CN117106948A - 一种黄梁木ssr分子标记引物组合及其应用 - Google Patents
一种黄梁木ssr分子标记引物组合及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种黄梁木SSR分子标记引物组合及其应用。本发明通过对不同地区的黄梁木种质资源样品进行分析，得到了可用于黄梁木种质资源来源(种源)鉴定的SSR分子标记。在此基础上，本发明还提供了一种黄梁木SSR分子标记引物组合，利用所述引物组合不仅可以实现对黄梁木的种源鉴定，亦可将其用于黄梁木遗传多样性分析及遗传连锁图谱的构建等，具有多态性高、重复性好、标记稳定、带型清晰易判读等优点。此外，本发明还提供了一种黄梁木SSR分子标记检测试剂盒，可将其用于黄梁木的种源鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究等方面，有助于黄梁木的分子辅助育种。
Description
技术领域
本发明属于分子标记技术领域。更具体地，涉及一种黄梁木SSR分子标记引物组合及其应用。
背景技术
黄梁木(Neolamarckia cadamba)又名团花，是茜草科(Rubiaceae)团花属(Neolamarckia)的落叶大乔木。因其生长快、出材量大、纹理通直、不易变形开裂，可作为家具、建筑装饰用材等的原材料。此外，黄梁木枝叶舒展，挺拔秀丽，也是良好的园林绿化树种。黄梁木在造林、药用、用材、饲料、绿化等方面都具有非常高的经济价值与应用前景。
然而，黄梁木人工林培育中所存在的问题也逐渐暴露出来，包括黄梁木的优质种质资源匮乏、优良亲本筛选效率低、培育目标不明确、人工林种源来源单一及种质混杂等。为了解决上述问题，更好的发展和利用黄梁木产业，需对世界范围的黄梁木野生种质资源进行收集，深入了解黄梁木的生长和遗传特性，对黄梁木野生种质资源进行遗传解析，探究黄梁木的遗传背景和发育机理，为黄梁木的种源鉴定、优质种源筛选和引种培育等方面提供重要依据。
基于脱氧核糖核酸(DNA)多态性的分子标记正逐渐成为分析生物遗传多样性的有利工具。Yiing等人(2014)虽利用简单重复间序列标记(ISSR)以及核基因片段对马来西亚沙捞越州(Sarawak)黄梁木的野生与栽培群体进行了遗传多样性研究，但ISSR揭示遗传差异性的效果不佳，在检测亲缘关系较近的种群遗传多样性时效率也不高，且试验重复性也稍差。因此，需要具有较高多态性的分子标记。简单重复序列(Simple Sequence Repeat，SSR)是一种基于聚合酶链式反应(PCR)的第二代分子标记技术，由1～6个核苷酸基元串联组成，长度一般在200bp左右。通过对目标植物物种进行SSR分子标记开发，可以更好的为物种遗传多样性分析、种源鉴定及构建遗传连锁图谱等方面提供依据，有利于优质种源筛选和引种培育等方面。
目前，SSR分子标记已广泛应用于各种植物类型，但针对黄梁木的SSR分子标记开发还未见报道。由于不同植物的遗传背景不同，对于如何获得可用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析等的SSR分子标记，仍有待解决。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有上述技术的缺陷和不足，提供一种黄梁木SSR分子标记引物组合及其应用。
本发明的第一个目的是提供一种黄梁木SSR分子标记引物组合。
本发明的第二个目的是提供所述SSR分子标记引物组合在黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建中的应用。
本发明的第三个目的是提供SSR分子标记引物组合在制备用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建的产品中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种黄梁木SSR分子标记检测试剂盒。
本发明的第五个目的是提供所述SSR分子标记检测试剂盒在黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建中的应用。
本发明的第六个目的是提供SSR分子标记检测试剂盒在制备用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建的产品中的应用。
本发明的第七个目的是提供一种鉴定黄梁木种源的方法。
本发明的第八个目的是提供一种分析黄梁木遗传多样性的方法。
本发明的第九个目的是提供一种黄梁木遗传连锁图谱的构建方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种黄梁木SSR分子标记引物组合，包括引物对TH02、TH03、TH06、TH11、TH12、TH15、TH16、TH19、TH22、TH23、TH27、TH32、TH33、TH36、TH37、TH42、TH43、TH45、TH54、TH72、TH78、TH81、TH82、TH83和TH84；所述TH02的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～2所示；所述TH03的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.3～4所示；所述TH06的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.5～6所示；所述TH11的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～8所示；所述TH12的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.9～10所示；所述TH15的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11～12所示；所述TH16的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.13～14所示；所述TH19的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.15～16所示；所述TH22的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.17～18所示；所述TH23的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.19～20所示；所述TH27的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.21～22所示；所述TH32的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.23～24所示；所述TH33的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.25～26所示；所述TH36的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.27～28所示；所述TH37的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.29～30所示；所述TH42的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.31～32所示；所述TH43的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.33～34所示；所述TH45的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.35～36所示；所述TH54的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.37～38所示；所述TH72的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.39～40所示；所述TH78的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.41～42所示；所述TH81的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.43～44所示；所述TH82的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.45～46所示；所述TH83的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.47～48所示；所述TH84的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ IDNO.49～50所示。
利用本发明上述SSR分子标记引物组合，可进行黄梁木(Neolamarckia cadamba)种源鉴定、遗传多样性分析和遗传连锁图谱构建。因此，本发明请求保护所述的SSR分子标记引物组合在黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建中的应用。
本发明还请求保护所述的SSR分子标记引物组合在制备用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建的产品中的应用。
本发明还提供了一种黄梁木SSR分子标记检测试剂盒，所述试剂盒中含有本发明所述的SSR分子标记引物组合。
具体地，所述试剂盒中还含有PCR反应所需试剂。
本发明还请求保护所述的SSR分子标记检测试剂盒在黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建中的应用。
本发明还请求保护所述的SSR分子标记检测试剂盒在制备用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建的产品中的应用。
本发明还提供了一种鉴定黄梁木种源的方法，包括以下步骤：
S1.提取黄梁木植株的总DNA；
S2.以步骤S1所得总DNA为模板，以所述的SSR分子标记引物组合进行PCR扩增；
S3.毛细管电泳检测步骤S2的扩增产物，收集数据；
S4.对步骤S3的数据进行处理，对黄梁木群体进行聚类分析。
本发明还提供了一种分析黄梁木遗传多样性的方法，包括以下步骤：
S1.提取黄梁木植株的总DNA；
S2.以步骤S1所得总DNA为模板，以所述的SSR分子标记引物组合进行PCR扩增；
S3.毛细管电泳检测步骤S2的扩增产物，收集数据；
S4.对步骤S3的数据进行处理，计算黄梁木的遗传多样性参数；
S5.对步骤S4所得参数进行黄梁木遗传多样性分析。
本发明还提供了一种黄梁木遗传连锁图谱的构建方法，包括以下步骤：
S1.提取黄梁木植株的总DNA；
S2.以步骤S1所得总DNA为模板，以所述的SSR分子标记引物组合进行PCR扩增；
S3.毛细管电泳检测步骤S2的扩增产物，收集数据；
S4.对步骤S3的数据进行处理，构建出黄梁木的SSR指纹图谱。
具体地，PCR扩增所用反应体系为：DNA 1.5μL，Easy Taq 0.4μL，正向引物和反向引物各0.8μL，dNTP 1.5μL，ddH2O补足20μL；所用反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，53或58℃退火35s，72℃延伸35s，共35个循环；72℃完全变性7min。
具体地，所述正向和反向引物的浓度为10μmol。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种黄梁木SSR分子标记引物组合，利用所述引物组合不仅可以实现对黄梁木的种源鉴定，亦可将其用于黄梁木遗传多样性分析及遗传连锁图谱的构建等，具有多态性高、重复性好、标记稳定、带型清晰易判读等优点。通过种源鉴定即可筛选出优异的种质资源，有利于黄梁木的优质种源筛选、引种和人工培育。此外，本发明还提供了一种黄梁木SSR分子标记检测试剂盒，可将其用于黄梁木的种源鉴定、DNA指纹图谱构建及遗传多样性评价与系统发育研究等方面。本发明为黄梁木的分子辅助育种提供了新的工具，有助于黄梁木的分子辅助育种，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为利用本发明所述的SSR分子标记引物组合获得的20个黄梁木个体的遗传聚类分析结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1黄梁木SSR位点鉴别及引物设计
1、黄梁木样品的DNA提取与质量检测
本发明采集并选取了不同地区的黄梁木种质资源样品，共20份，同时采集了3份大叶黄梁木(Neolamarckia macrophylla)作为外来群，具体采集信息见表1。用多酚类植物组织gDNA提取试剂盒(离心柱型)对选取的样品进行DNA提取，将提取得到的DNA原液样品用纳米滴分光光度计检测浓度，再用1％琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统对DNA样品进行质量检测，废除检测不合格的样品，保留检测良好的样品保存于-20℃备用。
表1黄梁木样品采集地点信息
注：NM为大叶黄梁木。
2、SSR位点鉴别及引物设计
本发明采用基因组浅层测序方法，对DNA样品进行基因组测序。使用MISA(Microsatellite，http://pgrc.ipk-gater-sleben.de/misa/)进行SSR位点检索，并用软件SPAdes version：3.13.1对二代测序数据进行拼接，利用misa.pl软件对组装结果scaffolds序列进行分析，获得含有短序列重复片段的序列。
针对获得的含有短序列重复片段的序列，本发明设计了96对引物，将96对引物委托生物公司合成，通过PCR扩增及测序检测多态性。
3、SSR多态性扩增及产物检测
分别以来自8个不同居群的黄梁木个体的DNA为模板，通过1％琼脂糖凝胶电泳对96对引物进行初步筛选。经多次实验对比，设计的20μL扩增体系如表2所示。
表2PCR扩增体系
PCR反应程序如下：94℃预变性2min，94℃变性30s，Tm℃(53/58℃)退火35s，72℃延伸35s，72℃完全变性7min，程序共35个循环，PCR终产物于4℃保存，取出后-20℃保存备用。
4、SSR测序
利用初步筛选出的引物对DNA样本进行SSR测序。具体过程如下：定量稀释筛选出的引物并用稀释后的引物进行PCR扩增，将所得PCR产物与甲酰胺按1:7的比例混合后加入点样孔，利用DNA测序仪进行毛细管荧光电泳检测。随后根据位点信息筛选出特异性高，多态性好的SSR引物，共25对，序列信息如表3所示，其中F表示正向引物，R表示方向引物。
表3 25对SSR引物的序列信息
5、黄梁木遗传多样性分析
利用GenAIex软件计算出各对引物相关的遗传多样性参数，包括扩增多态性位点比率(PPL％)、Shannon遗传信息指数(I)、等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)。多态信息含量(PIC)采用Milbourne等(1997)的公式计算。
25对引物的遗传多样性参数如表4所示，由表4可知，25对引物含多态性位点的等位基因数(Na)为5～33个，平均值为18.2；各SSR标记有效等位基因数(Ne)的平均值为8.98756，变化范围为1.876～22.23；Shannon多样性指数(I)均值为2.27528，变化范围为1.137～2.244；观测杂合度(Ho)的均值为0.62516，变化范围为0.246～0.908，期望杂合度(He)的均值为0.83368，变化范围为0.467～0.955；各SSR标记的多态信息含量(PIC)均值为0.8168，变化范围为0.459～0.953。当PIC大于0.5时，说明该位点具有高度多态性，数值介于0.25～0.5之间，属于中度多态性，小于0.25则属于低度多态性；本发明所述的25对引物中有24对引物具有高度多态性，引物TH15的PIC值为0.459，属于中度多态性，表明本发明挑选的25对引物具有较高的多态性。
表4 25对引物的遗传多样性参数
上述结果表明受试的黄梁木样品具有丰富的遗传多样性，所选用的25对SSR分子标记引物的多态性良好，可用于黄梁木的种源鉴定和遗传多样性分析。
实施例2遗传聚类分析验证SSR引物的有效性
为了检验开发的25对多态性SSR引物的有效性，本发明利用所述25对SSR分子标记引物对20个黄梁木个体进行了遗传聚类分析，并选用3个大叶黄梁木个体作为外类群。
遗传聚类分析包括以下步骤：
S1.提取黄梁木植株的总DNA；
S2.以步骤S1所得总DNA为模板，以所述的SSR分子标记引物组合(表3所示)进行PCR扩增；
S3.毛细管电泳检测步骤S2的扩增产物，收集数据；
S4.对步骤S3的数据进行处理，对黄梁木群体进行聚类分析。
PCR扩增所用反应体系和反应条件同实施例1。
具体地，在完成PCR扩增和数据收集后，使用DARwin V6软件(https：//Darwin.cirad.fr/)进行聚类分析，先根据SSR位点数据计算得出相异度矩阵文件，随后根据该文件构建进化树，构树模型选用Hierarchical Clustering，bootstrap值设定为1000。
遗传相似性系数是用来度量不同群体或不同个体之间遗传分化程度的有效指标，其范围在0～1之间，系数数值越小，代表种群间遗传分化程度越高，反之则遗传分化程度越低。利用本发明所述的SSR分子标记引物组合获得的20个黄梁木个体的遗传聚类分析结果如图1所示。由遗传聚类分析结果可知，黄梁木个体间遗传相似性系数在0.02～0.74之间，说明黄梁木居群间存在明显的遗传分化。同时，由遗传聚类分析结果可知，20个供试样品聚成3大类，云南德宏州(YND)、云南景洪市(YNJ)、越南(VN)和尼泊尔(NP)的样品聚成一枝，印尼(IN)、马来西亚金马伦高原(MY)和泰国(TL)的样品聚成一枝，马来西亚半岛沙捞越(ML)的样品单独聚为一枝，来自同一采样点的种质资源聚在一起。上述结果表明所述的25对SSR分子标记引物能够有效地把种源一致的个体聚为一类，能有效区分来源不同的居群，证实了开发的多态性SSR引物有效性，可通过遗传聚类分析进行种源鉴定，表明开发的25对多态性SSR引物有着较高的质量与实用性。
实施例3一种分析黄梁木遗传多样性的方法
由实施例1表5可知，利用本发明所述黄梁木SSR分子标记引物组合可以进行黄梁木的遗传多样性分析。由此本发明提供了一种分析黄梁木遗传多样性的方法，包括以下步骤：
S1.提取黄梁木植株的总DNA；
S2.以步骤S1所得总DNA为模板，以所述的SSR分子标记引物组合进行PCR扩增；
S3.毛细管电泳检测步骤S2的扩增产物，收集数据；
S4.对步骤S3的数据进行处理，计算黄梁木的遗传多样性参数；
S5.对步骤S4所得参数进行黄梁木遗传多样性分析。
PCR扩增所用反应体系和反应条件同实施例1。
实施例4一种黄梁木遗传连锁图谱的构建方法
本发明还提供了一种黄梁木遗传连锁图谱的构建方法，包括以下步骤：
S1.提取黄梁木植株的总DNA；
S2.以步骤S1所得总DNA为模板，以所述的SSR分子标记引物组合进行PCR扩增；
S3.毛细管电泳检测步骤S2的扩增产物，收集数据；
S4.对步骤S3的数据进行处理，构建出黄梁木的SSR指纹图谱。
PCR扩增所用反应体系和反应条件同实施例1。
根据Botstein(1980)提出的理论，指纹分析无法仅用1对引物将某个种质与其它种质区分开，因此需要利用引物组合的方式进行区分。本发明所述DNA指纹图谱表现形式采用闵学阳等(2017)的方法，根据扩增结果将有条带、无条带分别记为“1”和“0”；根据25对核心引物扩增结果的峰图，准确读出条带的大小，经Flexibin(Amos et al.，2007)修正，建立黄梁木资源的DNA指纹图谱。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种黄梁木SSR分子标记引物组合，其特征在于，包括引物对TH02、TH03、TH06、TH11、TH12、TH15、TH16、TH19、TH22、TH23、TH27、TH32、TH33、TH36、TH37、TH42、TH43、TH45、TH54、TH72、TH78、TH81、TH82、TH83和TH84；
TH02的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1～2所示；
TH03的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3～4所示；
TH06的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.5～6所示；
TH11的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7～8所示；
TH12的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.9～10所示；
TH15的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.11～12所示；
TH16的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.13～14所示；
TH19的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.15～16所示；
TH22的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.17～18所示；
TH23的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.19～20所示；
TH27的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.21～22所示；
TH32的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.23～24所示；
TH33的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.25～26所示；
TH36的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.27～28所示；
TH37的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.29～30所示；
TH42的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.31～32所示；
TH43的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.33～34所示；
TH45的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.35～36所示；
TH54的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.37～38所示；
TH72的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.39～40所示；
TH78的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.41～42所示；
TH81的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.43～44所示；
TH82的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.45～46所示；
TH83的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.47～48所示；
TH84的正向引物和反向引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO.49～50所示。
2.权利要求1所述的SSR分子标记引物组合在黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建中的应用。
3.权利要求1所述的SSR分子标记引物组合在制备用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建的产品中的应用。
4.一种黄梁木SSR分子标记检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有权利要求1所述的SSR分子标记引物组合。
5.权利要求4所述的SSR分子标记检测试剂盒在黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建中的应用。
6.权利要求4所述的SSR分子标记检测试剂盒在制备用于黄梁木种源鉴定、遗传多样性分析或遗传连锁图谱构建的产品中的应用。
7.一种鉴定黄梁木种源的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取黄梁木植株的总DNA；
S2.以步骤S1所得总DNA为模板，以权利要求1所述的SSR分子标记引物组合进行PCR扩增；
S3.毛细管电泳检测步骤S2的扩增产物，收集数据；
S4.对步骤S3的数据进行处理，对黄梁木群体进行聚类分析。
8.一种分析黄梁木遗传多样性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取黄梁木植株的总DNA；
S2.以步骤S1所得总DNA为模板，以权利要求1所述的SSR分子标记引物组合进行PCR扩增；
S3.毛细管电泳检测步骤S2的扩增产物，收集数据；
S4.对步骤S3的数据进行处理，计算黄梁木的遗传多样性参数；
S5.对步骤S4所得参数进行黄梁木遗传多样性分析。
9.一种黄梁木遗传连锁图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.提取黄梁木植株的总DNA；
S2.以步骤S1所得总DNA为模板，以权利要求1所述的SSR分子标记引物组合进行PCR扩增；
S3.毛细管电泳检测步骤S2的扩增产物，收集数据；
S4.对步骤S3的数据进行处理，构建出黄梁木的SSR指纹图谱。
10.根据权利要求7～9任一所述方法，其特征在于，PCR扩增所用反应体系为：DNA 1.5μL，Easy Taq 0.4μL，正向引物和反向引物各0.8μL，dNTP 1.5μL，ddH2O补足20μL；所用反应条件为：94℃预变性2min；94℃变性30s，53或58℃退火35s，72℃延伸35s，共35个循环；72℃完全变性7min。
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