CN117106050A - 一种非特异性靶向抑制致病菌的抗菌肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种非特异性靶向抑制致病菌的抗菌肽及其应用。所述抗菌肽的序列如SEQ ID NO:1所示。该抗菌肽不仅制备简单和细胞毒性较低，而且能非特异性靶向抑制致病菌，而不影响益生菌的正常生长，适用于制备抑菌剂，如用于制备口腔用品，调节口腔微生态的平衡，进而用于防治口腔疾病，尤其是防治龋病、牙周炎、口腔黏膜病或口腔癌等疾病。而且，本发明的抗菌肽长度较短，化学合成难度小，可直接合成为高纯产物，同时效果明确，应用广泛。
Description
技术领域
本发明属于抗菌肽技术领域。更具体地，涉及一种非特异性靶向抑制致病菌的抗菌肽及其应用。
背景技术
天蚕素A是一种抗菌肽，由37个氨基酸残基组成，分子质量约为4kDa。不同于传统抗生素，天蚕素A能够通过靶向抑制各种生物分子合成、破坏或渗透靶细胞质膜，以及靶向作用代谢酶等多种方式杀死病原菌或抑制病原菌的生长。此外，天蚕素A还可以破坏细菌细胞膜的物理完整性，而细菌耐药性又与自身生物膜有着密切联系，因此天蚕素A不易产生细菌耐药性问题。
目前，天蚕素A主要获取途径为从生物体内提取纯化，存在来源受限和细胞毒性较高等问题(Reddy K V R,Yedery R D,Aranha C.Antimicrobial peptides:premises andpromises[J].International journal of antimicrobial agents,2004,24(6):536-547.)，这也导致了天蚕素A的应用受限。
因此，亟需对天蚕素A进行改造，以拓宽其来源、降低其细胞毒性。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供一种非特异性靶向抑制致病菌的抗菌肽，由天蚕素A改造而来，细胞毒性显著降低。
本发明的第一目的是提供一种非特异性靶向抑制致病菌的抗菌肽。
本发明的第二目的是提供与上述抗菌肽具有90％以上同源性的多肽。
本发明的第三目的是提供将上述抗菌肽的N端进行乙酰化修饰得到的多肽。
本发明的第四目的是提供上述抗菌肽或多肽在制备抑菌剂中的应用。
本发明的第五目的是提供上述抗菌肽或多肽在制备口腔用品中的应用。
本发明的第六目的是提供一种口腔用品。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首次发现序列如SEQ ID NO:1所示的抗菌肽不仅制备简单和细胞毒性均较低，而且能非特异性靶向抑制致病菌，而不影响益生菌的正常生长。因此，本发明提供了序列如SEQ ID NO:1所示的非特异性靶向抑制致病菌的抗菌肽、与上述抗菌肽具有90％以上同源性的多肽、将上述抗菌肽的N端进行乙酰化修饰得到的多肽、上述抗菌肽或多肽在制备抑菌剂中的应用，以及上述抗菌肽或多肽在制备口腔用品中的应用。
所述抗菌肽包括37个氨基酸，分子量为3911.69，分子式为C178H305N51O47，总平均亲水性为-0.349。
本发明提供的抗菌肽具有非特异性靶向抑制致病菌的特点，其中，非特异性指代该抗菌肽具备同时抑制多种致病菌的特点，靶向指代该抗菌肽可以选择性抑制致病菌但不抑制益生菌。
优选地，所述口腔用品具有治疗和/或预防口腔疾病的作用。
进一步优选地，所述口腔疾病为口腔致病菌引发的口腔疾病，所述口腔致病菌如牙龈卟啉单胞菌、变异链球菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌、中间普氏菌、齿垢密螺旋体、福赛坦纳菌、粘性放线菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等。
在口腔中，若微生态失衡，其微生物群体容易转化为病原体的相关群体，对口腔健康带来负面影响；同时，致病菌的增加易使口腔产生异味(口臭)，进而导致龋病、牙周炎、口腔黏膜病或口腔癌等疾病的发生，而本发明上述抗菌肽或多肽能非特异性靶向抑制致病菌，且不影响益生菌的正常生长，进而有效调节口腔微生态的平衡，因此，含有上述抗菌肽或多肽的口腔用品均应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述口腔用品为牙膏、漱口水、漱口水泡腾片或口腔护理液中的一种或几种。
本发明具有以下有益效果：
本发明的抗菌肽不仅制备简单和细胞毒性较低，而且能非特异性靶向抑制致病菌，而不影响益生菌的正常生长，适用于制备抑菌剂，如用于制备口腔用品，调节口腔微生态的平衡，进而用于防治口腔疾病，尤其是防治龋病、牙周炎、口腔黏膜病或口腔癌等疾病。而且，本发明的抗菌肽长度较短，化学合成难度小，可直接合成为高纯产物，同时效果明确，应用广泛。
附图说明
图1为乙酰化抗菌肽的HPLC图谱。
图2为乙酰化抗菌肽的LCMS图谱。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1非特异性靶向抑制致病菌的抗菌肽的制备
将天蚕素A(如SEQ ID NO:2所示：KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK)N端的2号氨基酸更换为赖氨酸(K)，将其C端的34～36号氨基酸更换为3个脯氨酸(P)，37号氨基酸更换为1个天冬酰胺(N)，即得到本发明的抗菌肽序列：KKKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATPPPN(如SEQ ID NO:1所示)。
委托上海药明康德新药开发有限公司通过蛋白质化学合成方法(脱水缩合)合成上述抗菌肽(如SEQ ID NO:1所示)，且为了提高本发明抗菌肽在下述测试例中的稳定性，还将该抗菌肽N端的第一个赖氨酸(K)进行乙酰化修饰，得到的乙酰化抗菌肽基本理化性质如下表1所示。
表1乙酰化抗菌肽的基本理化性质
| 氨基酸数量 | 37 |
| 分子量 | 3911.69 |
| 理论等电点 | 10.39 |
| 分子式 | C178H305N51O47 |
| 带负电残基的总数(Asp+Glu) | 2 |
| 带正电残基的总数(Arg+Lys) | 8 |
| 不稳定指数 | 28.97<40.00，归类为稳定蛋白质 |
| 脂肪系数 | 94.86(稳定性好) |
| 总平均亲水性 | -0.349(亲水蛋白，溶于水) |
再对上述乙酰化抗菌肽进行HPLC分析和LCMS分析。分析结果如图1和图2所示，可见，乙酰化抗菌肽的纯度为96.7％，分子量为3953.68。
测试例1溶血性评价
本测试例的溶血性评价实验参照《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》进行。具体评价方法如下：取家兔心脏血20mL，放入盛有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇10min，除去纤维蛋白原，使成脱纤维血，加10倍体积量的0.9wt％氯化钠溶液，摇匀，1500r/min离心10min，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9wt％氯化钠溶液洗涤至离心后上清液不显红色为止，将所得红细胞按体积用0.9wt％氯化钠溶液配成2％的红细胞混悬液。以0.9wt％氯化钠溶液2.5mL中加入兔红细胞混悬液2.5mL为阴性组，以纯净水2.5mL中加入兔红细胞混悬液2.5mL为阳性组。准确称取原始的天蚕素A及本发明的乙酰化抗菌肽，分别配制成样品浓度为0.5wt％的氯化钠溶液(氯化钠浓度为0.9wt％)各2.5mL，然后分别加入兔红细胞混悬液2.5mL，作为样品组。振摇各组溶液，混合均匀，置于(37±0.5)℃水浴中保温3h，水浴完毕后取出，3000r/min离心10min，吸取上清液至比色皿中。实验重复三次，结果取平均值。以阴性组为空白，采用比色法于542nm下分别测定阳性组的吸光度(A阳)、阴性组吸光度(A阴)和样品组的吸光度(A样)，按溶血率＝(A样-A阴)/(A阳-A阴)×100％，计算溶血率，结果如表2所示。
表2溶血率测定结果
| 样品 | 天蚕素A | 乙酰化抗菌肽 |
| 溶血率(％) | 3.01 | 1.03 |
由表2中的结果可知，本发明的乙酰化抗菌肽溶血性较低，仅为1.03％，显著低于原始的天蚕素A，表明本发明的抗菌肽具有较低的溶血性。
测试例2细胞毒性评价
采用MTT比色法检测本发明提供的乙酰化抗菌肽对人口腔上皮细胞HOEC(由深圳市豪地华拓生物科技有限公司提供)的毒性。具体细胞毒性评价方法如下：①HOEC细胞扩增培养：将HOEC细胞用0.25wt％胰蛋白酶1mL消化2min，于800rpm离心5min，采用完全培养基(MEM培养基)重悬细胞后，进行扩瓶培养24h，培养条件：37℃下，5％体积分数的CO2及饱和湿度条件下培养。②铺板：镜下见培养瓶中细胞长满瓶底90％面积，收集细胞，然后以104个/孔接种于96孔板中培养24h。③干预：去除培养基后，分别加入30mL含终浓度为0.5wt％的乙酰化抗菌肽的完全培养基(MEM培养基)和30mL含终浓度为0.5wt％的天蚕素A的完全培养基(MEM培养基)，作为样品组；同时以30mL不加供试样品的含10wt％胎牛血清的完全培养基(MEM培养基)为空白对照组，并设立阴性对照组(30mL 0.9wt％氯化钠溶液)和阳性对照组(30mL体积分数为5％的二甲基亚砜溶液)，各组在①相同培养条件下培养24h。④测定：每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL，继续培养4h后弃去孔内液体，加入150μL DMSO，振荡10min后用酶标仪于570nm和630nm波长处测吸光度。通过以下公式计算相对增殖率(RGR)：RGR＝实验组吸光度/空白对照组吸光度×100％，结果如下表3所示。
表3对人口腔上皮细胞HOEC毒性测试结果(n＝6)
| 样品 | 天蚕素A | 乙酰化抗菌肽 | 阴性对照 | 阳性对照 | 空白对照 |
| 相对增殖率(％) | 81.44±3.95 | 109.23±2.58 | 99.52±3.71 | 12.31±0.15** | 100 |
**：与空白对照组相比，P<0.01。
由表3的数据可知，天蚕素A对人口腔上皮细胞HOEC的增殖有一定的抑制作用，乙酰化抗菌肽无明显抑制作用，表明本发明的抗菌肽对人口腔上皮细胞HOEC无明显毒性作用。
测试例3对常见致病菌的抑菌效果评价
参考《QBT2738-2012-日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》项下7.3抑菌型日化产品的抑菌效果检验方法(悬液定量法)，就本发明实施例1的乙酰化抗菌肽和原始天蚕素A(作用浓度均为0.5wt％)对11种常见致病菌的抑菌活性进行评价，并设立阴性对照组(氯化钠溶液，终浓度0.09wt％)和阳性对照组(西吡氯铵，终浓度0.1wt％)，作用时间2min。
本测试例使用的致病菌如表4所示，抑菌结果如表5所示。
表4致病菌种类及来源
表5对致病菌的抑菌活性检测(n＝3)
*：与天蚕素A相比，P＜0.05。**：与天蚕素A相比，P＜0.01。
由上述表5的数据可知，天蚕素A对11种菌中的大多数菌有抑制作用，对少部分菌有较强的抑制作用，而本发明的乙酰化抗菌肽对这11种菌均有较强的抑制作用，且本发明的乙酰化抗菌肽对齿垢密螺旋体和福赛坦纳菌的抑制作用比西吡氯铵的抑制作用还要强，表明本发明的抗菌肽有优异的抗菌性能，能非特异性靶向抑制致病菌，适用于制备抑菌剂。
测试例4对常见口腔益生菌的抑菌效果评价
为了考察本发明的抗菌肽能否适用于制备口腔用品，本测试例测试了乙酰化抗菌肽和天蚕素A(作用浓度均为0.5wt％)对9种常见口腔益生菌的抑制效果。实验方法参照《QBT2738-2012-日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》项下7.3抑菌型日化产品的抑菌效果检验方法(悬液定量法)进行，并设立阴性对照组(氯化钠溶液，终浓度0.09wt％)和阳性对照组(西吡氯铵，终浓度0.1wt％)，作用时间2min。
本测试例使用的口腔益生菌如表6所示，抑菌结果如表7所示。
表6口腔益生菌的种类及来源
表7对口腔益生菌的抑菌活性检测(n＝3)
*：与天蚕素A相比，P＜0.05。**：与天蚕素A相比，P＜0.01。
由表7的数据可知，相较于原始的天蚕素A来说，本发明的乙酰化抗菌肽对口腔常见益生菌的抑制作用较弱或无抑制作用，表明本发明的抗菌肽对口腔益生菌的正常生长不会产生明显影响。
结合测试例3和测试例4的结果可知，本发明的抗菌肽能非特异性靶向抑制致病菌，而不影响益生菌的正常生长，适用于制备抑菌剂，如用于制备口腔用品，调节口腔微生态的平衡，进而用于防治口腔疾病，尤其是防治龋病、牙周炎、口腔黏膜病或口腔癌等疾病。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种非特异性靶向抑制致病菌的抗菌肽，其特征在于，序列如SEQ IDNO:1所示。
2.与权利要求1所述抗菌肽具有90％以上同源性的多肽。
3.将权利要求1所述抗菌肽的N端进行乙酰化修饰得到的多肽。
4.权利要求1所述抗菌肽或权利要求2～3任一所述多肽在制备抑菌剂中的应用。
5.权利要求1所述抗菌肽或权利要求2～3任一所述多肽在制备口腔用品中的应用。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述口腔用品具有治疗和/或预防口腔疾病的作用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述口腔疾病为口腔致病菌引发的口腔疾病。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述口腔致病菌为牙龈卟啉单胞菌、变异链球菌、伴放线放线杆菌、具核梭杆菌、中间普氏菌、齿垢密螺旋体、福赛坦纳菌、粘性放线菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或白色念珠菌中的一种或几种。
9.一种口腔用品，其特征在于，含有权利要求1所述抗菌肽或权利要求2～3任一所述多肽。
10.根据权利要求9所述口腔用品，其特征在于，所述口腔用品为牙膏、漱口水、漱口水泡腾片或口腔护理液中的一种或几种。
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