CN117106624A - 一株上升岛链霉菌dl138及其在耐盐碱和解磷中的应用 - Google Patents
一株上升岛链霉菌dl138及其在耐盐碱和解磷中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株上升岛链霉菌DL138及其在耐盐碱和解磷中的应用，属于盐碱地改良技术领域。本发明公开的上升岛链霉菌DL138，其保藏编号为CGMCCNo.26849。上升岛链霉菌DL138是高耐盐碱解磷菌，具有高耐盐和高耐碱，并且高效解磷的效果。
Description
技术领域
本发明涉及盐碱地改良技术领域，更具体的说是涉及一株上升岛链霉菌DL138及其在耐盐碱和解磷中的应用。
背景技术
磷是植物正常生长发育所必需的矿质元素，在植物的细胞分裂、生长发育等生命活动以及光合作用和植物养分运输、糖酵解等新陈代谢和代谢调节途径中都具有重要的作用。磷在土壤中溶解度极小，主要以无机磷(包括难溶性磷酸钙、羟磷灰石、磷酸铁等)和有机磷(核酸、磷脂、磷蛋白等)两种形式存在，只有少量的磷能被植物直接吸收利用。在农业生产中，经常追加磷酸二氢钾、磷酸一铵等磷肥，可短时间内增加土壤中可溶性磷含量，供作物直接吸收利用。另外一方面，由于磷元素的不可运动性，导致追加的磷肥大部分通过淋溶、转化为难溶磷酸盐等方式降低利用率，造成损失浪费。然而，解磷菌是一类可以将难溶性磷转化为植物可吸收利用磷的一种促生菌，能显著提高作物整个生长发育期的土壤有效磷含量。因此，筛选具有高效解磷能力的优势菌株具有重要的农业应用价值。
我国各类盐碱土分布广泛，由于土壤障碍限制突出、水热资源约束强、地形条件局限大，生态脆弱，已经成为制约盐碱土农业生产的重要环境因素之一。盐碱土中无机盐含量丰富，有机质缺乏，土壤板结，持续施用无机磷肥导致土壤中累积大量的难溶性磷酸盐，会使土壤进一步退化。另外，土壤高盐度和高pH会降低碱性磷酸酶等多种酶活性，制约土壤中磷素的形态转化和有效性，从而导致盐碱地植被不能充分吸收利用磷肥。盐碱地改良的方法主要包括水利工程改良、化学改良和生物改良。在这些治理盐碱地的各项技术措施中，生物改良被认为是既经济有效又环保的改良途径。通过筛选适应盐碱环境的解磷菌，不仅可以提高盐碱地的磷素含量，促进植物生长；而且可以改善土壤的理化性质，有益于生物修复改良盐碱土，从而拓展具有开发利用潜力的盐碱土地资源，支撑国家粮食产能提升。
目前报道的解磷细菌主要集中在芽孢杆菌属、假单胞菌属、沙雷氏菌属、土壤杆菌属和节杆菌属等。但是报道指出不同菌属、同一菌属不同菌种之间的解磷效能强弱不同，解磷机理存在差异，而且在盐碱地中应用表现效果各异，部分解磷菌仅能够耐受高盐环境，不能耐受高碱环境；部分解磷菌仅能耐受高碱环境，不能耐受高盐环境。基于此，筛选既能耐受高盐又能耐受高碱环境的解磷菌对于开发稳定高效应用于盐碱土壤的解磷菌微生物菌剂具有重要的农业生产价值。
因此，提供一株上升岛链霉菌DL138及其在耐盐碱和解磷中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一株上升岛链霉菌DL138及其在耐盐碱和解磷中的应用，解决了现有技术中微生物难以在高盐度和高碱环境下生存，解磷活力低，不耐盐碱，解磷效能较差，不适用于盐碱地的技术问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株上升岛链霉菌(Streptomyces capoamus)DL138，其保藏编号为CGMCCNo.26849，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年03月17日，分类命名为上升岛链霉菌Streptomyces capoamus。
上升岛链霉菌DL138菌株是从陕西定边盐湖区土壤分离筛选出来的，菌株具有溶磷、耐盐、耐碱，并且在盐碱环境促进植物磷吸收等植物促生特性。经分析菌株形态、16SrDNA序列分析、生理生化测定，该菌株鉴定为上升岛链霉菌(Streptomyces capoamus)，菌株命名为DL138，最适生长温度30℃，最适生长pH为8.0。
进一步，所述的上升岛链霉菌DL138在解磷中的应用。
所述上升岛链霉菌DL138在pH为3.0-12.0和(或)0.03-11.11％NaCl的盐环境下解磷的应用。
进一步，所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱条件下解磷中的应用。
进一步，所述的上升岛链霉菌DL138在耐盐碱胁迫中的应用。
进一步，所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境促进玉米生长中的应用。
进一步，所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境促进玉米生物量增加中的应用。
进一步，所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境促进玉米植物磷吸收中的应用。
进一步，所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境促进玉米光合作用中的应用。
进一步，所述的上升岛链霉菌DL138在促进玉米光合作用中的应用。
进一步，所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境促进玉米抗氧化酶活中的应用。
上升岛链霉菌DL138能耐受8.8％NaCl和pH＝12.0的高盐高碱环境，促进无机磷酸盐增加溶解；本发明菌株在盐碱胁迫环境下，对玉米幼苗磷吸收、光合作用和抗氧化酶活等有不同程度的显著促进作用；进一步地，上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境下，对玉米幼苗的生长具有显著的促进作用；上升岛链霉菌DL138可应用于生产，具有促进植物生长以及缓解盐碱胁迫的作用，对于减少施用磷肥、保护生态环境具有重要意义。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一株上升岛链霉菌DL138及其在耐盐碱和解磷中的应用，上升岛链霉菌DL138是高耐盐碱解磷菌，具有高耐盐和高耐碱，并且高效解磷的效果。上升岛链霉菌DL138可作为菌剂添加到微生物肥料中，应用到盐碱地，将盐碱地中难溶性磷或不溶性磷转化为植物可直接吸收利用的可溶性磷酸盐，增加土壤中有效磷含量，提高植物根际及其周围的可利用磷含量，协调促进植物吸收其他营养元素，有效缓解因过度施肥造成的土壤板结现象，有效提升改善盐碱地理化性质，增加土壤肥力，减少化肥施用，促进农业可持续绿色发展。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明解磷菌DL138的菌落形态图；
图2附图为本发明不同浓度NaCl对解磷菌DL138的解磷能力和生物量OD600的影响；
其中，A：解磷能力；B：生物量OD600；
图3附图为本发明不同pH对解磷菌DL138的解磷能力和生物量OD600的影响；
其中，A：解磷能力；B：生物量OD600；
图4附图为本发明不同盐碱处理下解磷菌DL138对玉米生物量的影响；
其中，A：玉米鲜重；B：玉米干重；
图5附图为本发明不同盐碱处理下DL138对玉米叶片磷含量的影响；
图6附图为本发明不同盐碱处理下解磷菌DL138对玉米光合作用的影响；
其中，A：净光合速率；B：气孔导度；C：蒸腾速率；D：胞间二氧化碳浓度；
图7附图为本发明不同盐碱处理下解磷菌DL138对玉米抗氧化酶活的影响；
其中，A：SOD活性；B：POD活性；C：CAT活性；D：MDA含量；
图4-图7中，+，表示菌株DL138处理；-，表示无菌株处理。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1上升岛链霉菌DL138菌株的分离和鉴定
1)DL138菌株采用划线培养法从陕西定边盐湖边极端盐碱化土壤中分离得到，具体步骤如下：
(1)无机磷固体培养基成分如下：参考NBRIP培养基成分略有修改，该培养基含有(每升)10g葡萄糖、5g Ca3(PO4)2、0.03g FeSO4·7H2O、0.5g(NH4)2SO4、0.3g MgSO4·7H2O、0.3g KCl、0.3gNaCl、0.03g MnSO4和18g琼脂，补蒸馏水至1000ml，并将琼脂培养基的pH调节至7.0-8.0。
(2)分离纯化：称取10g盐碱土溶解在90ml无菌水中，150rpm振荡培养30min后，逐次稀释至10-5。在无机磷固体培养基平板上接种0.2ml稀释液，在28℃恒温培养箱倒置培养7天后，挑选可以产生清晰透明光晕的菌落继续在在无机磷固体培养基平板上重新划线2-3次进一步纯化菌株，直至琼脂平板上生长出单一菌落。
2)采用焦磷酸测序法对DL138菌株进行分类鉴定，具体步骤如下：
(1)细菌基因组总DNA的制备：用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)提取DL138菌株的基因组DNA，作为PCR反应的模板。
(2)基因的PCR扩增：
参照TransFast Taq DNA Polymerase试剂盒说明书的反应体系，以细菌全长通用引物27F和1492R进行PCR扩增反应。
通用引物27F和1492R的引物序列如下：
27F：5’-AGRGTTTGATYNTGGCTCAG-3’；SEQ ID NO.1；
1492R：5’-TASGGHTACCTTGTTASGACTT-3’；SEQ ID NO.2。
反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸1min，共循环30次；72℃延伸10min。
(3)PCR产物纯化、测序和分析
将PCR扩增产物提交给北京擎科有限公司西安分公司进行测序，测定16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.3所示。将测序返回的序列登录美国国立生物技术信息中心网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，在数据库中进行BLAST比对鉴定，结果表明DL138菌株与上升岛链霉菌(Streptomyces capoamus)的16S rRNA基因序列的同源一致性在99.01％，因此分离菌株被鉴定为上升岛链霉菌(Streptomyces capoamus)。
GTCACTTCGAAGCTCCCTCCCCACAAGGGGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCGCGGTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCTCCTGTGAGTCCCCATCACCCCGAAGGGCATGCTGGCAACACAGAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGCGCCTGTCTCCAGACGTTTCCGGTGTATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACCGACGACGTGGAATGTCGCCAACACCTAGTTCCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAATGGCCCAGAGATCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATCTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAATTCCGATCTCCCCTACCACACTCTAGCTAGCCCGTATCGAATGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACACCCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTCTGCAGGTACCGTCACTTTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTTCACCGCCGGAGCTTTCAACCCTCGCAGATGCCCGCGAGAGTGGTATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGAAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCACCGAAGTGGTTCATCGTTTCGACTGCAAGTGTAGCACGCCGAT；SEQ ID NO.3。
3)上升岛链霉菌DL138菌株的形态鉴定特征如下：
DL138菌株属于放线菌门，链霉菌科，链霉菌属，革兰氏染色阳性，无机磷固体培养基平板上菌落呈淡黄色，干燥，不透明，菌落边缘和培养基的连接较松弛，边缘不整齐(图1)。能利用葡萄糖、麦芽糖、木糖、蔗糖、乳糖和半乳糖作为唯一碳源；唯一氮源可利用硫酸铵、磷酸二氢铵、硝酸钠和硝酸钾。菌株能耐受pH＝12，8.8％NaCl的高盐高碱环境，最适生长条件为：pH＝8.0，4.1％NaCl，温度30℃。
实施例2上升岛链霉菌DL138菌株的生理生化特征
(1)淀粉水解试验
含0.2％可溶性淀粉的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基配制：牛肉膏3g/L，氯化钠5g/L，蛋白胨10g/L，2g/L可溶性淀粉，琼脂粉18g/L，调节pH＝7～8，121℃高温高压灭菌20min，在超净工作台内倒平板待用。鲁哥氏碘液：1g碘，2g碘化钾，先用少量去离子水将碘化钾溶解，再加入碘完全溶解，加水稀释至300ml。
将菌株接种于平板培养基，30℃恒温培养箱倒置培养3～5天，形成菌落后，滴加鲁哥氏碘液，均匀铺满平板。片刻之后观察，若培养基呈深蓝色，菌落周围出现无色透明圈，表明菌株可分泌淀粉酶水解淀粉，即为阳性反应；若菌落周围没有透明圈，表明菌株不能水解淀粉，即为阴性反应。
(2)V-P试验
培养基配制：蛋白胨5g/L，葡萄糖5g/L，NaCl 5g/L，调节pH＝7.0～7.2，分装每个试管10ml，121℃灭菌20min。试剂：40％KOH，6％α-萘酚无水乙醇溶液。
在超净工作台内，将菌株接种于上述培养基中，于30℃恒温摇床振荡培养3天，取培养液5ml，向试管中加入300μl 40％KOH溶液，再加300μl 6％α-萘酚溶液，用力振荡混匀，再放入37℃恒温培养箱中保温15～30min，若培养液出现红色，即为V-P阳性反应，有些细菌需要放置4h才会出现红色，若4h后仍不显现红色，可判定为阴性反应。
(3)M-R试验
培养基配制：与V-P试验一致。
M-R试剂：称量0.04g甲基红，先在60ml 95％乙醇溶液中溶解，然后加入40ml超纯水定容至100ml。
在超净工作台内，将菌株接种于上述培养基中，于30℃恒温摇床振荡培养3d后，用移液器吸取5ml培养液于无菌离心管中，向其加入100μl M-R试剂(变色范围pH＝4.2～6.3，颜色由红变黄)，如果出现红色，即为M-R阳性反应；变为黄色则为阴性反应。
(4)明胶水解试验
培养基配制：蛋白胨0.5g，明胶12g，去离子水100ml，pH＝7.2～7.4。分装每个试管10ml，121℃灭菌20min。
在超净工作台内，用长牙签挑取菌株穿刺接种于明胶中间约2/3深度，于20℃恒温培养7天，每天观察试验结果，若因培养温度高使明胶本身液化应不能摇动，静置4℃冰箱中2h凝固，观察明胶是否被细菌液化，若被液化，则明胶水解阳性反应，反之则为阴性反应。
(5)吐温80水解试验
培养基配制：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，氯化钙0.2g/L，吐温80 10ml/L，琼脂粉18g/L，pH＝7～8，121℃高温高压灭菌20min，倒平板待用。
在超净工作台内，将菌株接种于培养基平板，30℃恒温倒置培养3～5天后观察，若菌落周围有白色光晕圈即为阳性反应，反之则为阴性反应。
(6)过氧化氢酶活性
于1.5ml离心管中加入600μl 3％过氧化氢溶液，用移液器吸取400μl LB菌液添加其中，30秒内观察气泡的产生。有气泡产生的即为过氧化氢酶阳性反应，无气泡产生则为过氧化氢酶阴性反应。
LB菌液制备：蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，酵母浸粉10g/L，调节pH＝7～8，于100ml三角瓶分装50ml，121℃高温高压灭菌30min备用。接种DL138菌株于LB液体培养基，30℃、180rpm振荡培养3天，最终LB菌液浓度稀释至OD600＝0.6。以下所有需要接种菌液的实验，制备步骤都是与此一样。
(7)产H2S能力测定
培养基配制：蛋白胨20g/L，NaCl 5g/L，柠檬酸铁铵0.5g/L，Na2S2O3·5H2O0.5g/L，琼脂10g/L，调pH＝7.2，将蛋白胨、琼脂熔化，冷却至60℃加入其它成分，用移液器吸取10ml分装试管，112.6℃灭菌30min，直立搁置凝固待用。
用灭菌长牙签蘸取LB菌液，穿刺接种H2S试验用培养基，置于28℃恒温培养箱静置培养3d，若有黑色沉淀线出现，则表明有硫化物产生，即为阳性反应，反之则为阴性反应。
(8)水解柠檬酸盐能力测定
培养基配制：NH4H2PO41g/L，K2HPO41g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，柠檬酸钠2g/L，琼脂粉18g/L，将上述各成分加热溶解后，调pH＝6.8，然后加入1％溴麝香草酚蓝乙醇溶液指示剂，摇匀，呈黄绿色，用移液器吸取10ml分装至试管，121℃灭菌20min后制成斜面培养基。
用移液器吸取100μl LB菌液接种至柠檬酸盐斜面培养基，置于28℃培养箱静置培养3d，观察细菌是否生长及培养基变色情况：黄色或蓝色为阳性反应；绿色为阴性反应。
淀粉水解试验、V-P试验、M-R试验、明胶水解试验、吐温80水解试验、过氧化氢酶活性、产H2S能力测定、水解柠檬酸盐能力测定结果见表1。
表1DL138菌株生理生化特征
注：+，阳性反应；-，阴性反应。
实施例3不同盐碱胁迫条件下上升岛链霉菌DL138的解磷能力测定
(1)在pH＝8.5，NaCl浓度为CK(0.03％)、0.3M(1.75％)、0.7M(4.10％)、1.1M(6.43％)、1.5M(8.77％)和1.9M(11.11％)，分别接种0.5ml DL138菌株的培养物(LB菌液)于50ml上述以磷酸三钙为唯一磷源的含不同浓度NaCl的无机磷液体培养基(以无机磷固体培养基为基础，去除琼脂即为无机磷液体培养基CK，在CK基础上，0.3M、0.7M、1.1M、1.5M和1.9M处理组分别添加NaCl 17.2g/L、40.7g/L、64.0g/L、87.5g/L和110.8g/L)中，于30℃恒温摇床180rpm振荡培养5天，以不同培养条件为横坐标，解磷浓度和菌株扩繁指标OD600值为纵坐标绘图，结果见图2A和图2B。
根据图2A可知，随着NaCl浓度增加，DL138菌株对磷酸三钙的溶解能力逐渐降低，即解磷浓度由350mg/L下降至28mg/L；图2B的OD600值反映出菌株扩繁能力却随着NaCl浓度增加而呈现出先增加再下降的趋势，即OD600值由1.53上升至1.79(0.7MNaCl)，之后再一直下降至0.19，说明DL138菌株的最适NaCl浓度是0.7M(4.1％)，而且适应更高浓度的盐碱胁迫并发挥解磷作用。例如，当NaCl浓度为1.1M时，OD600值为0.83，解磷浓度仍可以达到115mg/L，远高于国标要求的70mg/L。
(2)NaCl浓度设定CK(0.03％)，调节pH＝3、4、5、6、7、8、9、10、11和12，接种0.5mlDL138菌株的培养物(LB菌液)于50ml上述以磷酸三钙为唯一磷源的不同pH的无机磷液体培养基中，于30℃恒温摇床180rpm振荡培养5天，以不同培养条件为横坐标，解磷浓度和菌株扩繁指标OD600值为纵坐标绘图，结果见图3A和图3B。
由图3A和图3B可知，pH与NaCl浓度对解磷菌的胁迫影响存在很大差异。在pH＝3到pH＝7条件下，解磷菌没有体现出明显的增溶规律，此阶段的溶磷主要是液体培养基中的无机酸贡献，因为反映菌株扩繁的OD600值由0.004逐渐增加至0.18(pH＝5)，pH＝6和7时分别为0.71和1.04，表明酸性条件对菌株有强烈的抑制作用，但是菌株可以适应微酸性栖息环境；在pH＝8-12范围内，菌株的溶磷能力逐渐下降，但是在pH＝11时，菌株DL138的解磷浓度为118mg/L，此时菌株DL138的OD600值为0.29，远高于国标要求的70mg/L。
综上可见，解磷菌DL138菌株既可以适应高盐环境(1.1M NaCl)溶解难溶性磷酸盐，又可以适应高碱环境(pH＝11)溶解难溶性磷酸盐。
实施例4菌株DL138对盐碱盆栽玉米生物量和植物磷的影响
将河沙用流水清洗，冲去表面残留矿物质养分，121℃灭菌1h，除去表面残留微生物。称取1.7kg处理好的河沙，以磷酸三钙为唯一磷源按照0.5％与河沙搅拌均匀后，置入干净花盆中。“郑单958”玉米种子用75％无水乙醇表面消毒10min，再用无菌水冲洗4-5次，去除残留酒精，每个花盆种植2棵植株，出苗一周后开始接种10ml菌株DL138培养物(OD600＝0.6)三次，每次间隔5天，生长期第一个月水分和霍格兰营养液正常管理幼苗。一个月后营养液中不加磷源管理植株，设置pH＝8.0，NaCl浓度0mM、100mM、200mM和300mM四种盐碱条件进行胁迫处理，每个花盆浇灌100ml，每个处理四个生物学重复，共计16盆植株。胁迫处理一个月后，收获植株，测定植株生物量和叶片植物磷，反映菌株DL138对盐碱胁迫的响应。同时设置无菌株处理作为空白对照，四种NaCl浓度与接种菌株一致，每个处理四个生物学重复，共计16盆植株。玉米生物量见图4，叶片植物磷见图5。
霍格兰营养液配制：四水硝酸钙945mg/L、硝酸钾607mg/L、磷酸二氢钾136mg/L、七水硫酸镁493mg/L、铁盐溶液2.5ml/L和微量元素液5ml/L；营养液中去除磷酸二氢钾即制备为不加磷源的营养液。
铁盐溶液：七水硫酸亚铁2.78g和乙二胺四乙酸二钠3.73g分别溶解于无菌去离子水，二者混合最终定容至500ml，调节pH＝5.5。
微量元素液：碘化钾0.83mg/l、硼酸6.2mg/L、硫酸锰22.3mg/L、硫酸锌8.6mg/L、钼酸钠0.25mg/L、硫酸铜0.025mg/L和氯化钴0.025mg/L。
根据图4A和图4B可知，菌株DL138能显著缓解300mM NaCl的盐碱胁迫，并能在无盐碱处理条件下显著促进玉米鲜重生物量的增加，虽然对低浓度盐碱条件下的胁迫也能响应，但是没有达到显著水平(p>0.05)。根据图5可知，与未加菌株处理比较，在不同浓度盐碱处理条件下，菌株DL138能显著促进玉米对磷素的吸收利用，促进玉米生长发育。
综上可见，菌株DL138具有广泛的栖息环境适应性，能缓解玉米适应不同浓度盐碱胁迫，促进玉米吸收利用磷素和生长发育。
实施例5菌株DL138对盐碱盆栽玉米光合作用和抗氧化酶活的响应
(1)选取上述实施例4中玉米植株，每个植株选取3片展开叶片，每片叶片计数10次，用Li-6400便携式光合仪(LI-COR Inc.,Lincoln,NE,USA)测定玉米光合作用(净光合速率、蒸腾速率、气孔导度和胞间二氧化碳浓度)对盐碱胁迫的响应。结果见图6。
根据图6可知，菌株DL138能缓解盐碱胁迫对玉米光合作用的不利影响。相比于无菌株处理的玉米，经过菌株DL138处理后，能显著促进玉米在不同盐碱浓度处理条件下的净光合速率，并能显著提升在pH＝8.0、200mM NaCl处理下玉米的气孔导度和维持更低的胞间二氧化碳浓度，但是对盐碱胁迫处理下的玉米蒸腾速率不显著；然而却在仅pH＝8.0，无NaCl胁迫处理条件下，均能显著促进增强光合作用的四个指标。
(2)选取上述实施例4中玉米植株，每盆取3g新鲜叶片保存，每个处理四个生物学重复，共计32个样品。提取粗酶液，测定SOD、POD、CAT活性和MDA含量。结果见图7。
粗酶液的提取方法：称取3g新鲜玉米叶片，加入约15ml粗酶提取液，冰浴充分研磨，10000rpm低温离心20min，取上清液冷藏备用。
粗酶提取液配制：以50mmol·L-1pH7.8的PBS配制，含有0.1mmol·L-1EDTA、质量浓度为0.3％Triton X-100和质量浓度为4％聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)(罗恩)，其中TritonX-100(罗恩)及PBS提前混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀备用。
50mmol·L-1pH7.8的PBS配制：
A液：配制500ml 0.2M NaH2PO4·H2O(沪试)，称取13.8g，定容至500ml；
B液：配制1L 0.2M Na2HPO4·12H20(沪试)，称取71.6g/L，定容至1L；
50mmol·L-1PBS(pH7.8)：A液85ml+B液915ml＝1000ml，稀释4X，即得到4L50mmol·L-1PBS。
1)SOD的测定方法
取10ml离心管，分别加入3ml反应混合液(在54ml 14.5mmol·L-1DL-蛋氨酸(麦克林)中，分别加入2ml 3μmol·L-1EDTA、2ml 2.25mmol·L-1NBT(麦克林)和2ml 60μmol·L-1核黄素溶液(麦克林))和粗酶液0.02ml，混合后放在透明离心管架上，在光照培养箱内照光(8000Lux)，照光10min后立即避光迅速测定A560值，以不加粗酶提取液的照光管作对照，计算反应被抑制的百分比，以能抑制NBT光化学反应的50％为一个酶单位。
SOD总活性＝(Ack-AE)V/0.5×Ack×W×Vt
式中
Ack：对照离心管吸光度
AE：样品管吸光度
V：提取液总体积(ml)
Vt：测定时样品用量体积(ml)
W：样品用量(g)
2)POD的测定方法
采用愈创木酚法。在10ml离心管中加入3ml反应混合液和磷酸缓冲液0.05ml，作为校零对照；另取10ml离心管加入反应混合液3ml和粗酶液0.05ml，迅速摇匀，立即测定A470值，于0，30s和60s分别计数一次，以每分钟每克鲜重的吸光度变化值表示酶活力单位，单位为ΔA470/min·g·FW。(反应混合液配制：0.05ml 50mmol·L-1PBS(pH＝7.8)，0.95ml0.2％愈创木酚(麦克林)和2ml 0.2％过氧化氢混合均匀)
POD活性(U)＝(ΔA470×V)/(0.001×Δt×Vs×W)
式中
ΔA470：反应混合液的吸光度变化值(A470)
Δt：酶促反应时间(min)
V：样品提取液总体积(ml)
Vs：测定时所取样品提取液体积(ml)
W：样品质量(g)。
3)CAT的测定方法
取2.9ml反应混合液加入0.1ml粗酶液，迅速颠倒2-3次充分混匀，立即测定A240值，分别于0，30s和60s计数一次。以每分钟每克鲜重的吸光度变化值(ΔA240/min·mg·FW)来表示。(反应混合液配制：1ml 0.2％过氧化氢(用pH＝7.8的PBS稀释)，添加蒸馏水1.9ml稀释)
计算公式为：u/mg＝E240×3/0.0436×EW
式中
E240：240nm处每分钟吸光度的减少值
EW：每0.1ml所用粗酶提取液中含样品的鲜重(mg)
0.0436：240nm处1μmol过氧化氢的吸光度。
3：反应混合液的总体积。
4)MDA的测定方法
吸取3ml粗酶液和3ml 0.6％硫代巴比妥酸(麦克林)，混匀后在10ml离心管上加盖，于沸水浴上反应15min，迅速冰浴冷却后于4000rpm离心10min，取上清液测定A532，A450值。
计算方法为：MDA(μmol-1)＝6.45A532-0.56A450
MDA(nmol·g-1)＝MDA(μmol-1)×V/W×1000
式中
V：粗酶提取液使用量
W：样品鲜重(g)。
根据图7可知，菌株DL138可以降低玉米响应盐碱胁迫导致活性氧含量增加的不利影响。相比于无菌株处理的玉米，POD抗氧化酶的活性在不同盐碱处理条件下均显著增强；在中低浓度盐碱处理下，CAT活性显著增强，SOD活性同样增强然而不显著，但是MDA含量显著降低，反映出经过菌株DL138处理后，能显著降低玉米在中低浓度盐碱条件下的ROS胁迫，从而维持玉米的正常代谢活动。
综上可见，解磷菌DL138菌株可以缓解盐碱胁迫对玉米光合作用的不利影响，促进玉米抗氧化酶活性的增强和降低MDA含量，以降低盐碱胁迫产生的活性氧对玉米的损伤，从而继续维持玉米的光合作用等正常代谢活动。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一株上升岛链霉菌(Streptomycescapoamus)DL138，其特征在于，其保藏编号为CGMCCNo.26849。
2.权利要求1所述的上升岛链霉菌DL138在解磷中的应用。
3.权利要求1所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱条件下解磷中的应用。
4.权利要求1所述的上升岛链霉菌DL138在耐盐碱胁迫中的应用。
5.权利要求1所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境促进玉米生长中的应用。
6.权利要求1所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境促进玉米生物量增加中的应用。
7.权利要求1所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境促进玉米植物磷吸收中的应用。
8.权利要求1所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境促进玉米光合作用中的应用。
9.权利要求1所述的上升岛链霉菌DL138在促进玉米光合作用中的应用。
10.权利要求1所述的上升岛链霉菌DL138在盐碱胁迫环境促进玉米抗氧化酶活中的应用。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6150976A (ja) * | 1984-08-17 | 1986-03-13 | Kirin Brewery Co Ltd | 新規物質ａｃ５ｙ |
| CN106701635A (zh) * | 2017-01-25 | 2017-05-24 | 南京农业大学 | 一株具杀根结线虫能力的香蕉内生链霉菌及其研制的生物育苗基质 |
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| CN115433697A (zh) * | 2022-09-08 | 2022-12-06 | 河北省科学院生物研究所 | 释硅链霉菌cs13-6及其应用 |
-
2023
- 2023-06-29 CN CN202310783539.8A patent/CN117106624B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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|---|
| R KAWUR 等: "Bioactive compound of Streptomyces capoamus as biocontrol of Bacterial Wilt Disease on Banana Plant", IOP CONFERENCE SERIES: EARTH ANDENVIRONMENTAL SCIENCE, vol. 347, 31 December 2019 (2019-12-31), pages 1 - 9 * |
| 满全莉: "微生物菌剂对盐碱地的改良研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库（电子期刊）基础科学辑, no. 1, 15 January 2022 (2022-01-15), pages 1 - 81 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117106624B (zh) | 2024-04-02 |
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