之间包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少6个碳原子，并且
其中每种P/A肽通过由P/A肽的C末端氨基酸残基RC的羧基和免疫佐剂的游离氨基形成的酰胺键与免疫佐剂缀合。
在一个优选的实施方案中，用于产生如本文所述的所述抗原结合分子(优选所述抗体或其抗原结合片段(针对内在无序肽/蛋白质和/或内在无序肽/蛋白质结构域))的方法是用所述P/A肽对非人类进行免疫的方法，
其中P/A肽独立地是肽RN-(P/A)-RC，并且是由约8至约90个氨基酸残基组成的肽，
其中(P/A)中至少70％的数量的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，其中(P/A)包括至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基，
其中RN是连接至(P/A)的N末端氨基的保护基团，
其中RC是经由其氨基与(P/A)的C末端羧基结合的氨基酸残基，并且在其氨基和羧基之间包含至少一个碳原子，并且
其中每种P/A肽经由由P/A肽的C末端氨基酸残基RC的羧基和免疫佐剂的游离氨基形成的酰胺键与免疫佐剂缀合。
如本文所用，术语“特异性结合部分”尤其包含本文所述的抗原结合分子、抗体及其抗原结合片段。然而，该术语还包含能够特异性结合所述内在无序肽/蛋白质但非普通抗体形式的其它分子。此类“结合部分”尤其可包含如融合蛋白或(蛋白质)构建体的分子，其包含基于或衍生自可通过本文提供的手段和方法获得的抗体的结合部分。此类构建体尤其可以包含本文提供的和/或用本发明的方法可获得的抗体/抗体片段的至少一个、至少两个或三个互补决定区(CDR)。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种产生针对内在无序肽/蛋白质和/或内在无序肽/蛋白质结构域的抗原结合分子的手段和方法，所述抗原结合分子优选抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于产生抗体和/或其抗原结合片段的手段和方法，所述抗体和/或其抗原结合片段针对和/或特异性结合内在无序肽/蛋白(IDPs)和/或内在无序蛋白质结构域，特别是富含Pro/Ala的序列(“PAS”)、“PAS”序列/“PAS”部分。
富含Pro/Ala的序列(“PAS”)，“PAS”序列/“PAS”部分在本文中定义，并且在WO
2008/155134和WO 2011/144756中也有描述。如在(Schlapschy等，2013)或(Binder和Skerra，2017)中进一步描述的，这些“PAS”部分还涉及由至少7个形成随机卷曲构象的氨基酸残基组成的肽，其中形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基选自Pro(P)、Ala(A)和Ser(S)，或者选自Pro(P)和Ala(A)。蛋白药物缀合物中包含的富含Pro/Ala的序列也被描述为“(P/A)”序列，例如在WO 2018/234455中。这些(P/A)序列，即此处富含Pro/Ala的序列，可由约7至约1200个氨基酸残基组成，其中(P/A)中至少80％的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，其中(P/A)包括至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基。然而，由本文的公开内容显而易见并且在本领域中也是已知的，术语“富含Pro/Ala的序列(PAS)”、“PAS”、“PAS部分”或“PAS序列”不应被解释为限于内在无序蛋白质/肽(IDP)和/或仅包含Pro和Ala的形成随机卷曲构象的蛋白/肽。该术语还涵盖主要由Pro、Ala和Ser组成的相应蛋白质/肽。此外，在较小程度上，还可包含其它氨基酸，如也在上文引用的WO 2008/155134、WO 2011/144756或WO 2018/234455中所公开的(全部通过引用并入)。
如本文所述，药物与此类(P/A)序列和/或富含Pro/Ala的序列(PAS)的缀合也被称为PAS蛋白修饰其通过延缓体内肾过滤而显著扩大流体动力体积并延长血浆半衰期(Griffiths等，2019；等，2018；Richter等，2020)。
因此，本发明提供了用于获得特异性结合结构无序和/或内在无序的序列，特别是富含Pro/Ala的序列(PAS)的特异性结合部分特别是抗体和/或其抗原结合片段的手段和方法。现有技术没有提供也没有描述针对结构无序和/或内在无序序列、特别是富含Pro/Ala的序列的任何抗体和/或抗原结合片段。此外，以前曾描述过由Pro、Ala和Ser组成的重组多肽，或甚至仅由Pro和Ala组成的重组多肽，无论其确切的氨基酸序列如何，都是高度亲水和结构无序的——如果避免某些重复模式或长的同源氨基酸序列(Breibeck和Skerra，2018；Schlapschy等，2013)。值得注意的是，氨基酸序列在遗传水平上被确切限定的PAS多肽是完全中性的，而它们的侧链——特别是不含Ser的P/A序列——缺乏明显的极性基团。因此，可以通过在缺乏刚性二级结构的情况下将肽基团暴露于水性溶剂来解释富含Pro/Ala的序列(PAS)的强亲水性(Breibeck和Skerra，2018)。最后但同样重要的是，由于缺乏明显的极性基团，富含Pro/Ala的序列/(PAS)序列在动物中缺乏免疫原性，特别是在哺乳动物中。这种低免疫原性确实是药物和医疗领域中技术的标志之一。
已知在技术中使用的PAS多肽在哺乳动物中缺乏免疫原性(“免疫惰性”)，特别是在啮齿类动物如小鼠、大鼠或兔中，即通常用于制备(单克隆)抗体的动物。实际上，由于其受限的氨基酸组成，PAS多肽缺乏带电荷和庞大的疏水侧链，而疏水侧链通常在分子识别中起作用，尤其是在免疫应答中。此外，它们在生理条件下的随机卷曲行为对与结合蛋白(如抗体)形成复合物时无序到有序的转变造成了巨大的熵成本。使用PAS蛋白修饰的抗体片段的大量体内成像研究以及涉及重复蛋白质给药的临床前动物实验，这也通过得到证实，其中既没有检测到任何与非靶组织或器官的非特异性结合，也没有检测到PAS特异性免疫应答(Bolze等，2016；Griffiths等，2019；Harari等，2014；Mendler等，2015；Richter等，2020)。
然而，尽管在以前的动物研究中富含Pro/Ala的序列(PAS)缺乏免疫原性，本发明人已经成功地产生了特异性结合不同富含Pro/Ala的序列(PAS)的结合部分，特别是(单克隆)抗体。这一成功乃是基于新颖且创造性地提供了用于非人类动物免疫的特异性抗原。所述创造性抗原在本文中表示为包含(P/A)序列[(P/A)是氨基酸序列]或(P/A)抗原[以本文所定义的格式RN-(P/A)-RC]，其特征在于它们与高免疫原性载体蛋白(“免疫佐剂”)的缀合，例如钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)。(P/A)序列或(P/A)抗原经由在(P/A)序列/抗原的C末端氨基酸或接头残基(本文称为“RC”)的羧基和免疫佐剂的一个或多个游离氨基之间形成的酰胺键与所述免疫佐剂缀合。此外，在本发明的上下文中使用的(P/A)序列/抗原是N末端封闭的，即被连接至所述(P/A)序列/抗原的N末端氨基的保护基团封闭，该保护基团在本文表示为“RN”。这也避免了N末端特异性抗体的形成。
本发明的创造性方法包括用本文公开的(P/A)肽/序列/抗原对非人类哺乳动物(特别是小鼠)进行免疫，特别是以本文讨论的RN-(P/A)-RC形式提供。这些(P/A)序列/抗原直接用作本文定义的免疫原，即在N末端包含保护基团“RN”，在C末端连接免疫佐剂。然而，还设想用于免疫的抗原包含多个所述(P/A)肽/序列/抗原。因此，本发明的情况下使用的抗原是免疫佐剂与一个或多个(P/A)肽/序列/抗原的缀合物，如本文所公开的。
优选的(P/A)肽/序列/抗原可以包含：
由约5至约100个氨基酸残基、更优选约8至约90个氨基酸残基组成的氨基酸序列/抗原，其中(P/A)中至少60％、至少70％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，其中(P/A)包含至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基；
由约5至约100个氨基酸残基、优选约10至约80个氨基酸残基组成的氨基酸序列/抗原，其中(P/A)中至少70％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，其中(P/A)中至少95％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸，并且其中(P/A)包括至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基；和/或
由约20至约40个独立地选自脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸残基组成的氨基酸序列/抗原，其中(P/A)中至少70％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，并且其中(P/A)包括至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基。
在本发明的一个实施方案中，在本文提供的用于非人类哺乳动物免疫的方法中使用的(P/A)肽/序列/抗原可以是(P/A)序列/抗原，其中所述(P/A)中包含的脯氨酸残基数量与(P/A)中包含的氨基酸残基总数的比例≥约10％且≤约70％，优选≥约20％且≤约50％，更优选≥约25％且≤约40％。
根据上文，在本发明的上下文中使用的(P/A)肽/序列/抗原可以是由以下组成的(P/A)肽/序列/抗原：(i)独立地选自“ASPA”、“APAP”、“SAPA”、“AAPA”和“APSA”的五个或更多个部分序列；以及(ii)任选地，独立地选自脯氨酸(P)、丙氨酸(A)和丝氨酸(S)的一个、两个或三个另外的氨基酸残基。(P/A)肽/序列/抗原也可以包含多聚体以及独立地选自“ASPA”、“APAP”、“SAPA”、“AAPA”和“APSA”的这些部分序列的组合。在一个实施方案中，所述(P/A)肽/序列/抗原由以下组成：(i)序列ASPA-APAP-ASPA-APAP-SAPA(SEQ ID NO：1)；(ii)序列AAPA-APAP-AAPA-APAP-AAPA(SEQ ID NO：2)；(iii)序列APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA(SEQ ID NO：3)；(iv)双倍的任何前述序列；或(v)前述序列中的至少两个的组合。
此类肽/序列/抗原的非限制性实施例是由以下组成的(P/A)：(i)序列ASPA-APAP-ASPA-APAP-SAPA-ASPA-APAP-ASPA-APAP-SAPA；(ii)序列AAPA-APAP-AAPA-APAP-AAPA-AAPA-APAP-AAPA-APAP-AAPA；或(iii)序列APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA。这些序列的多聚体也包含在本发明的要旨中，并且可以用于本文提供的非人类动物的免疫方法中。在实验部分还提供了实施方案的非限制性实例，如“PAS#1”、“P/A#1”或“APSA”。在实验部分，此类缀合到(“免疫佐剂”)并在N末端被封闭的20聚体肽(或其多聚体，如40聚体，如SEQ ID NO：5、6或7所示)被用作说明性实例。令人惊讶的是，用本文公开的新颖且创造性的方法获得了对PAS序列基序具有高结合活性和特异性的几种单克隆抗体(MAb)。
因此，在本发明的一个优选实施方案中，产生所述抗原结合分子、所述抗体和/或所述抗原结合片段的方法包括：用包含一种或多种P/A肽的抗原对非人类动物进行免疫，
其中所述P/A肽独立地是肽
RN-(P/A)-RC，
其中所述P/A肽是由约5至约100个氨基酸残基组成的肽，并且其中(P/A)中至少70％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，其中(P/A)包括至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基，
其中RN是连接至(P/A)的N末端氨基的保护基团，
其中RC是经由其氨基与(P/A)的C末端羧基结合的氨基酸残基，并且在其氨基和羧基之间包含至少一个碳原子，以及
其中每种P/A肽经由由P/A肽的C末端氨基酸残基RC的羧基和免疫佐剂的游离氨基形成的酰胺键与免疫佐剂缀合。
此外，在本发明的该优选实施方案的情况下，上文提供的对P/A肽/抗原和/或(P/A)的解释适用于此处。
如上所述，发明人使用本文提供的手段和方法，在产生针对内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域或肽、特别是针对PAS序列、正如尤其是针对在已知的途径/技术中使用的PAS序列的(非人类)单克隆抗体(MAb)方面，取得了令人惊讶的成功。已知这些在技术中使用的内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域或肽或PAS多肽在哺乳动物特别是在啮齿动物如小鼠、大鼠或兔中，即通常用于制备(单克隆)抗体的动物中，缺乏免疫原性(为“免疫惰性”)。如本文和所附实验部分、实施例和附图所示，这一成功是使用由本文定义的P/A肽/抗原或(P/A)(或其多聚体)组成和/或包含其的抗原进行免疫的结果。如本文所述，所述P/A肽/抗原可以采用随机卷曲构象。此外，抗原可以包含两种或更多种如本文所定义的“P/A肽”。所述抗原中包含的P/A肽可以是本文定义的相同P/A序列的多个拷贝，诸如但不限于独立地选自“ASPA”、“APAP”、“SAPA”、“AAPA”和“APSA”的序列。本文提供了实施例，并且也在序列如SEQ ID NO：5、6或7中进行了说明。同样，在本发明的上下文中使用的抗原是免疫佐剂与一种或多种P/A肽的抗原缀合物，其中每种P/A肽独立地是以下结构的肽
RN-(P/A)-RC。
在本发明的情况下，“RN”是连接至本文定义的(P/A)氨基酸序列的N末端氨基上的保护基团。所述“RN”可以选自焦谷氨酰基(Pga；称为2-吡咯烷酮-5-羧酸(2-pyrrolidone-5-carboxylic acid)或5-氧代脯氨酸(5-oxoproline))、高焦谷氨酰基、甲酰基、乙酰基、羟基乙酰基、甲氧基乙酰基、乙氧基乙酰基、丙氧基乙酰基、丙酰基、2-羟基丙酰基、3-羟基丙酰基、2-甲氧基丙酰基、3-甲氧基丙酰基、2-乙氧基丙酰基、3-乙氧基丙酰基、丁酰基、2-羟基丁酰基、3-羟基丁酰基、4-羟基丁酰基、2-甲氧基丁酰基、3-甲氧基丁酰基、4-甲氧基丁酰基、甘氨酸甜菜碱基、邻氨基苯甲酰基、-NH-(C1-6烷基)、-N,N(C1-8烷基)2、N,N,N-三(C1-6-烷基)3、N,N-四亚甲基和N,N-环戊烷。
应当理解，如果RN是基团N-(C1-6烷基)、N,N-二(C1-6烷基)或N,N,N-三(C1-6烷基)，将存在一个、两个或三个C1-6烷基结合待保护的(P/A)部分的氨基的氮原子。在两个或三个烷基结合氮原子的情况下，各个烷基各自独立地是C1-6烷基，因此可以相同或不同。在三个烷基的情况下，所述氮原子将是铵基。
此外，如果RN是基团N,N-四亚甲基或N,N-五亚甲基，应当理解，四亚甲基或五亚甲基碳链的两端将连接至待保护的相同氨基的氮原子上，并因此将与它们所连接的氮原子一起形成饱和的5或6元环(即，吡咯烷或哌啶环)。
如本文所用，“RC”是经由其氨基与本文定义的(P/A)氨基酸序列的C末端羧基结合的氨基酸残基，并且在其氨基和羧基之间包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或六个碳原子。在一个优选的实施方案中，所述“RC”可以是H2N-(C1-12烃基)-COOH。在另一个优选的实施方案中，“RC”可以选自H2N-(CH2)1-10-COOH、H2N-苯基-COOH和H2N-环己基-COOH。甚至更优选“RC”选自H2N-CH2-COOH(Gly)、H2N-(CH2)2-COOH(β-Ala)、H2N-(CH2)3-COOH、H2N-(CH2)4-COOH、H2N-(CH2)5-COOH、H2N-(CH2)6-COOH、H2N-(CH2)7-COOH、H2N-(CH2)8-COOH、对氨基苯甲酸和4-氨基环己烷羧酸。最优选“RC”是H2N-(CH2)5-COOH(氨基己酸)。
在一个优选的实施方案中，并如所附实施例所示，本发明的手段和方法中采用的抗原中包含的P/A肽采用随机卷曲构象。此外，所述抗原中包含的所述P/A肽没有带电荷的残基。如本文所述，还可以在较小程度上包含其它氨基酸，尤其如上文引用的WO 2008/155134、WO 2011/144756或WO 2018/234455中所公开的(全部通过引用并入本文)。此外，这些另外的氨基酸优选没有任何带电荷的残基和/或没有任何明显的疏水侧链。示例性的非限制性氨基酸可以是甘氨酸。
在本发明的上下文中采用并且如本文所提供的抗原是免疫佐剂与一种或多种如本文所定义的P/A肽的缀合物。此类“免疫佐剂”在本领域中是已知的，并被描述为高免疫原性载体蛋白，其对于将被施用这些高免疫原性载体蛋白的受试者来说不是排他的，但优选是外来的(即，来自不同的物种)。优选地，如实施例中所示，此类免疫佐剂形成分子量大于约5兆道尔顿(5 000 000Da)的蛋白质复合物。此类免疫佐剂的优选实施例是KLH。同样，这些高免疫原性载体蛋白诱导针对“免疫佐剂”/高免疫原性载体蛋白本身的可检测抗体滴度(即，结合的抗体)。在本发明的情况下，本文定义的P/A肽或(P/A)氨基酸序列与所述免疫佐剂的赖氨酸残基的ε氨基或游离N末端氨基缀合。免疫佐剂可以非限制性地选自钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)。优选地，所述免疫佐剂是钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)。
根据以上所述，本发明抗原的非限制性实施例以及在本文提供的手段和方法的上下文中使用的抗原是：
Pga-PAS#1(40)-Ahx：(Pga-ASPA-APAP-ASPA-APAP-SAPA-ASPA-APAP-ASPA-APAP-SAPA-Ahx；SEQ ID NO：5)；
Pga-P/A#1(40)-Ahx：(Pga-AAPA-APAP-AAPA-APAP-AAPA-AAPA-APAP-AAPA-APAP-AAPA-Ahx；SEQ ID NO：6)；
Pga-APSA(40)-Ahx：(Pga-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-APSA-Ahx；SEQ ID NO：7)。
Pga表示焦谷氨酰残基(也称为2-吡咯烷酮-5-羧酸或5-氧代脯氨酸)，Ahx表示氨基己酸。因此，这些说明性的40聚体“P/A”肽被设计成涵盖至少两个拷贝的相应“PAS序列重复”。这些肽仅含有化学惰性侧链，并具有封闭的N末端，它们的单个C末端羧酸基团(实际上，是一个Ahx接头残基)被选择性激活，并用于与免疫佐剂(即，在所附实施例中的KLH)的Lys侧链的ε氨基进行定向化学缀合。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了新颖且创造性的抗原，该抗原尤其可以在本发明方法中使用而无需再费周折，该方法用于在非人类动物(特别是啮齿类动物(如小鼠和大鼠)以及其它哺乳动物，包含但不限于马、绵羊、山羊、骆驼科动物等)中产生针对内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域或肽的抗原结合分子(特别是抗体)。因此，本发明还涉及本文定义和提供的抗原。此外，本发明的要旨是在本发明的方法中使用这种/这些抗原。因此，本发明还涉及本文提供的抗原的非治疗用途，用于产生针对内在无序肽/蛋白质和/或内在无序肽/蛋白质结构域的抗原结合分子，优选抗体或其抗原结合片段，其中所述用途包含非人类哺乳动物的免疫接种。
通过本发明可获得并获得的结合部分(特别是抗原结合分子，最特别是抗体或其抗原结合片段)针对内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域或肽。这些结合部分、抗原结合分子、抗体或其抗原结合片段也是本发明的一部分，并且它们优选且特异性地结合结构无序和/或内在无序的序列，特别是富含Pro/Ala的序列(PAS)，这也是本领域已知的。此类富含Pro/Ala的序列(PAS)在本文中定义，并且也描述于WO 2008/155134和WO 2011/144756中。如上所讨论的，如在(Schlapschy等，2013)或(Binder和Skerra，2017)中进一步描述的，这些“PAS”部分还涉及形成随机卷曲构象的由至少7个氨基酸残基和多至约2000个氨基酸残基组成的肽，其中形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基选自Pro(P)、Ala(A)和Ser(S)或者选自Pro(P)和Ala(A)。因此，在一个优选的实施方案中，本文提供的抗原结合分子的“结合靶标”，最特别是抗体或其抗原结合片段的“结合靶标”，是内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域，它们是富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或由至少10、至少20、至少40、至少50、至少60、至少80、至少100、至少120、至少140、至少160、至少180，至少190、至少200或约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、约1000、约1500或约2000个形成随机卷曲构象的氨基酸残基组成的氨基酸序列，并且由此形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基选自Pro(P)、Ala(A)和Ser(S)，或者是Pro(P)和Ala(A)。尤其是WO 2008/155134和WO 2011/144756中提供了形成随机卷曲构象的富含Pro/Ala的序列(PAS)的进一步定义和解释，这两篇文献均通过引用并入本文。
在本发明的进一步实施方案中，结合部分(特别是抗原结合分子，最特别是抗体或其抗原结合片段)可以结合富含Pro/Ala的序列(PAS分子；“PAS”)，其中所述PAS可以是由约7至约2000个、优选约7至约1200个氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中“PAS”中至少80％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，并且其中所述(PAS)包括至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基。所述“PAS”也可以是由约8至约400个氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中“PAS”中至少85％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，并且其中“PAS”中至少95％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，并且其中“PAS”包括至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基。本发明的结合部分也可以特异性结合富含Pro/Ala的序列(PAS分子；“PAS”)，其中“PAS”是由10至60个独立地选自脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸的氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中“PAS”中至少95％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，并且其中“PAS”包括至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基。相应的“PAS”分子也描述于WO 2018/234455中，其也通过引用并入本文。
因此，在一个具体实施方案中，本发明的结合部分、抗原结合分子或抗体(或其抗原结合片段)特异性结合富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或结合由至少20、优选至少40、优选至少60、优选至少80、更优选至少100、更优选至少120、更优选至少140、更优选至少160、更优选至少180、更优选至少200、更优选、更优选至少300至约1200个形成无规卷曲构象的氨基酸残基组成的氨基酸序列，并且由此形成所述无规卷曲构象的所述氨基酸残基选自Pro(P)、Ala(A)和Ser(S)，或者是Pro(P)和Ala(A)。因此，本发明的结合部分的优选目标富含Pro/Ala的序列(PAS分子；“PAS”)包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸或由其组成，或者包含丙氨酸和脯氨酸。
在本发明的一个实施方案中，本发明的结合部分(特别是抗原结合分子，最特别是抗体或其抗原结合片段)可以结合和/或检测所述PAS靶序列上的至少一个表位。该表位可以是线性表位，但也可以是由三维结构提供的表位。所附的非限制性实施例为相应的结合研究提供了充分的证据，包含表位定位(epitope mapping)、SPOT表位分析、抗原亲和力测量(例如，通过ELISA)、表面等离子体共振(SPR)实时测量、蛋白质印迹以及通过抗原结合片段(特别是Fab片段)的共结晶等。非限制性地，在本发明的一个实施方案中，本发明的抗原结合分子(最特别是抗体或其抗原结合片段)可以结合富含Pro/Ala的序列，该富含Pro/Ala的序列包含以下结构的至少一个表位
(P/S)A(A/S)P和/或
PA(A/S)P。
所述表位可以是或可以包含选自PAPAAP(SEQ ID NO：8)、PAPASP(SEQ ID NO：9)、PASPAAP(SEQ ID NO：10)、PSAAPS(SEQ ID NO：79)、ASPAAP(SEQ ID NO：80)、PASPAA(SEQ IDNO：81)、PAAP(SEQ ID NO：82)、PASP(SEQ ID NO：83)、APSA(SEQ ID NO：84)和PSAA(SEQ IDNO：85)的表位延伸片段(epitope stretch)。
如本文所附实施例和下文所述，本发明提供了多种新颖且创造性的抗体或其抗原结合片段。同样，不受理论的限制和束缚，
对于抗PA(S)MAb 2.2、抗PA(S)MAb 2.1、抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb 1.2，推导出表位检测“PAAP”；
对于抗PA(S)MAb 2.2、抗PA(S)MAb 2.1、抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb 1.2，推导出表位检测“PASP”；
对于抗PA(S)MAb 2.2和抗PA(S)MAb 2.1，推导出表位检测“PAPASP”；
对于抗PA(S)MAb 2.2和抗PA(S)MAb 2.1，推导出表位检测“PAPAAP”；
对于抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb 1.2，推导出表位检测“PASPAAP”；
对于抗PA(S)MAb 1.1，推导出表位检测“PASPAA”；
对于抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb 1.2，推导出表位检测“ASPAAP”；
对于抗PA(S)MAb 3.1和抗PA(S)MAb 3.2，推导出表位检测“APSA”；
对于抗PA(S)MAb 3.1和抗PA(S)MAb 3.2，推导出表位检测“PSAA”；
对于抗PA(S)MAb 3.2，推导出表位检测“PSAAPS”。
正如本文提供的附加的、非限制性的但高度说明性的抗原结合分子(Fab片段)的(共)结晶数据，实施例的进一步表位研究说明了本发明的抗原结合分子(即，抗体/其抗原结合片段)结合包含丙氨酸残基(A，Ala)的表位。有趣的是，富含Pro/Ala的序列的至少一个Ala残基参与了与抗PAS Fab的相关相互作用；因此，非限制性地，丙氨酸可被认为是本发明抗体与富含Pro/Ala的序列内的PAS表位相互作用的“热点”。直到本发明之前，认为具有最小侧链的氨基酸Ala在蛋白质-蛋白质/肽识别中发挥的作用可以忽略不计。实际上，丙氨酸扫描诱变策略(Cunningham和Wells，1989)已广泛应用于分析受体-配体或抗体-抗原结合的关键残基，假设丙氨酸甲基侧链对分子相互作用具有准惰性作用。出乎意料的是，本发明揭示了Ala实际上可以在抗原识别中扮演核心角色，如本发明上下文中提供的晶体结构研究所特别举例说明的。
在本文中，本发明还提供了本发明的结合部分、抗原结合分子、抗体/其抗原结合片段与富含Pro/Ala的序列(PAS)分子和本文提供的表位(特别是包含丙氨酸的表位)之间的复合物。这些表位可包含如(P/S)A(A/S)P和/或PA(A/S)P之类的结构。
在本发明的另一个实施方案中，本文提供并要求保护可通过本文提供的手段和方法获得的特异性结合部分之间的复合物，特别是本发明的抗原结合分子(如抗体及其抗原结合片段)和富含Pro/Ala的序列/(PAS)分子之间的复合物。此外，本发明的结合部分或抗原结合分子(如抗体及其抗原结合片段)与包含富含Pro/Ala的序列(PAS)分子的融合蛋白和/或药物缀合物之间的复合物也是本发明的一部分。本发明的此类“抗PAS”复合物特别适用于但不限于诊断、筛选方法，也可用作本文提供的研究工具。
如上所述以及如所附实施例所示，本发明人首次提供了与内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域或肽特别是富含Pro/Ala序列(PAS)分子和/或由这些富含Pro/Ala序列(PAS)分子包含或形成的表位特异性结合的结合部分、抗原结合分子、抗体/其抗原结合片段。
因此，本发明包含可获得的和/或通过本文提供的手段尤其是方法获得的结合部分、抗原结合分子、抗体/其抗原结合片段。因此，本发明还提供了一种可通过本文提供的方法获得的特异性结合部分，优选抗原结合分子，更优选抗体，和/或特异性结合内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域、或者结合所述内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域的抗原部分的特异性结合部分，优选抗原结合分子，更优选抗体，
(i)其中所述内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域是富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或由至少20个形成随机卷曲构象的氨基酸残基组成的氨基酸序列，并且由此形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基选自Pro(P)、Ala(A)和Ser(S)，或者是Pro(P)和Ala(A)，和/或
(ii)其中所述特异性结合部分、优选所述抗原结合分子结合以下结构的表位：(P/S)A(A/S)P和/或PA(A/S)P。此类表位可以选自PAPAAP(SEQ ID NO：8)、PAPASP(SEQ ID NO：9)、PASPAAP(SEQ ID NO：10)、PSAAPS(SEQ ID NO：79)、ASPAAP(SEQ ID NO：80)、PASPAA(SEQID NO：81)、PAAP(SEQ ID NO：82)、PASP(SEQ ID NO：83)、APSA(SEQ ID NO：84)和PSAA(SEQID NO：85)。
本发明的结合部分可以是抗原结合分子以及抗体(MAb)或其抗原结合片段(例如Fab)。所述抗原结合分子可以是免疫球蛋白(Ig)、抗体、其抗原结合片段、双特异性抗体、IgG抗体、骆驼/羊驼重链抗体(骆驼科抗体)、免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)或抗体模拟物。本发明还包含抗体、抗体构建体的抗原结合片段，抗体构建体是基于本发明的结合部分、抗原结合分子以及抗体或其抗原结合片段经由重组手段工程化的，并且可通过本文提供的手段和方法获得。例如，抗原结合分子的相应序列信息可用于构建此类工程化/重组结合部分/抗原结合分子。此类工程化的/重组的结合部分/抗原结合分子尤其可以基于通过本发明的方法获得的抗体的CDR序列，或者如本文所示例性提供的。
本发明还提供了抗原结合分子/抗体，其可选自单克隆抗体、嵌合抗体、重组抗体和重组或嵌合抗体的抗原结合片段。本发明的抗原结合片段可以是但不限于Fab片段、Fab′片段、(Fab′)2片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体或片段(如VHH结构域)或纳米抗体。本文使用的术语“抗体”还包含人源化抗体或展示在噬菌体、酵母细胞、细菌细胞或哺乳动物细胞表面的抗体。本发明的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG2a或IgG2b、IgG3或IgG4抗体。
本发明的PAS结合部分/抗体(抗PA(S)MAb)与缺乏结构无序PAS序列、序列延伸片段、(多)肽片段或蛋白质结构域的蛋白质基本上没有交叉反应性或交叉反应性非常低。具体而言，所述抗PA(S)MAb与人血浆蛋白和/或来自灵长类动物、哺乳动物、啮齿类动物，特别是来自猴、猕猴、狒狒、小鼠、大鼠、兔、狗、猪、牛、羊的血浆蛋白没有交叉反应性或交叉反应性非常低。此外，在另一个实施方案中，所述抗PA(S)Mab与来自通常用于重组蛋白产生、基因工程或生物技术领域的生产生物(production organism)的宿主细胞蛋白没有交叉反应性或交叉反应性非常低，例如细菌(如大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens))或酵母(如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))或哺乳动物细胞(如CHO、HEK、NS0或COS细胞)。
根据本发明的PAS结合部分/抗体(抗PA(S)MAb)对PAS序列、PAS多肽和/或PAS融合蛋白或缀合物表现出高亲和力/低解离常数(KD值)。此类KD值可以使用本领域公知的多种技术来确定，例如使用ELISA或SPR测量，如本文下面进一步公开的实施例中所示。值得注意的是，可以对完整抗体(MAb)或其抗原结合片段(例如Fab片段、Fv或scFv片段)进行此类测量，并且相应的KD值可以根据抗体蛋白的类型(完整或片段)和所用的精确测定(ELISA、SPR、荧光滴定等)而变化。通常，优选的KD值小于500μM、小于200μM、小于100μM、小于50μM、小于10μM，优选小于1μM、小于500nM、小于200nM、小于100nM、小于50nM、小于20nM、小于10nM、小于5nM、小于2nM，甚至更优选小于1nM、小于500pM、小于200pM或小于100pM。为了在生物分析或诊断测定中使用根据本发明的抗PA(S)MAb，优选特别低的KD值，如小于10nM、小于5nM或小于2nM，甚至更优选小于1nM、小于500pM、小于200pM或小于100pM。
不受理论的束缚，但也如所附实施例中所示，本发明结合部分/抗体的表观亲和力受亲合力效应的影响，并且当与含有多个表位的长PAS序列重复相互作用时，对于二价MAb来说似乎最为明显。本发明抗体的重组Fab片段与其同源PAS表位肽复合物的X射线结构分析显示，相互作用由与肽骨架的氢键网络以及由紧密形状互补产生的多重范德华相互作用所主导。如上所述，最令人惊讶的是，具有最小侧链的氨基酸(除了缺少侧链的Gly之外)Ala成为本发明结合部分/抗体的抗原识别的关键特征。所述Ala在不同的“抗PAS复合物”中的副表位中心处作出主要贡献。
本发明还提供了本发明结合部分/抗原结合分子/抗体和/或这些本发明抗体的抗原结合片段的具体但非限制性实施例。同样在本文中，术语“抗原结合分子”包含抗原结合片段，而该术语尤其优选包含本文提供的本发明抗体的抗原结合片段，其针对本文所述和/或可通过本发明方法获得的内在无序肽/蛋白质和/或内在无序肽/蛋白质结构域。
因此，本发明还提供了一种抗原结合分子，其中所述抗原结合分子选自:
a)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：35中所定义的CDR-H1[抗PA(S)MAb 1.1]，
SEQ ID NO：36中所定义的CDR-H2[抗PA(S)MAb 1.1]，和
SEQ ID NO：37中所定义的CDR-H3[抗PA(S)MAb 1.1]；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：38中所定义的CDR-L1[抗PA(S)MAb 1.1]，
SEQ ID NO：39中所定义的CDR-L2[抗PA(S)MAb 1.1]，和
SEQ ID NO：40中所定义的CDR-L3[抗PA(S)MAb 1.1]；或
是与包含(a)中任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段；
b)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：41中所定义的CDR-H1[抗PA(S)MAb 1.2]，
SEQ ID NO：42中所定义的CDR-H2[抗PA(S)MAb 1.2]，和
SEQ ID NO：43中所定义的CDR-H3[抗PA(S)MAb 1.2]；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：44中所定义的CDR-L1[抗PA(S)MAb 1.2]，
SEQ ID NO：45中所定义的CDR-L2[抗PA(S)MAb 1.2]，和
SEQ ID NO：46中所定义的CDR-L3[抗PA(S)MAb 1.2]；或是与包含(b)的任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段；c)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：47中所定义的CDR-H1[抗PA(S)MAb 2.1]，
SEQ ID NO：48中所定义的CDR-H2[抗PA(S)MAb 2.1]，和
SEQ ID NO：49中所定义的CDR-H3[抗PA(S)MAb 2.1]；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：50中所定义的CDR-L1[抗PA(S)MAb 2.1]，
SEQ ID NO：51中所定义的CDR-L2[抗PA(S)MAb 2.1]，和
SEQ ID NO：52中所定义的CDR-L3[抗PA(S)MAb 2.1]；或是与包含(c)中任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段；d)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：53中所定义的CDR-H1[抗PA(S)MAb 2.2]，
SEQ ID NO：54中所定义的CDR-H2[抗PA(S)MAb 2.2]，和
SEQ ID NO：55中所定义的CDR-H3[抗PA(S)MAb 2.2]；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：56中所定义的CDR-L1[抗PA(S)MAb 2.2]，
SEQ ID NO：57中所定义的CDR-L2[抗PA(S)MAb 2.2]，和
SEQ ID NO：58中所定义的CDR-L3[抗PA(S)MAb 2.2]；或是与包含(d)中任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段；e)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：59中所定义的CDR-H1[抗PA(S)MAb 3.1]，
SEQ ID NO：60中所定义的CDR-H2[抗PA(S)MAb 3.1]，和
包含氨基酸序列Trp-Gly-Arg或由其组成的CDR-H3；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：62中所定义的CDR1-L[抗PA(S)MAb 3.1]，
SEQ ID NO：63中所定义的CDR2-L[抗PA(S)MAb 3.1]，和
SEQ ID NO：64中所定义的CDR3-L[抗PA(S)MAb 3.1]；或是与包含(e)中任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段；和
f)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：65中所定义的CDR-H1[抗PA(S)MAb 3.2]，
SEQ ID NO：66中所定义的CDR-H2[抗PA(S)MAb 3.2]，和
SEQ ID NO：67中所定义的CDR-H3[抗PA(S)MAb 3.2]；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：68中所定义的CDR-L1[抗PA(S)MAb 3.2]，
SEQ ID NO：69中所定义的CDR-L2[抗PA(S)MAb 3.2]，和
SEQ ID NO：70中所定义的CDR-L3[抗PA(S)MAb 3.2]；或
是与包含(f)中任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段。
包含抗PA(S)Mab 3.1的序列“Trp-Gly-Arg”在本文中表示为SEQ ID NO：61。然而，应当理解，在所附的序列表中，该SEQ ID表示为“000”，因为该序列仅由3个氨基酸组成，而BiSSAP不允许包括仅含3个氨基酸残基的序列。此外，ST.25标准指出，只有长度为4或更多个氨基酸残基的序列才应包括在相应的序列表中。
在一个实施方案中，本发明涉及一种抗原结合分子，其与本发明的任何抗体或抗原结合片段或可通过本发明的手段和方法获得的抗体或抗原结合片段的相同表位结合。在本发明的一个具体实施方案中，所述抗原结合分子与上文(a)至(f)中所定义的任何抗体或抗原结合片段的相同表位结合。
如上所述，本发明还包含抗原结合分子，其是本发明抗体的抗原结合片段。这些抗原结合片段可选自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段或scFv片段。此类抗原结合片段已经在所附的实施例中进行了说明，甚至包括来自蛋白质晶体学和表位结合的数据。在所附的实验部分中也充分提供了阐明表位以及表位结合的其它手段和方法。相应的技术包含免疫学测定，如ELISA和蛋白质印迹，以及用于表位定位(epitope mapping)的SPOT测定，以及更精细的技术，如重组Fab片段和PAS表位肽之间的复合物的X射线结构分析。然而，本领域技术人员很容易推断出给定抗原结合分子(包括抗体和/或其抗原结合片段)的表位结合。
在本发明的上下文中，术语“与相同表位结合”不限于线性表位，它还可以包含结合相同的三维构象或“构象”表位。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种抗原结合分子，特别是抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合分子、抗体或其抗原结合片段
a)包含可变重(VH)链序列，所述可变重链序列包含SEQ ID NO：11[抗PA(S)MAb1.1]、SEQ ID NO：13[抗PA(S)MAb 1.2]、SEQ ID NO：15[抗PA(S)MAb 2.1]、SEQ ID NO：17[抗PA(S)MAb 2.2]、SEQ ID NO：19[抗PA(S)MAb 3.1]或SEQ ID NO：21[抗PA(S)MAb3.2]的氨基酸序列，
或与SEQ ID NO：11、13、15、17、19或21具有85％、优选87％、更优选至少90％序列同一性的序列；和
包含可变轻(VL)链序列，所述可变轻链序列包含SEQ ID NO：12[抗PA(S)MAb1.1]、SEQ ID NO：14[抗PA(S)MAb 1.2]、SEQ ID NO：16[抗PA(S)MAb 2.1]、SEQ ID NO：18[抗PA(S)MAb 2.2]、SEQ ID NO：20[抗PA(S)MAb 3.1]或SEQ ID NO：22[抗PA(S)MAb3]的氨基酸序列
或与SEQ ID NO：12、14、16、18、20或22具有85％、优选87％、更优选至少90％序列同一性的序列；或
b)是与(a)的抗体相同表位结合的抗体。
在这方面，SEQ ID NO：11、13、15、17、19或21提供了说明性抗体的重链可变区/可变重(VH)链序列，而SEQ ID NO：12、14、16、18、20或22提供了说明性抗体的轻链可变区/轻重(VL)链[A1]序列。值得注意的是，如SEQ ID NO：19所示的重链SEQ ID NO：19[抗PA(S)MAb3.1]的CDR-H3相对较短，仅包含3个氨基酸，即氨基酸Trp-Gly-Arg(SEQ ID NO：61)；其特征在于“000”序列作为“抗PA(S)MAb 3.1”的附加序列方案中的占位符。
本发明特别优选的抗原结合分子或抗体，即本文中称为抗PA(S)MAb 1.1的抗体，是以下抗原结合分子或抗体
a)包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列，可变重链包含SEQ ID NO：35中所定义的CDR-H1、SEQ ID NO：36中所定义的CDR-H2和SEQ ID NO：37中所定义的CDR-H3，可变轻链序列包含SEQ ID NO：38中所定义的CDR-L1、SEQ ID NO：39中所定义的CDR-L2和SEQ ID NO：40中所定义的CDR-L3；或
b)是与(a)的抗体相同表位结合的抗体。
本发明进一步优选的抗原结合分子或抗体，即本文中称为抗PA(S)MAb 1.2的抗体，是下列抗原结合分子或抗体
a)包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列，可变重链包含SEQ ID NO：41中所定义的CDR-H1、SEQ ID NO：42中所定义的CDR-H2和SEQ ID NO：43中所定义的CDR-H3，可变轻链序列包含SEQ ID NO：44中所定义的CDR-L1、SEQ ID NO：45中所定义的CDR-L2和SEQ ID NO：46中所定义的CDR-L3；或
b)是与(a)的抗体相同表位结合的抗体。
本发明进一步优选的抗原结合分子或抗体，即本文中称为抗PA(S)MAb 2.1的抗体，是下列抗原结合分子或抗体
a)包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列，可变重链包含SEQ ID NO：47中所定义的CDR-H1、SEQ ID NO：48中所定义的CDR-H2和SEQ ID NO：49中所定义的CDR-H3，可变轻链序列包含SEQ ID NO：50中所定义的CDR-L1、SEQ ID NO：51中所定义的CDR-L2和SEQ ID NO：52中所定义的CDR-L3；或
b)是与(a)的抗体结合相同表位的抗体。
本发明进一步优选的抗原结合分子或抗体，即本文中称为抗PA(S)MAb 3.1的抗体，是下列抗原结合分子或抗体
a)包含可变重(VH)链和可变轻(VL)链序列，可变重链包含SEQ ID NO：59中所定义的CDR-H1、SEQ ID NO：60中所定义的CDR-H2以及包含氨基酸序列Trp-Gly-Arg或由其组成的CDR-H3，可变轻链序列包含SEQ ID NO：62中所定义的CDR-L1、SEQ ID NO：63中所定义的CDR-L2和SEQ ID NO：64中所定义的CDR-L3；或
b)是与(a)的抗体相同表位结合的抗体。
本发明的结合部分/抗体为如何通过本文提供的免疫方法获得针对被称为“免疫惰性”(如PAS序列)的抗原的抗体提供了有价值的见解。此外，本发明还提供了如何获得特异性结合和/或识别“无特征肽(feature-less peptide)”的结合部分/抗体的手段和方法，“无特征肽”缺乏明显的疏水或带电荷侧链和/或没有确定的二级结构和/或包含随机卷曲构象或构型。本发明上下文中提供的并且如本文所表征的结合部分/抗体也为药物缀合物的临床前和临床开发提供了有价值的工具，如PAS蛋白修饰的生物制剂或PAS蛋白修饰的(小分子)药物——“PAS蛋白修饰的”是指与PAS分子/序列/(多)肽缀合。
示例性的PAS蛋白修饰的蛋白质或肽包括但不限于腺苷脱氨酶、阿加糖酶-α、α人心房钠尿肽、胰淀素或类似物、抗-HIV融合抑制剂(如恩夫维肽(enfurvitide))、天冬酰胺酶(如calaspargase)、B结构域缺失因子VIII(如beroctocogα或octofactor)、溶菌素(包括内溶素和外溶素)、双环肽(如TG-758)、缓激肽拮抗剂(如艾替班特(icatibant))、脑钠尿肽(BNP或B型钠尿肽)、降钙素、CD19拮抗剂、CD20拮抗剂(如利妥昔单抗)、CD3受体拮抗剂、CD40拮抗剂、CD40L拮抗剂(如达匹罗珠单抗或Antova)、脑苷脂硫酸酯酶、绒毛膜促性腺激素、凝血因子IV、凝血因子IX、凝血因子VIIa(如依他凝血素(eptacog)α)、凝血因子VIII(如susoctocogα)、凝血因子Xa、凝血因子XIII(如卡曲得考(catridecacog))、补体成分5a拮抗剂、补体因子C3抑制剂、C肽、克立他酶(Crisantaspase)、CTLA-4拮抗剂、C型利钠肽、脱氧核糖核酸酶I(如阿法链道酶(dornaseα))、EGFR受体拮抗剂、红细胞生成素(如红细胞生成素α或红细胞生成素ζ)、艾塞纳肽-4(exendin-4)、艾塞纳肽-4类似物(如艾塞纳肽9-39)、FcγIIB受体拮抗剂、成纤维细胞生长因子1(人酸性成纤维细胞生长因子)、成纤维细胞生长因子18、成纤维细胞生长因子2(人碱性成纤维细胞生长因子)、成纤维细胞生长因子21、成纤维细胞生长因子受体2拮抗剂(如FPA144)、促卵泡激素(如促卵泡素α或促卵泡素β)、胃抑制多肽(GIP)、GIP类似物、GLP-1、GLP-1类似物(如利西那肽(lixisenatide)、利拉鲁肽(liraglutide)或半鲁肽(semiglutide))、GLP-2、GLP-2类似物(如特杜鲁肽(teduglutide))、胰高血糖素或类似物、葡萄糖脑苷脂酶(如伊米苷酶(imiglucerase))、戈那瑞林(gonadorelin)、促性腺激素释放激素激动剂(如戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)、曲普瑞林(triptorelin)、亮丙瑞林(leuprolide)、普罗瑞林(protirelin)、醋酸兰瑞肽(lecirelin)、夫替瑞林(fertirelin)或地索瑞林(desiorelin))、促性腺激素释放激素拮抗剂(如阿巴瑞克(abarelix)、西曲瑞克(cetrorelix)、德加瑞克(degarelix)、加尼瑞克(ganirelix)或替维瑞克(teverelix))、gp120、gp160、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、格来灵(grehlin)、生长激素(如人、猫、牛或猪生长激素)、血红素、肝细胞生长因子、铁调素(hepcidin)拮抗剂、hsp70拮抗剂、人绒毛膜促性腺激素(如绒毛膜促性腺激素α)、人甲状旁腺激素、透明糖酶或牛透明质酸酶、透明质酸酶(如人透明质酸酶PH-20)、葡萄糖脑苷脂酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、胰岛素、胰岛素类似物、胰岛素样生长因子1、胰岛素样生长因子2、整联蛋白α4β1拮抗剂、干扰素τ、干扰素α、干扰素α拮抗剂、干扰素α超激动剂、干扰素α-n3(如Alferon N注射液)、干扰素β、干扰素γ、干扰素λ、白细胞介素、白细胞介素2融合蛋白(如DAB(389)IL-2)、白细胞介素受体拮抗剂(如白细胞介素-1受体拮抗剂、EBI-005或阿那白滞素(anakinra))、白细胞介素-11(如奥普瑞白介素(oprelevkin))、白细胞介素-12、白细胞介素-17受体拮抗剂、白细胞介素-18结合蛋白、白细胞介素-2、白细胞介素-22、白细胞介素-22受体亚单位α(IL-22ra)拮抗剂、白细胞介素-38(IL-38)、白细胞介素-4、白细胞介素-6受体拮抗剂、白细胞介素-7、犬尿氨酸酶、L-精氨酸降解酶(如精氨酸酶或精氨酸脱亚胺酶)、瘦素、L-艾杜糖醛酸酶、L-苯丙氨酸降解酶(如苯丙氨酸羟化酶或苯丙氨酸氨裂解酶)、N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸酯酶(如依洛硫酸酯酶(elosulfase)α)、纳米鱼精蛋白(Nanofitin)、嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白、Anticalin、奥曲肽(octreotide)、非洲钝缘蜱(Ornithodoros moubata)补体抑制剂(OmCI/Coversin)、甲状旁腺素(PTH)、PD1拮抗剂、PD1L拮抗剂、PDGF拮抗剂、(PYY 3-36)、苯丙氨酸解氨酶(如缬氨酸酶)、Phylomer、血小板衍生生长因子、松弛素、RGD肽、丝氨酸蛋白酶抑制剂(如conestatα)、可溶性CD64、可溶性DCC(在结肠直肠癌中缺失)受体、可溶性Fc受体(如CD16、CD32、CD64)、可溶性肿瘤坏死因子I受体(sTNF-RI)、可溶性肿瘤坏死因子II受体(sTNF-RII)、可溶性VEGF受体、生长抑素、生长抑素类似物(如帕瑞肽(pasireotide)或CAP-232)、压力素、T细胞受体配体、特立帕肽(teriparatide)
(PTH 1-34)、胸腺素α1、胸腺素β4、胸腺素β15、肿瘤坏死因子(TNFα)、肿瘤坏死因子α拮抗剂、尿酸酶(如拉布立酶(rasburicase)或pegadricase)、尿皮质素、血管活性肠肽、血管加压素、血管加压素类似物(如去氨加压素(desmopressin)、苯赖加压素(felypressin)或特利加压素(terlypressin))、VEGF拮抗剂(如兰尼单抗(ranbizumab)或贝伐单抗(bevacizumab))、VEGF拮抗剂、附着素(Adnectin)、PDGF拮抗剂、DARPin、血管性血友病因子(von Willebrand factor)(如vonicogα)。
示例性的PAS蛋白修饰的小分子药物包括但不限于鹅膏菌素、奥瑞他汀(auristatin)、刺孢霉素(calicheamicin)、喜树碱、地高辛(digoxigenin)、荧光素、阿霉素、烟曲霉素、地塞米松、格尔德霉素、紫杉醇、多西他赛、依立替康、环孢菌素、丁丙诺啡、纳曲酮、纳洛酮、长春地辛、万古霉素、利培酮、阿立哌唑、帕洛诺司琼、格拉司琼、阿糖胞苷、核酸(如反义核酸)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miR)抑制剂、微小RNA模拟物、DNA适体、RNA适体、LNA(锁核酸)、RNA疫苗、DNA疫苗、适用于制备疫苗的碳水化合物，例如肿瘤相关的碳水化合物抗原(TACA、α-GalNAc-O-Ser/Thr)、唾液酸化Tn抗原(例如NeuAcα(2,6)-GalNAcα-O-Ser/Thr)、汤姆森-弗里登里奇(Thomsen-Friedenreich)抗原(Galβ1-3GalNAcα1)、路易斯(Lewis)Y(例如，Fucα(l,2)-Galβ(l,4)-[Fucα(l,3)]-GalNAc)、唾液酸化路易斯X或唾液酸化路易斯A。
在特定情况下，例如用于研究目的、作为诊断工具、用于筛查方法，包括患者分层等。本发明的抗原结合分子，特别是抗体或其抗原结合片段，包含标签和/或标记可能是有用的。因此，本发明还涉及可通过本发明的手段和方法获得的和/或如本文所提供的抗原结合分子/抗体/其抗原结合片段，其中所述抗原结合分子/抗体/其抗原结合片段与报告分子、标签和/或标记缀合或融合。此类报告分子、标签和/或标记在本领域中是众所周知的，并且尤其可以包含小分子荧光染料，例如以化学活化方式施用(包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、异硫氰酸酯、碘乙酸酯或马来酰亚胺)，如呫吨衍生物(例如荧光素、罗丹明)、Alexa染料(如Alexa488)、花青衍生物(如Cy3或Cy5)、有机硼化合物(如4,4-二氟-4-硼-3a,4a-二氮杂-s-茚烯(BODIPY))、小分子(半抗原)(如生物素或地高辛)、荧光蛋白(如绿色荧光蛋白或其衍生物、红色荧光蛋白或其衍生物或别藻蓝蛋白)、酶(如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、或催化可见光发射(生物发光)的酶，如荧光素酶)。
本发明还提供了一种多核苷酸，其编码抗原结合分子(特别是本发明的抗体或抗原结合片段)的可变重(VH)链序列和/或可变轻(VL)链序列中的至少一种。在本发明的优选实施方案中，所述多核苷酸编码抗原结合分子(特别是抗体或抗原结合片段)的可变重(VH)链序列和/或可变轻(VL)链序列中的至少一种，该抗原结合分子(特别是抗体或抗原结合片段)能够特异性结合富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或特异性结合由至少4个或至少10个或至少20个形成随机卷曲构象的氨基酸残基组成的氨基酸序列，并且其中形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基选自Pro(P)、Ala(A)和Ser(S)，或者是Pro(P)和Ala(A)，或者能够特异性结合其抗原部分。本发明的多核苷酸可以编码抗原结合分子(或其片段)，该抗原结合分子(或其片段)能够结合以下结构的表位：
(P/S)A(A/S)P和/或
PA(A/S)P。
本发明的多核苷酸优选编码本文提供的抗原结合分子(特别是抗体或抗原结合片段)的至少一个可变重(VH)链序列和/或至少一个可变轻(VL)链序列。优选地，所述抗原结合分子，特别是抗体或抗原结合片段，结合内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域或肽上的表位。优选地，所述内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域或肽包含富含Pro/Ala的序列(PAS)或由其组成。所述表位可以包含本文公开的表位/表位延伸片段，并且可以选自PAPAAP(SEQ ID NO：8)、PAPASP(SEQ ID NO：9)、PASPAAP(SEQ ID NO：10)、PSAAPS(SEQID NO：79)、ASPAAP(SEQ ID NO：80)、PASPAA(SEQ ID NO：81)、PAAP(SEQ ID NO：82)、PASP(SEQ ID NO：83)、APSA(SEQ ID NO：84)和PSAA(SEQ ID NO：85)。
可以通过技术人员已知的常规测序方法容易地获得相应的多核苷酸/核酸分子，包括DNA或RNA，并且也在所附的实施例中说明。作为此类测序技术的来源，可以使用根据本发明方法免疫的非人类动物的B细胞。此类细胞包含“杂交瘤细胞”，其无需进一步处理即可产生，例如单克隆抗体生成手册中所述，如(Harlow和Lane，1988)。此类本发明多核苷酸/核酸分子(包括DNA或RNA)的实施例是如包含在保藏的克隆DSM ACC3365、DSM ACC3366或DSMACC3367中的多核苷酸/核酸分子(包括DNA)。这些保藏的克隆是杂交瘤，其包含能够分别编码本发明的示例性单克隆抗体(抗PA(S)Mab)抗PA(S)Mab 1.1、抗PA(S)Mab 2.1和抗PA(S)Mab 3.1的多核苷酸。
从所附的保藏证明可以明显看出，这三种杂交瘤已根据布达佩斯条约的规定于2020年11月13日(2020-11-13)保藏在“DSMZ”(莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心)，并已从所述国际保藏机构收到保藏号：DSM ACC 3365(抗-PA(S)Mab 1.1)；DSM ACC3366(抗PA(S)Mab 2.1)和DSM ACC3367(抗PA(S)Mab 3.1)。
本发明还涉及这些保藏物，因此涉及杂交瘤DSM ACC3365、DSM ACC3366和DSMACC3367。
本发明还涉及一种宿主细胞，其包含本发明的多核苷酸，即编码抗原结合分子(特别是本发明的抗体或抗原结合片段)的可变重(VH)链序列和/或可变轻(VL)链序列中至少一种的多核苷酸。本发明的(宿主)细胞也可以是表达本文提供的杂交瘤中包含的多核苷酸的细胞，如DSM ACC3365、DSM ACC3366或DSM ACC3367。所述杂交瘤也可以是本发明的宿主细胞。
本文还提供了一种产生抗原结合分子、特别是本发明的抗体或抗原结合片段的方法，包括培养本发明的杂交瘤和/或包含培养本发明的宿主细胞，例如本发明的细菌细胞或哺乳动物细胞。所述产生所述本发明抗原结合分子可包括本发明宿主细胞和/或杂交瘤的常规培养。可以通过本文提供的用于产生结合部分、特别是抗原结合分子(其针对和/或特异性结合本文定义的内在无序蛋白质和/或内在无序蛋白质结构域或肽)的手段和方法，获得产生本发明的抗原结合分子、特别是抗体或抗原结合片段的进一步杂交瘤，而不必再费周折。产生本发明抗原结合分子的方法还可以包括从培养系统中、例如从宿主细胞/杂交瘤的培养液中分离或纯化所述抗原结合分子。
在一个实施方案中，本发明还提供了一种产生特异性结合本文定义的富含Pro/Ala的序列(PAS)抗体或其抗原部分的方法，所述方法包括向非人类哺乳动物施用富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或
由至少20个、优选40个形成随机卷曲构象的氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基选自Pro(P)、Ala(A)和Ser(S)，或者是Pro(P)和Ala(A)，或者是其抗原性部分，
(i)其中所述富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或其中由至少20个、优选40个形成随机卷曲构象的氨基酸残基组成的所述氨基酸序列包含以下结构的至少一个表位/表位延伸片段：
(P/S)A(A/S)P和/或
PA(A/S)P，
(ii)其中所述富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或其中由至少20个、优选40个形成随机卷曲构象的氨基酸残基组成的所述氨基酸序列包含与N末端连接的保护基团；以及
(iii)其中免疫佐剂与所述富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或由至少20个、优选40个形成随机卷曲构象的氨基酸残基组成的所述氨基酸序列在C端连接。
在一个实施方案中，在如上所述的用于产生特异性结合富含Pro/Ala的序列(PAS)的抗体的所述方法中，(i)的所述表位包含选自PAPAAP(SEQ ID NO：8)、PAPASP(SEQ ID NO：9)、PASPAAP(SEQ ID NO：10)、PSAAPS(SEQ ID NO：79)、ASPAAP(SEQ ID NO：80)、PASPAA(SEQID NO：81)、PAAP(SEQ ID NO：82)、PASP(SEQ ID NO：83)、APSA(SEQ ID NO：84)和PSAA(SEQID NO：85)的表位/表位延伸片段。在进一步的实施方案中，上文定义为RN-(P/A)-RC的肽中包含表位/表位延伸片段。
本发明还涉及一种组合物，其包含结合部分，特别是抗原结合分子，其通过本发明的手段和方法产生，能够特异性结合内在无序蛋白质结构域或肽。所要求保护的组合物还可包含结合部分，特别是可通过所述创造性方法获得的抗原结合分子，以及通过上文提供的方法产生的结合部分，特别是抗原结合分子。
本发明中还包含组合物，该组合物包含本文定义的特异性抗原，该特异性抗原是免疫佐剂与一种或多种如上定义的P/A肽的缀合物，其中每种所述P/A肽可以独立地是结构RN-(P/A)-RC的肽。
本发明的结合部分(特别是抗原结合分子/抗体或其抗原结合片段)作为研究工具和生物分析工具特别有用。它们也可以用于体外筛选患者样品，如从已经用PAS蛋白修饰的药物和/或蛋白质治疗的个体获得的血液样品。另一方面，也可以用本发明的结合部分(特别是抗原结合分子/抗体或其抗原结合片段)体外测试从未接受过PAS蛋白修饰的药物和/或蛋白质的个体获得的样品。这可以被认为是“阴性对照”，并且可能有助于评估或避免本发明抗体的假阳性反应。因此，本发明的组合物(特别是包含抗原结合分子/抗体或其抗原结合片段的组合物)可用于(患者)筛选和/或用于跟踪所述患者/个体用PAS蛋白修饰的(小分子)药物和/或蛋白质/肽药物(伴随)治疗的时间进程。因此，本发明还涉及诊断组合物。
根据以上所述，本发明还提供了一种检测方法，所述方法用于在生物样本中检测
(i)富含Pro/Ala的序列(PAS)，
(ii)蛋白质、肽或小分子药物与富含Pro/Ala的序列(PAS)的缀合物，和/或
(iii)蛋白质、肽或小分子药物与氨基酸序列的缀合物，所述氨基酸序列由形成随机卷曲构象的至少20个氨基酸残基组成，其中形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基选自Pro(P)、Ala(A)和Ser(S)，或者是Pro(P)和Ala(A)。
因此，要求保护的方法可以是使用生物样品的体外方法，所述生物样品获自用PAS蛋白修饰的药物和/或蛋白质/肽处理或假定处理的个体，特别是哺乳动物，优选人类。
所述体外方法可以包括在允许抗原结合分子和/或抗体与(i)或(ii)的所述富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或(iii)的形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基结合的条件下，将所述生物样品与本发明的抗原结合分子和/或抗体接触。所述方法还可以包含作为附加步骤的检测是否在所述抗原结合分子和/或所述抗体与所述富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基之间形成复合物。在所述生物样品中富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基的(阳性)检测可以指示例如包含富含Pro/Ala的序列(PAS)的药物/蛋白质(即“PAS蛋白修饰的(小分子)药物和/或蛋白质或肽药物”)是否仍然存在于个体体内。这将是定性测定。然而，也设想了这些生物样品中包含富含Pro/Ala的序列(PAS)的药物/蛋白质的时间进程和/或定量。此类测定还包含对个体生物样品的“筛选测定”。
本发明的结合部分(特别是抗原结合分子/抗体或其抗原结合片段)和所述富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或包含此类富含Pro/Ala的序列(PAS)的蛋白质/肽药物/小药物的所述缀合物之间形成的复合物的体外检测是技术人员的常规工作。所形成的复合物的此类检测可以包含已知技术，如免疫组织化学、免疫荧光成像、酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、电化学发光(ECL)免疫测定(ECLIA)、表面等离子共振(SPR、Biacore)、侧流免疫测定、基于纸的免疫测定、基于声波的免疫测定、基于干涉测量法的免疫测定、基于纳米材料和微材料的免疫测定、基于微悬臂的传感器、基于石英晶体微量天平的传感器、电化学免疫传感器、芯片实验室(LOC)免疫测定、基于智能手机的免疫测定、基于质谱的免疫测定(MSIA、Immuno-MALDI、Immuno-MRM、SISCAPA)或免疫沉淀。还设想了射线照相方法和成像，例如在用本领域公知的放射性物质对本发明的结合部分进行相应标记之后。
还设想将结合部分(特别是抗原结合分子/抗体或其抗原结合片段)用于个体的体内，例如在研究环境中，由此用这些发明的化合物和组合物来测试和筛选非人类动物。
根据上述内容，本发明还涉及一种用于监测受试者或动物对用PAS蛋白修饰的药物缀合物治疗的应答的方法，所述方法包括使用抗原结合分子和/或本发明的抗体或组合物，用于和/或测量血液样品(优选血浆或血清样品)中循环的富含Pro/Ala序列(PAS)分子和/或包含富含Pro/Ala序列(PAS)分子的融合蛋白和/或药物缀合物的水平，在治疗受试者/患者或非人类测试个体之前的一个或多个时间点和之后的一个或多个时间点，用
(a)蛋白质或肽或小分子药物与富含Pro/Ala序列(PAS)的缀合物，和/或
(b)蛋白质药物或肽或小分子与氨基酸序列的缀合物，所述氨基酸序列由形成随机卷曲构象的至少20个氨基酸残基组成，其中形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基选自Pro(P)、Ala(A)和Ser(S)，或者是Pro(P)和Ala(A)。
该方法还可以包括检测时间进程和/或时间-剂量关系，特别是在用上文(a)或(b)中定义的任何缀合物对所述受试者/患者或所述非人类受试个体进行所述治疗后，在不同时间点筛选样品时。
此外，检测在本发明的结合部分(特别是抗原结合分子/抗体或其抗原结合片段)与所述富含Pro/Ala的序列(PAS)和/或包含此类富含Pro/Ala的序列(PAS)的蛋白质药物/小药物的所述缀合物之间形成的复合物是常规工作，并且上文提供的实施方案，加之必要的修改，也适用于这种“监测方法”。
通过以下非限制性的附图和实施例进一步描述本发明。
附图说明
图1：本发明抗PAS抗体的VH(A)和VL(B)结构域的氨基酸序列比对(在引入用于亚克隆的侧翼限制性位点之前)。CDR用黑色轮廓标记。相对于在每个比对顶部显示的抗PA(S)MAb 1.1的VH和VL序列，相同的氨基酸位置表示为“.”氨基酸序列比对中的空位表示为“-”。
图2：示例性蛋白质印迹分析表明本发明的不同抗PAS抗体特异性结合相应的PAS蛋白修饰的融合蛋白。与来自杂交瘤克隆的细胞培养上清液一起温育的蛋白质印迹：(A)抗PA(S)MAb 2.2，(B)抗PA(S)MAb 2.1，(C)纯化的抗PA(S)MAb 2.1，(D)抗PA(S)MAb 3.1，(E)抗PA(S)MAb 3.2，(F)抗PA(S)MAb 1.1，(G)抗PA(S)MAb 1.2和(H)抗小鼠IgG Fc特异性碱性磷酸酶(山羊中生产，Sigma-Aldrich)第二抗体作为对照。下列样品应用于SDS-PAGE进行蛋白质印迹：M-PageRuler预染色蛋白质阶梯(Ladder)，10-180kDa(Thermo FisherScientific)；1-PAS#1(200)-IL1Ra(SEQ ID NO：72)；2-P/A#1(200)-IL1Ra(SEQ ID NO：73)；3-APSA(200)-IL1Ra(SEQ ID NO：74)；4-合并的人血清(SEQENS IVD/H2B)，在ddH2O中以1:200稀释，并掺入1μg IL1Ra(Kineret/Anakinra，SOBI)；5-大肠杆菌BL21全细胞蛋白，在SDS样品缓冲液中裂解。
图3：用本发明的抗PAS抗体检测PAS序列或PAS蛋白修饰的融合蛋白的ELISA实验的示例性结果：(A)用抗PA(S)MAb 2.1的Fab片段和IL1Ra-PAS#1(800)、PAS#1(600)-瘦素和P/A#1(600)-GMCSF作为测试物质以及BSA作为对照的ELISA。(B)用抗PA(S)MAb2.2的Fab片段和P/A#1(600)作为测试物质的ELISA。(C)用抗PA(S)MAb 1.2的Fab片段和IL1Ra-PAS#1(800)、PAS#1(600)-瘦素和P/A#1(600)-GMCSF测试物质以及BSA作为对照的ELISA。(D)用抗PA(S)MAb 1.2的杂交瘤上清液的ELISA，使用预先吸附到微量滴定板的来自山羊的特异性抗小鼠IgG Fc捕获，hu4D5-PAS#1(200)作为测试物质。
图4：用本发明的抗PAS抗体检测PAS序列或PAS蛋白修饰的融合蛋白的ELISA实验的示例性结果：(A)用抗-PA(S)MAb 3.1的Fab片段和APSA(200)-IL1Ra作为测试物质的ELISA。(B)用抗PA(S)MAb 3.2的Fab片段和APSA(200)-IL1Ra作为测试物质的ELISA。(C)用抗PA(S)MAb 1.1的Fab片段和PAS#1(600)-瘦素作为测试物质的ELISA。(D)用抗PA(S)MAb2.1的杂交瘤上清液和hu4D5-P/A#1(200)作为测试物质的MAb捕获ELISA(见图3D)。
图5：抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb 1.2的杂交瘤培养物上清液的SPOT测定结果。合成了来自PAS#1和P/A#1序列的连续12聚体肽，每个肽分别在SEQ ID NO：5和6中移位一个残基，其C末端锚定在亲水膜上。膜显色后，用软件CLIQS版本1.2.044(TotalLab)扫描和定量斑点强度，并显示为条形图。表位序列以粗体突出显示。
图6：抗PA(S)MAb 2.1的Fab片段和抗PA(S)MAb 2.2的杂交瘤培养上清液的SPOT测定结果。有关解释，请见图5。
图7：抗PA(S)MAb 3.1和抗PA(S)MAb 3.2的杂交瘤培养上清液的SPOT测定结果。合成了包含序列AAPSAAPSAA的10聚体肽，其C末端锚定在亲水膜上，由此位置3至8被所有20种蛋白氨基酸连续取代。膜显色后，用软件CLIQS版本1.2.044(TotalLab)扫描和定量斑点强度，并显示为条形图。对应于原始序列AAPSAAPSAA中残基的条被填充。
图8：抗PA(S)MAb 3.1(APSA(200)-IL1Ra作为分析物)以及抗PA(S)MAb 1.1(PAS#1(200)-IL1Ra作为分析物)和抗PA(S)MAb 1.2(PAS#1(200)-IL1Ra作为分析物在Biacore X100仪器上测量)的示例性SPR传感图。将杂交瘤上清液施加到涂有抗小鼠抗体的CM3传感器芯片(GE Healthcare)(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)。注射阶段标有黑条，以及相应的注射分析物浓度。
图9：使用具有固定的抗PAS Fab 1.2的柱亲和纯化PAS蛋白修饰的蛋白质的原理。(A)一步纯化PAS蛋白修饰的蛋白质的示意图：(i)应用含有目的PAS蛋白修饰的蛋白质的细胞提取物，(ii)用运行缓冲液洗涤柱，以及(iii)通过应用1M L-脯氨酰胺溶在运行缓冲液中的溶液洗脱目的PAS蛋白修饰的蛋白质。(B)Fab 1.2与其PAS#1表位肽(显示为顶部的棒状模型)复合物的晶体结构(PDB ID：7O31)(示意图)。(C)被Fab 1.2识别的PAS#1肽表位的相关部分。(D)L-脯氨酸酰胺的化学结构。
图10：使用本发明的固定化抗PAS抗体亲和纯化PAS蛋白修饰的蛋白质的示例性色谱图。将抗PA(S)MAb 1.2的Fab片段共价固定到1ml HiTrap HP柱(GE Healthcare)作为亲和基质。将StrepII-eGFP-PAS#1(200)融合蛋白(SEQ ID NO：71)用作测试蛋白，用于从(A，C)预先纯化的蛋白溶液和(B，D)表达StrepII-eGFP-PAS#1(200)的BL21大肠杆菌细胞的全细胞提取物中纯化。通过平行测量280nm处的总吸光度以及488nm处的eGFP发色团的比吸光度，来监测从色谱柱洗脱的蛋白质(A，B)。在应用蛋白质样品并用缓冲液洗涤后，结合的PAS融合蛋白用L-脯氨酰胺的1M溶液洗脱，后者在280nm处也显示出强吸收(可能是由于芳香族氨基酸的污染)。SDS-PAGE分析(C，D)显示在这些洗脱级分中存在StrepII-eGFP-PAS#1(200)。样品：M-Pierce未染色蛋白质MW标志物(Thermo Fisher Scientific)；0-纯的StrepII-eGFP-PAS#1(200)；1-级分7-7.5ml；2-级分7.5-8ml；3-级分8-8.5ml；4-级分8.5-9ml；5-级分9-9.5ml；6-级分9.5-10ml；7-级分10-10.5ml。1*-表达StrepII-eGFP-PAS#1(200)的BL21大肠杆菌细胞的全细胞裂解物；2*-级分2-4ml；3*-级分7-7.5ml；4*-级分7.5-8ml；5*-级分8-8.5ml；6*-级分8.5-9ml；7*-级分9-9.5ml；8*-级分9.5-10ml；9*-级分10-10.5ml。这一实验证明，抗PAS亲和柱特异性结合PAS蛋白修饰的测试蛋白质StrepII-eGFP-PAS#1(200)，其可在温和条件下通过应用L-脯氨酰胺溶液洗脱。
图11：示例性色谱图和SDS PAGE分析记录了使用本发明的固定化抗PAS抗体对治疗相关的PAS蛋白修饰的蛋白质进行的一步PAS亲和纯化。将抗PA(S)Mab 1.2的Fab片段共价固定到1ml HiTrap HP柱(GE Healthcare)作为亲和基质。分别从大肠杆菌BL21的周质或细胞组分中纯化C末端PAS蛋白修饰的Anticalin H1GA-PAS#1(200)-His6(SEQ ID NO：90)(A，B)和N末端PAS蛋白修饰的细胞因子PAS#1(800)-IL1Ra(SEQ ID NO：91)(C，D)。通过测量280nm处的吸光度，来监测从色谱柱中洗脱的蛋白质。在应用蛋白质样品并用缓冲液洗涤后，用运行缓冲液中的1M L-脯氨酰胺溶液洗脱结合的PAS融合蛋白。SDS-PAGE分析(B，D)揭示了在洗脱级分中存在PAS蛋白修饰的蛋白质。样品：未染色的蛋白质MW标志物(ThermoFisher Scientific)-PE/CE(表达各自相应蛋白质的大肠杆菌BL21细胞的周质提取物/全细胞提取物)-FT(流穿液)-洗涤-洗脱。箭头表示分别对应于H1GA-PAS#1(200)-His6和PAS#1(800)-IL1Ra的蛋白质条带。该实验证明，携带包含200-800个残基的PAS标签的N末端和C末端PAS蛋白修饰的蛋白质可以被高选择性地纯化。
图12：使用本发明的固定化抗PAS抗体对PAS蛋白修饰的蛋白质进行亲和纯化的示例性色谱图。将抗PA(S)MAb 1.2的Fab片段共价固定到1ml HiTrap HP柱(GE Healthcare)作为亲和基质。将预纯化的StrepII-eGFP-PAS#1(200)融合蛋白(SEQ ID NO：71)用作测试蛋白质。通过测量eGFP发色团在488nm处的特定吸光度来监测从色谱柱中洗脱的蛋白质。在应用蛋白质样品并用缓冲液洗涤后，在特别温和的条件下(1M L-脯氨酰胺，100mM Tris，150mM NaCl，1mM EDTA，用HCl将pH调节至8.0)洗脱结合的PAS融合蛋白。该实验证明，抗PAS亲和柱定量结合了PAS蛋白修饰的测试蛋白质StrepII-eGFP-PAS#1(200)，可以在温和的缓冲液条件下通过应用L-脯氨酰胺将其洗脱。
图13：与本发明的抗PAS抗体的重组Fab片段复合的合成PAS表位肽的晶体结构：(A)与抗PA(S)MAb 2.2结合的P/A#1-表位肽，(B)与抗PA(S)MAb 1.1结合的PAS#1-表位肽，(C)抗PA(S)MAb 1.2和(D)与抗PA(S)MAb 3.1结合的Pga-(APSA)3肽。表位肽显示为棒状(深灰色)，Fab重链(中灰色)和轻链(浅灰色)显示为线状。
图14：在Wistar大鼠中的PAS蛋白修饰的胸腺素α1的药物代谢动力学(PK)研究。(A)用于通过ELISA设置A定量大鼠血浆样品中的PAS蛋白修饰的胸腺素α1的标准曲线的线性范围，所述ELISA设置A如图15所示。(B)以3.4mg/kg体重的剂量向雌性Wistar大鼠(N＝5)皮下注射PAS蛋白修饰的胸腺素α1。使用抗PA(S)MAb 2.1作为捕获抗体，碱性磷酸酶缀合的抗PA(S)MAb 1.2作为检测试剂，通过夹心ELISA定量血浆中融合蛋白的浓度。数据对注射后的取样时间作图，并用一室(one-compartment)模型拟合。PK曲线显示了PAS蛋白修饰的肽药物的不同吸收和消除阶段(PK参数见表1)。
图15：用于检测PAS蛋白修饰的分子的示例性ELISA设置。(A)夹心ELISA，使用吸附在微量滴定板上的抗PAS抗体以捕获PAS蛋白修饰的分子和作为检测试剂的使用与报告酶缀合的第二种抗PAS抗体。(B)夹心ELISA，使用吸附在微量滴定板上的抗PAS抗体，以捕获PAS蛋白修饰的分子，和针对PAS蛋白修饰的药物的生物活性部分的第二种酶偶联抗体。(C)ELISA，使用吸附在微量滴定板上的蛋白质、肽或小分子药物(例如受体，此处称为靶标)的结合配偶体，以捕获PAS蛋白修饰的分子和本发明的酶偶联抗PAS抗体，从而检测PAS蛋白修饰的药物。(D)竞争性ELISA的示意图，显示了一种PAS蛋白修饰的分析物分子与一种PAS蛋白修饰的和生物素化的分子竞争吸附在微量滴定板上的抗PA(S)MAb的结合位点。随后通过链霉亲和素-酶缀合物检测与MAb结合的PAS蛋白修饰的和生物素化的分子。
图16：抗PA(S)Mab 2.2的Fab片段的荧光滴定，在100mM Tris/HCl pH 7.5中以1M施加，以及合成表位肽Abz-APAPAAPA。RFU-相对荧光单位(在280nm处荧光激发，在340nm处信号检测)。
图17：在Biacore X100仪器(Cytiva，德国弗莱堡)上使用抗PA(S)Mab 1.1的表面等离子体共振(SPR)光谱。捕获PAS蛋白修饰的的抗半乳糖凝集素Fab片段，并确定PAS-Fab与其抗原半乳糖凝集素-3的结合动力学。(A)显示PAS蛋白修饰的抗体片段在CM5表面等离子体共振(SPR)传感器芯片(Cytiva)上的固定化的传感图。(1)使用EDC/NHS化学将芯片的葡聚糖水凝胶表面上的羧酸酯基团转化为反应性N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)基团。(2)抗PA(S)Mab 1.1经由活化的NHS酯共价缀合到芯片表面，和(3)使用0.1M乙醇胺饱和未反应的NHS酯。(B)单循环动力学实验，显示了(1)PAS蛋白修饰的抗半乳糖凝集素Fab的非共价固定，接着是(2)半乳糖凝集素-3以1:2系列稀释(0.1nM至1.6nM)的五次连续注射以及两次酸性再生步骤。(C)将来自(B)的单循环动力学实验的参考校正传感图的基线设置为零以及开始时间＝0秒，并使用Biacore X100评估软件拟合到全局1:1Langmuir结合模型。
实施例
实施例1：本发明中采用的方法
A.制备用于免疫的PAS肽缀合物
通过固相合成获得三种不同的肽(Pga-PAS#1(40)-Ahx和Pga-P/A#1(40)-Ahx：Peptide Specialty Laboratories-PSL，德国海德堡；Pga-APSA(40)-Ahx：AlmacSciences，苏格兰爱丁堡)，各自具有封闭的N末端:
Pga-PAS#1(40)-Ahx(Pga-ASPAAPAPASPAAPAPSAPA-ASPAAPAPASPAAPAPSAPA-Ahx；SEQ ID NO：5)；
Pga-P/A#1(40)-Ahx(Pga-AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA-AAPAAPAPAAPAAPAPAAPA-Ahx；SEQ ID NO：6)；
Pga-APSA(40)-Ahx(Pga-APSAAPSAAPSAAPSAAPSA-APSAAPSAAPSAAPSAAPSA-Ahx；SEQ ID NO：7)。
Pga意为焦谷氨酰残基(也称为2-吡咯烷酮-5-羧酸或5-氧代脯氨酸)，Ahx指氨基己酸。所有其它残基是标准的蛋白原L-氨基酸，用它们的单字母缩写表示。40聚体PAS肽被设计成具有足够的长度，以便涵盖相应PAS序列重复的至少两个拷贝，在一些实施方案中包含20个残基，因此也包含两个相邻序列重复之间的至少一个连接点。值得注意的是，此类连接也将在更长的重组PAS多肽中构成潜在的表位。由于所有肽仅包含化学惰性侧链，并具有封闭的N末端，因此它们的单个C末端羧酸基团(实际上是Ahx接头残基之一)被选择性地激活，并用于与KLH的Lys侧链的ε氨基进行定向化学缀合，KLH被用作高免疫原性载体蛋白(Swaminathan等，2014)。为此，将50mg每种肽溶解在1450μl二甲基亚砜(DMSO)中，并用10倍摩尔量的每种2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基铵四氟硼酸盐(TBTU；IrisBiotech，德国马克特雷德维茨)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA Sigma Aldrich，德国陶夫基兴)。将10mg KLH(Thermo Scientific，马萨诸塞州沃特海姆)溶于水中，针对PBS(4mMKH2PO4，16mM Na2HPO4，115mM NaCl)进行透析，调节至浓度为2.3mg/ml，体积为4.35ml，并与活化的肽溶液混合。在冰上温育30分钟后，将溶液针对25mM硼酸钠(pH 9.0)进行透析，并通过用相同缓冲液平衡的Source 15Q柱(GE Healthcare，德国慕尼黑)上的阴离子交换色谱纯化缀合物。在280nm监测的运行缓冲液中，用0-500mM NaCl的线性浓度梯度洗脱缀合物。汇集主峰的洗脱级分，针对PBS进行透析，浓缩至2mg/ml，通过0.22m Millex-GV PVDF过滤器(Merck，德国达姆施塔特)无菌过滤，并在液氮中快速冷冻。
B.小鼠免疫和杂交瘤细胞的产生
使用上述PAS肽-KLH缀合物作为抗原，免疫Balb/c小鼠，并根据标准程序(ProMabBiotechnologies，加利福尼亚州里士满)制备杂交瘤。对于每种抗原，用50μg抗原和弗氏完全佐剂(CFA)对5只Balb/c小鼠进行皮下免疫。引发后三周，每隔两周进行三次加强注射(对于APSA(40)-KLH，为五次)，每次施用25μg抗原和弗氏不完全佐剂(IFA)。在最后一次加强免疫后两周，腹膜内注射50μg无佐剂抗原的最终加强免疫。从动物收获脾细胞，并与Sp2/0骨髓瘤细胞融合，使用本领域熟知的标准方法产生杂交瘤克隆。
使用含有10％v/v FCS(超低IgG One Shot，Life Technologies，纽约)、6mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(Biochrom)、1:100青霉素/链霉素(Biochrom)并补充有10％v/vHybridoma Premium Medium(ProMab Biotechnologies)的DMEM(Biochrom，德国柏林)在细胞培养物中繁殖有希望的杂交瘤克隆。细胞培养上清液中分泌的抗PAS MAb通过实时表面等离子体共振(SPR)光谱和酶联免疫吸附测定(ELISA)进行表征。
对于一些研究，使用1ml HiTrap Protein G HP柱(GE Healthcare)从杂交瘤上清液中纯化抗PA(S)MAb，使用Explorer 10色谱工作站(GE Healthcare)以1ml/min的流速操作。杂交瘤上清液用结合缓冲液(20mM NaPi，pH 7.0)以1:1的比例稀释，并施加到已经用10倍柱体积的结合缓冲液预平衡的柱上。用10倍柱体积的结合缓冲液洗涤后，用2倍柱体积的洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸/HCl pH 2.7)洗脱抗体。为了保留对酸不稳定的IgG的活性，在分级之前，按每1ml收集体积将200μl的1M Tris/HCl pH 9.0加入到每个收集管中。随后针对200体积的储存缓冲液(20mM KPi，125mM NaCl，50％甘油，pH 7.2)透析含有亲和纯化的MAb的级分，并在-21℃冷冻。通过测量280nm处的吸光度来确定蛋白质浓度(A280＝1.4，等于1.0mg/ml IgG的浓度)。
C.通过ELISA和SPR表征杂交瘤MAb
使用NUNC Maxisorp F 96孔板(Thermo Fisher Scientific，德国慕尼黑)通过ELISA对杂交瘤单克隆抗体进行表征，孔板用50μl的5μg/ml抗小鼠IgG Fc特异性山羊抗体(Sigma Aldrich)PBS溶液包被1小时，随后用PBS洗涤两次，并用PBS/T(PBS+0.1％v/v吐温20)中的3％w/v牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时。用PBS/T洗涤后，每孔用50μl的以1:100稀释于PBS/T中的每种杂交瘤上清液温育1小时，并再次洗涤。然后，将50μl以下PAS蛋白修饰的蛋白质(每种8nM)的溶液以1:2系列稀释用PBS施加并温育1小时：hu4D5-PAS#1(200)(Schlapschy等，2013)、hu4D5-P/A#1(200)(WO 2011/144756 A1)或APSA(200)-IL1Ra(SEQID NO：74)，其已经根据制造商的说明标记有DIG-NHS(Santa Cruz Biotechnology，得克萨斯州达拉斯)。用PBS/T洗涤后，将50μl的1:1000稀释的抗人κ轻链抗体碱性磷酸酶缀合物(Sigma Aldrich公司)或抗DIG-Fab碱性磷酸酶缀合物(Roche Diagnostics)加到每个孔中，温育1小时。用PBS最后洗涤后，加入50μl的0.5mg/ml对硝基苯磷酸盐的AP缓冲液(100mMTris/HCl pH 8.8，100mM NaCl，5mM MgCl2)，使用Synergy 2光度计(BioTek Instruments，德国巴特腓特烈斯哈尔)在405nm以1分钟的间隔记录信号出现15分钟。浓度依赖性信号(ΔA/Δt)按照公开的程序(Voss和Skerra，1997年)使用以下公式进行评估：
[MAb·Ag]＝[MAb]t·[Ag]t/(KD+[Ag]t)
[MAb·Ag]是抗体/抗原复合物的可检测量，其与每个孔测量的ΔA/Δt信号成比例；
[MAb]t是固定化抗体的总量，对应于结合曲线的渐近最大信号；[Ag]t是施加到每个孔的PAS抗原的(可变)总浓度，KD是由用KaleidaGraph(Synergy Software，宾夕法尼亚州雷丁)评估的曲线拟合产生的抗体/抗原复合物的解离常数。
在25℃在Biacore X 100或Biacore T 200仪器(GE Healthcare)上使用小鼠抗体捕获试剂盒和CM3传感器芯片(均来自GE Healthcare)进行SPR测量。将培养物上清液在HBS-ET缓冲液(0.01M HEPES/NaOH pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005％v/v吐温20)中以1:5稀释，并以10μl/min的流速注射30μl样品。使用单循环动力学(Karlsson等，2006)以30μl/min的流速将下列测试抗原的系列浓度注射到传感器船上：PAS#1(200)-IL1Ra(SEQID NO：72)、P/A#1(200)-IL1Ra(SEQ ID NO：73)、P/A#1(600)-GMCSF(SEQ ID NO：75)、APSA(200)-IL1Ra(SEQ ID NO：74)和hu4D5-P/A#1(200)WO 2011/144756 A1。传感器芯片用10mM甘氨酸/HCl pH 1.7再生100秒。减去来自参考通道和用HBS-ET缓冲液测量的空白基线中的信号后，使用Biacore X100评估软件版本2.0.1(GE Healthcare)和二价分析物模型拟合数据。拟合算法使用的速率方程如下：
二价分析物(A)与配体(B)结合。
A(溶液)＝Conc
A[0]＝0
dA/dt＝(tc*f^(1/3))*(Conc-A)-((2*ka1)*A*B-kd1*AB)
B[0]＝RMax
dB/dt＝-((2*ka1)*A*B-kd1*AB)-(ka2*AB*B-(2*kd2)*AB2)
AB[0]＝0
dAB/dt＝((2*ka1)*A*B-kd1*AB)-(ka2*AB*B-(2*kd2)*AB2)
AB2[0]＝0
dAB2/dt＝(ka2*AB*B-(2*kd2)*AB2)
总响应：
AB+AB2+RI
参数：Conc，分析物浓度[M]；tc，传质常数；f，溶液通过流动池的体积流速[m3·s-1]；RMax，结合能力；RI，折射率。
D.由杂交瘤细胞克隆V基因
机械裂解杂交瘤细胞，使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，德国希尔登)提取总RNA，然后使用带有oligo(dT)18引物的第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Fisher Scientific)合成cDNA。使用一组覆盖所有的小鼠胚系VL/VH基因区段的63个正向引物(Chardes等，1999)连同用于轻链的反向引物RMK(5’-GAC CTC CAC GGA GTC AGC-3’；SEQ ID NO：77)及用于重链的反向引物RMG(5’-AGG TCG CCA CAC GTG TGG-3’；SEQ ID NO：78)(Loers等，2014)，用Q5 DNA聚合酶(New England Biolabs，德国法兰克福)从该cDNA PCR扩增Ig V基因区。正向引物最初应用于5-15池中，以减少所需的PCR反应次数，在为此类池鉴定出PCR产物后，单独产生单一PCR产物。之后，使用Wizard SV凝胶和PCR净化系统(Promega，威斯康星州麦迪逊)通过琼脂糖凝胶电泳分离合适的PCR产物，并使用Mix2Seq试剂盒(Eurofins Genomics，德国埃伯斯伯格)进行双链DNA测序。
E.Fab片段细菌表达质粒的构建
为了在细菌表达载体pASK88上克隆V基因(Schiweck和Skerra，1995)，用引物对对来自上述V基因扩增的产物进行PCR扩增，引物对被设计成按照先前公开的常规程序引入合适的侧翼限制性位点(Loers等，2014；Peplau等，2020)。得到的PCR产物用相应的限制酶切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离，在两次连续的连接中，将VH和VL基因分别插入到已经用相应的限制酶切割的pASK88中。根据ProMab生物技术公司测定的这些杂交瘤的V基因序列，用合适的侧翼限制性位点(GeneArt，德国雷根斯堡)通过基因合成，获得抗PA(S)MAb 2.1、抗PA(S)MAb 1.2和抗PA(S)MAb 3.1的编码区。
F.大肠杆菌产生和Fab片段的纯化
含有抗PA(S)MAb 2.1、抗PA(S)MAb 2.2、抗PA(S)MAb 1.1、抗PA(S)MAb 1.2、抗PA(S)MAb 3.1和抗PA(S)MAb 3.2的V基因的pASK88衍生物用于表达嵌合Fab片段(来自杂交瘤的鼠可变结构域与人恒定结构域融合)，或者使用大肠杆菌菌株JM83(Yanisch-Perron等，1985)在6×2l摇瓶培养物中，或者经由使用菌株KS272的8l台式发酵(Meerman和Georgiou，1994)并遵循以下公开的程序(Schiweck和Skerra，1995；Skerra，1994)。经由固定化金属离子亲和层析(IMAC)，随后通过在Resource S 6ml柱上的阳离子交换层析(CEX)以及在HiLoad 16/60Superdex75 prep grade柱上的尺寸排阻层析(SEC)(均来自GEHealthcare)，从周质细胞提取物中纯化重组蛋白。通过分别使用用于抗PA(S)MAb 2.1、抗PA(S)MAb 2.2、抗PA(S)MAb 1.1、抗PA(S)MAb 1.2、抗PA(S)MAb 3.1或抗PA(S)MAb 3.2的嵌合Fab片段的计算消光系数88405M-1cm-1、89895M-1cm-1、77405M-1cm-1、66405M-1cm-1、69955M-1cm-1或57465M-1cm-1(Gasteiger等，2003)，通过测量280nm处的吸光度，来确定蛋白质浓度。通过SDS-PAGE(Fling和Gregerson，1986)和在maXis Q-TOF仪器(Bruker Daltonics，不莱梅)上的电喷雾电离质谱(ESI-MS)，检查蛋白质的完整性和纯度。
G.通过ELISA、荧光滴定和SPR测量Fab的抗原亲和力
在NUNC Maxisorp F 96孔板中，对于抗PA(S)MAb 2.1和抗PA(S)MAb 2.2的重组Fab片段，用50μl的在PBS中10μg/ml的P/A#1(600)多肽(Breibeck和Skerra，2018)包被，对于抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb 1.2的Fab片段，用50μl的在PBS中10μg/ml的PAS#1(600)-瘦素包被(Morath等，2015)，对于抗PA(S)MAb 3.1和抗PA(S)MAb 3.2的Fab片段，用50μl的10μg/ml APSA(200)-IL1Ra(SEQ ID NO：74)包被，并在4℃温育过夜。在用PBS/T进行单一洗涤步骤后，用PBS/T中的3％w/v BSA(NeoFROXX，德国艾因豪森)封闭孔1小时，接着洗涤并用每种50μl PBS/T中的纯化Fab片段的适当稀释系列温育1小时。再次用PBS/T洗涤孔，接着用PBS/T中50μl的1:1000稀释的与碱性磷酸酶(Sigma Aldrich)缀合的抗人κ轻链山羊抗体温育1小时。最终洗涤两次(每次用PBS/T和PBS)之后，用对硝基苯磷酸产生信号，并如上所述进行测量和评估。
如前所述(Voss和Skerra，1997年)使用LS-50B发光光谱仪(Perkin Elmer，康涅狄格州诺沃克)进行荧光滴定，该光谱仪配备有恒温在25℃的2ml石英比色皿，用于激发的波长为280nm，用于检测的波长为340nm(在5秒内对信号进行积分)。用每份1μl的5mM Abz-APAPAAPA肽(Peptide Specialty Laboratories-PSL，德国海德堡)(Abz指邻氨基苯甲酰基)溶液滴定2ml的在100mM Tris/HCl pH 7.5中的1μM抗PA(S)MAb 2.2纯化Fab片段溶液，总体积达22μl。将数据归一化为100％的初始荧光，并通过KaleidaGraph(SynergySoftware，宾夕法尼亚州雷丁)的非线性最小二乘回归进行拟合，如(Edwardraja等，2017)所述，包括通过用相同的肽滴定N-乙酰基-色氨酸酰胺来校正内部过滤效应。
在25℃，在Biacore X 100仪器(GE Healthcare)上用相应的抗PA(S)MAb的Fab片段进行SPR测量。PAS#1(200)-IL1Ra、P/A#1(200)-IL1Ra或硫氧还蛋白A-APSA(200)根据制造商的说明用20倍摩尔量的N-琥珀酰亚氨基6-生物素氨己酸(Sigma Aldrich)进行生物素化，并按照制造商的方案作为配体单独固定在生物素CAPture chip(GE Healthcare)上。在固定每个配体之前，通过连续两次注射30％v/v乙腈、0.25M NaOH 120秒以及6M胍/HCl、0.25M NaOH持续120秒，来再生传感器芯片。使用单循环动力学和30μl/min的流速将一系列浓度的重组Fab片段注射到传感器芯片上。在减去来自参考通道和用HBS-ET缓冲液测量的空白基线的信号后，使用Biacore X100评估软件版本2.0.1(GE Healthcare)采用1:1结合模式拟合数据。拟合算法使用的速率方程如下：
A(溶液)＝Conc
A[0]＝0
dA/dt＝(tc*f^(1/3))*(Conc-A)-(ka*A*B-kd*AB)
B[0]＝RMax
dB/dt＝-(ka*A*B-kd*AB)
AB[0]＝0
dAB/dt＝(ka*A*B-kd*AB)
总应答
AB+RI
参数：Conc，分析物浓度[M]；tc，传质常数；f，溶液通过流动池的体积流速[m3·s-1]；RMax，结合能力；RI，折射率。
H.固定化肽阵列的SPOT合成和表位定位
根据标准方案(Frank，2002)，使用MultiPep SPOT合成器(Intavis，德国科隆)在亲水膜上合成覆盖PAS#1或P/A#1氨基酸序列重复的整个氨基酸序列的20个重叠的12聚体肽的阵列，或包含序列AAPSAAPSAA的在3至8位连续取代所有20种蛋白原氨基酸的10聚体肽。分别与纯化的Fab片段或含有分泌的MAb的杂交瘤细胞培养物上清液温育，然后与抗人κ轻链抗体碱性磷酸酶缀合物(Sigma Aldrich)或抗小鼠IgG Fc特异性抗体碱性磷酸酶缀合物(Sigma Aldrich)温育后，根据公开的程序(Zander等，2007)进行膜上缀合活性的检测。
I.蛋白质印迹法检测PAS蛋白修饰的蛋白质
测试来自杂交瘤上清液的抗PA(S)MAb用于在蛋白质印迹上检测PAS蛋白修饰的蛋白质。一组不同的PAS蛋白修饰的蛋白质(PAS#1(200)-IL1Ra(SEQ ID NO：72)，P/A#1(200)-IL1Ra(SEQ ID NO：73)，APSA(200)-IL1Ra(SEQ ID NO：74)，以及作为对照的人血清(人血清(PL)，合并；SEQENS IVD/H2B，法国里摩日)在水中以1:200稀释，并掺入1μg IL1Ra(Kineret/Anakinra；Swedish Orphan Biovitrum，瑞典斯德哥尔摩)和大肠杆菌BL21全细胞裂解物进行SDS-PAGE，然后在硝酸纤维素膜上进行半干电转移。用PBS/T洗涤后，用PBS/T中1:2000稀释的抗PAS MAb作为杂交瘤上清液，或者在纯化的抗PA(S)MAb 2.1的情况下，用1:200000稀释的抗PAS MAb温育膜。使用在PBS/T中1:50000稀释的与碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich)缀合的抗小鼠IgG Fc特异性山羊抗体检测结合的MAb，随后与5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸(BCIP)和硝基蓝四唑(NBT)(均来自卡尔斯鲁厄的Carl Roth)进行显色反应。
J.大鼠体内药代动力学分析
Aurigon毒理学研究中心(ATRC，匈牙利多瑙凯西)根据适用的动物福利法规对8-9周龄的雌性Wistar大鼠进行药代动力学(PK)研究。每个笼子最多可容纳3只动物，环境温度为22±3℃，相对湿度为50±20％，光照12小时，黑暗12小时。通过单次注射在大鼠背部区域皮下施用纯化的PAS蛋白修饰的胸腺素α1(SEQ ID NO：76)(3.4mg/kg)。在不同的时间点从5只动物中各取血样(100μl)。在K3-EDTA试管(Greiner Bio-One，德国弗里肯豪森)中收集后，将样品在室温下离心10分钟(3000xg)，并将所得血浆储存在-15至-30℃。使用夹心ELISA对这些样品中的PAS蛋白修饰的胸腺素α1进行定量(参见方法K和图15A)。适用于定量动物或人类患者的血液或血浆/血清样品中的PAS蛋白修饰的肽或蛋白质的潜在替代ELISA设置如图15的B至D图所示。
K.通过ELISA定量大鼠血浆中PAS蛋白修饰的胸腺素α1
给8-9周龄的雌性Wistar大鼠(n＝5)(Aurigon毒理学研究中心，匈牙利多瑙凯西)皮下注射PAS蛋白修饰的胸腺素α1(SEQ ID NO：76)(3.4mg/kg)，并在不同时间点在K3-EDTA试管(Greiner Bio-One，德国弗里肯豪森)中收集血样(100μl)。为了对大鼠PK研究(方法J)中施用的PAS蛋白修饰的胸腺素α1进行定量，在4℃下用PBS中的100μg/ml抗PA(S)MAb 2.1包被Nunc Maxisorb ELISA 96孔板(Thermo Fisher Scientific)过夜。用PBS/T洗涤两次后，室温下用PBS/T中的3％w/v BSA封闭游离结合位点1小时。
然后，用PBS/T洗涤平板3次，并将大鼠血浆样品每个以1:2的稀释系列加到PBS/T中，后者已经补充了来自未处理动物的0.5％(v/v)血浆，以保持大鼠血浆成分的恒定比例。以同样的方式，使用在含有与测试样品相同量的大鼠血浆的PBS/T中确定浓度的纯化的PAS蛋白修饰的胸腺素α1的稀释系列来制备标准曲线。在室温下温育1小时后，用PBS/T洗涤孔3次。为了检测结合的PAS蛋白修饰的胸腺素α1，将孔与50μl的1μg/ml抗PA(S)MAb1.2的PBS/T溶液温育1小时，后者已经使用Lightning-Link碱性磷酸酶抗体标记试剂盒(BioTechne，德国威斯巴登)与碱性磷酸酶缀合。用PBS/T洗涤两次并用PBS洗涤两次后，用对硝基苯磷酸酯(0.5mg/ml)检测酶活性。为此，将板在30℃温育20分钟，使用SpectraMax M5e微量滴定板读数器(Molecular Devices，加利福尼亚州桑尼韦尔)在405nm处测量吸光度，通过与标准曲线比较来定量PAS蛋白修饰的胸腺素α1的浓度(图14A)。
数据相对于注射后的取样时间作图，并使用一室(one-compartment)模型使用Phoenix WinNonlin 6.3软件拟合。所得的PK参数(表1)和PK曲线(图14B)对于长效肽药物而言是典型的，并证明本发明的抗PAS抗体适于定量哺乳动物血浆中的PAS蛋白修饰的药物浓度。值得注意的是，该方法中应用的ELISA设置(图15A)使用抗PAS抗体作为捕获抗体，因此避免了检测与人肽具有100％的序列同一性的内源性大鼠胸腺素α1。替代的ELISA设置如图15所示，并且在本领域中是众所周知的(Vashist和Luong，2018)。
表1：大鼠体内PAS蛋白修饰的胸腺素α1(Tα1)的药代动力学参数。列出了药物的最大血清浓度(C最大)、达到C最大的时间(T最大)、曲线下面积(AUC)、分布半衰期(t1/2α)、消除半衰期(t1/2β)和清除率(CL)。
L.抗PAS Fab片段与PAS肽的共结晶、X射线数据采集和分子模型构建
抗PA(S)MAb 2.2、抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb 3.1的纯化重组Fab片段与其同源PAS肽直接共结晶，而在抗PA(S)MAb 1.2的Fab的情况下，最初制备了(Ereno-Orbea等，2018)中描述的具有抗人κVHH结构域的复合物。为此，将纯化的Fab与三倍摩尔量的VHH结构域(Thermo Fisher Scientific)在4℃温育1小时。将蛋白质混合物在HiLoad 16/60Superdex75 prep grade柱上进行SEC，将Fab·VHH复合物与过量的抗人κVHH结构域分离，并使用10mM HEPES/NaOH pH 6.5、70mM NaCl作为运行缓冲液在一个峰中分离。
使用Amicon Ultracel离心过滤单元(MWCO 10kDa；Millipore，马萨诸塞州比尔里卡)，将不同蛋白质溶液浓缩如下：在20mM HEPES/NaOH pH 6.5、80mM NaCl中的抗PA(S)MAb2.2，至9.6mg/ml；在10mM HEPES、pH 6.5、100mM NaCl中的抗PA(S)MAb3.1，至9.2mg/ml；均在10mM HEPES/NaOH pH 6.5、70mM NaCl中的抗PA(S)MAb 1.1至8.4mg/ml和抗PA(S)MAb1.2(作为Fab·VHH)至13.7mg/ml。对于共结晶，将每种浓缩的蛋白质溶液与来自大于50mM储备溶液的适当肽以1:3的摩尔比(Fab:肽)混合，并在4℃温育1小时。然后，通过坐滴蒸气扩散法以及蛋白质和储备溶液的等体积混合物进行蛋白质结晶筛选，得到总液滴体积在300-1000nl范围内。为了改进有希望的结晶条件，使用具有1ml的储库体积以及由1μl蛋白质和1μl储库溶液组成的液滴的悬滴蒸气扩散法建立了进一步的筛选。在表3中列出的条件下，在20℃，一周内出现晶体。收获蛋白质晶体，转移到补充有20％w/v PEG200用于抗PA(S)MAb 2.2、20％w/v乙二醇用于抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb 1.2或20％w/v甘油用于抗PA(S)MAb 3.1的沉淀缓冲液中，并立即在液氮中冷冻。
在德国亥姆霍兹柏林中心操作的BESSY II的MX Beamline BL14.2下，或者，对于抗PA(S)MAb 3.1的Fab片段，在瑞士Villigen-PSI的瑞士光源(SLS)的蛋白质晶体BeamlineX06SA-PXI下，以100K从每个晶体收集单波长X射线同步加速器数据集。使用XDS程序包(Kabsch，2010)对衍射数据(表3)进行简化，并使用Phaser(McCoy等，2007)进行分子替换，使用Fab 101F(PDB ID：3QQ9)的恒定和可变结构域作为搜索模型来解析抗PA(S)Mab2.2Fab·P/A#1复合物的结构。通过以抗PA(S)MAb 2.2的Fab的精细结构作为搜索模型的分子置换来解析抗PA(S)Mab 1.1Fab·PAS#1和抗PA(S)Mab 1.2Fab·PAS#1的结构，在后一种情况下还包括抗人κVHH结构域(PDB编号：6ANA)。通过分子置换解析抗PA(S)MAb 3.1Fab·APSA的结构，其中抗PA(S)MAb 1.2的Fab的精细结构作为搜索模型，不包含抗人κVHH结构域。使用Coot(Emsley等，2010)手动调整蛋白质模型，并使用Refmac5(Murshudov等，2011)细化蛋白质模型。肽和水分子是在细化过程中在Coot中手动构建的。最终的结构模型使用MolProbity服务器进行验证(Williams等，2018)。使用PISA(Krissinel和Henrick，2007)分析晶体接触位点以及可及和埋藏的表面区域(分别为ASA和BSA)(在输入文件中使用轻链和重链连接作为连续不间断的氨基酸链进行计算)。使用用于计算静电的APBS模块(Baker等，2001)，用PyMOL(马萨诸塞州剑桥)制备分子图形。原子距离通过CONTACT进行计算(Winn等，2011)。
对于Ig轻链，多肽被表示为L、对于Ig重链为H以及对于每个结合的PAS肽为P，而抗人κVHH结构域被指定为链标识符X。在抗PA(S)MAb 1.1的情况下，在不对称单元中具有两个Fab·肽复合物，具有较高平均结晶B因子的一个分别被分配链标识符A、B和Q。
M.使用固定在琼脂糖凝胶柱上的抗PAS Fab亲和纯化StrepII-eGFP-PAS#1(200)、H1GA-PAS#1(200)-His6和PAS#1(800)-IL1Ra
根据制造商的方案，将总共5mg纯化的抗PA(S)MAb 1.2的Fab片段共价固定在1mlHiTrap NHS活化的HP柱(GE Healthcare)上。简而言之，在注射1ml偶联缓冲液(0.2MNaHCO3，0.5M NaCl，pH 8.3)中的Fab之前，用冰冷的1mM HCl洗涤柱，并在25℃温育30分钟。通过重复交替注射0.5M乙醇胺、0.5M NaCl、pH 8.3和0.1M乙酸钠、0.5MNaCl、pH 4来进行过量反应基团的洗涤和失活。
使用在1ml/min流速下操作的Pure 25色谱系统在该柱上进行PAS蛋白修饰的测试蛋白质StrepII-eGFP-PAS#1(200)、H1GA-PAS#1(200)-His6和PAS#1(800)-IL1Ra的纯化。首先用2ml运行缓冲液(100mM Tris/HCl pH 8，150mM NaCl，1mM EDTA)平衡该柱，然后注射(i)纯的StrepII-eGFP-PAS#1(200)(SEQ ID NO：71)或(ii)表达StrepII-eGFP-PAS#1(200)的大肠杆菌BL21细胞的全细胞裂解物或(iii)表达H1GA-PAS#1(200)-His6(SEQ IDNO：90)的大肠杆菌BL21细胞的周质提取物，或(iv)表达PAS#1(800)-IL1Ra(SEQ ID NO：91)的大肠杆菌BL21细胞的全细胞裂解物。用2ml运行缓冲液将未结合的蛋白质从柱上洗去，然后用2-3ml 1M L-脯氨酰胺(Sigma Aldrich)的运行缓冲液溶液洗脱结合的蛋白质，或者用1M L-脯氨酰胺、100mM Tris、150mM NaCl、1mM EDTA，用HCl将pH调节至8.0，然后用运行缓冲液再生柱。为了监测一般蛋白质的存在和StrepII-eGFP-PAS#1(200)的特异性存在，分别在280nm和488nm处检测紫外吸光度(图10A，
B)。SDS-PAGE分析证实了纯的PAS蛋白修饰的蛋白质的特异性洗脱(图10C，D)。由于市售L-脯氨酰胺物质中的明显杂质会导致280nm处的背景吸收，因此记录空白色谱图(不应用PAS蛋白修饰的蛋白质)并用于相减，以获得H1GA-PAS#1(200)-His6和PAS#1(800)-IL1Ra的校正色谱图(图11A，C)。SDS-PAGE分析证实了纯PAS蛋白修饰的蛋白的特异性洗脱(图11B，D)。
N.制备PAS蛋白修饰的测试蛋白质
根据本领域中充分描述的常规程序，例如在WO 2008/155134 A1、WO 2011/144756A1、WO 2017/109087A1、WO 2018/234455A1中或在(Binder和Skerra，2011；Breibeck和Skerra，2018；Morath等，2015；Schlapschy等，2013)中，在大肠杆菌中经由胞质表达或经由周质分泌，从含有相应合成基因的常规表达载体，产生本文所述方法中使用的与具有不同组成和长度的PAS序列融合的所有测试蛋白质和肽。
O.保藏
本发明的下列MAb由XL-protein公司(德国弗赖辛丽舍迈特纳街30号，邮编85354(Lise-Meitner-Strasse 30，85354Freising，Germany))作为细胞培养物保藏在莱布尼茨研究所DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(德国布伦瑞克英霍夫大街7B，邮编38124(Inhoffenstrasse 7B，38124Braunschweig，Germany))，该保藏中心1991年2月28日根据布达佩斯条约被世界知识产权组织认可为关于动物和人类细胞培养物保藏的国际保藏机构：
·抗PA(S)Mab 1.1＝DSM ACC3365
·抗PA(S)Mab 2.1＝DSM ACC3366
·抗PA(S)Mab 3.1＝DSM ACC3367
实施例2：单克隆抗PAS抗体的产生及其对PAS序列的特异性检测
在小鼠中产生针对三种不同PAS肽序列的抗体，PAS#1(SEQ ID NO：1)、P/A#1(SEQID NO：2)和APSA(SEQ ID NO：3)。为此，如上文实施例1中所述，用相应的合成N末端保护的40聚体肽对动物进行免疫，所述肽经由其C末端羧酸基团与海水养殖钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)化学偶联，作为高免疫原性T细胞依赖性载体抗原/“免疫佐剂”(Swaminathan等，2014)。在PAS#1和P/A#1的情况下，40聚体正好覆盖了设计的20聚体序列重复的两个拷贝(Breibeck和Skerra，2018；Schlapschy等，2013)，而“APSA”肽包含10个拷贝的4-残基基序，这可以被认为是一种简化的富含Pro/Ala的序列模式。
这些2×20聚体和/或40聚体PAS肽被设计成涵盖至少两个拷贝的相应PAS序列重复，因此包括至少一个拷贝的两个相邻序列重复之间的连接，这也构成了较长重组PAS多肽中的潜在表位。在每次25-50μg抗原的四到六轮免疫以及最后一次加强免疫之后，从每种抗原的五只小鼠中分离脾细胞，并与Sp2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤。对于每种免疫活动，使用包含相应PAS多肽(200至600个残基)的重组融合蛋白，通过ELISA表征来自40个杂交瘤克隆的抗体，目的是筛选(i)PAS序列的序列特异性和背景非依赖性识别和(ii)显示不同PAS序列之间潜在交叉反应性的抗体的鉴定。用杂交瘤培养上清液进行单克隆抗体捕获ELISA，以浓度依赖性方式施加PAS融合蛋白，以确定解离常数(KD)。通过实时表面等离子体共振(SPR)光谱法对有希望的候选杂交瘤培养物上清液的抗原亲和力和结合动力学进行表征。实施例1中描述了相应的方法。
基于从ELISA和SPR测量中得到的KD值，还考虑到浓度依赖性ELISA中的吸收振幅，从PAS#1(40)-KLH和P/A#1(40)-KLH免疫中各选择8个具有不同特性的克隆，并使用Synthetic Peptides On Transfer membranes(SPOT)技术在合成肽阵列上测试线性表位识别(Frank，2002)。该测定揭示了“PAPAAP”(SEQ ID NO：8)和“PAPASP”(SEQ ID NO：9)作为抗PA(S)MAb 2.1和2.2的表位序列，而抗PAPA(S)MAb 2.1和2.2主要识别肽基序“PASPAAP”(SEQ ID NO：10)(见图5和6)。由于APSA序列更简单的重复性质，对该抗原进行了SPOT置换分析(图7)。因此，以C末端锚定在亲水膜上合成了包含序列AAPSAAPSAA的10聚体肽，其在3-8位连续置换为所有20种必需氨基酸。有趣的是，用PAS#1(40)-KLH免疫产生的抗体仅识别PAS#1多肽序列(抗PA(S)MAb 1.1和1.2)，而来自P/A#1(40)-KLH免疫的一些单克隆抗体也显示出超出了P/A#1表位的与PAS#1的交叉反应性(抗PA(S)MAb 2.1)。出乎意料的是，被本发明的所有抗PA(S)MAb识别的通用序列基序以“(P/S)A(A/S)P”或PA(A/S)P出现。
为了证实本发明的单克隆抗体在检测PAS蛋白修饰的融合蛋白中的适用性，在蛋白质印迹实验中测试了来自杂交瘤上清液的抗PA(S)MAb，其中证实了PAS蛋白修饰的融合蛋白的特异性检测。此外，未检测到与非PAS蛋白修饰的蛋白质版本、人血清蛋白质或大肠杆菌全细胞裂解物中的蛋白质的交叉反应性(图2)。
实施例3：单克隆抗体V基因序列的克隆和Fab产生
对于每种抗原，基于它们与靶序列的亲和力以及与其它PAS序列的交叉反应性，选择两个最有希望的杂交瘤克隆用于进一步分析：抗PA(S)MAb 2.1和抗PA(S)MAb 2.2用于P/A#1；抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb 1.2用于PAS#1，抗PA(S)MAb 3.1和抗PA(S)MAb 3.2用于APSA。为了从mRNA/cDNA确定它们的V基因序列，如上文实施例1所述，每个VH和VL结构域的编码区被逆转录并通过聚合酶链式反应(PCR)扩增，使用合适的寡脱氧核苷酸引物。然后将克隆的V基因序列(抗PA(S)MAb 2.2、抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb 3.2)或相应的合成DNA片段(抗PA(S)MAb 2.1、抗PA(S)MAb 1.2和抗PA(S)MAb 3.1)插入编码第一个人IgG1重链和κ轻链恒定区的细菌表达载体中，以表达相应的嵌合Fab片段(Schiweck和Skerra，1995；Skerra，1994)。在摇瓶和台式发酵罐规模下，通过大肠杆菌中的周质分泌产生功能状态的Fab片段，并通过IMAC、CEX和SEC纯化至同质(见实施例1)。
获得以下氨基酸序列(见图1；CDR根据(Kabat等，1991)的定义，用黑色框标记)：
VH抗PA(S)MAb 1.1(SEQ ID NO：23)：
VL抗PA(S)MAb 1.1(SEQ ID NO：24)：
VH抗PA(S)MAb 1.2(SEQ ID NO：25)：
VL抗PA(S)MAb 1.2(SEQ ID NO：26
VH抗PA(S)MAb 2.1(SEQ ID NO：27)：
VL抗PA(S)MAb 2.1(SEQ ID NO：28)：
VH抗PA(S)MAb 2.2(SEQ ID NO：29)：
VL抗PA(S)MAb 2.2(SEQ ID NO：30)：
VH抗PA(S)MAb 3.1(SEQ ID NO：31)：
VL抗PA(S)MAb 3.1(SEQ ID NO：32)：
VH抗PA(S)MAb 3.2(SEQ ID NO：33)：
VL抗PA(S)MAb 3.2(SEQ ID NO：34)：
值得注意的是，除了(Kabat等，1991)用于确定CDR的方法(其主要基于跨物种序列可变性)之外，至少有一种本领域熟知的其它方法，该方法基于抗原-抗体复合物的晶体学研究(Al-Lazikani等，1997；Chothia等，1989)。如本文所用，CDR优选指Kabat(见上文)的定义，但也可指由其它所述方法或两种方法的组合所定义的CDR。使用顺序编号法对氨基酸进行编号。
实施例4：结合亲和力的表征(抗PAS单克隆抗体和抗PAS Fab)
在定量ELISA和实时SPR测量中研究了通过本文提供的方法和实施例获得的本发明的单克隆抗体(Mab)以及相应的重组抗PAS Fab，以便精确确定它们对不同PAS多肽的KD值(也见表2)。这些测量基本上证实了初步杂交瘤筛选的结果。对于每种类型的PAS抗原，鉴定了至少一种具有特别高亲和力的MAb，这从Fab测量的一位数纳摩尔范围内的KD值中显而易见：对于抗PA(S)MAb 2.1，对P/A#1为2nM；对于抗PA(S)MAb 1.1，对PAS#1为23nM；对于抗PA(S)MAb 3.1，对APSA方为2nM。与以前研究的完整单克隆抗体相比，Fab的亲和力通常弱1-2个数量级，这很可能是由于二价单克隆抗体与含有多拷贝表位的长PAS多肽(例如，600-残基PAS多肽中30个拷贝的重复20PAS#1氨基酸延伸片段)相互作用时产生的亲合力效应。抗P/A#1Fab或者对P/A#1序列特异，或者也与PAS#1序列交叉反应，而抗PAS#1Fab只对PAS#1序列表现出特异性。抗APSA抗体片段或者对APSA序列特异，或者与PAS#1和P/A#1多肽交叉反应(见下表2)。
表2：通过ELISA、SPR和荧光滴定(FT)测量的MAb和相应Fab对其同源PAS(多)肽的亲和力。
n.q.：不可量化
n.d.：不确定
为了确定抗PA(S)MAb 2.1和抗PA(S)MAb 2.2对其表位序列的单价亲和力，用相应的重组Fab片段和合成肽Abz-APAPAAPA(SEQ ID NO：4)(携带N末端邻氨基苯甲酰基作为荧光共振能量转移探针)进行荧光滴定(FT)实验。虽然对于抗PA(S)MAb 2.1的Fab不能推导出可靠的KD值，但是对于抗PA(S)MAb 2.2的Fab确定了KD＝9.2±0.1μM(图16)。该值必须与ELISA中对纯P/A#1(600)抗原测得的KD＝8±1nM进行比较，后者高出约1000倍(见表2)。对于抗PA(S)MAb 2.1的Fab，这种差异甚至必须更高，并且表明不仅亲合力效应，而且更特别的方面，如表位肽的精确分子邻域或具有许多序列重复的多肽内的表位密度，都可以显著影响表观亲和力。
实施例5：通过与抗PAS Fab共结晶对PAS肽的结合的结构表征
使用X射线晶体学分析本发明的一些抗PA(S)MAb识别抗原的结构机制。因此，使用上述实施例1中描述的方法制备的重组抗PA(S)Fab片段与它们的同源合成肽进行共结晶实验，肽的序列或者基于通过上述SPOT测定确定的表位序列，或者在简单APSA基序的情况下，包含具有三个APSA重复的12个氨基酸序列。为了避免N末端的电荷(在较长的(多)肽链中不存在电荷)，用焦谷氨酸(Pga)或乙酰化来封闭这些电荷。获得了抗PA(S)MAb2.2Fab·P/A#1和抗PA(S)MAb 1.1Fab·PAS#1的Fab·肽复合物的衍射质量晶体(见附表3)。在抗PA(S)MAb2.1和抗PA(S)MAb 1.2的情况下，我们应用了最近发表的策略，该策略利用抗人κ轻链VHH结构域来促进(我们的嵌合的)Fab片段的(共)结晶(Ereno-Orbea等，2018)。实际上，这种方法产生了与PAS#1表位肽复合的抗PA(S)Mab 1.2的Fab的晶体，其在同步加速器X射线源下衍射到的高分辨率。使用功能不相关的抗人RSV Fab101F(PDB编号：3QQ9)的恒定区和可变区作为搜索模型，通过分子替代解析抗PA(S)MAb 2.2Fab·P/A#1复合物的结构。随后，复合物抗PA(S)MAb 1.1Fab·PAS#1和抗PA(S)MAb 1.2Fab·PAS#1·VHH的结构的解析是通过分子替代，以Fab 3F3E2Anti-PA(S)MAb 2.2的精细结构作为搜索模型，以及抗人κ轻链VHH结构域(PDB编号：6ANA)(在后一种情况下)。以抗PA(S)MAb 1.2Fab的精细结构作为搜索模型，通过分子替代来解析抗PA(S)MAb 3.1Fab·(APSA)3的结构，在这种情况下不包括抗人κVHH结构域。在手动定位PAS#1、P/A#1和(APSA)3肽后，完成结晶细化，得到R游离(Rfree)值为23-27％(表3)。
表3：在具有PAS肽表位的复合物中结晶的抗PAS MAb的重组Fab片段的X射线衍射和精细化统计。
*最高分辨率壳层(shell)的值显示在括号中。
#用MolProbity计算(Williams等，2018)。
对这些晶体结构的进一步分析表明，PAS肽以或多或少松弛的构象与所有四种Fab结合，覆盖了抗原结合位点的广泛区域，涉及六个互补决定区(CDR)中的至少四个。由于缺乏极性侧链——除了PAS#1表位肽中的一个Ser残基和(APSA)3肽中的三个Ser残基——相互作用主要通过与肽主链原子的氢键(见附表4)和范德华接触(见附表5)介导，包含一些局部疏水相互作用，而盐桥完全不存在，如预期的那样。有趣的是，在每种情况下，PAS肽的至少一个Ala残基参与了与抗PAS Fab的相关相互作用；因此，Ala可以被认为是PAS表位中抗体相互作用的热点。到目前为止，Ala这种侧链最小的氨基酸被认为在蛋白质-蛋白质/肽识别中起着微不足道的作用。实际上，假设Ala甲基侧链对分子相互作用具有准惰性作用，丙氨酸扫描诱变策略(Cunningham和Wells，1989)已广泛应用于剖析受体-配体或抗体-抗原结合的关键残基。出乎意料的是，本发明揭示了Ala实际上可以在抗原识别中起到主要作用，特别是以抗PA(S)MAb 2.2Fab·P/A#1和抗PA(S)MAb 1.1Fab·PAS#1两种晶体结构为例，。实际上，AlaP5被完全掩埋在结合口袋中，并且其羰基氧参与两个氢键，在复杂的抗PA(S)MAb 2.2Fab·P/A#1的抗体-肽界面中充当“热点”残基(Clackson和Wells，1995)。同样，抗PA(S)MAb 1.1Fab的结构显示，在抗原结合位点的中间有一个孔，该孔被完美地模制以容纳AlaP7的甲基，从而允许高度的形状互补性和紧密的界面。
与(APSA)3肽复合的抗PA(S)MAb 3.1Fab的结构揭示了在VH和VL链之间的互补位中有一个独特的沟，其中肽以伸长的形状结合。结合涉及肽中所有三个APSA重复的残基，主要通过与肽主链原子或肽Ser侧链的氢键以及肽Pro和Ala侧链的疏水相互作用来介导。与抗PA(S)MAb 2.2Fab·P/A#1和抗PA(S)MAb 1.1Fab·PAS#1的结构相似，表位中的Ala残基在介导氢键和范德华接触中起重要作用(表4和表5)。
出乎意料的是，在抗PA(S)MAb 1.2Fab与PAS#1表位肽复合的情况下，肽的N末端焦谷氨酰残基也有助于形成具有三个氢键的复合物。这些氢键在具有更长的PAS#1(多)肽的复合物中是不可能的，其Pga残基的位置将被Pro占据。虽然Pro残基完全适合晶体结构中的这个位置，但是更长多肽链的N末端路线将导致与Fab的空间冲突。
为了阐明复合物中与抗PA(S)MAb 1.1Fab或抗PA(S)MAb 1.2Fab结合的PAS#1肽之间的任何构象相似性，对它们的结构进行叠加。实际上，SerP5到AlaP8四个残基显示出它们的Cα位置匹配极好，均方根偏差(RMSD)仅为STRIDE的二级结构分析(Frishman和Argos，1995)确定了这个四残基伸展的I型β转角。除了SerP5羰基氧和AlaP8酰胺氢之间的分子内氢键之外，这一转角还被SerP5羟基和AlaP7酰胺氢之间的氢键所稳定。这种类型的β转角被归类为SPXX转角，并且出现在基因调节蛋白中，作为DNA结合基序(Suzuki和Yagi，1991)。然而，尽管它们在两个Fab复合物中相互相似，但这些转角以不同的方向结合：在抗PA(S)Mab 1.1Fab·PAS#1复合物中，该转角位于结合袋中，而在抗PA(S)Mab 1.2Fab·PAS#1复合物中，它暴露于溶剂中。值得注意的是，用STRIDE进行的类似分析确定，P/A#1表位肽与抗P/A#1MAb 2.2Fab的复合物以及(APSA)3肽与抗PA(S)MAb 3.1Fab的复合物都没有二级结构特征。
在本发明的上下文中，特异性识别具有三种不同序列(即SEQ ID No：1、2和3中提供的序列)的结构无序富含Pro/Ala的(多)肽中的线性表位的单克隆抗体通过本文提供的手段和方法产生。本发明的抗PA(S)MAb或其重组形式和片段，为PAS蛋白修饰的候选药物的生物化学研究以及生物制药开发提供了有价值的生物分析和诊断工具(Binder和Skerra，2017；Gebauer和Skerra，2018；Richter等，2020)，包括适用于临床研究的测定。
表4：抗PA(S)MAb与PAS表位肽之间的氢键相互作用。
表5：抗PAS MAb与PAS表位肽之间的范德华原子接触
在本文提供的所有结晶Fab复合物中，互补位中Tyr残基的高丰度是明显的。这些残基负责大部分疏水接触(附表5)，因此产生了非常适合于结合电荷或极性侧链较少的抗原的表面。实际上，在抗PA(S)MAb 2.2、抗PA(S)MAb 1.2、抗PA(S)MAb 1.1和抗PA(S)MAb3.1中，所有的接触分别有62％、49％、43％和23％由Tyr介导。有趣的是，抗PA(S)MAb2.2显示了高Tyr含量，并且在结晶复合物中也具有高亲和力。这与先前的分析一致，先前的分析表明抗体互补位中高含量的Tyr通常有助于增强抗原特异性和亲和力(Birtalan等，2008；Birtalan等，2010年)。
本文提供的数据阐明了抗体对无序表位的分子识别机制。由于在所有评估的Fab结构中没有由PAS表位肽引起的明显的侧链相互作用和盐桥，复合物的形成主要由涉及肽骨架的氢键(附表4)以及范德华接触(附表5)驱动，包括一些局部疏水相互作用。由于PAS肽的无特征性质，必须有效地利用能够进行极性相互作用的少数原子团。例如，用抗PA(S)MAb1.2的结构很好地证明了这一点，其中具有PAS#1肽的骨架氢键网络的一小段类似于反平行的β折叠。在两个Fab与含有一个Ser残基的PAS#1表位肽的复合物中，两种抗体都与唯一可用的极性侧链结合形成氢键。抗PA(S)MAb 3.1的结构也是如此，其中三个Ser侧链中的两个涉及氢键。然而，在竞争性水环境中，此类氢键的能量增益有限(Gao等，2009)。实际上，考虑到抗PA(S)MAb 1.1和1.2与针对P/A#1生成的最佳单克隆抗体相比，亲和力明显较低，抗PA(S)MAb 1.1和1.2似乎并没有从这种相互作用中获益多少(见表2)。在所有评估的Fab复合物中，六个CDR中至少有四个参与肽-抗体相互作用的观察结果(见表6)强调了需要一个扩展的界面来或多或少紧密结合结构灵活的抗原。
表6：参与抗PA(S)MAb与PAS表位肽之间原子接触的CDR所有抗体的氨基酸序列采用连续编号；因此，CDR的数量可能是个别不同的。
实施例6：使用抗PA(S)Mab 1.1捕获PAS蛋白修饰的抗半乳糖凝集素Fab片段并测定PAS-Fab与其抗原半乳糖凝集素-3结合动力学的SPR光谱
本发明的抗PA(S)Mab 1.1抗体用作在表面等离子体共振(SPR)传感器芯片上稳定非共价捕获PAS蛋白修饰的人源化抗半乳糖凝集素Fab片段(Peplau等，2021)的工具，以确定该Fab与其抗原半乳糖凝集素-3的亲和力。用HBS/T(10mM HEPES pH 7.4，150mM NaCl，3mM EDTA，0.005％v/v吐温20)作为运行缓冲液以30μl/min的流速操作的Biacore X100仪器(Cytiva，德国弗莱堡)装有羧甲基葡聚糖包被的CM5传感器芯片(Cytiva)。通过以5μl/min的流速注射483mM 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和100mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的1:1混合物持续430秒，使用胺偶联试剂盒(Cytiva)将两个流动通道中的葡聚糖水凝胶的羧酸根基团转化为反应性N-羟基琥珀酰亚胺酯基团。接下来，从Genscript(Piscataway，美国新泽西)获得的蛋白A亲和纯化的重组抗PA(S)Mab 1.1通过以5μl/min的流速注射在10mM乙酸钠pH 4.5中的100μg/ml抗PA(S)Mab 1.1溶液持续600秒而共价固定到芯片表面上。通过以5μl/min的流速注射0.1M乙醇胺溶液持续430秒，最终封闭未反应的NHS酯基团。该程序(图17)产生大约13500共振单位(ΔRU)的抗PA(S)Mab 1.1表面密度。
为了研究抗半乳糖凝集素-PAS(200)Fab片段(SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：93)与携带C173T突变和C末端Strep标签II(SEQ ID NO：94)的重组半乳糖凝集素-3(Uniprot标识符P17931)的结合动力学，将纯化的PAS蛋白修饰的Fab片段在HBS/T中稀释至3.57μg/ml，并以5μl/min的流速注射到流道2中持续40秒，随后缓冲液流动600秒。这导致约580共振单位(ΔRU)的PAS-Fab表面密度，其保持稳定在±7％以内(图17B)。随后，使用来自抗原半乳糖凝集素-3的1:2稀释系列(1.6nM至0.1nM)的五次连续注射，以30μL/min的流速进行单循环动力学实验，每次持续60秒，最后跟随3600秒解离期。之后，通过以30μl/min的流速连续两次注射10mM甘氨酸/HCl pH 2.4持续60秒，以再生芯片。这种再生程序允许重复使用相同的MAb功能化的传感器表面，在超过两个月内用于对PAS蛋白修饰的蛋白质的更多测量。
参考校正传感图(图17C)显示了抗半乳糖凝集素-PAS(200)Fab片段与其抗原半乳糖凝集素-3之间的双分子反应的典型结合曲线。使用Biacore X100评估软件(Cytiva)将这些数据拟合到全局1:1朗格缪尔(Langmuir)结合模型中，得到的结合速率为7.9×106M-1s-1，解离速率为3.0×10-5s-1，平衡解离常数(KD值)为3.8pM。
这些发现表明，本发明的高度特异性抗PAS 1.1MAb为在SPR传感器芯片上稳定非共价捕获PAS蛋白修饰蛋白提供了有价值的工具。此外，使用10mM甘氨酸/HCl pH 2.4的温和酸性再生完全去除了PAS蛋白修饰的蛋白质及其配体，提供了重复使用相同MAb功能化的传感器表面以更多测量PAS蛋白修饰的蛋白质的能力。
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序列表
<110> XL蛋白质公司
慕尼黑工业大学
<120> 对结构无序序列具有特异性的抗体
<130> AD2541 PCT S3
<150> EP 20 216 744.1
<151> 2020-12-22
<160> 94
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS#1的20聚体构件的氨基酸序列
<400> 1
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ser Ala Pro Ala
20
<210> 2
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P/A#1的20聚体构件的氨基酸序列
<400> 2
Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ala
20
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> APSAPAS#1的20聚体构件的氨基酸序列
<400> 3
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ser Ala
20
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> 阻断的
<220>
<223> 荧光滴定中使用的肽的氨基酸序列，N-末端用邻氨基苯甲酸修饰
<400> 4
Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
1 5
<210> 5
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> 吡咯烷酮羧酸
<220>
<223> 用于免疫原的PAS#1(40)聚合物的氨基酸序列，N末端用Pga修饰，C末端用Ahx修饰
<220>
<221> MOD_RES
<222> 41
<223> 阻断的
<400> 5
Glu Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
35 40
<210> 6
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> 吡咯烷酮羧酸
<220>
<223> 用于免疫原的P/A#1(40)聚合物的氨基酸序列，N末端用Pga修饰，C末端用Ahx修饰
<220>
<221> MOD_RES
<222> 41
<223> 阻断的
<400> 6
Glu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala
35 40
<210> 7
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> 吡咯烷酮羧酸
<220>
<223> 用于免疫原的APSA(40)多聚体的氨基酸序列，N末端用Pga修饰，C末端用Ahx修饰
<220>
<221> MOD_RES
<222> 41
<223> 阻断的
<400> 7
Glu Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser
1 5 10 15
Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser
20 25 30
Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
35 40
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位PAPAAP的氨基酸序列
<400> 8
Pro Ala Pro Ala Ala Pro
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位PAPASP的氨基酸序列
<400> 9
Pro Ala Pro Ala Ser Pro
1 5
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位PASPAAP的氨基酸序列
<400> 10
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro
1 5
<210> 11
<211> 120
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.1重链可变区的氨基酸序列
<400> 11
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Tyr Gly Arg Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.1轻链可变区的氨基酸序列
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Gly Tyr Asn Tyr Met Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Trp Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg
85 90 95
Glu Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 110
<210> 13
<211> 123
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.2重链可变区的氨基酸序列
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Leu Val
35 40 45
Ala Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Gly Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.2轻链可变区的氨基酸序列
<400> 14
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Tyr Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Trp
85 90 95
Glu Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 121
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.1重链可变区的氨基酸序列
<400> 15
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Asp Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ser Ser Val Asp Ala Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Met Arg Asp Asn Tyr Gly Val Trp Phe Ala Phe Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 16
<211> 113
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.1轻链可变区的氨基酸序列
<400> 16
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser
20 25 30
Asn Arg Glu Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Asn Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
Arg
<210> 17
<211> 121
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.2重链可变区的氨基酸序列
<400> 17
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Tyr
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Thr Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Ser Val
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Phe Asn Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ser Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Gln Leu Ala Tyr His Asp Asn Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
115 120
<210> 18
<211> 113
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.2轻链可变区的氨基酸序列
<400> 18
Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.1重链可变区的氨基酸序列
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile His Pro Gly Ser Gly Asn Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Val Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Leu Trp Gly Arg Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 20
<211> 113
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.1轻链可变区的氨基酸序列
<400> 20
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Val Thr Leu Ser Val Asn Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Gly Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asp Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Glu Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Leu Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 21
<211> 114
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.2重链可变区的氨基酸序列
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Leu Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met Phe Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Cys Ile
35 40 45
Gly Thr Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Asn Asp Arg Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 22
<211> 113
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.2轻链可变区的氨基酸序列
<400> 22
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Ser
35 40 45
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 23
<211> 360
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.1重链可变区的核苷酸序列
<400> 23
caggtgcagc tgaaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccatc 60
acatgcaccg tctcagggtt ctcattaacc ggctatggtg taaattgggt tcgccagcct 120
ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg atggaatcac agactataat 180
tcagctctca aatccagact gagcatcagc aaggacaact ccaagagtca agttttctta 240
aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccaggtact actgtgccag ggattactac 300
ggtaggaggt actatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360
<210> 24
<211> 336
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.1轻链可变区的核苷酸序列
<400> 24
gacattgtac tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagcaa aagtgtcagt tcatctggct ataattatat gttctggtac 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc ttgcatccaa cctagaatct 180
ggggtccctg acaggttctg gggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatgc agcaacctat tactgtcagc acagtaggga gcttcctcta 300
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgg 336
<210> 25
<211> 369
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.2重链可变区的核苷酸序列
<400> 25
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgcagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatggca tgtcttgggt tcgccagact 120
ccagacaaga ggctggagtt ggtcgcaacc attaatagta atggtggtag cacctattat 180
ctagacagtg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca aagccaagaa caccctgtac 240
ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgt aagagggggg 300
tcgatctatg atggttacga ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 360
gtctcctca 369
<210> 26
<211> 336
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.2轻链可变区的核苷酸序列
<400> 26
gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60
atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctagct atagttatat gcactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagagtct 180
ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240
cctgtggagg aggaggatac tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattcctctc 300
acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgg 336
<210> 27
<211> 363
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.1重链可变区的核苷酸序列
<400> 27
caggtcactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttatgata tgggtgtagg ttggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gccaacattt ggtggaatga taataaatac 180
tataactcag ccctgaagag ccgcctcaca atctccaagg atacctccaa caaccaggtg 240
ttcctcaaga tctccagtgt ggacgctaca gatactgcca catattattg tgctcaaatg 300
agggataact acggagtttg gtttgctttc tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360
gca 363
<210> 28
<211> 339
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.1轻链可变区的核苷酸序列
<400> 28
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
atgagctgca agtccagtca gagccttttt tatagtaaca gggaaaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcaatg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataactat 300
cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaacgg 339
<210> 29
<211> 363
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.2重链可变区的核苷酸序列
<400> 29
caggtcactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60
acttgttctt tctctgggtt ttcactgaac acttatggta tgggtgtagg ttggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gccaacattt ggtggactga tgataagtac 180
tataattcag tcctgaagag ccggctcaca atctccaagg ataccttcaa caaccaggta 240
ttcctcaaga tctccagtgt ggacactgca gatactgcca catactactg tgctcaacta 300
gcctatcatg ataacccctg gtttgcttac tggggccaag ggactctggt cactgtctct 360
gca 363
<210> 30
<211> 339
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.2轻链可变区的核苷酸序列
<400> 30
gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60
ctgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtaaca atcaaaagaa ctacttggcc 120
tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180
gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240
atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttataactat 300
cccacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339
<210> 31
<211> 336
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.1重链可变区的核苷酸序列
<400> 31
caggttcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg ctttgggcta catatttact gactatgaaa tgcactgggt gaagcagaca 120
cctgtacatg gcctggaatg gattggagtt attcatccag gaagtggtaa tactgtctac 180
aatcagaagt tccagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggaggtca gcagcctgac atctgaggac tctgctgtct attactgtaa tctatgggga 300
aggtggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 336
<210> 32
<211> 339
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.1轻链可变区的核苷酸序列
<400> 32
gatgttgtga tgacccagac tccagtcact ttgtcggtta acattggaca accagcctcc 60
atctcttgca agtcaggtca gagcctctta catagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc tgatctggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactagcagt ggatcaggga cagatttcac actggaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acatcttccg 300
catacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339
<210> 33
<211> 342
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.2重链可变区的核苷酸序列
<400> 33
caggttcaac tgcagcagtc tggggctgag ctggtgaggc ctggggcttc agtgaagctg 60
tcctgcaagg ctttgggcta cacatttact gactatgaaa tgttctgggt gaagcagaca 120
cctgtgcatg gcctggaatg tattggaact attcatccag gaagtggtgg aactgcctac 180
aatcagaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagcctac 240
atggagctca gcagcctgac gtctgaggac tctgctgtct attactgtac aagaaatgac 300
agaggctcct ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342
<210> 34
<211> 339
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.2轻链可变区的核苷酸序列
<400> 34
gatgttgtgc tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60
atctcttgca ggtcaagtca gagcctctta aatagtgatg ggaagacatt tttgaattgg 120
ttgttacaga ggccaggcct gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taaactggac 180
tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240
agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttcct 300
cacacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaacgg 339
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.1 CDRH1的氨基酸序列
<400> 35
Gly Phe Ser Leu Thr Gly Tyr Gly Val Asn
1 5 10
<210> 36
<211> 16
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.1 CDRH2的氨基酸序列
<400> 36
Met Ile Trp Gly Asp Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.1 CDRH3的氨基酸序列
<400> 37
Asp Tyr Tyr Gly Arg Arg Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 38
<211> 15
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.1 CDRL1的氨基酸序列
<400> 38
Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Ser Ser Gly Tyr Asn Tyr Met Phe
1 5 10 15
<210> 39
<211> 7
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.1 CDRL2的氨基酸序列
<400> 39
Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.1 CDRL3的氨基酸序列
<400> 40
Gln His Ser Arg Glu Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 41
<211> 10
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.2 CDRH1的氨基酸序列
<400> 41
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 42
<211> 17
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.2 CDRH2的氨基酸序列
<400> 42
Thr Ile Asn Ser Asn Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Leu Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 43
<211> 14
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.2 CDRH3的氨基酸序列
<400> 43
Gly Gly Ser Ile Tyr Asp Gly Tyr Asp Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.2 CDRL1的氨基酸序列
<400> 44
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Thr Ser Ser Tyr Ser Tyr Met His
1 5 10 15
<210> 45
<211> 7
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.2 CDRL2的氨基酸序列
<400> 45
Tyr Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 46
<211> 9
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 1.2 CDRL3的氨基酸序列
<400> 46
Gln His Ser Trp Glu Ile Pro Leu Thr
1 5
<210> 47
<211> 12
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.1 CDRH1的氨基酸序列
<400> 47
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Asp Met Gly Val Gly
1 5 10
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.1 CDRH2的氨基酸序列
<400> 48
Asn Ile Trp Trp Asn Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 49
<211> 11
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.1 CDRH3的氨基酸序列
<400> 49
Met Arg Asp Asn Tyr Gly Val Trp Phe Ala Phe
1 5 10
<210> 50
<211> 17
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.1 CDRL1的氨基酸序列
<400> 50
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Tyr Ser Asn Arg Glu Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.1 CDRL2的氨基酸序列
<400> 51
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.1 CDRL3的氨基酸序列
<400> 52
Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Thr
1 5
<210> 53
<211> 12
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.2 CDRH1的氨基酸序列
<400> 53
Gly Phe Ser Leu Asn Thr Tyr Gly Met Gly Val Gly
1 5 10
<210> 54
<211> 16
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.2 CDRH2的氨基酸序列
<400> 54
Asn Ile Trp Trp Thr Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Ser Val Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 55
<211> 11
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.2 CDRH3的氨基酸序列
<400> 55
Leu Ala Tyr His Asp Asn Pro Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 56
<211> 17
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.2 CDRL1的氨基酸序列
<400> 56
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 57
<211> 7
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.2 CDRL2的氨基酸序列
<400> 57
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 58
<211> 8
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 2.2 CDRL3的氨基酸序列
<400> 58
Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Thr
1 5
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.1 CDRH1的氨基酸序列
<400> 59
Gly Tyr Ile Phe Thr Asp Tyr Glu Met His
1 5 10
<210> 60
<211> 17
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.1 CDRH2的氨基酸序列
<400> 60
Val Ile His Pro Gly Ser Gly Asn Thr Val Tyr Asn Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 61
<400> 61
000
<210> 62
<211> 16
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.1 CDRL1的氨基酸序列
<400> 62
Lys Ser Gly Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn
1 5 10 15
<210> 63
<211> 7
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.1 CDRL2的氨基酸序列
<400> 63
Leu Val Ser Asp Leu Asp Ser
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.1 CDRL3的氨基酸序列
<400> 64
Trp Gln Gly Thr His Leu Pro His Thr
1 5
<210> 65
<211> 10
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.2 CDRH1的氨基酸序列
<400> 65
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu Met Phe
1 5 10
<210> 66
<211> 17
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.2 CDRH2的氨基酸序列
<400> 66
Thr Ile His Pro Gly Ser Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 67
<211> 5
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.2 CDRH3的氨基酸序列
<400> 67
Asn Asp Arg Gly Ser
1 5
<210> 68
<211> 16
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.2 CDRL1的氨基酸序列
<400> 68
Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Lys Thr Phe Leu Asn
1 5 10 15
<210> 69
<211> 7
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.2 CDRL2的氨基酸序列
<400> 69
Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
1 5
<210> 70
<211> 9
<212> PRT
<213> 家鼠
<220>
<223> 抗PA(S) MAb 3.2 CDRL3的氨基酸序列
<400> 70
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro His Thr
1 5
<210> 71
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> StrepII-eGFP-PAS#1(200)的氨基酸序列
<400> 71
Ala Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ser Lys Gly Glu
1 5 10 15
Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp
20 25 30
Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala
35 40 45
Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln
65 70 75 80
Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Arg His Asp Phe Phe Lys
85 90 95
Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys
100 105 110
Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp
115 120 125
Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp
130 135 140
Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn
145 150 155 160
Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe
165 170 175
Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His
180 185 190
Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp
195 200 205
Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu
210 215 220
Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile
225 230 235 240
Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Gln Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
245 250 255
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
275 280 285
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
290 295 300
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
305 310 315 320
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
325 330 335
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
340 345 350
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
355 360 365
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
370 375 380
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
385 390 395 400
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
405 410 415
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
420 425 430
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
435 440 445
Ala Ala
450
<210> 72
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS#1(200)-IL1Ra的氨基酸序列
<400> 72
Met Lys His His His His His His Ser Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala
20 25 30
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser
35 40 45
Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala
85 90 95
Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala
100 105 110
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser
115 120 125
Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala
130 135 140
Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala
165 170 175
Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala
180 185 190
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser
195 200 205
Ala Pro Ala Ala Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala
210 215 220
Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn
225 230 235 240
Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu
245 250 255
Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile
260 265 270
His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr
275 280 285
Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg
290 295 300
Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr
305 310 315 320
Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala
325 330 335
Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly
340 345 350
Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu
355 360
<210> 73
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P/A#1(200)-IL1Ra的氨基酸序列
<400> 73
Met Lys His His His His His His Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
35 40 45
Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
50 55 60
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala
85 90 95
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
115 120 125
Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
130 135 140
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
145 150 155 160
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala
165 170 175
Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
195 200 205
Ala Pro Ala Ala Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala
210 215 220
Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn
225 230 235 240
Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu
245 250 255
Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile
260 265 270
His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr
275 280 285
Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg
290 295 300
Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr
305 310 315 320
Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala
325 330 335
Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly
340 345 350
Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu
355 360
<210> 74
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> APSA(200)-IL1Ra的氨基酸序列
<400> 74
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
1 5 10 15
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
20 25 30
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
35 40 45
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
50 55 60
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
65 70 75 80
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
85 90 95
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
115 120 125
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
130 135 140
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
145 150 155 160
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
165 170 175
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala
180 185 190
Ala Pro Ser Ala Ala Pro Ser Ala Ala Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser
195 200 205
Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe
210 215 220
Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn
225 230 235 240
Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala
245 250 255
Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys
260 265 270
Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp
275 280 285
Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser
290 295 300
Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp
305 310 315 320
Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn
325 330 335
Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp
340 345 350
Glu
<210> 75
<211> 736
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P/A#1(600)-GMCSF的氨基酸序列
<400> 75
His His His His His His Ser Ser Ser Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
35 40 45
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
50 55 60
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
85 90 95
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
100 105 110
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
115 120 125
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
130 135 140
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
145 150 155 160
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
195 200 205
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
210 215 220
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
225 230 235 240
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
245 250 255
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
260 265 270
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
275 280 285
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
290 295 300
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
305 310 315 320
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
325 330 335
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
340 345 350
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
355 360 365
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
370 375 380
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
385 390 395 400
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
405 410 415
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
420 425 430
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
435 440 445
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
450 455 460
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
465 470 475 480
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
485 490 495
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
500 505 510
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
515 520 525
Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
530 535 540
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
545 550 555 560
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala
565 570 575
Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro
580 585 590
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro
595 600 605
Ala Ala Pro Ala Arg Ser Pro Ser Pro Ser Thr Gln Pro Trp Glu His
610 615 620
Val Asn Ala Ile Gln Glu Ala Arg Arg Leu Leu Asn Leu Ser Arg Asp
625 630 635 640
Thr Ala Ala Glu Met Asn Glu Thr Val Glu Val Ile Ser Glu Met Phe
645 650 655
Asp Leu Gln Glu Pro Thr Cys Leu Gln Thr Arg Leu Glu Leu Tyr Lys
660 665 670
Gln Gly Leu Arg Gly Ser Leu Thr Lys Leu Lys Gly Pro Leu Thr Met
675 680 685
Met Ala Ser His Tyr Lys Gln His Cys Pro Pro Thr Pro Glu Thr Ser
690 695 700
Cys Ala Thr Gln Ile Ile Thr Phe Glu Ser Phe Lys Glu Asn Leu Lys
705 710 715 720
Asp Phe Leu Leu Val Ile Pro Phe Asp Cys Trp Glu Pro Val Gln Glu
725 730 735
<210> 76
<211> 629
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> 乙酰化作用
<220>
<223> N末端乙酰化的PAS蛋白修饰的胸腺素α1的氨基酸序列
<400> 76
Ser Asp Ala Ala Val Asp Thr Ser Ser Glu Ile Thr Thr Lys Asp Leu
1 5 10 15
Lys Glu Lys Lys Glu Val Val Glu Glu Ala Glu Asn Ala Ser Pro Ala
20 25 30
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
35 40 45
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
50 55 60
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
65 70 75 80
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
85 90 95
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
100 105 110
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
115 120 125
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
130 135 140
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
145 150 155 160
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
165 170 175
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
195 200 205
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
210 215 220
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
225 230 235 240
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
260 265 270
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
275 280 285
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
290 295 300
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
305 310 315 320
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
325 330 335
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
340 345 350
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
355 360 365
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
370 375 380
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
385 390 395 400
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
405 410 415
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
420 425 430
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
435 440 445
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
450 455 460
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
465 470 475 480
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
485 490 495
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
500 505 510
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
515 520 525
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
530 535 540
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
545 550 555 560
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
565 570 575
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
580 585 590
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
595 600 605
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
610 615 620
Ser Ala Pro Ala Ala
625
<210> 77
<211> 18
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 引物RMK的核苷酸序列
<400> 77
gacctccacg gagtcagc 18
<210> 78
<211> 18
<212> DNA
<213> 家鼠
<220>
<223> 引物RMG的核苷酸序列
<400> 78
aggtcgccac acgtgtgg 18
<210> 79
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位PSAAPS的氨基酸序列
<400> 79
Pro Ser Ala Ala Pro Ser
1 5
<210> 80
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位ASPAAP的氨基酸序列
<400> 80
Ala Ser Pro Ala Ala Pro
1 5
<210> 81
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位PASPAA的氨基酸序列
<400> 81
Pro Ala Ser Pro Ala Ala
1 5
<210> 82
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位PAAP的氨基酸序列
<400> 82
Pro Ala Ala Pro
1
<210> 83
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位PASP的氨基酸序列
<400> 83
Pro Ala Ser Pro
1
<210> 84
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位APSA的氨基酸序列
<400> 84
Ala Pro Ser Ala
1
<210> 85
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位PSAA的氨基酸序列
<400> 85
Pro Ser Ala Ala
1
<210> 86
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位ASPA的氨基酸序列
<400> 86
Ala Ser Pro Ala
1
<210> 87
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位APAP的氨基酸序列
<400> 87
Ala Pro Ala Pro
1
<210> 88
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位SAPA的氨基酸序列
<400> 88
Ser Ala Pro Ala
1
<210> 89
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 表位AAPA的氨基酸序列
<400> 89
Ala Ala Pro Ala
1
<210> 90
<211> 388
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> H1GA-PAS#1(200)-His6
<400> 90
Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val
1 5 10 15
Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr
20 25 30
Val Val Gly Ala Ala Gly Asn Val Leu Leu Arg Glu Asp Lys Asp Pro
35 40 45
Leu Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys Ser Tyr
50 55 60
Asn Val Thr Ser Val Gly Phe Asp Asp Lys Lys Cys Leu Tyr Lys Ile
65 70 75 80
Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe Thr Leu Gly Arg
85 90 95
Ile Lys Ser Glu Pro Gly Gly Thr Ser Trp Leu Val Arg Val Val Ser
100 105 110
Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe Phe Lys Glu Val Ala Gln
115 120 125
Asn Arg Glu Thr Phe Asn Ile Thr Leu Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly
145 150 155 160
Leu Pro Glu Asn His Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile
165 170 175
Asp Gly Ser Ser Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
180 185 190
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
195 200 205
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
210 215 220
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
225 230 235 240
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
245 250 255
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
260 265 270
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
275 280 285
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala
290 295 300
Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala
305 310 315 320
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
325 330 335
Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala
340 345 350
Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro
355 360 365
Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ser Ala His His
370 375 380
His His His His
385
<210> 91
<211> 954
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS#1(800)-IL1Ra
<400> 91
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
1 5 10 15
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
20 25 30
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
50 55 60
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
65 70 75 80
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
85 90 95
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
100 105 110
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
115 120 125
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
130 135 140
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
145 150 155 160
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
165 170 175
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
180 185 190
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
210 215 220
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
225 230 235 240
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
245 250 255
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
260 265 270
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
275 280 285
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
290 295 300
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
305 310 315 320
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
325 330 335
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
340 345 350
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
355 360 365
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
370 375 380
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
385 390 395 400
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
405 410 415
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
420 425 430
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
435 440 445
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
450 455 460
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
465 470 475 480
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
485 490 495
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
500 505 510
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
515 520 525
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
530 535 540
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
545 550 555 560
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
565 570 575
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
580 585 590
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
595 600 605
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
610 615 620
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
625 630 635 640
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
645 650 655
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
660 665 670
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
675 680 685
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
690 695 700
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
705 710 715 720
Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
725 730 735
Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro
740 745 750
Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala
755 760 765
Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro
770 775 780
Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro
785 790 795 800
Ala Ala Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg
805 810 815
Ile Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu
820 825 830
Val Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile
835 840 845
Asp Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly
850 855 860
Gly Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu
865 870 875 880
Gln Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln
885 890 895
Asp Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser
900 905 910
Phe Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu
915 920 925
Ala Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met
930 935 940
Val Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu
945 950
<210> 92
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS蛋白修饰的人源化抗半乳糖凝集素-3 Fab重链
<400> 92
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ala Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Ile Tyr Ala Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Ile Ile Ser Leu Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Met Met Ala Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys His His His
210 215 220
His His His
225
<210> 93
<211> 420
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS蛋白修饰的人源化抗半乳糖凝集素-3 Fab轻链
<400> 93
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ser Trp Ile Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Gly Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Trp Gln Ala
85 90 95
Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Ala Ser Pro Ala Ala
210 215 220
Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala
225 230 235 240
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser
245 250 255
Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala
260 265 270
Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
275 280 285
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala
290 295 300
Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala
305 310 315 320
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser
325 330 335
Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala
340 345 350
Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala
355 360 365
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala Ser Pro Ala Ala
370 375 380
Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser Ala Pro Ala Ala
385 390 395 400
Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ser Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ser
405 410 415
Ala Pro Ala Ala
420
<210> 94
<211> 259
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人半乳糖凝集素-3 C173T C末端与Strep-tagII融合
<400> 94
Ala Asp Asn Phe Ser Leu His Asp Ala Leu Ser Gly Ser Gly Asn Pro
1 5 10 15
Asn Pro Gln Gly Trp Pro Gly Ala Trp Gly Asn Gln Pro Ala Gly Ala
20 25 30
Gly Gly Tyr Pro Gly Ala Ser Tyr Pro Gly Ala Tyr Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Pro Gly Ala Tyr Pro Gly Gln Ala Pro Pro Gly Ala Tyr Pro Gly
50 55 60
Ala Pro Gly Ala Tyr Pro Gly Ala Pro Ala Pro Gly Val Tyr Pro Gly
65 70 75 80
Pro Pro Ser Gly Pro Gly Ala Tyr Pro Ser Ser Gly Gln Pro Ser Ala
85 90 95
Thr Gly Ala Tyr Pro Ala Thr Gly Pro Tyr Gly Ala Pro Ala Gly Pro
100 105 110
Leu Ile Val Pro Tyr Asn Leu Pro Leu Pro Gly Gly Val Val Pro Arg
115 120 125
Met Leu Ile Thr Ile Leu Gly Thr Val Lys Pro Asn Ala Asn Arg Ile
130 135 140
Ala Leu Asp Phe Gln Arg Gly Asn Asp Val Ala Phe His Phe Asn Pro
145 150 155 160
Arg Phe Asn Glu Asn Asn Arg Arg Val Ile Val Thr Asn Thr Lys Leu
165 170 175
Asp Asn Asn Trp Gly Arg Glu Glu Arg Gln Ser Val Phe Pro Phe Glu
180 185 190
Ser Gly Lys Pro Phe Lys Ile Gln Val Leu Val Glu Pro Asp His Phe
195 200 205
Lys Val Ala Val Asn Asp Ala His Leu Leu Gln Tyr Asn His Arg Val
210 215 220
Lys Lys Leu Asn Glu Ile Ser Lys Leu Gly Ile Ser Gly Asp Ile Asp
225 230 235 240
Leu Thr Ser Ala Ser Tyr Thr Met Ile Ser Ala Trp Ser His Pro Gln
245 250 255
Phe Glu Lys

Claims (21)

1.一种产生针对内在无序肽/蛋白质和/或内在无序肽/蛋白质结构域的抗原结合分子、优选抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括用抗原对非人类哺乳动物进行免疫的步骤
其中所述抗原是免疫佐剂与一种或多种P/A肽的缀合物，
其中每种P/A肽独立地是由约5至约100个氨基酸残基组成的肽，其中所述肽的至少60％的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，并且其中保护基团RN连接至所述肽的N末端氨基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中每种P/A肽独立地是肽
RN-(P/A)-RC，
其中(P/A)是由约8至约90个氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中(P/A)中至少70％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，其中(P/A)包含至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基，
其中RN是连接至(P/A)的N末端氨基的保护基团，
其中RC是经由其氨基与(P/A)的C末端羧基结合的氨基酸残基，并且在其氨基和羧基之间包含至少一个碳原子，以及
其中每种P/A肽经由酰胺键与所述免疫佐剂缀合，所述酰胺键由P/A肽的C末端氨基酸残基RC的羧基和所述免疫佐剂的游离氨基形成。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗原中的(P/A)是由约10至约80个氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中(P/A)中至少70％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，其中(P/A)中至少95％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸，并且其中(P/A)包含至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述抗原中的(P/A)是由独立地选自脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的20至40个氨基酸残基组成的氨基酸序列，其中(P/A)中至少70％数目的氨基酸残基独立地选自脯氨酸和丙氨酸，并且其中(P/A)包含至少一个脯氨酸残基和至少一个丙氨酸残基。
5.根据权利要求2至4中任一项所述的方法，其中(P/A)中包含的脯氨酸残基的数量与(P/A)中包含的氨基酸残基的总数的比例为≥10％且≤70％，优选≥20％且≤50％，更优选≥25％且≤40％。
6.根据权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述抗原中的(P/A)由(i)独立地选自ASPA(SEQ ID NO：86)、APAP(SEQ ID NO：87)、SAPA(SEQ ID NO：88)、AAPA(SEQ ID NO：89)和APSA(SEQ ID NO：84)的五个或更多个部分序列，和(ii)任选地，独立地选自脯氨酸、丙氨酸和丝氨酸的一个、两个或三个另外的氨基酸残基组成。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的方法，其中(P/A)由(i)序列ASPA-APAP-ASPA-APAP-SAPA；(ii)序列AAPA-APAP-AAPA-APAP-AAPA；(iii)序列APSA-APSA-APSA-APSA-APSA；(iv)双倍的任何前述序列；或(v)前述序列中的两个的组合组成。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中RN选自焦谷氨酰基(Pga)、高焦谷氨酰基、甲酰基、乙酰基、羟基乙酰基、甲氧基乙酰基、乙氧基乙酰基、丙氧基乙酰基、丙酰基、2-羟基丙酰基、3-羟基丙酰基、2-甲氧基丙酰基、3-甲氧基丙酰基、2-乙氧基丙酰基、3-乙氧基丙酰基、丁酰基、2-羟基丁酰基、3-羟基丁酰基、4-羟基丁酰基、2-甲氧基丁酰基、3-甲氧基丁酰基、4-甲氧基丁酰基、甘氨酸甜菜碱基、邻氨基苯甲酰基、-NH-(C1-6烷基)、-N,N(C1-8烷基)2、N,N,N-三(C1-6-烷基)3、N,N-四亚甲基和N,N-环戊烷。
9.根据权利要求2至9中任一项所述的方法，其中RC是H2N-(C1-12烃基)-COOH，其中优选RC选自H2N-(CH2)1-10-COOH、H2N-苯基-COOH和H2N-环己基-COOH，其中更优选RC选自H2N-CH2-COOH(Gly)、H2N-(CH2)2-COOH(β-Ala)、H2N-(CH2)3-COOH、H2N-(CH2)4-COOH、H2N-(CH2)5-COOH、H2N-(CH2)6-COOH、H2N-(CH2)7-COOH、H2N-(CH2)8-COOH、对氨基苯甲酸和4-氨基环己烷羧酸，并且其中甚至更优选RC是H2N-(CH2)5-COOH。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述抗原中包含的P/A肽采用随机卷曲构象，和/或其中所述抗原中包含的P/A肽没有带电残基。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述免疫佐剂选自钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)，优选其中所述免疫佐剂是钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)。
12.一种如权利要求1至11中任一项所定义的抗原。
13.权利要求12的抗原的非治疗用途，用于产生针对内在无序肽/蛋白质和/或内在无序肽/蛋白质结构域的抗原结合分子、优选抗体或其抗原结合片段，其中所述用途包括非人类哺乳动物的免疫接种。
14.根据权利要求1到11中任一项所述的方法或根据权利要求13所述的非治疗用途，其中所述内在无序肽/蛋白质和/或内在无序肽/蛋白质结构域是富含Pro/Ala的序列，
优选地，其中所述富含Pro/Ala的序列是由至少20个形成随机卷曲构象的氨基酸残基组成的氨基酸序列，并且由此形成所述随机卷曲构象的所述氨基酸残基选自Pro(P)、Ala(A)和Ser(S)，优选选自Pro(P)和Ala(A)。
15.根据权利要求13所述的方法或非治疗用途，其中所述富含Pro/Ala的序列包含以下结构的至少一个表位
(P/S)A(A/S)P；和/或
PA(A/S)P；
优选地，其中所述表位包含选自PAAP、PASP、PAPASP、PAPAAP、PASPAAP和APSA的表位延伸片段。
16.一种针对内在无序肽/蛋白质和/或内在无序肽/蛋白质结构域的抗原结合分子、优选抗体或其抗原结合片段，其可通过根据权利要求1至11、14或15中任一项所述的方法获得。
17.根据权利要求16所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子选自：
a)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：35[抗PA(S)MAb 1.1]中所定义的CDR-H1，
SEQ ID NO：36[抗PA(S)MAb 1.1]中所定义的CDR-H2，和
SEQ ID NO：37[抗PA(S)MAb 1.1]中所定义的CDR-H3；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：38[抗PA(S)MAb 1.1]中所定义的CDR-L1，
SEQ ID NO：39[抗PA(S)MAb 1.1]中所定义的CDR-L2，和
SEQ ID NO：40[抗PA(S)MAb 1.1]中所定义的CDR-L3；或
是与包含(a)中任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段；b)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：41[抗PA(S)MAb 1.2]中所定义的CDR-H1，
SEQ ID NO：42[抗PA(S)MAb 1.2]中所定义的CDR-H2，和
SEQ ID NO：43[抗PA(S)MAb 1.2]中所定义的CDR-H3；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：44[抗PA(S)MAb 1.2]中所定义的CDR-L1，
SEQ ID NO：45[抗PA(S)MAb 1.2]中所定义的CDR-L2，和
SEQ ID NO：46[抗PA(S)MAb 1.2]中所定义的CDR-L3；或
是与包含(b)的任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段；c)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：47[抗PA(S)MAb 2.1]中所定义的CDR-H1，
SEQ ID NO：48[抗PA(S)MAb 2.1]中所定义的CDR-H2，和
SEQ ID NO：49[抗PA(S)MAb 2.1]中所定义的CDR-H3；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：50[抗PA(S)MAb 2.1]中所定义的CDR-L1，
SEQ ID NO：51[抗PA(S)MAb 2.1]中所定义的CDR-L2，和
SEQ ID NO：52[抗PA(S)MAb 2.1]中所定义的CDR-L3；或
是与包含(c)中任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段；d)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：53[抗PA(S)MAb 2.2]中所定义的CDR-H1，
SEQ ID NO：54[抗PA(S)MAb 2.2]中所定义的CDR-H2，和
SEQ ID NO：55[抗PA(S)MAb 2.2]中所定义的CDR-H3；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：56[抗PA(S)MAb 2.2]中所定义的CDR-L1，
SEQ ID NO：57[抗PA(S)MAb 2.2]中所定义的CDR-L2，和
SEQ ID NO：58[抗PA(S)MAb 2.2]中所定义的CDR-L3；或
是与包含(d)中任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段；
e)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：59[抗PA(S)MAb 3.1]中所定义的CDR-H1，
SEQ ID NO：60[抗PA(S)MAb 3.1]中所定义的CDR-H2，和
包含氨基酸序列Trp-Gly-Arg[抗PA(S)MAb 3.1]或由其组成的CDR-H3；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：62[抗PA(S)MAb 3.1]中所定义的CDR1-L，
SEQ ID NO：63[抗PA(S)MAb 3.1]中所定义的CDR2-L，和
SEQ ID NO：64[抗PA(S)MAb 3.1]中所定义的CDR3-L；或
是与包含(e)中任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段；和
f)抗体或其抗原结合片段，其包含
可变重(VH)链，其包含
SEQ ID NO：65[抗PA(S)MAb 3.2]中所定义的CDR-H1，
SEQ ID NO：66[抗PA(S)MAb 3.2]中所定义的CDR-H2，和
SEQ ID NO：67[抗PA(S)MAb 3.2]中所定义的CDR-H3；和/或
可变轻(VL)链，其包含
SEQ ID NO：68[抗PA(S)MAb 3.2]中所定义的CDR-L1，
SEQ ID NO：69[抗PA(S)MAb 3.2]中所定义的CDR-L2，和
SEQ ID NO：70[抗PA(S)MAb 3.2]中所定义的CDR-L3；或
是与包含(f)中任何一个或多个CDR的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段。
18.根据权利要求16或17所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是抗体或其抗原结合片段，其：
a)包含可变重(VH)链序列，所述可变重链序列包含SEQ ID NO：11[抗PA(S)MAb1.1]、SEQ ID NO：13[抗PA(S)MAb 1.2]、SEQ ID NO：15[抗PA(S)MAb 2.1]、SEQ ID NO：17[抗PA(S)MAb 2.2]、SEQ ID NO：19[抗PA(S)MAb 3.1]或SEQ ID NO：21[抗PA(S)MAb3.2]的氨基酸序列，
或与SEQ ID NO：11、13、15、17、19或21具有85％、优选87％、更优选至少90％序列同一性的序列；和/或
包含可变轻(VL)链序列，所述可变轻链序列包含SEQ ID NO：12[抗PA(S)MAb 1.1]、SEQID NO：14[抗PA(S)MAb 1.2]、SEQ ID NO：16[抗PA(S)MAb 2.1]、SEQ ID NO：18[抗PA(S)MAb2.2]、SEQ ID NO：20[抗PA(S)MAb 3.1]或SEQ ID NO：22[抗PA(S)MAb3.2]的氨基酸序列，
或与SEQ ID NO：12、14、16、18、20或22具有85％、优选87％、更优选至少90％序列同一性的序列；或
b)是与(a)的抗体相同表位结合的抗体或其抗原结合片段。
19.根据权利要求17至18中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子是选自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段或scFv片段的抗原结合片段。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的抗原结合分子，其中所述抗原结合分子与报告分子和/或标记缀合或融合。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的抗原结合分子，其中在基于基质的蛋白质/肽纯化或固定中采用所述抗原结合分子。
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