WO2024146263A1 - 用于调控口腔菌群平衡的多肽 - Google Patents
用于调控口腔菌群平衡的多肽Info
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Abstract
本发明提供了用于调控口腔菌群平衡的多肽。所述多肽的序列如SEQ ID NO:1所示。该多肽能在选择性抑制口腔有害菌的同时，保证口腔益生菌正常的生理活动，进而有效维持口腔微生物之间、微生物与宿主之间的动态平衡，有利于维持机体正常的机体代谢、免疫、营养及口腔健康，且可有效预防龋齿、牙周病、口臭、反复性口腔溃疡等口腔疾病的发生。
Description
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及用于调控口腔菌群平衡的多肽。
口腔中居住着数十亿个微生物，各种微生物在不同部位共栖、竞争和拮抗，在种群数量及功能上保持着动态平衡的自稳状态，构建了人类复杂的口腔微生态“微世界”。其中，作为人体第二大菌群的口腔菌群，细菌种类多达700余种，其中大多数细菌是有益的，可以抵御疾病、帮助消化以及调节机体机能，对口腔健康有重要作用，被称为口腔益生菌(Probiotics)。
口腔益生菌，是一类对宿主有益的活性微生物，主要通过分泌抗菌物质、与口腔有害菌竞争性定殖、调节宿主免疫反应、调整生物膜pH值等过程发挥其益生效能，甚至特定的益生菌菌株如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophillus)和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)已经被证实有抗菌和抗真菌的效果，唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarizs)被认为可以抑制龋齿的发生和拮抗牙周病原菌(晏子衡,胡晓芳,吴新.益生菌对口腔常见疾病的影响研究[J].口腔医学,2018,38(02):185-188.DOI:10.13591/j.cnki.kqyx.2018.02.021.)。
正常生理状态下，口腔微生物之间、微生物与宿主之间存在着动态平衡，共同参与机体代谢、免疫、营养及维持口腔健康。然而，目前很多口腔抑菌产品在杀死口腔有害菌的同时，还会过多地杀死口腔益生菌，导致口腔微生态系统平衡被打破，口腔益生菌减少且不能快速增殖，口腔有害菌增多及其产生的毒素会破坏口腔健康，进而导致相关口腔疾病的发生，如龋齿、牙周病、口臭、反复性口腔溃疡等，且口腔疾病会进一步加剧口腔微生态的失衡，使得口腔问题进入恶性循环，因此，寻找一种能有效调节口腔菌群平衡的口腔抑菌产品，对于口腔健康十分必要。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，旨在提供用于调控口腔菌群平衡的多肽，能在选择性抑制口腔有害菌的同时，保证口腔益生菌正常的生理活动，进而有效维持
口腔微生态的平衡。
本发明的第一目的是提供与SEQ ID NO:1所示多肽具有90％以上同源性的多肽。
本发明的第二目的是提供用于调控口腔菌群平衡的多肽。
本发明的第三目的是提供将上述多肽的N端进行乙酰化修饰得到的多肽。
本发明的第四目的是提供上述多肽在制备抑菌产品中的应用。
本发明的第五目的是提供上述多肽在制备调节口腔菌群平衡的产品中的应用。
本发明的第六目的是提供上述多肽在制备口腔用品中的应用。
本发明的第七目的是提供一种口腔用品。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
序列如SEQ ID NO:1所示的多肽包括36个氨基酸，分子量为4050.85，分子式为C189H310N50O48，总平均亲水性为-0.411，而本发明首次发现该多肽能在选择性抑制口腔有害菌的同时，保证口腔益生菌正常的生理活动，进而有效维持口腔微生态的平衡。因此，本发明提供了与SEQ ID NO:1所示多肽具有90％以上同源性的多肽、一种序列如SEQ ID NO:1所示的有效调节口腔菌群平衡的多肽、将上述多肽的N端进行乙酰化修饰得到的多肽，以及上述多肽在制备抑菌产品中的应用。
优选地，所述抑菌为抑制口腔有害菌。
进一步优选地，所述口腔有害菌包含金黄色葡萄球菌、具核梭杆菌、大肠杆菌、伴放线放线杆菌、福赛坦纳菌、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、变异链球菌、白色念珠菌或粘性放线菌中的一种或多种。
更优选地，所述口腔有害菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或牙龈卟啉单胞菌中的一种或多种。
本发明还提供了上述多肽在制备调节口腔菌群平衡的产品中的应用。
优选地，所述调节口腔菌群平衡包括抑制口腔有害菌和维持口腔有益菌活性。
进一步优选地，所述口腔有害菌包含金黄色葡萄球菌、具核梭杆菌、大肠杆菌、伴放线放线杆菌、福赛坦纳菌、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、变异链球菌、白色念珠菌或粘性放线菌中的一种或多种。
进一步优选地，所述口腔益生菌包含长双歧杆菌、粪肠球菌、唾液链球菌、
唾液乳杆菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌、血链球菌、鼠李糖乳杆菌中的一种或多种。
本发明还提供了上述多肽在制备口腔用品中的应用，以及一种含上述多肽的口腔用品。
优选地，所述口腔用品为口腔护理液、漱口水、牙膏或漱口水泡腾片中的一种或几种。
本发明具有以下有益效果：
本发明的多肽能在选择性抑制口腔有害菌的同时，保证口腔益生菌正常的生理活动，进而有效维持口腔微生物之间、微生物与宿主之间的动态平衡，有利于维持机体正常的机体代谢、免疫、营养及口腔健康，且可有效预防龋齿、牙周病、口臭、反复性口腔溃疡等口腔疾病的发生。
图1为实施例1乙酰化多肽的HPLC图谱。
图2为实施例1乙酰化多肽的LCMS图谱。
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
人口腔上皮细胞HOEC：来自深圳市豪地华拓生物科技有限公司。
长双歧杆菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 15707。
粪肠球菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 29212。
唾液链球菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 13419。
唾液乳杆菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 11741。
乳酸乳球菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 11007。
嗜酸乳杆菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 4355。
青春双歧杆菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 15704。
血链球菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 10556。
鼠李糖乳杆菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 11981。
金黄色葡萄球菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 29213。
具核梭杆菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 10953。
大肠杆菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 15597。
伴放线放线杆菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 700685。
福赛坦纳菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 43037。
中间普氏菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 25611。
牙龈卟啉单胞菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 33277。
齿垢密螺旋体：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 35405。
变异链球菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 25175。
白色念珠菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 10231。
粘性放线菌：美国模式培养物集存库(American type culture collection)，编号为ATCC 27044。
实施例1用于调控口腔菌群平衡的多肽
选取天蚕素A(序列如SEQ ID NO:2所示：KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK)的N端1～16号氨基酸，将天蚕素A的N端2号氨基酸更换为赖氨酸，标记为序列片段1；
选取天蚕素D(序列如SEQ ID NO:3所示：MKISKIFVFVFAIVFATASVSAAPGNFFKDLVSIVLDVSGS)的C端22～41号氨基酸，将天蚕素D的C端38～40号氨基酸更换为3个脯氨酸，同时将天蚕素D的C端41号氨基酸更换为天冬酰胺，标记为序列片段2；
将序列片段1和序列片段2连接，得到目标多肽序列，其中，序列片段1的N端作为目标多肽序列的N端，而序列片段2的C端作为目标多肽序列的C端：KKKLFKKIEKVGQNIRAAPGNFFKDLVSIVLDPPPN(如SEQ ID NO:1所示)。
委托上海药明康德新药开发有限公司通过蛋白质化学合成方法(脱水缩合)合成序列如SEQ ID NO:1所示的目标多肽，且为了提升目标多肽在下述测试实验中的稳定性，还将该目标多肽N端的第一个赖氨酸进行乙酰化修饰，得到乙酰化多肽。再对其进行HPLC分析与LCMS分析，得到的HPLC图谱和LCMS图谱分别如图1和图2所示，且其分子量、分子式等基本理化性质如表1所示。
表1
结合图1～2和表1可知，乙酰化多肽的分子量为4050.85，分子式为C189H310N50O48，纯度为98.52％。
测试例1乙酰化多肽的细胞毒性
本测试例通过MTT比色法检测乙酰化多肽的细胞毒性，具体如下：
(1)扩增培养：用1mL 0.25wt％胰蛋白酶将人口腔上皮细胞HOEC消化2min，以800rpm的转速离心5min，采用MEM完全培养基重悬细胞后，在37℃、5％体积分数的CO2及饱和湿度条件下扩瓶培养24h。
(2)铺板：镜下见培养瓶中细胞长满瓶底90％面积，收集细胞，然后以104个/孔接种于96孔板中，再培养24h。
(3)干预：去除培养基后，分别加入30mL含终浓度为0.5wt％的天蚕素A的MEM完全培养基，作为1号实验组；分别加入30mL含终浓度为0.5wt％的天蚕素D的MEM完全培养基，作为2号实验组；分别加入30mL含终浓度为0.5wt％的乙酰化多肽的MEM完全培养基，作为3号实验组；同时设立空白组(30mL不加供试样品的含10wt％胎牛血清的MEM完全培养基)、阴性组(30mL 0.9wt％氯化钠溶液)和阳性组(30mL体积分数为5％的二甲基亚砜溶液)，继续在(1)相同培养条件下培养24h。
(4)测定：每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液，继续培养4h，弃去孔内液体，加入150μL DMSO，振荡10min后用酶标仪于570nm和630nm波长下测得吸光度。
根据公式“RGR＝实验组吸光度/空白组吸光度×100％”计算各组细胞的相对增殖率(RGR)。结果如表2所示。
表2
**表示与空白组相比，P<0.01。
可见，1号实验组和2号实验组在一定程度上会抑制HOEC的增殖，3号实验组则对HOEC的增殖几乎没有影响，表明本发明多肽的毒性较低。
测试例2乙酰化多肽的溶血性
参考《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》，对实施例1所得
乙酰化多肽进行溶血性的评价实验。
首先取20mL家兔心脏血，置于三角烧瓶中(三角烧瓶盛有玻璃珠)，振摇10min，除去纤维蛋白原，使成脱纤维血，加入体积10倍量的0.9wt％的氯化钠溶液，摇匀，以1500r/min的转速离心10min，除去上清液，沉淀的红细胞再用0.9wt％氯化钠溶液洗涤2次，将所得红细胞按体积用0.9wt％氯化钠溶液稀释成2％的红细胞混悬液。
以纯净水2.5mL为阳性对照组，以0.9wt％氯化钠溶液2.5mL为阴性对照组，以原始的天蚕素A配制成样品浓度为0.5wt％的氯化钠溶液(氯化钠浓度为0.9wt％)2.5mL为1号实验组，以原始的天蚕素D配制成样品浓度为0.5wt％的氯化钠溶液(氯化钠浓度为0.9wt％)2.5mL为2号实验组，以实施例1所得乙酰化多肽配制成样品浓度为0.5wt％的氯化钠溶液(氯化钠浓度为0.9wt％)2.5mL为3号实验组。各组分别加入兔红细胞混悬液2.5mL后，振摇、混合均匀，置于(37±0.5)℃水浴中保温3h，水浴完毕后取出，以3000r/min的转速离心10min，吸取上清液至比色皿中。实验重复三次，结果取平均值。以阴性对照组为空白，采用比色法于542nm下分别测定阳性对照组的吸光度(A阳)、阴性对照组吸光度(A阴)和实验组的吸光度(A实)，按溶血率＝(A实-A阴)/(A阳-A阴)×100％，计算溶血率，结果如表3所示。
表3
可见，3号实验组的溶血性较低，溶血率低至1.04％，显著低于1号实验组和2号实验组，表明本发明多肽的溶血性较低。
测试例3对益生菌的抑制显著降低
参照《QBT2738-2012-日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》项下7.3抑菌型日化产品的抑菌效果检验方法(悬液定量法)，本测试例对乙酰化多肽、天蚕素A和天蚕素D(作用浓度均为0.5wt％)对几种常见口腔益生菌的抑制效果进行了测试，作用时间2min，并设立了阳性组(终浓度0.1wt％的西吡氯铵)和阴性组(终浓度0.09wt％的氯化钠溶液)。结果如表4所示。
表4
#：与天蚕素A相比，P<0.05；##：与天蚕素A相比，P<0.01；*：与天蚕素D相比，P<0.05；**：与天蚕素D相比，P<0.01。
可见，与天蚕素A和天蚕素D相比，本发明的乙酰化多肽对口腔益生菌的抑制作用得到显著的降低。
测试例4对有害菌的抑制显著增强
参照《QBT2738-2012-日化产品抗菌抑菌效果的评价方法》项下7.3抑菌型日化产品的抑菌效果检验方法(悬液定量法)，本测试例对乙酰化多肽、天蚕素A和天蚕素D(作用浓度均为0.5wt％)对几种常见口腔有害菌的抑制效果进行了测试，作用时间2min，并设立了阳性组(终浓度0.1wt％的西吡氯铵)和阴性组(终浓度0.09wt％的氯化钠溶液)。结果如表5所示。
表5
#：与天蚕素A相比，P<0.05；##：与天蚕素A相比，P<0.01；*：与天蚕素D相比，P<0.05；**：与天蚕素D相比，P<0.01。
可见，与天蚕素A和天蚕素D相比，本发明的乙酰化多肽对口腔有害菌的抑制作用得到显著的提升。
综上，本发明的多肽能在选择性抑制口腔有害菌的同时，保证口腔益生菌正常的生理活动，进而有效维持口腔微生物之间、微生物与宿主之间的动态平衡，有利于维持机体正常的机体代谢、免疫、营养及口腔健康，且可有效预防龋齿、牙周病、口臭、反复性口腔溃疡等口腔疾病的发生。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
- 与SEQ ID NO:1所示多肽具有90％以上同源性的多肽。
- 用于调控口腔菌群平衡的多肽，其特征在于，序列如SEQ ID NO:1所示。
- 将权利要求2所述多肽的N端进行乙酰化修饰得到的多肽。
- 权利要求1～3任一所述多肽在制备抑菌产品中的应用。
- 根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述抑菌为抑制口腔有害菌。
- 根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述口腔有害菌包含金黄色葡萄球菌、具核梭杆菌、大肠杆菌、伴放线放线杆菌、福赛坦纳菌、中间普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、齿垢密螺旋体、变异链球菌、白色念珠菌或粘性放线菌中的一种或多种。
- 权利要求1～3任一所述多肽在制备调节口腔菌群平衡的产品中的应用。
- 权利要求1～3任一所述多肽在制备口腔用品中的应用。
- 根据权利要求8所述应用，其特征在于，所述口腔用品为口腔护理液、漱口水、牙膏或漱口水泡腾片中的一种或几种。
- 一种口腔用品，其特征在于，含有权利要求1～3任一所述多肽。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| CN202310002737.6 | 2023-01-03 |
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