CN117683866A - 检测细胞中dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请属于分子生物学领域，具体涉及一种检测细胞中DNA相关无序蛋白全基因组的方法。包括收集待测细胞，裂解取细胞核，加入带文库接头的Tn5转座酶，得第一混合物，富集所述第一混合物，洗脱并纯化，得第二混合物，扩增所述第二混合物后进行建库，测序分析，获取细胞中DNA相关无序蛋白质全基因组。采用本申请的方法能够实现建库效率高，可实现少量细胞中的信息捕获，实验流程简化，有效缩短了实验时间，以及数据重复性以及信息捕获效率更高的技术效果。
Description
技术领域
本申请属于分子生物学领域，具体涉及一种检测细胞中DNA的方法。
背景技术
氨基酸的序列决定了蛋白三维结构，而三维结构决定蛋白质的功能。21世纪以来，研究人员发现在天然状态下没有稳定三维结构的蛋白质依然发挥重要的生物学功能，这得益于这类蛋白拥有一段无法折叠成稳定的结构的区域，被称为固有无序区域（intrinsically disordered regions，IDRs）。
IDRs的存在使得蛋白更容易形成液滴状，诱发相变生成和调控发生。IDRs参与到信号传导、转录、RNA加工和细胞周期调控等多个重要生物学过程中，近期研究发现，含有IDRs的蛋白质参与下游基因表达调控。例如，转录因子在增强子区域通过其IDRs区域介导凝析物的形成，驱动相分离以实现下游关键基因表达。报道显示，79%的癌症相关蛋白被证实具有IDRs，但目前对针对这类蛋白质在全基因组基因调控中发挥的协调作用知之甚少，研究这类含有IDRs的蛋白质与DNA在染色质环境下的相互作用可以进一步了解基因表达及其调控模式，也可为下游相关癌症靶标药物的研发提供新的机遇。
近期发表于《自然—生物技术》杂志的DNA相关无序蛋白质全基因组测序技术（disordered protein precipitation followed by DNA sequencing，DisP-seq）是一种不依赖抗体的、通过生物素化异恶唑（biotinylated isoxazole，b-isox）沉淀和下一代测序，研究DNA-蛋白IDRs的全基因组图的一种方法。该方法利用小分子化合物b-isox在低温条件下可与含有IDRs蛋白质形成微晶体沉淀的特性，结合二代测序，测定能与这些含有IDRs的蛋白质结合的相关DNA片段的全基因组图谱，研究它们在基因调控程序中的作用。
然而，现有的DisP-seq技术主要存在如下问题：
1、起始细胞量高，不适用于少量细胞实验
利用适当的酶切条件获得片段大小合适的DNA-蛋白复合物是DisP-seq实验成功的前提，然而目前DisP-seq中使用的微球菌核酸酶micrococal nuclease（MNase），对细胞数量（百万级以上）有很高的要求。目前的DisP-seq技术的起始量细胞为1000万，即单个样品需要至少千万级别的起始数目才可保证实验的可重复性和可比性，无法满足针对少量细胞群体的生物学问题，限制了其在一些稀有和珍贵的样本中的应用。
2、实验流程繁琐，所需时间长
目前的DisP-seq技术经酶切等后续操作后，需进行繁琐且耗时的传统DNA片段化、末端修复以及添加测序引物等一系列建库操作，通常由MNase介导的高通量测序技术往往需要2-3天的实验时间。DisP-seq技术从样品制备到获得可供测序的样品，需历经细胞核提取（0.5h）-酶切（0.5h）-漂洗（0.5h）-DNA-IDR蛋白复合物富集（1h）-漂洗（0.5h）-DNA-IDR蛋白复合物洗脱（1h）-解交联（4h）-纯化（0.5h）-DNA建库（2h）-PCR扩增（1h）-纯化（0.5h）-库检（1h）等长达12个小时以上的操作步骤，复杂的实验过程增加了样品制备的时间，增大了误差的概率。
3、文库制备具有偏好性，易造成关键信息丢失
研究指出，基因组的某些区域比其他区域对MNase消化更敏感，目前DisP-seq技术中使用的MNase更偏好切割基因组中碱基AT富集区域，具有明显的序列偏好性；此外，由于MNase与染色质结合后同时具有核酸外切酶及核酸内切酶活性，因此MNase更适用于探查核小体定位的分布，即更倾向获得与核小体定位相关的蛋白结合的DNA信息，核小体之外蛋白结合的DNA信息实验过程中则极容易被丢失，降低了测序数据的准确性。
发明内容
基于此，本申请一实施例提供一种检测细胞中DNA相关无序蛋白全基因组的方法，能够准确并且精确获取细胞中DNA相关无序蛋白全基因组。
一种检测细胞中DNA的方法，包括：
对待测细胞进行裂解，取细胞核；
混合所述细胞核和带测序文库接头的Tn5转座酶进行反应，制备第一混合物；
用无序蛋白富集所述第一混合物中的DNA，收集所述DNA，制备第二混合物；以及，
采用与所述测序文库接头匹配的引物扩增所述第二混合物，构建测序文库，测序分析，实现获取细胞中DNA的检测。
在其中一个实施例中，所述文库接头包括接头1与接头2。
所述接头1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述接头2的序列如SEQ ID NO.2所示。
在其中一个实施例中，所述带文库接头的Tn5转座酶的制备过程包括：
将所述的接头1与接头2分别进行退火反应，得接头1’和接头2’；混合Tn5转座酶、接头1’和接头2’，室温孵育，制备带文库接头的Tn5转座酶。
在其中一个实施例中，Tn5转座酶、接头1’与接头2’的摩尔比为（0.8~1.2）:（0.4~0.6）:（0.4~0.6）。
在其中一个实施例中，所述接头1的退火反应的反应体系包括：48mM~52mM的NaCl、0.8mM~1.2mM的EDTA，180μM~220μM的ME、180μM~220μM的接头1以及8mM~12mM,pH为7.4~7.6的Tris缓冲体系；
所述接头2的退火反应的反应体系包括：48mM~52mM的NaCl、0.8mM~1.2mM的EDTA，180μM~220μM的ME、180μM~220μM的接头2以及8mM~12mM，pH为7.4~7.6的Tris缓冲体系；
所述ME的序列如SEQ ID NO.3所示。
在其中一个实施例中，所述接头1和所述接头2的退火反应的条件各自独立地包括：94℃~96℃，1.5min~2.5min；94ºC~96℃，7s~9s，-0.08℃~-0.12ºC，共690~710个循环。
在其中一个实施例中，富集第一混合物后还包括漂洗的步骤。
在其中一个实施例中，漂洗包括加入洗涤缓冲液。
所述洗涤缓冲液包括18mM~22mM的Tris-HCl，pH为7.3~7.5、145mM~155mM的NaCl、4mM~6mM的MgCl2、0.40v/v%~0.60v/v%的NP-40、9v/v%~11v/v%的glycerol、48×~52×的PI、0.08mM~0.12 mM的PMSF、18mM~22 mM的beta-mercaptoethanol。
在其中一个实施例中，用无序蛋白富集第一混合物包括加入b-isox裂解缓冲液；
所述b-isox裂解缓冲液包括18mM~22mM的Tris-HCl，pH为7.3~7.5、185mM~190mM的NaCl、4mM~6mM的MgCl2、0.60v/v%~0.65v/v%的NP-40、12v/v%~13v/v%的glycerol、48×~52×的PI、0.08mM~0.12 mM的PMSF、24mM~26 mM的beta-mercaptoethanol以及90μM~110μM的b-isox。
在其中一个实施例中洗脱并纯化包括：加入洗脱缓冲液后采用磁珠纯化。
在其中一个实施例中，所述洗脱缓冲液包括8mM~12mM的Tris-HCl,pH为7.3~7.5、145mM~155 mM的NaCl、0.08v/v%~0.12v/v%的SDS和4mM~6 mM的DTT；
在其中一个实施例中，所述磁珠包括AMpureXP磁珠、VAHTSDNA磁珠和SpriSelect磁珠中的一种或多种。
建库效率高，能实现少量细胞中的信息捕获：采用本申请的检测细胞中DNA相关无序蛋白全基因组的方法，在Tn5转座酶酶切时，能够直接将带有测序文库接头的序列链接在产物片段DNA的两端，这一高效的引物连接过程使得含有接头连接在目标DNA片段两端的效率大大提高，在实验流程上能够将实验时间极大缩短，通过简单的酶促反应实现DNA片段化的同时插入测序接头，避免了后续繁琐传统的末端修复以及添加测序引物等步骤，从而在后面扩增过程中捕获了更多的信息量，极大提高了数据重复性。
数据重复性以及信息捕获效率更高：从数据重复度上讲，采用本申请的检测细胞中DNA相关无序蛋白全基因组的方法，在Tn5转座酶在酶切染色质片段时，不会酶切核小体形式的DNA片段，而双端测序可以对DNA片段的两端进行测序，使基因组重复区域的reads比对更加准确。利用本申请所提供的技术方案，能够在更少的细胞量中获得更多的peakcalling数，更特异的信号富集峰以及更低的非特异性背景，具有更高的准确性和精确性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为DisP-seq和tagDisP-seq技术方案的对比；
图2为DisP-seq所涉MNase酶以及本申请tagDisP-seq所涉Tn5酶的在不同细胞中的酶切结果图；
图3为对DisP-seq所涉的MNase酶以及本申请tagDisP-seq的Tn5酶的酶切结果比较；
图4为使用MACS2进行Peak Calling统计；
图5为IGV可视化界面比较本申请所提供的tagDisP-seq和现有DisP-seq的实验结果；
图6为用IGV可视化界面比较人不同样品中的信号值分布；
图7为用IGV可视化界面比较小鼠不同样品中的信号值分布；
其中，DisP-seq为DNA相关无序蛋白质全基因组测序技术；tagDisP-seq为少量细胞DNA相关无序蛋白质全基因组测序技术；sample name为样本名字；Fragment length为片段长度；peaks distance为峰值距离。
具体实施方式
下面结合实施方式和实施例，对本申请作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本申请公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本申请可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本申请内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本申请更为充分地理解，应理解，本申请可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本申请所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
术语
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非与本申请的申请目的和/或技术方案相冲突，否则，本申请涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本申请中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本申请中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本申请为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。
本申请中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数。
本申请利用tagDisP-seq可以将实验时间极大缩短，通过简单的酶促反应实现DNA片段化的同时插入测序接头，避免了后续繁琐传统的末端修复以及添加测序引物等步骤，极大提高了数据重复性。此外，简化的轻交联步骤也大大缩短了实验时间，减少了实验误差的概率。本申请的方法操作简单、与时俱进，能够适用于包括人、小鼠原代细胞等多种细胞系。目前市场上未有DisP-seq建库相关试剂盒，本申请能开发成适用于与现阶段流行的Hisq 3000和HiSeq X Ten等几乎所有二代测序仪的一种细胞易得、操作快捷省事、商业前景广阔的一种检测细胞中DNA相关无序蛋白质全基因组的试剂盒。
tagDisP-seq技术步骤中的Tn5转座酶在酶切染色质片段时，不会酶切核小体形式的DNA片段，而双端测序可以对DNA片段的两端进行测序，使基因组重复区域的reads比对更加准确。因而与现有MNase酶介导的DisP-seq技术相比，具有更高的数据重复性。与此同时，与现有的DisP-seq技术处理大量细胞获得的信号相比，利用本申请所提供的技术方案，可以在更少的细胞量中获得更多的peak calling数，更特异的信号富集峰以及更低的非特异性背景。因此，tagDisP-seq的技术方案具有更高的准确性和精确性。
本申请的具体术语如表1所示
表1
本申请一方面提供一种检测细胞中DNA相关无序蛋白全基因组的方法，对待测细胞进行裂解，取细胞核；混合所述细胞核和带测序文库接头的Tn5转座酶进行反应，制备第一混合物；用无序蛋白富集所述第一混合物中的DNA，收集所述DNA，制备第二混合物；以及采用与所述测序文库接头匹配的引物扩增所述第二混合物，构建测序文库，测序分析，实现获取细胞中DNA的检测。在一个具体的示例中，文库接头包括接头1与接头2。
接头为一段已知的短核苷酸序列，用于链接未知的目标测序片段。
接头1的序列如SEQ ID NO.1所示，接头2的序列如SEQ ID NO.2所示。
SEQ ID NO.1: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
SEQ ID NO.2: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'
在一个具体的示例中，带文库接头的Tn5转座酶的制备过程包括：
将接头1与接头2分别进行退火反应，得接头1’和接头2’，混合Tn5转座酶、接头1’和接头2’，室温孵育，制备带文库接头的Tn5转座酶。
Tn5转座酶可以仅识别OE序列并将其随机插入DNA中，完成体外的转座。根据这一原理，将测序的P5、P7端部分接头序列（接头1/2）加入OE序列中，Tnp识别含有OE序列的接头1和接头2序列后便可形成Tn5转座复合体。该复合体识别受体DNA的靶序列（Target site），切断受体DNA，并插入携带的供体DNA，形成一端带有P5部分接头1，一端带有P7部分接头2的DNA，之后通过PCR加上Barcode以及接头其余部分，形成含P5端与P7端完整接头的DNA文库。
可选地，Tn5转座酶、接头1’与接头2’的摩尔比为（0.8~1.2）:（0.4~0.6）:（0.4~0.6）。例如(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2):(0.4、0.5、0.6):(0.4、0.5、0.6)。
进一步可选地，退火反应体系包括：
接头1用的退火反应的反应体系包括：48 mM ~52 mM的NaCl、0.8 mM ~1.2 mM的EDTA，180μM~220μM的ME、180μM~220μM的接头1以及8 mM ~12 mM, pH为7.4~7.6的Tris缓冲体系。
接头2用的退火反应的反应体系包括：48 mM ~52 mM的NaCl、0.8 mM ~1.2 mM的EDTA，180μM~220μM的ME、180μM~220μM的接头2以及8 mM ~12 mM, pH为7.4~7.6的Tris缓冲体系。
其中，ME的序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.3:5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'。
在一个具体的示例中，退火反应的条件包括：94℃~96℃，1.5min~2.5min；94ºC~96℃，7s~9s，-0.08℃~-0.12ºC，共690~710个循环。
可选地，富集第一混合物后还包括漂洗的步骤。
进一步可选地，漂洗包括加入洗涤缓冲液。
洗涤缓冲液包括18mM~22mM的Tris-HCl，pH为7.3~7.5、145mM~155mM的NaCl、4mM~6mM的MgCl2、0.40%~0.60%的NP-40、9%~11%的glycerol、48×~52×的PI、0.08mM~0.12 mM的PMSF、18mM~22 mM的beta-mercaptoethanol。
其中，富集第一混合物包括加入b-isox裂解缓冲液。
b-isox裂解缓冲液包括18mM~22mM的Tris-HCl，pH为7.3~7.5、185mM~190mM的NaCl、4mM~6mM的MgCl2、0.60%~0.65%的NP-40、12%~13%的glycerol、48×~52×的PI、0.08mM~0.12 mM的PMSF、24mM~26 mM的beta-mercaptoethanol以及90μM~110μM的b-isox。
在一个具体的示例中，收集DNA前包括洗脱并纯化的步骤，洗脱并纯化包括：加入洗脱缓冲液后采用磁珠纯化。
可选地，洗脱缓冲液包括8mM~12mM的Tris-HCl，pH为7.3~7.5、145mM~155 mM的NaCl、0.08%~0.12%的SDS和4mM~6 mM的DTT。
可选地，磁珠包括但不限于AMpureXP磁珠、VAHTS DNA磁珠和SpriSelect磁珠中的一种或多种。
下面将结合实施例对本申请的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本申请中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
实施例1
tagDisP-seq实验流程
一、前期准备：构建带二代测序文库接头的Tn5转座酶
1、分别制备
接头1（5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3'）和
接头2（5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3'）的退火反应体系（10 mMTris，pH 7.5，50 mM NaCl，1mM EDTA，200μM ME，200μM接头1或接头2）。
ME序列：5'-[phos]CTGTCTCTTATACACATCT-3'。
2、上述退火反应体系分别进行退火反应：95℃，2min；95℃，8s，-0.1℃per cycle（700个循环），4℃保存。
3、将Tn5转座酶、接头1和接头2按摩尔比1:0.5:0.5混合，吹打混匀，室温孵育1小时。
4、-20℃保存。
二、细胞核提取（0.5h）
1、分别培养原代小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblasts，MEFs）和人原代脐带间充质干细胞（Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，UC-MSCs），并在细胞汇合率达到80%左右时收集细胞。
2、使用1×PBS将细胞沉淀重悬细胞，500×g，4℃离心5 min，弃上清。
3、血球计数板计数，选取1万个的单细胞悬液用于实验。
4、用50μL预冷的细胞核裂解液（10mM Tris-HCl,pH 7.4,10 mM NaCl,3 mMMgCl2,0.1%Igepal CA-630）重悬细胞，冰上放置10min充分裂解。
5、4℃，500×g离心5min，收集细胞核。
6、弃上清，在下一步实验开始前置于冰上。
三、Tn5转座酶酶切（0.5h）
1、在细胞核中加入49μL的酶切缓冲液（10mM HEPES pH7.2，100mM NaCl，10mMMgCl2）以及上述所构建的带二代测序文库接头的Tn5转座酶1μL，上下吹吸50次充分混匀，37℃，孵育30 min。
2、在上述反应体系中立即加入2μL 0.5M EDTA，55℃孵育5min终止酶切。
四、DNA-IDR蛋白复合物富集与漂洗（2h）
1、在酶切后的细胞中加入200μL b-isox裂解缓冲液（20mM Tris-HCl, pH 7.4，187.5 mM NaCl，5 mM MgCl2，0.625% NP-40，12.5% glycerol，50×PI，0.1 mM PMSF，25 mMbeta-mercaptoethanol）和100μM b-isox，4℃，旋转孵育1.5h。
2、4℃，18400×g，离心15 min，弃上清。
3、加入200 μL洗涤缓冲液（20mM Tris-HCl，pH 7.4、150 mM NaCl、 5 mM MgCl2、0.5%NP-40、10% glycerol、50×PI、0.1 mM PMSF、20 mM beta-mercaptoethanol）中洗涤沉淀1次。
4、4℃，18400×g，离心15 min，弃上清。
五、DNA洗脱与纯化（1.5h）
1、用100 μL洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl, pH 7.4，150 mM NaCl，0.1 % SDS，5mM DTT）重悬DNA-IDR蛋白复合物，65℃，600 rpm振荡洗脱1h。
2、加入5μL蛋白酶K，65℃，600 rpm振荡孵育10 min。
3、加入2倍体积的AMpure XP磁珠，室温孵育5 min。
4、将反应管置于磁力架上2min，弃上清。
5、加入200μL新鲜配制的80%乙醇，添加时保证样品管始终在磁力架上，孵育30s后移除上清。
6、开盖干燥3min，加入26μL ddH2O，混合均匀后静置5min。
7、将反应管置于磁力架上2min，弃磁珠，获得纯化后的DNA产物。
六、PCR扩增与产物纯化
1、制备总体积为50μL的PCR混合物（Vazyme TD501：5×TAB，10×PPM，50×TAE；Vazyme TD202：10×P5 Primer，10×P7 Primer；24μL纯化后的DNA产物）。
2、按如下程序设置PCR。
72℃延伸：3 min; 98℃预变性30s；14个循环（98℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s）；72℃延伸5 min，4℃保存PCR产物。
3、在PCR产物中加入100μL的AMpure XP磁珠，室温孵育5 min。
4、将反应管置于磁力架上2min，弃上清。
5、加入200μL新鲜配制的80%乙醇，添加时保证样品管始终在磁力架上，孵育30s后移除上清。
6、开盖干燥 3min，加入15μL ddH2O，混合均匀后静置5min。
7、将反应管置于磁力架上2min，弃磁珠，获得测序文库，送样库检测序。
七、结果验证
1、本申请同时在MEFs和UC-MSCs两种不同种属的原代细胞系中，分别进行DisP-seq以及tagDisP-seq技术。由于现有DisP-seq技术起始量细胞的限制，DisP-seq的起始细胞量为500万个细胞，而本申请所提供的tagDisP-seq的起始细胞量为1万个细胞。两个技术方案的具体对比情况如图1所示。
与DisP-seq技术相比，tagDisP-seq起始细胞量从1000万个细胞减少到大约1万个细胞，样本量至少减少了10000倍，大大节约了收集材料的时间，大大降低了细胞培养的成本及耗材成本，在保证群体细胞特征的前提下也大大降低了实验误差，这些优势在针对细胞样品极其珍贵的实验中显得尤为重要。
2、为了更好的观测不同酶酶切染色质片段的效果，分别根据对DisP-seq所涉MNase酶以及本申请tagDisP-seq所涉Tn5酶的酶切结果进行了DNA电泳跑胶。结果发现无论是在MEFs细胞中还是UC-MSCs细胞中，MNase酶的酶切片段均在100bp以下，而Tn5酶的主酶切片段在180bp左右，显示了良好的酶切效果和反应时间的合理性（具体如图2所示）。
3、获得原始测序下机的 Raw Reads 后需进行序列的质量评估以及序列的过滤，得到可以用于后续分析的高质量Clean Reads。本申请采用Trimmomatic 软件做数据的过滤，主要参数默认参考值。
其中，评估结果中用Q20、Q30 等参数表示碱基质量情况，Q20表示碱基的测序正确率为99%，Q30表示碱基的测序正确率为99.9%。可以发现四个样品中Q20和Q30都在85%以上，并且片段GC含量0.4到0.6之间（如图3中的A所示），说明处理后的数据质量优良。文库的上机测序非常成功。酶切片段的长度分布可以反映实验中酶用量是否合适，通过对测序数据的片段分布的分析，发现无论是DisP-seq还是tagDisP-seq，均表现出2个以上的酶切片段分布峰，而不是单一的只呈现一个峰（如图3中的B所示），证明实验中MNase以及Tn5酶量是合适的。
4、使用MACS2进行Peak Calling，来分析统计学方法上，不同样品参考基因组上比对上的 Reads 显著富集的区域（称为Peak）。MACS2的筛选阈值为 qvalue < 0.05。使用参数为macs2 callpeak-nomodel-f BAMPE-keep-dup1-q 0.05-B–SPMR。结果发现，在DisP-seq的起始量是500万个细胞的前提下，tagDisP-seq技术使用的1万个细胞无论是在MEFs细胞中还是UC-MSCs细胞中，Peak Calling的数目更多（如图4中的A所示）。
此外，以MSCs细胞为例，通过比对到基因组上的Reads在Peak上的分布情况，发现与DisP-seq相比，tagDisP-seq数据质量更高，富集位点附近的信号更集中（如图4中的B所示）。
5、IGV可视化界面比较本申请所提供的tagDisP-seq和现有DisP-seq的实验结果如图5所示。结果发现，在IGV软件的相同阈值中，比较某些基因位点处（例如GPC1、ANKMY1、GPR35等）两种技术捕获的信号值分布，可见tagDisP-seq的信号值更为显著而特异。用IGV可视化界面比较人及小鼠两个不同样品中的信号值分布，结果如图6和图7所示，可见，不论在人还是小鼠样品中，tagDisP-seq的信号分布比DisP-seq更具有特异性，性噪比较更高。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，便于具体和详细地理解本申请的技术方案，但并不能因此而理解为对申请专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本申请提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本申请所附权利要求的保护范围内。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书和附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种检测细胞中DNA的方法，其特征在于，包括：
对待测细胞进行裂解，取细胞核；
混合所述细胞核和带测序文库接头的Tn5转座酶进行反应，制备第一混合物；
用无序蛋白富集所述第一混合物中的DNA，收集所述DNA，制备第二混合物；以及，
采用与所述测序文库接头匹配的引物扩增所述第二混合物，构建测序文库，测序分析，实现获取细胞中DNA的检测。
2.根据权利要求1所述的检测细胞中DNA的方法，其特征在于，所述文库接头包括接头1与接头2；
所述接头1的序列如SEQ ID NO.1所示，所述接头2的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的检测细胞中DNA的方法，其特征在于，所述带文库接头的Tn5转座酶的制备过程包括：
将所述的接头1与接头2分别进行退火反应，得接头1’和接头2’；
混合Tn5转座酶、接头1’和接头2’，室温孵育，制备带文库接头的Tn5转座酶。
4.根据权利要求3所述的检测细胞中DNA的方法，其特征在于，Tn5转座酶、接头1’与接头2’的摩尔比为（0.8~1.2）:（0.4~0.6）:（0.4~0.6）。
5.根据权利要求3所述的检测细胞中DNA的方法，其特征在于，
所述接头1的退火反应的反应体系包括：48 mM ~52 mM的NaCl、0.8 mM ~1.2 mM的EDTA，180μM~220μM的ME、180μM~220μM的接头1以及8 mM ~12 mM, pH为7.4~7.6的Tris缓冲体系；
所述接头2的退火反应的反应体系包括：48 mM ~52 mM的NaCl、0.8 mM ~1.2 mM的EDTA，180μM~220μM的ME、180μM~220μM的接头2以及8 mM ~12 mM, pH为7.4~7.6的Tris缓冲体系；
所述ME的序列如SEQ ID NO.3所示。
6.根据权利要求3所述的检测细胞中DNA的方法，其特征在于，所述接头1和所述接头2的退火反应的条件各自独立地包括：94℃~96℃，1.5min~2.5min；94ºC~96℃，7s~9s，-0.08℃~-0.12ºC，共690~710个循环。
7.根据权利要求1~6任一项所述的检测细胞中DNA的方法，其特征在于，用无序蛋白富集第一混合物后还包括漂洗的步骤。
8.根据权利要求7所述的检测细胞中DNA的方法，其特征在于，漂洗包括加入洗涤缓冲液；
所述洗涤缓冲液包括18mM~22mM的Tris-HCl，pH为7.3~7.5、145mM~155mM的NaCl、4 mM~6mM的MgCl2、0.40v/v%~0.60 v/v %的NP-40、9 v/v %~11 v/v %的glycerol、48×~52×的PI、0.08 mM ~0.12 mM的PMSF、18mM ~22 mM的beta-mercaptoethanol。
9.根据权利要求1~6和8任一项所述的检测细胞中DNA的方法，其特征在于，用无序蛋白富集第一混合物包括加入b-isox裂解缓冲液；
所述b-isox裂解缓冲液包括18mM~22mM 的Tris-HCl，pH为7.3~7.5、185 mM~190mM的NaCl、4 mM~6mM的MgCl2、0.60v/v%~0.65v/v%的NP-40、12v/v%~13v/v%的glycerol、48×~52×的PI、0.08 mM ~0.12 mM的PMSF、24 mM ~26 mM的beta-mercaptoethanol以及90μM~110μM的b-isox。
10.根据权利要求1~6和8任一项所述的检测细胞中DNA的方法，其特征在于，收集DNA前包括洗脱并纯化的步骤；
可选地，洗脱并纯化包括加入洗脱缓冲液后采用磁珠纯化；
可选地，所述洗脱缓冲液包括8 mM ~12 mM的Tris-HCl, pH为7.3~7.5、145mM ~155 mM的NaCl、0.08 v/v %~0.12 v/v %的SDS和4mM~6 mM的DTT；
可选地，所述磁珠包括AMpure XP磁珠、VAHTS DNA磁珠和SpriSelect磁珠中的一种或多种。
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Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130029879A1 (en) * | 2011-07-29 | 2013-01-31 | Ginkgo Bioworks | Methods and Systems for Cell State Quantification |
| US20170355977A1 (en) * | 2016-06-09 | 2017-12-14 | The Trustees Of Princeton University | Optogenetic tool for rapid and reversible clustering of proteins |
| CN109897885A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-06-18 | 嘉兴菲沙基因信息有限公司 | 一种适用于细胞系和动物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法 |
| WO2019152108A1 (en) * | 2018-02-05 | 2019-08-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems and methods for multiplexed measurements in single and ensemble cells |
| CN113444770A (zh) * | 2020-03-27 | 2021-09-28 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用 |
| CN113481607A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-10-08 | 苏州京脉生物科技有限公司 | 一种精准定量的CUT＆Tag文库制备方法及试剂盒 |
| CN114350693A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-15 | 苏州译酶生物科技有限公司 | 一种Tn5转座酶及其制备方法 |
| CN114836838A (zh) * | 2021-02-01 | 2022-08-02 | 南方医科大学 | 一种中通量单细胞拷贝数文库构建的方法及其应用 |
| WO2023283631A2 (en) * | 2021-07-08 | 2023-01-12 | The Broad Institute, Inc. | Methods for differentiating and screening stem cells |
| CN115851876A (zh) * | 2022-07-21 | 2023-03-28 | 浙江大学绍兴研究院 | 一种同时获取全基因组转录和蛋白-dna结合信息的测序方法 |
| US20230365637A1 (en) * | 2020-09-28 | 2023-11-16 | The Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Identification of pax3-foxo1 binding genomic regions |
| CN117120476A (zh) * | 2020-12-22 | 2023-11-24 | Xl-普洛坦公司 | 对结构无序序列具有特异性的抗体 |
-
2024
- 2024-01-22 CN CN202410088610.5A patent/CN117683866B/zh active Active
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130029879A1 (en) * | 2011-07-29 | 2013-01-31 | Ginkgo Bioworks | Methods and Systems for Cell State Quantification |
| US20170355977A1 (en) * | 2016-06-09 | 2017-12-14 | The Trustees Of Princeton University | Optogenetic tool for rapid and reversible clustering of proteins |
| WO2019152108A1 (en) * | 2018-02-05 | 2019-08-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems and methods for multiplexed measurements in single and ensemble cells |
| CN109897885A (zh) * | 2019-03-20 | 2019-06-18 | 嘉兴菲沙基因信息有限公司 | 一种适用于细胞系和动物组织ATAC-seq测序技术的文库构建方法 |
| CN113444770A (zh) * | 2020-03-27 | 2021-09-28 | 中国人民解放军陆军军医大学 | 一种单细胞转录组测序文库的构建方法及其应用 |
| US20230365637A1 (en) * | 2020-09-28 | 2023-11-16 | The Research Institute At Nationwide Children's Hospital | Identification of pax3-foxo1 binding genomic regions |
| CN113481607A (zh) * | 2020-11-04 | 2021-10-08 | 苏州京脉生物科技有限公司 | 一种精准定量的CUT＆Tag文库制备方法及试剂盒 |
| CN117120476A (zh) * | 2020-12-22 | 2023-11-24 | Xl-普洛坦公司 | 对结构无序序列具有特异性的抗体 |
| CN114836838A (zh) * | 2021-02-01 | 2022-08-02 | 南方医科大学 | 一种中通量单细胞拷贝数文库构建的方法及其应用 |
| WO2023283631A2 (en) * | 2021-07-08 | 2023-01-12 | The Broad Institute, Inc. | Methods for differentiating and screening stem cells |
| CN114350693A (zh) * | 2021-12-30 | 2022-04-15 | 苏州译酶生物科技有限公司 | 一种Tn5转座酶及其制备方法 |
| CN115851876A (zh) * | 2022-07-21 | 2023-03-28 | 浙江大学绍兴研究院 | 一种同时获取全基因组转录和蛋白-dna结合信息的测序方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| YU-HANG XING，ET AL: "DisP-seq reveals the genome-wide functional organization of DNA-associated disordered proteins", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 42, no. 1, 10 April 2023 (2023-04-10), pages 52 - 64 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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