JP7479381B2 - 治療または予防に使用するためのディフェンシン断片 - Google Patents

Description

本発明は、アルファディフェンシンに由来する特定のペプチド配列、ならびに医学的療法および／または予防におけるそれらの使用に関する。

嫌気性および好気性微生物、特に細菌および酵母、すなわち酸素と共にもしくは酸素なしで生存する、または酸素耐性である単細胞微生物は、様々な臨床像、例えば、創傷感染症および膿瘍、敗血症、特に腹腔内、泌尿生殖器、皮膚または口内、目内、耳内、および顎領域の感染症を引き起こす可能性がある。したがって、これらの病原性種は、多くの場合、皮膚および口腔の領域、特に炎症を起こした皮膚／湿疹、歯周組織、目および耳、ならびに胃の粘膜のひだ内の胃の領域、および十二指腸において、すでに発見され、局所的ではあるが、状況によっては全身性の急性および慢性の炎症を引き起こし得る。かなり薄くコロニーを形成した小腸でさえ、複数の通性嫌気性菌が小腸の非常に敏感な粘膜の病理学的変化を引き起し得る。細菌叢の主要部位である直腸では、確かに好気性細菌が優勢であり、ここでも、嫌気性代表が結腸粘膜の深刻な炎症反応を引き起こす可能性がある。カンジダ亜種（Ｃａｎｄｉｄａ ｓｓｐ．）は、多くの個体の糞便内にも見られ、潜在的に病原性がある。

現在、特にそのような疾患は、主に細菌の細胞壁を攻撃して破壊する抗生物質で治療されている。これらの炎症性疾患を抗生物質により治療するときに生じる大きい問題は、使用される抗生物質に対する耐性の発現であり、これは最近さらに進行している。これにより、病原性細菌／微生物が抗生物質の作用を弱めるか、完全に中和することができる。そして微生物が一般的な抗生物質に耐性があることが判明した場合には、その疾患は生命を脅かし得る。過去に多剤耐性細菌の数が大幅に増加した理由は、細菌は、その急速な成長および短い培養期間により、抗生物質を中和するための新しい戦略を継続的に開発できるためである。したがって、現在、抗生物質に加えて、例えば、天然、特に植物、および合成油および乳濁液も使用されている。

近年、自然免疫系の一部であり、微生物による感染に対する上皮の防御に極めて重要である抗菌ペプチドが、研究および治療器具の関心を集めている。

健康なヒトでは、皮膚および粘膜が微生物による感染に対する物理的障壁を形成する。物理的障壁は、健康な皮膚では、角質層、粘膜では粘膜層で構成されており、ここでは、落屑および粘液分泌により、表面が絶え間なく再生され、同時に表面に付着している微生物が継続的に除去される。皮膚にも存在する脂質との相互作用において、この物理的障壁は、生きている表皮に微生物が侵入するのを防ぐ。

しかし、この物理的障壁は別として、健康な皮膚および粘膜を感染から保護するためには、さらなる因子も必要であり、これらの因子としては、内因性抗菌ペプチド（ＡＭＰ）がある。例えば、リゾチームは、鼻の分泌物内に存在し、特にグラム陽性菌を死滅させることができる抗菌ペプチドである。腸粘膜の抗菌ペプチドとしても知られているのはディフェンシンであり、特に腸上皮が非常に大量の細菌にさらされていることを考えると、その存在が必要であると考えられる。腸内粘膜には、微生物にとって侵入が困難である粘液層を有するのみでなく、ヒトのディフェンシン－５（アルファディフェンシン）を分泌するパネート細胞が含まれており、他の機能の中でも、腸粘膜を継続的に再生するにあたって重要である幹細胞を保護する。ヒトでは、アルファディフェンシンおよびベータディフェンシンのみが発現する。アルファディフェンシンは、主に好中球、ＮＫ細胞、および特定のＴリンパ球サブセット内で発現するが、ヒトディフェンシン５およびディフェンシン６は、小腸のパネート細胞でのみ発現し、腸管腔内の微生物バランスの調節および維持に寄与する。一方、ベータディフェンシンは、最も広く分布しており、多くの種類の白血球および上皮細胞から分泌される。さらに知られているＡＭＰは、ソリアシン（ｐｓｏｒｉａｓｉｎ）として知られているペプチド、ならびにヒトにおいて効果的な内因性広域抗生物質を表すＲＮａｓ－７である。

既知の内因性抗菌ペプチドに加えて、多くの抗生物質も既存の技術において公知である。これらとしては、生物学的起源の物質、および合成により製造された物質の両方が挙げられ、したがって、真菌または細菌の自然に形成された（本来の意味で）低分子量代謝産物、または化学的に合成された治療剤のいずれかである。

特に、天然および合成抗生物質に対する耐性の発現が微生物感染症の治療をますます困難にしているという事実を鑑みて、副作用が少なく、製造および取り扱いが簡素である新規抗菌活性剤の必要性も頻繁に生じる。

胃腸の微小環境は、単一の細胞層上皮、粘液層、局所免疫系、およびマイクロバイオームで構成されており、これら４つの構成成分が一緒になって、健康な時期に恒常性を維持する上で重要な役割を果たす。ヒトの結腸には、腸内細菌１グラムあたり１０^１１～１０^１２細胞の高密度の微生物群集を保持し、ヒトの健康は、まとめて腸内マイクロバイオータとして公知である腸内の微生物の多様なセットと密接に関連している。一方で、それらの存在量および有病率は疾患に関連しており、例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）および感染性大腸炎でのフィーカリバクテリウム プラウスニッツィ（Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒａｕｓｎｉｔｚｉｉ）の場合と同様に、示されているとおり、他方では、バクテロイデス フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）などの粘膜種は、大腸炎から保護できる。

その結果、感染症の場合に抗生物質を適用すると、ヒトの結腸内での微生物組成が大きく影響を受け、微生物のバランスが崩壊される。ディフェンシンは、小さいカチオン性分子であり、３つの保存されたジスルフィド結合を特徴とし、ＡＭＰのメイングループを表している。現在までに、６つのアルファディフェンシン、すなわち４つのヒト好中球ペプチド（ＨＮＰ）１、２、３、および４、ならびに２つのヒトディフェンシン（ＨＤ）５および６がヒトにおいて同定されている。ＨＮＰは、好中球の兵器庫の一部を形成し、全身の自然免疫に関与するが、ＨＤは、腸のパネート細胞内に発現する。上記のように、小腸では、パネート細胞は、マイクロバイオータ組成のバランスを取り、様々なＡＭＰの分泌によって病原体の侵入から宿主を保護する上で重要な役割を果たすが、最も豊富なのは２つのαーデフェンシン５（ＨＤ５）およびαーデフェンシン－６（ＨＤ６）である。

ＨＮＰ－１、ＨＮＰ－２、およびＨＮＰ－３は単一のアミノ酸のみが異なるが、ＨＮＰ－４は、その配列が異なり、１つの追加の正電荷を有し、ＨＮＰ－１～３と比較して改善された殺菌活性を呈する^１－２。全長抗菌ペプチドの活性は、塩濃度、ｐＨ、酸化還元電位などの環境条件の影響を受ける^３－６。その強力な抗菌活性に基づいて、抗菌能力を備えた新規治療剤の前駆体としてＨＮＰ－４を使用した。正確に折りたたまれたディフェンシンの大規模な発現は大きな問題であるが、ＨＮＰ－４の小さい断片に焦点を当てた。天然に存在するプロテアーゼを使用して全長ペプチドを消化し、次いで、生成された断片を同定した。これらの断片の抗菌性および抗真菌性の試験を行い、細胞毒性および溶血性の能力を分析した。

アルファディフェンシンの抗菌活性は、過去に集中的に研究されており、それらの特定の配列の変化がそれらの活性の主要な変化に寄与する可能性があり、抗菌活性の完全な喪失にさえつながり得ることが認められている。

したがって、本発明によって解決される問題は、新規のまたは代替の防止的および／または治療的アプローチを提供することであり、それによって、感染症のみでなく、異常に関連する他の疾患、例えば、代謝性疾患、肺疾患、泌尿生殖器疾患、口、目、および耳の疾患、および皮膚疾患を防止するかつ／または効果的に治療することができる。

本発明によれば、この問題および他の問題は、抗菌活性を有し、アルファディフェンシン断片に由来するアミノ酸配列を有するペプチドを提供することによって解決され、このペプチドは、６～２７、特に、より短いペプチド断片からなり、直鎖ペプチド、例えば、７、９、１１、または１３の連続アミノ酸を有する直鎖ペプチドとして合成され得る。

ペプチドに共通するのは、それらが天然に存在するアルファディフェンシン、ＨＤ－５およびＨＮＰ－４の断片であり、天然に存在するペプチドを還元し、それらをプロテアーゼ活性を用いた切断にさらされることによって生成できることである。驚くべきことに、複数の予測される切断部位を含む関連ペプチド、ＨＤ－６は、同じ条件下で切断することができなかった。

天然に存在するアルファディフェンシンのこれらの短い断片は、小さい直鎖ペプチドとして化学的に合成できるという利点があり、したがって、全長ペプチドの製造と比較してコストを有意に削減できる。さらに、ペプチドのうちのいくつかは、有効濃度において無毒ではあるが、天然に存在する全長ディフェンシンの抗生物質効果を保持している。

これらのペプチドは、腸のマイクロバイオームを調節するために、および／または健康なマイクロバイオームのバランスの大きな変化を誘発することなく／乱すことなく抗菌剤として使用することができる。

本発明の範囲内で、アルファディフェンシンのペプチド配列が同定されており、これは、抗菌試験において、一方では、全長ペプチドと比較して、特定の（特に、病原性）細菌に対して抗菌効果の増加を有することが示され、一方で、微生物の多様性に対する新たに同定されたペプチドの影響はなかった。

これらの結果により、微生物感染症および細菌性疾患、さらには抗生物質耐性細菌によって引き起こされる疾患を治療するのみでなく、細菌感染症を防止するため、ならびに腸内マイクロバイオームおよび潜在的に他の上皮表面（例えば、肺、皮膚、尿生殖器管、口、目、耳など）のマイクロバイオームを調節するため、本発明によるペプチドの適用が可能になる。

したがって、本発明の範囲内で、この分野で一般的に理解されているように、「マイクロバイオームの調節」は、腸および上皮表面に存在する微生物に対するペプチドの有益な影響を意味する。上記のとおり、腸内微生物は、免疫、代謝、神経行動特性など、ヒトの健康の多くの態様の鍵となる。本発明に従って使用するためのペプチドを用いて、腸内マイクロバイオームの細菌の多様性、および潜在的に他の上皮表面の細菌の多様性を支持し、促進することができる。

「腸内マイクロバイオーム」とは、哺乳動物、特にヒトの腸を意味する。したがって、本発明の好ましい実施形態は、ヒトの腸内マイクロバイオームを調節する際に使用するためのペプチドに関する。

本発明のペプチドの一実施形態によれば、アルファディフェンシン断片は、ＨＤ－５またはＨＮＰ４の断片である。

冒頭で述べたように、ＨＤ－５は、小腸のパネート細胞内で発現する。シグナルペプチドおよびプロドメインなどのＨＤ５は、９４アミノ酸を含み、成熟ペプチドは、アミノ酸番号６３～９４を含む。

ＨＮＰ４はまた、冒頭で述べたように、好中球の顆粒内に発現する。シグナルペプチドおよびプロドメインなどのＨＮＰ４は、９７アミノ酸を含み、成熟ＨＮＰ４ペプチドは、アミノ酸番号６４～９６を含む。

本発明の好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドは、ＨＤ－５に由来する６～２７の連続するアミノ酸からなり、添付している配列表の
配列ＨＤ－５_１－９ＡＴＣＹＣＲＴＧＲ（配列番号１）または
配列番号１のリバース配列ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ（配列番号２）、
修飾ＨＤ－５_１－９：Ａｃ－ａｔｃｙｃｒｔＧｒ－ＮＨ_２（配列番号５）、
ＨＤ－５_１－１３、ＡＴＣＹＣＲＴＧＲＣＡＴＲ（配列番号３４）、
ＨＤ－５_１－２８、ＡＴＣＹＣＲＴＧＲＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲ（配列番号１２）、
ＨＤ－５_７－３２、ＴＧＲＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号１４
ＨＤ－５_{１０－３２}、ＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号１９、
ＨＤ－５_{１４－３２}、ＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号２５
ＨＤ－５_{１０－２７}ＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹ（配列番号２８）、または
ＨＤ－５_{２６－３２}ＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号４１）からなる。

一般に、アミノ酸配列の場合、大文字は、Ｌ－アミノ酸を示し、小文字はＤ－アミノ酸を示す。

好ましい実施形態では、ペプチドは、配列ＡＴＣＹＣＲＴＧＲ（配列番号１）、
ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ（配列番号２）、
Ａｃ－ａｔｃｙｃｒｔＧｒ－ＮＨ_２（配列番号５）、
ＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号４１）、
ＡＴＣＹＣＲＴＧＲＣＡＴＲ（配列番号３４）、
ＡＴＣＹＣＲＴＧＲＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲ（配列番号１２）、または
ＴＧＲＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号１４）からなる。

より好ましくは、ペプチドは、配列
ＡＴＣＹＣＲＴＧＲ（配列番号１）、
ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ（配列番号２）、
Ａｃ－ａｔｃｙｃｒｔＧｒ－ＮＨ_２（配列番号５）、または
ＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号４１）からなる。

好ましいペプチドとしては、ＨＤ－５_１－９：
ＡＴＣＹＣＲＴＧＲ（配列番号１）、
ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ（配列番号２）、または
Ａｃ－ａｔｃｙｃｒｔＧｒ－ＮＨ_２（配列番号５）をベースとしたものが挙げられる。

本発明の好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドは、７、９、１１、または１３の連続するアミノ酸のいずれかからなる。

本発明の好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドは、ＨＤ－５に由来する９つの連続するアミノ酸からなり、好ましくは、添付の配列表の配列ＡＴＣＹＣＲＴＧＲ（配列番号１）または配列番号１のリバース逆配列ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ（配列番号２）からなる。

本発明の別の好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドは、ＨＮＰ４に由来する１１の連続するアミノ酸からなり、好ましくは、配列ＶＣＳＣＲＬＶＦＣＲＲ（配列番号３）、配列番号３のリバース配列ＲＲＣＦＶＬＲＣＳＣＶ（配列番号４）、または修飾ＨＮＰ－４_１－１１：Ａｃ－ｖｃｓｃｒｌｖｆｃｒｒ－ＮＨ_２（配列番号６）からなる。

一実施形態では、本発明は、本発明のペプチドを製造する方法に関し、本方法は、還元されたＨＤ－５またはＨＮＰ－４をプロテアーゼ活性、例えば、トリプシンまたはキモトリプシンに供し、次いで精製することを含む。

ＨＤ－５またはＨＮＰ４に由来する、本明細書に開示および記載されるペプチドは、病原性細菌に対して優れた抗菌活性を呈すると同時に、共生マイクロバイオータ、例えば、腸内マイクロバイオータに特に影響を及ぼさないことが示されている。

好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドは、Ｌ－アミノ酸および／またはＤ－アミノ酸を含む。

現在、一般的に理解されているように、「Ｌ－アミノ酸」は、そのアミノ基がフィッシャー予測の左側にある特定のアミノ酸の立体異性体を指し、Ｄ－アミノ酸は、そのアミノ基が、フィッシャー予測の右側にあるアミノ酸の他の立体異性体を指す。本明細書の配列において、Ｌ－アミノ酸は、大文字で示され、Ｄ－アミノ酸は小文字で示されている。

ほとんどの天然ペプチドは、Ｌ配置のアミノ酸で構成されているが、Ｄ－アミノ酸は、タンパク質分解に対して強い耐性を示している。

したがって、好ましい実施形態によれば、本発明によるペプチドは、Ｄ－アミノ酸からなる。

別の実施形態によれば、本発明によるペプチドは、Ｌ－アミノ酸からなる。

別の実施形態によれば、本発明によるペプチドは、Ｄ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸の混合物、好ましくは交互のＤ－アミノ酸およびＬ－アミノ酸からなるか、または好ましくは１つのＬ－アミノ酸であり、残りのアミノ酸はＤ－アミノ酸を含む。

好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾を含む。

特に、例えば、それらの環境に存在するプロテアーゼにより、ペプチドの遊離Ｎ－／Ｃ－末端の分解および／または修飾を促進する環境において、Ｎ末端および／またはＣ末端の修飾により、本発明によるペプチドの例えば、安定性または半減期に影響を与える／増強することが可能である。

現在、一般的に理解されているように、Ｃ末端（カルボキシル末端、カルボキシ末端、Ｃ末端テール、Ｃ末端、またはＣＯＯＨ末端としても公知である）は、アミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端であり、遊離カルボキシル基（－ＣＯＯＨ）で終了しており、Ｎ末端（アミノ末端、ＮＨ_２末端、Ｎ末端、またはアミン末端としても公知である）は、タンパク質またはポリペプチドの始まりであり、ポリペプチドの末端にある遊離アミン基（－ＮＨ_２）と称される。ペプチド配列を書くための慣習は、Ｃ末端を右側に置き、Ｎ末端からＣ末端まで配列を書く。

好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドにおいて、Ｃ－末端修飾は、－アミド、－酸、－Ｎ－アルキル－アミド、－アルデヒド、－エステル、－ｐ－ニトロアニリド、および－７－アミノ－４－メチルクマリンからなる群の１つから選択される。

これらの修飾により、ペプチドの抗菌活性に主要な範囲まで影響を及ぼすことなく、ペプチドのＣ末端を保護することができる。

好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドにおいて、Ｎ末端修飾は、アセチル－、ホルミル－、ピログルタミル－、脂肪酸－、尿素－、カルバメート－、およびアルキルアミン－からなる群の１つから選択される。

両端、すなわちＮ末端およびＣ末端のいずれかが、上記の修飾のいずれかで修飾され得るか、または末端のうちの一方のみ、すなわち、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかのみで修飾され得ることが理解されるべきである。

好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドにおいて、Ｎ末端は、アセチル－（ａｃ）修飾を有し、Ｃ末端にはいかなる修飾も有さない。

好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドは、ペプチドは、Ｄ－アミノ酸からなり（またはそれを含み）、Ｎ末端でアセチル－（ａｃ）修飾を有し、Ｃ末端ではいかなる修飾も有さない。

Ｎ末端のアセチル化により、ペプチドのアミノ末端からの電荷が除去され、また、アセチル修飾により、ペプチドは、タンパク質内の自然な構造を模倣することを意味する。さらに、この修飾により、エキソペプチダーゼによって生じる酵素分解に向けて、得られたペプチドを安定化する。

好ましい実施形態によれば、本発明によるペプチドは、Ｎ末端アセチル修飾およびＣ末端アミド修飾を有する。

Ｃ末端のアミド修飾により、ペプチドは、タンパク質内の自然な構造を模倣することを意味する。さらに、この修飾により、ペプチド分子への追加電荷の導入が回避される。

好ましい実施形態によれば、本発明によるペプチドは、９つのアミノ酸を含み、ここで、８つのアミノ酸は、Ｄ－アミノ酸であり、１つのアミノ酸は、Ｌアミノ酸であり、さらに好ましくは、このペプチドは、Ｎ末端のアセチル修飾およびＣ末端のアミド修飾を含む。

好ましい実施形態によれば、本発明によるペプチドは、１１のアミノ酸を含み、ここで、すべてのアミノ酸が、Ｄ－アミノ酸であり、さらに好ましくは、このペプチドは、Ｎ末端のアセチル修飾およびＣ末端のアミド修飾を含む。

別の好ましい実施形態によれば、本発明によるペプチドは、化学的に合成されたペプチドまたは生物学的に発現されたペプチドである。

ペプチドを化学的に合成するための多種多様な方法が当技術分野において公知であり、ペプチドの化学合成は、古典的な液相技術を使用して実行され得るが、これらはほとんどの研究開発環境において固相法に置き換えられている。ペプチド合成の概要は、例えば、Ｓｔａｗｉｋｏｗｓｋｉら（「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｃｕｒ．Ｐｒｏｔ．Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，（２０１２年）、付録６９，１８．１．１－１８．１．１３）^７に見出され得る。

本発明を使用するためのペプチドの実施形態によれば、ペプチドは酸化状態または還元状態にある。

これに関連して、「酸化された」とは、システイン、メチオニン、トリプトファン、ヒスチジン、およびチロシンなどのアミノ酸残基を有するペプチド内で生じるジスルフィド架橋が存在するペプチドの状態を指す。「還元された」状態または形態は、ジスルフィド結合が形成されていないペプチドの形態を示す。

本発明内の「生物学的に発現された」ペプチドは、ペプチド（複数可）を発現するように修飾された遺伝子操作された宿主細胞によって、本発明に従って使用するためのペプチド（複数可）の発現を包含するものとする。

本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、現在、形質転換またはトランスフェクトされた細胞、または本発明に従って使用するためのペプチドをコードする外因性ポリヌクレオチド配列による形質転換またはトランスフェクションが可能な細胞として定義される。

様々な宿主発現ベクター系を利用して、本発明に従って使用するためのペプチドをコードする遺伝子を発現させ得る。そのような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、その後精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合、本発明の遺伝子産物をｉｎ ｓｉｔｕで使用するためのペプチドを呈する細胞も表す。

組換え産生のために、宿主細胞は、本発明の使用のためのペプチドをコードする発現系またはその一部またはポリヌクレオチドを組み込むように遺伝子操作され得る。ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（２０１２年）^８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年^９などの多くの標準的な実験マニュアルに記載されている方法によって行うことができる。

したがって、本発明によるペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞に安定に形質転換／トランスフェクトされるベクターに含まれ得る。ベクターにおいて、本発明のペプチド（複数可）をコードするポリヌクレオチドは、例えば、誘導性プロモーターの制御下にあり、その結果、遺伝子／ポリヌクレオチドの発現を特異的に標的化することができ、所望であれば、遺伝子をそのように過剰発現させ得る。

多種多様な発現系を使用して、本発明のポリペプチドを産生することができる。そのようなベクターとしては、とりわけ、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母の染色体エレメント由来、ウイルス由来のベクター、およびそれらの組み合わせ由来のベクター、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝的エレメント由来のもの、例えば、コスミドおよびファージミドなどが挙げられる。発現系コンストラクトは、発現を調節し、発生させる制御領域を含み得る。一般に、ポリヌクレオチドを維持する、増殖させるまたは発現させるのに、および／または宿主においてポリペプチドを発現させるのに好適である任意の系またはベクターを、この点に関する発現に使用してもよい。適切なＤＮＡ配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されているものなど、様々な周知の日常的な技術のいずれかによって発現系に挿入され得る。上記を参照のこと。

好ましい実施形態によれば、本発明に従って使用するためのペプチドは、以下のうちの少なくとも１つから選択される：
ＨＤ－５_１－９：ＡＴＣＹＣＲＴＧＲ（配列番号１）
ＨＤ－５_{１－９ｒｅｖ}：ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ（配列番号２）
ＨＤ－５_{１－９ｍｏｄ}：Ａｃ－ａｔｃｙｃｒｔＧｒ－ＮＨ_２（配列番号５）
ＨＮＰ－４_１－１１：ＶＣＳＣＲＬＶＦＣＲＲ（配列番号３）
ＨＮＰ－４_{１－１１ｒｅｖ}：ＲＲＣＦＶＬＲＣＳＣＶ（配列番号４）
ＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}：Ａｃ－ｖｃｓｃｒｌｖｆｃｒｒ－ＮＨ_２（配列番号６）

本発明の別の態様によれば、マイクロバイオームの調節におけるペプチドの使用は、腸、肺、泌尿生殖器、口、目、耳もしくは皮膚、または異常に関連する他の状態もしくは疾患の治療および／または予防における使用からなる。

上記のように、多様な細菌微生物を含む健康な腸内マイクロバイオームは、無傷の腸のみでなく、哺乳類、特にヒトの全体的な健康のために必須である。より低い細菌多様性は、とりわけ、炎症性腸疾患、セリアック病などの疾患のみでなく、肥満および２型糖尿病などの代謝性疾患を有するヒトにおいて再現性よく観察され、例えば癌のチェックポイント阻害剤治療の有効性もマイクロバイオームの影響を強く受けており、統合失調症のようなＣＮＳ疾患でさえマイクロバイオームの影響を受けることが報告されている。多様性の低下および疾患との関連は、種が豊富である腸の生態系が、環境の影響に対してより堅牢であることを示している。これは、無傷の生態系において機能的に関連する微生物が他の失われた種の機能を補償できるためである。

遺伝的に影響を受ける腸の疾患とは別に、特定の食物および食事のパターン、ならびに薬剤も、腸内の様々な種類の細菌の存在量に影響を及ぼし得る。多くの場合、腸内マイクロバイオームに対する栄養または食事のプラスの効果の変化との関連が観察され得るが、プレバイオティクスおよびプロバイオティクス食品を使用することにより、本発明によるペプチドは、その天然起源のために、より広範で、より便利で、非常に効率的なツールを提供する。また、本発明によるペプチドを用いて、そうでなければ栄養の変化および影響に対して非常に感受性の高い対象の治療が可能である。

本発明に従って使用するためのペプチドを用いて、腸疾患のみでなく、肺、皮膚、および脳の疾患も、腸の天然のマイクロバイオームに積極的に影響を与えることによって、効率よく防止するおよび／または治療することができる。

したがって、好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは、炎症性腸疾患、特にクローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、壊死性腸炎、過敏性腸症候群、海外旅行者下痢症、消化器癌および腸移植片対宿主病、代謝性疾患、好ましくは、糖尿病、および前糖尿病、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質異常症、および肺疾患、好ましくは、喘息およびＣＯＰＤ、および脳疾患、好ましくは、統合失調症、パーキンソニズム、双極性障害、自閉症およびうつ病から選択される疾患の防止／治療に使用される。

本発明によるペプチドを用いて、皮膚、口、目、耳、膣または循環の単純なマイクロバイオームに関連する疾患を効率よく防止するかつ／または治療することができる。

したがって、好ましい実施形態では、本発明によるペプチドは、敗血症、アトピー性皮膚炎、酒さ様皮膚炎、脂漏性皮膚炎、湿疹、癰、ブドウ球菌感染症、カンジダ症、蜂巣炎、伝染性膿痂疹、尋常性ざ瘡、毛巣洞嚢胞、水虫、白癬、伝染性軟腫症、皮膚リンパ腫、歯周炎、齲蝕、ドライアイ、シェーグレン病、結膜炎、眼瞼炎、麦粒腫、霰粒腫、眼窩周囲蜂巣炎、涙嚢炎、眼内炎、ブドウ膜炎、虹彩炎、乳様突起炎、前庭神経炎、水疱性鼓膜炎、肉芽性鼓膜炎（ｇｒａｎｕｌａｒ ｍｙｒｉｎｇｉｔｉｓ）、外耳炎、中耳炎、細菌性膣炎、トリコモナス膣炎、カンジダ、非感染性膣炎、炎症性膣炎から選択される疾患の防止／治療に使用される。

別の態様によれば、本明細書に記載のペプチドは、多剤耐性細菌によって誘発される感染症に対する抗菌剤としても使用され得る。本発明の範囲内では、本発明によるペプチドは、天然の腸内マイクロバイオームにプラスの影響を与えるために使用できるのみでなく、多剤耐性細菌を特異的に標的化するためのツールとしても使用でき、したがって、多剤耐性細菌によって引き起こされる感染症の治療／予防のための効率的なツールであることが見出された。別の目的によれば、本発明はまた、本発明によるペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬剤に関する。

現在、一般的にこの分野で理解されているように、「薬学的に許容される担体」は、言及された疾患の治療の分野において典型的に使用され、生物への本発明による生成物の投与を単純化するかまたは可能にし、かつ／またはその安定性および／または活性を改善する任意の賦形剤、添加剤、またはビヒクルを意味すると理解される。医薬組成物はまた、結合剤、希釈剤または潤滑剤を組み込むことができる。医薬担体または他の添加剤の選択は、意図された投与経路および標準的な医薬慣行に基づいて行うことができる。薬学的に許容される担体の使用は、それぞれの用量レジームに最も適合しているものに応じて、かつ同様に本発明による化合物と適合性があるかに応じて、溶媒、増量剤、または他の液体結合媒体、例えば分散剤もしくは懸濁剤、界面活性剤、等張剤、スプレッダーまたは乳化剤、防腐剤、カプセル化剤、固体結合媒体などで行うことができる。そのような追加の成分の概要は、例えば、Ｒｏｗｅ（編）ら：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ、第７版、２０１２年、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ^１０に記載されている。

本発明のペプチドは、局所投与用に配合された場合、皮膚状態の治療に使用することができる。局所投与の方法は当技術分野において公知である。

局所投与用に配合される場合、本発明の組成物は、担体、ビヒクルまたは媒体などの局所医薬または化粧品組成物に典型的な成分を含み得る。具体的には、担体、ビヒクル、または媒体は、皮膚、毛髪、爪、膣、尿道、耳、口腔、鼻腔、呼吸器系、眼領域および／または粘膜などの適用される組織と適合性がある。本発明の組成物および構成成分は、感染組織に接触するのに、または一般に、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー応答などを伴わずに患者に使用するのに好適である。必要に応じて、本発明の組成物は、検討中の分野において従来から使用されている任意の成分を含み得る。

それらの形態に関して、本発明の組成物は、溶液、エマルジョン（マイクロエマルジョンなど）、懸濁液、クリーム、ローション、ゲル、粉末、または組成物が使用され得る皮膚および他の組織への適用に使用される他の典型的な固体または液体組成物を挙げることができる。そのような組成物は以下を含み得る：追加の抗菌剤、保湿剤および水和剤、浸透剤、防腐剤、乳化剤、天然油または合成油、溶剤、界面活性剤、洗剤、ゲル化剤、皮膚軟化剤、抗酸化剤、芳香剤、充填剤、増粘剤、ワックス、臭気吸収剤、染料、着色剤、粉末、粘度調整剤および水、任意により麻酔薬、かゆみ止め活性剤、植物抽出物、コンディショニング剤、暗色化剤（ｄａｒｋｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）または淡色化剤（ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、光輝顔料（ｇｌｉｔｔｅｒ）、保湿剤、マイカ、鉱物、ポリフェノール、シリコーンまたはその誘導体、日焼け止め、ビタミン、ならびに薬効植物（ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎａｌ）。特定の実施形態では、本発明の組成物は、継続的または長期の治療が意図される場合に有益であり得るように、長期間安定であるように上記の成分と共に配合される。

本発明の組成物は、制御性組成物または徐放性組成物の形態であり得る。ここで、抗菌ペプチドは、追加の活性剤と共に、材料内にカプセル化されるか、または別の方法で含まれ、これにより、時間の経過と共に制御された方法で皮膚または患部領域に放出される。本発明の組成物は、マトリックス、リポソーム、ベシクル、マイクロカプセル、ミクロスフェアなどの中または上、あるいは固体粒子材料の中または上に含まれ得る。

本発明の組成物の投与は、任意の影響を受けたまたは感受性のある区域、例えば、脚、肩、背中（腰を含む）、腋窩、手のひら、足、首、鼠径部、胴体、または手もしくは足、肘、上腕、膝、上肢、臀部、胴体、骨盤、または感染の治療または防止が望まれる可能性のある身体の他の部分に行うことができる。そのような治療はまた、創傷領域の感染を治療するまたは防止するために、皮膚への切り傷、擦り傷、および火傷などの創傷を治療および／またはドレッシングするために企図される。

本発明の組成物は、約４．５～約６．３の範囲のｐＨを有する生理学的環境での使用に好適であり、したがって、組成物は、同様のまたは同等のｐＨで配合され得る。本発明による組成物は、室温または冷蔵条件下で保存することができる。本発明の組成物は、抗菌作用に有効な量の抗菌ペプチドを含む。一般に、組成物は、約０．０１％（重量／体積）～約２０％の抗菌ペプチドを含む。特定の実施形態では、組成物は、約０．５％～約１０％の抗菌ペプチド、例えば、約０．５％、約１％、約５％、または約１０％の抗菌ペプチドを含む。

本発明によるペプチドの特性、特徴および利点は、本発明による薬剤にも同様に適用される。したがって、本発明によるペプチドを含む薬剤はまた、以下から選択される疾患を治療および／または防止するために使用され得る；炎症性腸疾患、特に、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、壊死性腸炎、過敏性腸症候群、海外旅行者下痢症、消化器癌および腸移植片対宿主病、代謝性疾患、好ましくは糖尿病および前糖尿病、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質異常症、および肺疾患、好ましくは、ぜん息およびＣＯＰＤ；皮膚の疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、酒さ様皮膚炎、脂漏性皮膚炎、湿疹、癰、ブドウ球菌感染症、カンジダ症、蜂巣炎、伝染性膿痂疹、尋常性ざ瘡、毛巣洞、水虫、白癬、伝染性軟属腫、皮膚リンパ腫など；口の疾患、例えば歯周炎および虫歯；目の疾患、例えばドライアイ、シェーグレン病、結膜炎、眼瞼炎、麦粒腫、霰粒腫、眼窩周囲蜂巣炎、涙嚢炎、眼内炎、ブドウ膜炎、虹彩炎など；耳の疾患、例えば、乳様突起炎、前庭神経炎、水疱性鼓膜炎、顆粒性脊髄炎、外耳炎、中耳炎など；膣の疾患、例えば細菌性膣炎、トリコモナス膣炎、カンジダ、非感染性膣炎、炎症性膣炎など、ならびに敗血症、および精神疾患、好ましくは、統合失調症、パーキンソニズム、双極性障害、うつ病または自閉症。

別の好ましい実施形態によれば、ペプチドは、二量体、好ましくはホモ二量体として存在する。二量体は、好ましくは共有結合、適切にはジスルフィド結合を介して結合される。

ペプチドの二量体化は、当技術分野において公知である。ペプチドの二量体化に現在使用されている化学反応には、保護されていないペプチド間の化学選択的反応が含まれる。実施例は、以下の結合、例えば、Ｃｙｓ－マレイミドチオエーテル、ジスルフィドまたはトリアゾールの形成である。

前述の特徴および以下に言及される特徴は、それぞれの場合に示される組み合わせで使用できるのみでなく、本発明の範囲から逸脱することなく、他の組み合わせで、または単独の方式で使用することもできることを理解されたい。

ここで、本発明は、本発明の追加の特性、特徴、および利点をもたらす実施形態によってさらに説明される。実施形態は、純粋に例示的な性質のものであり、本発明の領域（ｓｃｏｐｅ）または範囲（ｒａｎｇｅ）を限定するものではない。

特定の実施形態で言及される特性はまた、一般に本発明の特性であり、これらは、それぞれの実施形態において適用可能であるのみでなく、本発明の任意の実施形態の文脈において孤立した方法でも適用可能である。

本発明はまた、以下の図面を参照することにより、さらに詳細に記載され、説明される。

ＨＤ－６ナノネット形成が十二指腸液の影響を受けないことを証明するための実験結果を示す図である。（Ａ）は、２ｍＭ ＴＣＥＰにより還元した後に十二指腸液とインキュベートしたＨＤ－６のクロマトグラフを示している。これらのｍ／ｚグラフでの保持時間、２、３、４、５、６倍のプロトン化イオンおよび中性質量のため、酸化および還元された全長ペプチドのみが検出された。（Ｂ）２００μｇ／ｍｌ ＨＤ－６または０．０１％ＨＡｃ（対照）および十二指腸液または０．９％ＮａＣｌ（対照）と共にインキュベートした還元ビーズを示している。これらのネットは、０．９％ＮａＣｌを含むＨＤ－６と同じように見えるため、ナノネットの形成は影響を受けなかった。倍率バー＝０．２μｍ。 ＨＤ－５および十二指腸液のインキュベーションが多くの異なる断片をもたらした実験の結果を示す図である。ＨＤ－５は、２ｍＭ ＴＣＥＰにより還元した後、十二指腸液とインキュベートした。（Ａ）還元型ＨＤ－５および十二指腸液のインキュベーションによるクロマトグラムの概要を示している。検出可能なすべての断片は灰色（ａ～ｍ）でマークし、（Ｂ）においてそれらの保持時間のために列挙されている。同定されたすべての断片および検出されたイオンおよびそれらの中性質量の質量電荷比（ｍ／ｚ）グラフ。ペプチド（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｅ）、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）、および（ｍ）は、合成およびそれらの能力のより深い調査のために選択した。（Ｃ）ここでは、選択した断片を、アミノ酸配列およびＨＤ－５配列での分布と共に（灰色で）列挙している。 ＨＤ－５断片が、共生細菌に対する抗菌活性ペプチドであることを証明する実験結果を示す図である。（Ａ）は、ＨＤ－５断片に対する感受性による様々な共生細菌の試験をまとめた表を示している図である。このヒートマップには、すべての細菌と、それらに対するＲＤＡの断片の活性が列挙されている。ＲＤＡでは、全長２μｇおよび各断片４μｇを使用した。５ｍｍを超える阻害区域は、高活性として決定され、２．５～５ｍｍは、低活性として決定され、２．５ｍｍは穿孔ウェルの直径であり、したがって活性はなかった。（Ｂ）ここで、図では、（Ａ）の元のデータは、少なくとも３つの独立した実験からの平均と標準偏差で配置されている。（Ｃ）様々なペプチドの作用機序を調査する電子顕微鏡写真を示す図である：大腸菌ＭＣ１０００をすべての異なる断片とインキュベートし、透過型電子顕微鏡法を実施し、得られた表現型を分析した。全長ペプチドＨＤ－５_ｆｌ（１μｍ）を除いて、すべての写真の倍率バーは０．５μｍである。 病原性細菌に対する様々な断片の抗菌活性を証明する実験の結果を示す図である。（Ａ）病原性細菌に対するＨＤ－５断片の抗菌活性の試験をまとめた表を示している。高活性（ＲＤＡの阻害区域＞５ｍｍ）、低活性（２．５～５ｍｍ）、および非活性（２．５ｍｍ）のヒートマップシステムを使用した。（Ｂ）少なくとも３回の独立した実験からの平均および標準偏差を含む（Ａ）のデータの図を示している。 システインおよびアルギニン置換を含むＨＤ５_１－９が、大腸菌および黄色ブドウ球菌の変異体に対してほとんど抗菌効果を示さないことを証明する実験の結果を示す図である。ＨＤ５_１－９およびその変異体の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、１８時間後の光学密度（ＯＤ_６００）の測定により、（Ａ）大腸菌ＢＷ２５１１３変異体および（Ｂ）黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３変異体に対して決定した。＋／－ＳＥＭを使用した３つの独立した実験の結果が示されている。 ＨＤ５_１－９および合成ＨＤ５_１－９の還元がその抗菌活性の完全な溶解を引き起こすことを要約した実験を示す図である。１８時間後の光学密度の測定により、いくつかの濃度の（Ａ）大腸菌ＢＷ２５１１３および（Ｂ）黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３の還元および酸化ＨＤ５_１－９および二量体の最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定した。その後、ＭＩＣを確認するために細菌をプレーティングした。＋／－ＳＥＭを使用した３つの独立した実験の結果を示している。 ＨＤ５_１－９処理細胞の代謝活性の低下がほとんど観察されなかったことを示す実験データを示す図である。ＨＤ５_１－９および二量体により処理した細胞の代謝活性を分析するために、ＷＳＴ－１アッセイを実施した。細胞株は、３．１２３～１００μＭの濃度のＨＤ５_１－９またはＨＤ５_１－９二量体で刺激され、２４時間または４８時間インキュベートした。活性は陰性対照に対して正規化している。陽性対照として、細胞を２％トリトンＸ－１００で処理し、陰性対照として、０．０１％酢酸で処理したものを使用した。結果は、３つの独立した実験（Ａ、Ｂ、Ｃ）の＋／－ＳＥＭでの平均を示している。 ＨＤ５_１－９の抗菌作用機序を示す図である。ＨＤ５_１－９によって誘発される細胞壁の損傷は、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２と黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３とでは異なる。ＨＤ５_１－９によって引き起こされる細菌細胞の損傷を検出するために、フローサイトメトリー分析を実施した。１．５ｘ１０^６大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２および黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３を、様々な濃度のＨＤ５_１－９（６．２５μＭ、１２．５μＭ、および５０μＭ）と共に１時間インキュベートした。（Ａ）ヨウ化プロピジウムまたは（Ｂ）膜感受性ＤｉＢＡＣ_３（３）色素のいずれかを使用して細菌を染色した。陽性対照として、１２．５μＭ ｈＢＤ３を使用し、未処理細胞は陰性対照として機能する。＋／－ＳＥＭを使用した３つの独立した実験の結果を示している。（Ｃ）透過型電子顕微鏡法を実施して、ＨＤ５_１－９（２００μｇ／ｍｌ）で処理した大腸菌ＭＣ１０００の形態学的変化を評価した。比較のために、全長ＨＤ５（ＨＤ５_ｆｌ）を使用し、０．０１％酢酸（ＨＡｃ）での処理は、陰性対照として機能した。バー：左上パネル：１μｍ；右上および左下：０．５μｍ；右下パネル：２μｍ。 糞便中のアッケルマンシアおよびＨＤ－５_１－９処理に対する感受性に関する調査および実験の結果を示す図である。（Ａ）ＨＤ－５_１－９またはＰＢＳで７日間処理されたマウスから収集された糞便サンプル（０日目、７日目、１４日目）中のアッケルマンシア属の量は、ＰＢＳ処理動物と比較して、ＨＤ－５_１－９処理動物において増加している（線形混合効果モデル；ｐ＝０．０７５）。ここでは、群あたりｎ＝６の平均が８０％信頼区間で示されている。（Ｂ）では、アッケルマンシアムシニフィラがＨＤ－５_１－９処理の影響を受けやすいかを試験した。（Ｂ）嫌気性ジャー内で３７℃で７２時間培養後の、未処理の対照と比較した成長率を％で示している。アッケルマンシアに対するＨＤ－５_１－９のＭＩＣは、このアッセイでは検出できなかった。グラフは、標準偏差がｎ＝３の平均を示している。 ＨＤ５_１－９で刺激されたヒトＰＢＭＣの炎症誘発性および抗炎症性免疫応答を示す図である。ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、１０μｇ／ｍｌ ＬＰＳ（サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ））と様々な濃度のＨＤ５_１－９で刺激した後、２４時間インキュベートした。ＰＢＭＣの上清を使用して、多検体キット（ＬＥＧＥＮＯｐｌｅｘ）によって産生されたサイトカインの数を定量化した。以下のサイトカインを評価した：炎症誘発性サイトカイン（Ａ）ＴＮＦ－α、（Ｂ）ＩＦＮ－γ、（Ｃ）ＩＬ－１β、（Ｄ）ＩＬ－６、（Ｅ）ＩＬ－８および抗炎症性サイトカイン、（Ｆ）ＩＬ－１０。陰性対照として、未処理の細胞を使用し、陰性対照に対してサイトカイン濃度を正規化した。結果は、３つの独立した実験の＋／－ＳＥＭでの平均を示している。統計分析のために、クラスカル・ウォリス検定を実行した。ｐ＞０．０５＝ｎｓ；ｐ≦０．０５＝^＊；ｐ≦０．０１＝^＊＊；ｐ≦０．００１＝^＊＊＊；ｐ＜０．０００１＝^＊＊＊＊。 ＨＤ５_１－９およびその二量体形態の毒性プロファイルは、ヒト細胞株に対していかなる細胞毒性の影響も示さないことを示す図である。（Ａ）代謝活性および（８）ＨＤ５_１－９および二量体の細胞毒性は、ＷＳＴ－１アッセイおよびＬＤＨアッセイを使用して決定した。ＨＴ２９－ＭＴＸ Ｅ１２細胞は、ＨＤ５_１－９またはＨＤ５_１－９二量体のいずれかで３．１２３～１００μＭの濃度で刺激し、４８時間インキュベートした。活性は、陰性対照または陽性対照のいずれかに正規化した。陽性対照として、細胞を２％トリトンＸ－１００で処理し、陰性対照として、０．０１％酢酸で処理したものを使用した。結果は、３つの独立した実験の＋／－ＳＥＭでの平均を示している。（Ｃ）さらに、ＨＤ５_１－９の溶血活性を分析した。赤血球懸濁液を様々な濃度のＨＤ５_１－９と共にインキュベートした。溶血活性は、０．１％トリトンＸ－１００の溶血活性に対して正規化した。これらの実験は、重複して実施した。 追加の毒性データを示す図である。ペプチド処理後、ＴＲ１４６細胞の細胞毒性効果はほとんど観察されなかった。ＨＤ５_１－９および二量体の細胞毒性効果を評価するためにＬＤＨアッセイを実施した。細胞株をＨＤ５_１－９またはＨＤ５_１－９二量体のいずれかで３．１２３～１００μＭの濃度で刺激し、２４時間または４８時間インキュベートした。活性は、陽性対照に対して正規化した。陽性対照として、細胞を２％トリトンＸ－１００で処理し、陰性対照として、０．０１％酢酸で処理したものを使用した。結果は、３つの独立した実験の＋／－ＳＥＭでの平均を示している。ＴＲ１４６細胞の細胞毒性効果は、（Ａ）２４時間および４８時間後のＨＤ５_１－９、ならびに（Ｂ）２４時間および４８時間後のＨＤ５_１－９二量体について評価した。さらに、（Ｃ）ＨＤ５_１－９および二量体の細胞毒性は、２４時間後にＨＴ２９－ＭＴＸ－Ｅ１２細胞で測定した。 全体的な糞便微生物群集を示す図である。ＨＤ－５_ｆｌとＨＤ５_１－９とを比較した１週間の治療後のすべてのマウス（群あたりｎ＝１２）を使用した加重および非加重ＵｎｉＦｒａｃ距離のＰＣｏＡ。 全体的な小腸微生物群集を示す図である。ＨＤ－５_ｆｌとＨＤ５_１－９とを比較した１週間の治療後１週目に屠殺したすべてのマウス（群あたりｎ＝６）を使用した加重および非加重ＵｎｉＦｒａｃ距離のＰＣｏＡ。 全長および断片化されたＨＤ－５処理によって異なる影響を受ける細菌属を示す図である。すべてのマウスを使用して、糞便マイクロバイオータの０日目、７日目、および１４日目にケージ用に調整された線形混合モデル（０日目および７日目の群あたりｎ＝１２、１４日目の群あたりｎ＝６に留意のこと）。有意に異なる属のみを提示した。 ＨＤ５_１－９の大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２および大腸菌ＢＷ２５１１３ならびにそのＬＰＳ変異体に対する抗菌活性を示す図である。（Ａ）大腸菌ＢＷ２５１１３変異体の細胞壁構築。大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２には全長ＬＰＳが含まれているが、大腸菌ＢＷ２５１１３にはＯ抗原がない。内核内にいくつかのリン酸残基がないΔｗａａＹとは対照的に、大腸菌ＢＷ２５１１３変異体ΔｗａａＧは、外核を含まない。最後の変異体ΔｗａａＰは、外核を含むが、内核にはリン酸残基を含まない。（Ｂ）ＨＤ５_１－９の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、１８時間後の光学密度によりペプチド濃度が異なる大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２および大腸菌ＢＷ２５１１３変異体に対して決定した。平均＋／－ＳＥＭを使用した少なくとも２つの独立した実験の結果が示されている。 黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３およびその細胞壁変異体に対するＨＤ５_１－９の抗菌活性を示す図である。（Ａ）黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３細胞壁変異体を使用して、ＨＤ５_１－９の電荷依存性抗菌効果を分析した。黄色ブドウ球菌変異体ΔｄｌｔＡは、Ｄ－アラニンを欠いており、これによりペプチドグリカン層がより負の電荷となる。同様の特徴は、細胞膜の負電荷を引き起こすＬ－リジンを欠く変異体ΔｍｐｒＦを有する。黄色ブドウ球菌変異体ΔｔａｒＨには、ペプチドグリカン層の強化をもたらす追加のテイコ酸が含まれている。（Ｂ）ＨＤ５_１－９の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３、および１８時間後の光学密度によりペプチド濃度が異なる変異体に対して決定した。＋／－ＳＥＭを使用した２つの独立した実験の結果が示されている。 ＨＤ５_１－９の抗菌効果が、グラム陰性菌に対する二量体形態と比較して異なることを示す図である。ＨＤ５_１－９およびＨＤ５_１－９－二量体の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、１８時間後の光学密度により、ペプチド濃度が異なる様々なサルモネラ種に対して決定した。平均＋／－ＳＥＭを使用した少なくとも２つの独立した実験の結果が示されている。 ＨＤ５_１－９の抗菌効果が、グラム陽性菌に対する二量体形態と比較して異なることを示す図である。ＨＤ５_１－９およびＨＤ５_１－９－二量体の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、１８時間後の光学密度により、異なるペプチド濃度で黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３および臨床分離株黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００に対して決定した。＋／－ＳＥＭを使用した２つの独立した実験の結果が示されている。 還元されたＨＮＰ－４が、トリプシンによって消化されることを示す図である。（Ａ）２ｍＭ ＴＣＥＰで還元後、還元したＨＮＰ－４をトリプシンとインキュベートしたクロマトグラムの概要を示す。検出可能なすべての断片は、赤または灰色（ａ～ｊ）でマークされ、保持時間により列挙されている。全長ペプチドは（ｉ）として、および断片ＨＮＰ－４_１－１１（ｄ）としてマークされている。 ＨＮＰ４誘導体が、共生細菌および病原性細菌に対して高い抗菌活性を示す図である。ＲＤＡを使用して、同定された断片およびその修飾型の共生細菌および病原性菌に対する抗菌力を分析した。ヒートマップを示すと、５ｍｍを超える阻害区域は、高活性であると判断され、２．５～５ｍｍは低活性であると判断され、直径２．５ｍｍ（穿孔ウェルの直径）は非活性としてマークされた。ヒートマップは、少なくとも３つの独立した実験に基づく。 ＨＮＰ－４_１－１１およびＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}が、高濃度でわずかな細胞毒性および溶血活性のみ示す図である。（Ａ）ＣａＣｏ２／ＴＣ７または（Ｂ）ＨＴ２９ ＭＴＸＥ２９細胞に対するＨＮＰ－４_１－１１およびＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}の細胞毒性活性を調査した。１５００個ウェルの細胞を播種し、２４時間後に様々なペプチド濃度で処理した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ２．０アッセイを使用して、９６時間の処理後に生細胞を測定した。（Ｃ）０．１％トリトン－Ｘ処理と比較したペプチドのヒト赤血球に対する溶血活性。材料および方法細菌株

アシネトバクター－バウマニ４－ＭＲＧＮ、肺炎桿菌４－ＭＲＧＮ、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３、エンテロコッカス‐フェシウム４７５７４７、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバシラス・サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）およびストレプトコッカスサリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）は、Ｒｏｂｅｒｔ－Ｂｏｓｃｈ－Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から臨床分離株として得た。アッケルマンシアムシニフィラ、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１６８ｔｒｐＣ、および黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ ｕｎｄ ｌｎｆｅｋｔｉｏｎｓｍｅｄｉｚｉｎ（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得た。

Ｂ．アドレセンティスＮｉ３，２９ｃ、Ｂ．ブレーベは、Ａｒｄｅｙｐｈａｒｍより提供された。Ｂ．ブルガタスＤＳＭ１４４７は、ＤＳＭＺより得て、Ｌ．ラムノーサスは、ｌｎｆｅｋｔｏＰｈａｒｍ（Ｈｅｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より提供された。大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌ／ｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ（Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より得た。サルモネラ種の臨床分離株、ならびに黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ ２５９２３、黄色ブドウ球菌ＳＡ１３３、およびその変異体は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙおよびＨｙｇｉｅｎｅ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙによって提供された。大腸菌ＢＷ２５１１３およびその変異体は、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙおよびＩｎｆｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｍ，Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから得た。
ペプチド すべての実験で、酸化ペプチドＨＤ－５およびＨＤ－６（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を使用した。すべての断片、すなわち、ＨＤ－５_１－９およびＨＮＰ－４_１－１１、ＨＤ－５_１－１３、ＨＤ－５_１－２８、ＨＤ－５_７－３２、ＨＤ－５_{１０－３２}、ＨＤ－５_{１４－３２}、ＨＤ－５_{１０－２７}およびＨＤ－５_{２６－３２}（本発明のすべてのペプチド）は、ＥＭＣ ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ＧｍｂＨ（Ｔｕｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。すべてのペプチドを同様の濃度の０．０１％酢酸（ＨＡｃ）に溶解した。

以下の配列（本発明によるペプチド）の試験を行った（Ｎ－＞Ｃ末端）：

胃内視鏡検査中の十二指腸液の収集。

ヒトの十二指腸液は、３名の健康な個体からの定期的な胃内視鏡検査中に収集した。十二指腸を０．９％ＮａＣｌ溶液で洗浄し、これを再度収集した。患者は、通知を受けた後、書面およびインフォームドコンセントを行った。サンプルコレクションは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙの倫理委員会によって以前に承認されていた。
ＬＣ／ＭＳを使用したＨＤ－５およびＨＤ－６の断片のスクリーニング。

２．５μｇのＨＤ－５またはＨＤ－６を、２ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンを含む５０ｍＭ ＮＨ_４ＨＣＯ_３バッファ（ｐＨ８．０）（Ｆｌｕｋａ）中で、３７℃で１５分間インキュベートした。その後、ヒト十二指腸液を添加し、３７℃でさらに３０分間インキュベートした。最後に、ギ酸およびアセトニトリルをそれぞれ最終濃度０．５％および１０％で添加し、質量分析によってサンプルを分析した。質量分析は、ＬＣ／ＭＳシステムとして、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＨＰＬＣ、ＡｇｉｌｅｎｔＡｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍａｐ（２．１ｘ１５０ｍｍ、２．７μｍ）カラムをカラム温度５５℃で流量０．４ｍｌ／分で使用し、質量分析用に６５４０ ＵＨＤ Ｑ－ＴＯＦ ＬＣ／ＭＳシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。サンプルは、アセトニトリルを含む０．１％ギ酸のグラジエントによって分離した。グラジエントは、２％アセトニトリルで４分間開始し、次に、３５分間で４５％に上昇させた。質量分析は、正のイオン極性を有する１００～３４００ｍ／ｚのシングルＭＳモードで実行され、Ａｇｉｌｅｎｔ ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｂ０６．００ソフトウェアによって分析した。
走査型電子顕微鏡

走査型電子顕微鏡は、前述のとおり実行した。簡潔に言えば、プロテインＡコーティングビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を、１％（ｗ／ｖ）ＴＳＢを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ中の還元ＨＤ－６（２００μｇ／ｍｌ）と３７℃で１．５時間インキュベートし、正味の形成を可能にした。続いて、サンプル全体を十二指腸液と共に３７℃さらに３０分間インキュベートした。対照として、０．０１％酢酸（ＨＡｃ）を使用した。ビーズを遠心分離し、カルノフスキー試薬で固定した。サンプルをＰＢＳで洗浄し、１％ＯｓＯ_４を含むＨ_２Ｏでさらに固定した。次に、それらを脱水して１００％エタノールとし、ＣＯ_２から乾燥させ臨界点とし、Ｍａｘ Ｐｌａｎｃｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で走査型電子顕微鏡によって分析した。
透過型電子顕微鏡

透過型電子顕微鏡実験は、以前に記載されたように実施した^１１。６ｘ１０^８ｃｆｕ大腸菌ＭＣ１０００を各ペプチド２００μｇ／ｍｌと共に２時間インキュベートした。細菌は、カルノフスキー固定液で固定させ、アガロースに包埋し、凝固させ、小さいブロックに切断させ、カルノフスキー溶液で再び固定させた。固定後、糖質エーテルブロックに包埋した後、ウルトラミクロトームを使用して切断した。切片（３０ｎｍ）を銅グリッドに載せ、Ｚｅｉｓｓ ＬＩＢＲＡ１２０透過型電子顕微鏡を使用して分析した。
放射状拡散アッセイ

すべてのペプチドの抗菌活性は、Ｌｅｈｒｅｒら^１２の修正放射状拡散アッセイにより試験を行った。短く説明すると、対数期細菌は液体トリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内で成長した（ＡｎａｅｒｏＧｅｎを含む嫌気性細菌、嫌気性ジャー内のオキソイド）。１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファｐＨ７．４で数回洗浄した後、アッセイごとに４ｘ１０^６ｃｆｕ／ｍｌを使用した。同定されたペプチド断片の抗菌効果を測定するために、細菌を、０．３ｍｇ／ｍｌ ＴＳＢ粉末および１％（ｗ／ｖ）低ＥＥＯ－アガロース（Ａｐｐｌｉｃｈｅｍ）を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）中でインキュベートした。次に、ペプチド断片をピペットで穿孔ウェルに入れ、３７℃で３時間拡散させた。その後、６％ＴＳＢ（ｗ／ｖ）および１％アガロースを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファを含む栄養豊富なゲルを最初のゲルの上に注いだ。２４時間後、阻害区域を測定した。陰性対照として０．０１％酢酸を使用したが、穿孔ウェルの直径よりも大きい阻害区域は示されなかった。すべての実験は少なくとも３回実施した。
濁度ブロスアッセイ

試験した細菌を１ｘＴＳＢブロスで一晩インキュベートし、遠心分離し、１％（ｗ／ｖ）ＴＳＢブロスを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファで洗浄した。５ｘ１０^５ｃｆｕ／ｍｌ細菌を、１％（ｗ／ｖ）ＴＳＢ（最終容量１００μｌ）を含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ中で様々なペプチド濃度で混合し、３７℃で２時間インキュベートした。その後、１００μｌの２ｘＴＳＢブロスを添加し、６００ｎｍでの光学密度を測定した（Ｓｐａｒｋ １０Ｍ，Ｔｅｃａｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）。細菌の成長を１２時間モニターし、アッケルマンシアムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）を除いて、測定中に３０分ごとに振盪させながら３７℃で成長させ、これを嫌気性ジャー内で３７℃でインキュベートし、７２時間後に成長を測定した。

細胞壁標的実験ならびにＨＤ－５二量体実験における大腸菌および黄色ブドウ球菌株の殺菌活性を、以前に記載したとおり評価した。対数期の細菌を遠心分離（２５００ｒｐｍ、１０分、４℃）で収集し、１％（ｗ／ｖ）ＴＳＢブロスを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファで２回洗浄し、ＯＤ６００ｎｍ（ＯＤ６００＝０．１）での光学密度を決定した。約５ｘ１０^５ＣＦＵ／ｍｌの細菌を、１％（ｗ／ｖ）ＴＳＢブロスを含む１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ中で最終容量１００μｌの連続ペプチド濃度（１．１７～１５０μＭ）で、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、１００μｌの６％ＴＳＢ（ｗ／ｖ）を添加し、６００ｎｍ（Ｔｅｃａｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で吸光度を測定し、１８時間モニターした。その後、ウェルあたり１００μｌをＬＢ－プレートにプレーティングし、微生物学的に生菌数を測定した。殺菌活性は、ＬＣ９９．９として表され、９９．９％以上の細菌を死滅させた最低濃度である。この実験は独立して少なくとも３回繰り返した。
細胞毒性アッセイ

ＣａＣｏ２／ＴＣ７（Ｘ、Ｘ）およびＨＴ２９ ＭＴＸ Ｅ２９（Ｘ、Ｘ）を、９０μｌの培地（１５００細胞／ウェル）の９６ウェルプレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、様々な濃度のペプチド処理を開始し（０．０１％酢酸に溶解した容量１０μｌ）、細胞を９６時間インキュベートした。未処理および１％トリトン－Ｘ処理細胞を対照として使用した。インキュベーション後、１００μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ２．０溶液を添加し、測定プロトコルを開始した。測定は、Ｓｐａｒｋ１０Ｍ（Ｔｅｃａｎ）で行い、１２分間連続振盪し、その後ウェルあたり１秒からの積分時間で発光測定を行った。実験は、重複して実施した。
溶血アッセイ

溶血活性は、既存のプロトコル後に測定した^１３。２名のボランティアドナーから血液を採取し（サンプル収集は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｔｕｂｉｎｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｙ）の倫理委員会によって事前に承認されていた）、１ｍｌの血液をＰＢＳで２回洗浄した。その後、血液を１０００ｇで遠心分離し、ＰＢＳで１％（ｖ／ｖ）の血液懸濁液を処理した。血液懸濁液を様々なペプチド濃度（最終濃度０．５％）で、３７℃で１時間インキュベートした。次に、サンプルを１０００ｇで１０分間遠心分離し、上清を収集して４１４ｎｍで測定した。溶血活性は、０．１％トリトンＸ－１００の溶血活性に対して相対的に決定した。これらの実験は、重複して実施した。
Ｉｎ ｖｉｖｏマイクロバイオータ分析

マイクロバイオータ組成に対する機能的影響の概念実証を評価するために、ケージあたり３匹の群で飼育された９週齢の健康な固形飼料を与えた雄マウスにＨＤ－５_１－９を投与した。実験開始前にマウスを３週間馴化させ、ケージあたりの平均体重に基づいて実験群に階層化し、群間において確実に均等な体重分布となるようにした。より詳細には、野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは、マウス１匹あたり７．１９μｇのＨＤ－５_１－９を含む１００μＬのＰＢＳ溶液を７日間強制経口投与することにより処理した。対照マウスは、等量のＰＢＳで処理した。最初に、７日間の実験を６匹／群のマウスで実行した。これらの結果に基づいて、腸内微生物調節の時間的影響を研究するために、６匹／群のマウスを含む新しい研究を設計した。この研究には、１週間の強制経口投与後、７日間の洗浄期間を含めた。体重を測定すると同時に、午前９時に、０日目、７日目、および１４日目（それぞれ治療群および対照群ｎ＝６）に個々のマウスから新鮮な糞便サンプルを収集した。１４日目に、マウスを安楽死させ、小腸内容物を収集した。

細菌ＤＮＡは、０日目、７日目、１４日目に収集された急速凍結糞便から抽出し、剖検時の小腸の内容物は、製造業者の指示に従ってＮｕｃｅｌｏＳｐｉｎ ９６土壌キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）によって抽出した。ＢＧＩ（Ｅｕｒｏｐｅ）は、社内の標準的な操作手順を使用して、その後のライブラリーの調製およびＤＮＡシーケンスを実行した。簡潔に言えば、サンプルあたり３０ｎｇの細菌ＤＮＡを、プライマー５１５Ｆ：ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡ（配列番号７）、８０６Ｒ：ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ（配列番号８）、Ｖ４ １６ＳｒＤＮＡ領域を標的とするイルミナアダプターを使用してＰＣＲ増幅させた。次に、ＰＣＲ産物をＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ（ＡＧＥＮＣＯＵＲＴ）で精製して、非特異的産物を除去した。平均分子長は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００バイオアナライザ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＤＮＡ １０００試薬）によって決定した。ＤＮＡの定量化は、ＨｉＳｅｑ２５００システムでのペアエンドシーケンシングの前に、リアルタイム定量ＰＣＲ（ＥｖａＧｒｅｅｎ（商標））によって評価した。

リードの処理および品質管理は、ＲパッケージＤＡＤＡ２バージョン１．４．０^１４を使用して実行し、フォワードおよびリバースプライマーはリードからトリミングした。次に、残りの呼び出されていない塩基または３つ以上の予想されるエラーを含むすべてのリードを除去した。その後、ＤＡＤＡ２エラーモデルのパラメーターは、１００万回のリードのランダムなサブセットから学習させた。次に、このエラーモデルを使用して、すべてのシーケンスのノイズを除去した。すなわち、ＡＳＶを推測する。次に、ノイズ除去されたリード（ＡＳＶ）がマージされ、順方向リードと逆方向リードとの間に１つ以上の競合する塩基を有するリードペアを除去した。２５１塩基より短く２５４塩基より長いＡＳＶは廃棄した。次に、関数「ｒｅｍｏｖｅＢｉｍｅｒａＤｅｎｏｖｏ」を使用して、キメラ配列を検出して除去した。最後に、リード（ＡＳＶ）は、Ｓｉｌｖａリファレンス１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子データベースバージョン１３２を使用して、キングダムから属レベルに分類され、すべてのサンプルのすべてのＡＳＶのリードカウントを含むＡＳＶテーブルを作成した。

すべての動物プロトコルは、Ｌａｖａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｈａｎｄｌｉｎｇ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって設定されたガイドラインに従って実施した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）は、１２：１２時間の明暗サイクルで、病原体のない温度制御された環境で飼育され、飼育場での宿泊５週間（馴化３週間および実験プロトコル２週間）、標準的なげっ歯類の固形飼料を自由に与えた（Ｈａｒｌａｎ Ｔｅｋｌａｄ Ｔ－２０１８年）。
統計分析

マイクロバイオーム分析を除いて、すべてのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７で分析した。ｐ値＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。図に示されているように、すべての結果は、平均とその±標準偏差、平均の標準誤差、または８０％信頼区間として表す。バイオインフォマティクス分析は、Ｒ Ｓｔｕｄｉｏ（Ｒバージョン３．４．２およびＲ Ｓｔｕｄｉｏバージョン１．０．１３６）およびパッケージｐｈｙｌｏｓｅｑ１．２２．３^１５、ｍｅｔａｇｅｎｏｍｅＳｅｑ１．２０．０^１６、ｖｅｇａｎ２．４－４^１７、ｌｍｅ４ １．１－１５、およびｇｇｐｌｏｔ２ ２．２．１^１８を使用して実行した。マウスの研究では、ケージで調整したｐ値を使用した。
ソフトウェア

Ｓｉｌｉｃｏダイジェスト分析としては、ＳＩＢ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｏｒｔａｌ（https://web.expasy.org/peptide_mass/）のＥｘＰＡＳｙ ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓツールを使用した。
結果

天然のヒト十二指腸液は、ＨＤ－５を消化するが、ＨＤ－６を形成するナノネットは、プロテアーゼ耐性である。

パネート細胞ディフェンシンは、天然に存在するチオレドキシンシステムによって還元され得るため、タンパク質分解消化物に対する感受性を調査した。実験手順を開始する前に、腸のプロテアーゼによるＨＤ－５およびＨＤ－６の断片化の可能性を調査した。したがって、ＥｘＰＡＳｙ（ＳＩＢ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｐｏｒｔａｌ）のＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓモジュールを使用して、ＨＤ－５およびＨＤ－６のｓｉｌｉｃｏ消化をトリプシン、キモトリプシン、または両方の組み合わせで実行し、５回までの切断の失敗を許容した。考えられる断片は、個々の質量に基づいて、以下の表１に列挙している。
十二指腸粘液インキュベーション後のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ（通常の文字）およびｅｘ ｖｉｖｏの現実（太字）では、トリプシンまたはキモトリプシン、あるいはその両方を組み合わせたパネート細胞ＨＤ－５およびＨＤ－６の消化で、５回まで切断の失敗および５００Ｄａを超える断片。ＥｘＰＡＳｙ ＰｅｐｔｉｄｅＭａｓｓモジュールを使用した様々な配列の決定。ヒトペプチドをヒト十二指腸粘液とインキュベートした後、質量分析により同定できる断片は太字で示す。表の最初の行は、２つの全長ペプチドを示しており、これらも同定できる。

理論的には、パネート細胞ディフェンシンは両方とも、プロテアーゼに感受性があるように見えるが、ＨＤ－６は、ＨＤ－５と比較してより多くの断片化の傾向を示した（表１）。第２のステップでは、還元剤トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）を使用して、ＨＤ－５またはＨＤ－６を還元し、タンパク質分解活性があることが知られている天然の十二指腸液にペプチドをチャレンジした。質量分析を行った後、ＨＤ－６の２ｍＭ ＴＣＥＰによる部分的な還元が見られた。これは、以前に公開された研究と一致している。２つの全長型ＨＤ－６_ｏｘ（予想：３７０５．４９Ｄａ）およびＨＤ－６_ｒｅｄ（３７１１．５４Ｄａ）のほかに、驚くべきことに、２、３、４、５、６倍のプロトン化イオンを示す質量電荷比（ｍ／ｚ）信号によって同定可能である他の断片はいずれも同定されなかった。この驚くべき観察は、タンパク質分解切断部位が生物情報学的に予測されたため、理由は依然としてわかりにくいが、ＨＤ－６_ｒｅｄがタンパク質分解消化から保護されていることを示している。その酸化還元状態に依存しないＨＤ－６の両方の形態（ＨＤ－６_ｏｘおよびＨＤ－６_ｒｅｄ）がナノネットを形成できることは公知である。したがって、正味の形成がプロテアーゼ分解から保護し、したがって、観察されたペプチド保護の機構的説明を提供し得るとの仮説が立てられた。ナノネットの形成がより安定した構造につながるか否かを明らかにするために、十二指腸液とインキュベートした還元型ＨＤ－６からの走査型電子顕微鏡検査を実施した（図１）。この仮説と一致して、十二指腸液のインキュベーションとは関係なく等しいナノネットが観察された（図１Ｂ）。まとめると、ナノネットの形成は、少なくともＨＤ－６のタンパク質分解消化の防止に寄与するものと考えられる。

次に、２番目のより豊富なパネート細胞ディフェンシンであるＨＤ－５を、同じ実験設定で研究した。２ｍＭ ＴＣＥＰおよび十二指腸液とのインキュベーション後、ＨＤ－５_ｏｘは検出限界（ＬＯＤ）を下回ったが、ＨＤ－５_ｒｅｄは非常に豊富であった。ＨＤ－５は、ナノネットを形成できないが、驚くべきことに、ＨＤ－６とは対照的に、十二指腸液がＨＤ－５に異なる影響を有することが観察された。既知のプロテアーゼ切断部位と一致して、ＨＤ－５の添加前には存在しなかった様々な断片が同定された（図２Ａ、太字で強調表示されている表）。これらの断片を分析し、質量電荷比で列挙し、各断片について、観察された様々なプロトン化イオンおよびその質量を示した（図２Ｂ）。同定された断片は、中性質量および保持時間と共に列挙しており、十二指腸液によるＨＤ－５の断片化により、ペプチド配列全体に由来する豊富な断片が得られたことを示している。しかし、依然として検出可能な量の全長ＨＤ－５_ｒｅｄを発見した。これは、タンパク質分解消化が不完全であったことを示唆している。Ｚｎ^２＋は、ＨＤ－５_ｒｅｄをタンパク質分解消化から保護できることが知られており、これは本発明の設定において実際に確認された（データは示していない）。要約すると、十二指腸液は驚くべきことにＨＤ－５およびＨＤ－６に異なる影響を及ぼしており、局所的な微小環境の状態の変化がディフェンシンの断片化に影響を有することが示された。注目すべきことに、ＨＤ－６ナノネットの形成は、還元された全長ペプチドの破壊に対して保護すると考えられ、ＨＤ－６の還元は、抗菌活性を明らかにすることが知られている。したがって、還元は両方のパネート細胞ディフェンシンの活性を変化させるが、ＨＤ－６は、直接抗菌活性を獲得する一方で、ＨＤ－５は、腸のプロテアーゼによって消化され、潜在的な生物活性抗菌活性を有する生物活性ペプチド断片を形成する。
ＨＤ－５断片は、放射状拡散アッセイにおいて抗菌活性がある

ＨＤ－５断片からの抗菌活性の試験を行うために、選択した断片を化学合成して、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの抗菌機能を調査した（図２Ｃ）。共生腸菌および病原性細菌に対して、４μｇの異なる断片と２μｇの全長ペプチドを用いていくつかの放射状拡散アッセイを実施した。興味深いことに、かつ驚くべきことに、ＨＤ－５由来断片のほとんどは、様々な程度まで、共生細菌および病原性細菌に対して抗菌活性があることが観察された。さらに、異なる断片は、適用された細菌株に対して異なる活性パターン（図３Ａおよび図３Ｂ）を呈することが見出された。予想通り、全長ＨＤ－５は、幅広い抗菌活性を示した。それでも驚くべきことに、ＨＤ－５_１－９は、抗菌活性の観点からのみでなく、試験が行われたすべての細菌に対して活性であったため、汎用性の観点からも最も活性の高いペプチドとして同定された。ＨＤ－５_１－９とは対照的に、ＨＤ－５_{１０－２７}は、測定可能な活性を呈さなかった。注目すべきことに、ＨＤ－５_１－１３、ＨＤ－５_１－２８、ＨＤ－５_７－３２、およびＨＤ－５_{２６－３２}も、ＨＤ－５_１－９よりも程度は低いが、抗菌特性を呈した。得られたペプチド処理細菌の表現型をさらに評価するために、大腸菌ＭＣ１０００をすべての断片とインキュベートし、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を実行した（図３Ｃ）。ＨＤ－５_ｆｌ処理により、内膜の分離、および細菌の細胞外皮の周りでの小さい小胞構造が生じることが観察された（図８）。興味深いことに、細菌は、異なる作用機序を示しているＨＤ－５の異なる断片とのインキュベーション後に、驚くべきことに異なる典型的な表現型を示した。ＨＤ－５_１－９の場合、細菌の１つの極に大きい液胞構造が追加されている分離した内膜が観察されたが、ＨＤ－５_１－１３およびＨＤ－５_１－２８処理により、細菌内でより大きい凝集が生じた（図８）。この調査結果は、様々な種類の細菌の表現型を示しており、この多様性は、わずかな配列の違い（ＨＤ－５_１－９およびＨＤ－５_１－１３など）が宿主微生物の相互作用の様々な機構となる可能性があることを示唆している。

注目すべきことに、かつ驚くべきことに、これらの観察は、異なるペプチドの抗菌活性が特定の群の細菌に適用されなかったことを示した。一例として、ビフィズス菌株、Ｂ．アドレセンティスおよびＢ．ロンガムはペプチドに対して非常に感受性が高かったが、Ｂ．ブレーベでは高くなかった。まとめると、上記の結果は、パネート細胞ＨＤ－５のタンパク質分解消化物が、共生腸内細菌を調節する小さい抗菌活性断片をもたらすことを示している。

次に、病原性グラム陽性菌およびグラム陰性菌（図４Ａおよび図４Ｂ）に対する抗菌活性を調べた。ここで、以前に試験が行われた共生細菌と同様に、これらの断片は抗菌活性であるが、抗菌効果は、断片間で劇的に異なることが見出された。驚くべきことに、ＨＤ－５_１－９、ＨＤ－５_１－１３、ＨＤ－５_７－３２、およびＨＤ－５_ｆｌは、試験を行ったすべての細菌の成長に強い影響を有するが、ＨＤ－５_１－２８、ＨＤ－５_{１０－３２}およびＨＤ－５_{２６－３２}などの他の断片は、様々な菌株に関して最小の活性であるかまたはより選択的であったことのみ観察された。対照的に、ＨＤ－５_{１４－３２}およびＨＤ－５_{１０－２７}は、試験された条件下で試験された細菌に対しては不活性であった。興味深いことに、ＨＤ－５_{１０－３２}の活性は、２つのグラム陽性菌に限定されていた。最初の実験（図３）で記載された発見と一致し、共生生物を死滅させる効率の観点から、ＨＤ－５_１－９は、グラムの状態に関係なく、すべての試験された菌株に対して活性であり、この特定の断片が細菌障壁の突破に対して非常に防御的であることが示唆されている。対照的に、ＨＤ－５_１－１３は、肺炎桿菌３－ＭＲＧＮを除いて、試験された病原性細菌を強力に制御した。全体として、これらの結果は、ＨＤ－６ではなくパネート細胞ＨＤ－５のタンパク質分解消化が、複数の短く活性な抗菌断片の生成につながることを示している。これらの断片は、局所的な環境条件に応じて単一の全長ペプチドに基づいて抗菌性の変動を広げるため、この驚くべき発見の重要性は非常に重要であることが証明され得る。
ＨＤ－５断片および抗生物質耐性菌に対する最小阻害濃度

潜在的な抗生物質治療用途に対するこれらの断片の可能性をさらに調査するために、様々な抗生物質耐性グラム陰性細菌株およびグラム陽性細菌株に対するペプチドの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を測定した。前述のＲＤＡ実験の結果は、共生細菌および病原性細菌に対する有望な抗菌活性を示した。様々なＨＤ－５断片の抗菌能力をより詳細に理解するために、濁度ブロスアッセイを実施して、これらのペプチドのＭＩＣを決定した。ＭＩＣは、すべての実験中で１２時間後に細菌の成長がいずれも検出されなかった濃度として決定した。このパラメーターを使用して、ＨＤ－５_１－９、ＨＤ－５_１－１３、ＨＤ－５_１－２８、ＨＤ－５_７－３２、およびＨＤ－５_{１０－３２}の抗菌活性を検出することができた（以下の表２を参照）。
病原性細菌に対するＨＤ－５断片のＭＩＣ（μＭおよびμｇ／ｍｌ）。各実験は、少なくとも３回実施した。ＭＩＣは、１２時間のインキュベーション後のすべての実験において、いかなる細菌の成長もない濃度として決定した。

これらの断片のＭＩＣ（μＭ）を全長ペプチドと比較すると、驚くべきことに、ほとんどのディフェンシン断片は、全長ペプチドと同じくらい活性であった。しかし、ペプチド断片のμｇ／ｍｌ ＭＩＣ濃度を比較したときに、必要な量は少なく、この濃度に基づいて、特にＨＤ－５_１－９は全長ペプチドよりも活性が高かった。注目すべきことに、Ａ．バウマニ４－ＭＲＧＮおよびＥ．フェシウム４７５７４７のＨＤ－５_１－９を除いて、観察されたＭＩＣは、比較的高く、これは、腸の障壁における抗菌活性物質の役割は、陰窩などの高濃度の領域に制限されていることが示されている。Ｉｎ ｖｉｖｏでのそれらの機能的能力を明らかにするために、特にパネート細胞が腸管内に自然に位置するため、それらの腸内マイクロバイオーム調節機能を調査することを目的とした。

抗菌活性は、グラム陰性菌とグラム陽性菌、およびカンジダ種に対する最小阻害濃度によって決定され、ＨＤ５_１－９の作用機序がジスルフィド結合および電荷に依存するかを調査した。したがって、システインのα－アミノ酪酸（Ａｂｕ）との交換およびアルギニンのシトルリン（Ｃｉｔ）との置換を含む、ＨＤ５_１－９のいくつかのバリアントが合成された。さらに、ＨＤ５_１－９の逆（ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ）およびランダム（ＣＴＲＡＴＹＣＲＧ）アミノ酸構造の試験を行った。ＨＤ５_１－９は、大腸菌ＢＷ２５１１３に対して強力な殺菌効果を示したが、ＨＤ５_１－９は、Ｓ．サルモネラ・エンテリカ血清型エンテリティディスに対して抗菌活性が低かった。同様の効果が、両方のグラム陰性菌に対する逆バリアントＲＧＴＲＣＹＣＴＡで観察された。

ＨＤ５_１－９バリアントは、配列がランダムであり、かつシステインまたはアルギニンアミノ酸のいずれかを欠いている場合、試験されたグラム陰性菌に対する抗菌活性を驚くほど失った。両方のＳスタフィロコッカス種について、ＨＤ５_１－９またはそのバリアントの殺菌効果は決定なかった。対照的に、ＨＤ５_１－９は、Ｅ．フェカーリスに対して強い細菌活性を示した。しかし、ＨＤ５_１－９のシステインおよびアルギニン置換により、殺菌効果およびランダム配列ＧＴＲＣＹＣＴＡおよびＣＴＲＡＴＹＣＲＧの完全な溶解がもたらされる。Ｅ．フェカーリスとは異なり、ＨＤ５_１－９もそのバリアントもＥ．フェシウムに対して殺菌効果を示さなかった。ＨＤ５_１－９およびバリアントの抗菌活性は、２４時間後に２つのカンジダ種に対してさらに調査した。真菌成長の阻害は、低い抗菌スペクトルを示すＣ．トロピカリスで観察できた。ＨＤ５_１－９のシステインおよびアルギニン置換は、真菌の成長阻害に影響を与えない。同様の効果がＣ．アルビカンスで観察されたが、ＨＤ５_１－９およびバリアントは、抗菌活性を示さなかった。要約すると、結果は、抗菌効果を誘発するために、現在のシステインおよびアルギニン残基とＨＤ５_１－９の元のアミノ酸構造の重要性を強く強調している。

以下の表３は、試験された細菌およびカンジダ種に対するＨＤ５_１－９の抗菌活性を示している。最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、１８時間または２４時間後の光学密度により、ＨＤ５_１－９濃度が異なる大腸菌ＢＷ２５１１３、サモネラエンテリティディス、黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３、表皮ブドウ球菌Ｅｖａｎｓ １９１６、Ｅ．フェカーリスＡＴＣＣ１９４３３、Ｅ．フェシウムＡＴＣＣ１９４３４、Ｃ．トロピカリスＡＴＣＣ４５６３およびＣ．アルビカンスＡＴＣＣ１０２３１で決定した。３つの独立した実験の結果が示されている：

以下の表４は、本発明によるＨＮＰ－４断片の効果も示している。この表から、本発明によるＨＮＰ－４ペプチド断片は、ＨＤ－５_１－９ペプチドと同様の抗菌挙動を示すことが確認できる。
表４：以下の表４は、ＨＤ５_１－９、ＨＤ５_{１－９；ｍｏｄ}、ＨＮＰ－４_１－１１、およびＨＮＰ－４_{１－１１；ｍｏｄ}の、試験された細菌およびカンジダアルビカンスに対する抗菌活性を示している。１２時間後、光学密度により、異なるペプチド濃度を有するＡ．バウマニ４－ＭＲＧＮ、Ａ．バウマニＤＳＭ３０００７、Ｅ．フェシウム４７５７４７、Ｅ．フェシウムＤＳＭ２０４７７、肺炎桿菌３－ＭＲＧＮ、肺炎桿菌ＤＳＭ３０１４０４、緑膿菌４－ＭＲＧＮ、緑膿菌ＡＴＣＣ２７８５３、緑膿菌ＰＡＯ１、緑膿菌ＸＰＡＴ１、緑膿菌ＸＰＡＴ２、黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３、Ｓ．エンテリティディス、大腸菌ＢＷ２５１１３、Ｙ．エンテロコリチカ、およびＣ．アルビカンス５２５Ｌの最小阻害濃度（ＭＩＣ）を決定した。３つの独立した実験の結果を示す：

ＨＤ－５_１－９処理は、特定の細菌属に影響するが、微生物の多様性には影響しない。

同定されたＨＤ－５断片のマイクロバイオーム調節機能を調査するために、固形飼料を与えたマウスをＨＤ－５_１－９またはＰＢＳで７日間経口投与（７．１９μｇ／マウス）した後、７日間ウォッシュアウトした。マウスの２つの群のマイクロバイオータ組成はベースラインでは区別できなかった（Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓ距離を使用したＡｄｏｎｉｓ ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．２２）。ＨＤ－５_１－９処理の７日後、対照（Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓ距離を使用したＡｄｏｎｉｓ ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０８）と比較して、糞便サンプル中の全体的なマイクロバイオータ組成に境界線の相違があったが、群のベースラインマイクロバイオータ（Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓ距離を使用したＡｄｏｎｉｓ ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．３８、データは示さず）と比較したところ、相違はなかった。ＨＤ－５は、小腸のパネート細胞から自然に分泌されるため、剖検時に小腸の微生物群集を調査した。ＨＤ－５_１－９で処理したマウスは、７日間のウォッシュアウト後、対照と比較して、小腸の微生物群集構造に統計的変化を呈さなかった（Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓ距離を使用したＡｄｏｎｉｓ ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．０９、データは示さず）。結果は、ＨＤ－５_１－９が、その顕著な抗菌効果にもかかわらず、固形飼料を与えた健康なマウスの全体的な糞便マイクロバイオータ組成を驚くほど変化させないことを意味する最初の実験と一致していた（図１２）。

糞便マイクロバイオータ組成のシャノン多様性は、ベースライン時は、群間で等しく（ウィルコクソン検定、ｐ＝１）、ＨＤ－５_１－９処理の７日後（ウィルコクソン検定、ｐ＝０．１８）および１４日目のウォッシュアウト後は依然としてほぼ同じであった（ウィルコクソン検定、ｐ＝０．０７）（データは示さず）。小腸マイクロバイオータの多様性は、同様に１４日目の２つの群間でほぼ同じであったが（ウィルコクソン検定、ｐ＝０．４５、図５Ｂ右）、７日目は異なっていた。ビヒクル強制飼養対照マウスと比較して、ＨＤ－５_１－９で処理されたマウスは、驚くべきことに細菌の多様性の増加を呈した（ｐ＝０．００４、データは現在示されている）。

実験設計ではさらに、潜在的なコケージ効果を層別化する線形混合モデルを使用して、同じマウスから繰り返しサンプル抽出して、糞便サンプルのペア分析を実行することが可能になった。糞便サンプル中のいくつかの少量の微生物属に対するＨＤ－５_１－９の有意な効果が確認された。より具体的には、パラサテレラ（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ）属およびＣａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｓｔｏｑｕｅｆｉｃｈｕｓ属の相対存在量の増加が観察された一方で、ラクノスピラ科（Ｌａｃｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）のＧＣＡ－９０００６６５７５およびヒドロゲノアネロバクテリウム（Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）は、ＨＤ－５_１－９処理によって減少した。アッケルマンシア属は、糞便サンプルでＨＤ－５_１－９によって境界線が増加した（線形混合モデル、ｐ＝０．０７５４、（データは示さず）。これにより、アッケルマンシアがＨＤ－５_１－９処理によって特異的に増加した（線形混合モデル、ｐ＝０．０７４８）最初の実験の所見が確認された。小腸のマイクロバイオータは、１４日目において２つの群間でほぼ類似していたが、アッケルマンシアの相対存在量は、ＨＤ－５_１－９によって増加し（線形混合モデル、ｐ＝０．００８５）、これは以前の実験の結果と一致した（線形混合モデル、ｐ＝０．０１７）。さらに、ルミノコッカス科のルミノコッカス＿１属は、相対存在量で増加し、インテスティニモナス、クロストリジウム科のＡＳＦ３５６、およびルミノコッカス科のルミノコッカス＿ＵＣＧ－０１３は相対存在量で減少した（データは示さず）。

総合すると、これらの結果は、ＨＤ－５_１－９が、驚くべきことに、固形飼料を与えた健康なマウスの全体的なコミュニティ構造または多様性に影響を与えることなく、糞便マイクロバイオータ中の特定の低存在量の細菌の量を変更させることを示している。

さらに、濁度ブロスアッセイにおいて、アッケルマンシアムシニフィラが、ＨＤ－５_１－９に対して感受性があるかを試験した。これらの調査結果は、ＨＤ－５_１－９の濃度が低くても、アッケルマンシアムシニフィラの成長をわずかに減少させるが、細菌を死滅させることはなかったことを示している（図９Ｂ）。

ＨＤ５_１－９の炎症誘発性および抗炎症性効果の試験が行われ、ＩＦＮ－γおよびＩＬ－８を減少させる用量依存性の傾向を伴う低い抗炎症効果があった事実にもかかわらず、これは統計的に有意ではなく、ＩＬ－１０を増加させる用量依存的な傾向も見られなかった（図１０）。

ＨＤ５_１－９の毒性効果は、多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ実験でも試験されたが（図１１および図１２）、ＨＤ５_１－９は、短い直鎖ペプチドであるにもかかわらず、驚くべきことにいかなる毒性も観察されなかった。
大腸菌ＢＷ２５１１３および黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３の変異体における細胞壁標的の同定

ＨＤ５_１－９の作用機序は、大腸菌ＢＷ２５１１３および黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３の細胞壁変異体を使用して同定した。この目的は、細胞壁のいずれの成分がＨＤ５_１－９の結合に重要であるか、および電荷が重要な役割を果たすかを分析することであった。濁度アッセイを上記のように実施した。ＭＩＣを決定することにより、異なるＬＰＳ構造を有する大腸菌株を調査した（図１６）。野生型大腸菌ＢＷ２５１１３および大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２を対照として使用した。最後のものは、大腸菌ＢＷ２５１１３と同様の細胞壁組成を含むが、さらにＯ抗原は、全長ＬＰＳを有する。変異大腸菌ＢＷ２５１１３ΔｗａａＧは、内膜に野生型と同量のリン酸残基を含むため、同様の電荷を所有しているが、外核が欠落している。変異体ΔｗａａＹは外核を含むが、内核のいくつかのリン酸残基が欠落している。最後の大腸菌変異体ΔｗａａＰも外膜を所有しているが、内膜にリン酸残基がないため、内膜の電荷がより正になる^１９。

ＨＤ５_１－９の抗菌活性は、様々な大腸菌株および変異体に対して分析した。全長ＬＰＳを含む大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２は、Ｏ抗原を含まない試験済みの大腸菌ＢＷ２５１１３と同様に、ＨＤ５_１－９に対して非常に感受性が高かった。ＨＤ５_１－９が細菌の細胞壁へ結合している間の外核の機能を明らかにするために、変異体ΔｗａａＧを使用した。

ＭＩＣの測定は、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２および大腸菌ＢＷ２５１１３のようなΔｗａａＧに対して、ＨＤ５_１－９の同様の抗菌効果を示している。驚くべきことに、１つの内核リン酸を含まない大腸菌ΔｗａａＹおよび２つの内核リン酸を含まない大腸菌ΔｗａａＰは、ＨＤ５_１－９に対してより耐性がなかった。カチオン性抗菌ペプチドが、静電相互作用のために、細胞壁のアニオン性リン脂質と相互作用することが知られているため、この観察は驚くべきことである。細胞壁の内核にこの負電荷がない場合、通常、ペプチドが細菌の細胞壁に結合する能力が低下するであろう。しかし、ＨＤ５_１－９は、驚くべきことに、記載されているすべての大腸菌変異体について、約１２．５μＭの濃度で殺菌効果を示している。抗菌活性は、細胞壁の負電荷に依存するのみでなく、グラム陰性菌には追加の結合部位が存在しなければならないことが説明され得る。

ＨＤ５_１－９および変異体の抗菌活性は、様々な細胞壁変異を有する様々な黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３株に対して調査した（図１７）。目的は、ＨＤ５_１－９がグラム陽性菌の細胞壁にどのように結合できるか、および電荷がＨＤ５_１－９の抗菌活性に決定的な役割を果たすかを調査することであった。

最初の変異体ΔｄｌｔＡは、ペプチドグリカン層内にＤ－アラニンを含むことなく、ペプチドグリカン層のより負の電荷をもたらす^２０。変異体ΔｍｐｒＦは、Ｌ－リジンを欠いており、細胞膜のより負の電荷をもたらす^２１。最後の変異体ΔｔａｒＨは、さらに壁テイコ酸を含み、これは、ペプチドグリカンの強化を引き起こす^２２。ＨＤ５_１－９は、野生型株黄色ブドウ球菌ＳＡ１１３に対して成長阻害を示さなかったのに対し、より負のペプチドグリカン層を含む黄色ブドウ球菌ΔｄｌｔＡ変異体は、ＨＤ５_１－９に対してはるかに感受性が高く、６．２５μＭでＭＩＣを示した（図１５）。ＨＤ５_１－９は、Ｌ－リシンを欠くΔｍｐｒＦ変異体に対しても殺菌効果を示し、細菌の細胞膜がより負の電荷となる。しかし、驚くべきことに、黄色ブドウ球菌ΔｔａｒＨ変異体内での追加のテイコ酸によるペプチドグリカン層の強化は、ＨＤ５_１－９の抗菌効果を減少させた。

これらの結果は、ＨＤ５_１－９のグラム陽性菌への結合に対する細胞壁電荷の重要性を強調しているのに対し、細胞壁電荷は、グラム陰性菌への結合にとって重要性は低いと考えられる。
異なる細菌に対するＨＤ５_１－９およびＨＤ５_１－９－二量体の抗菌活性の特性評価

ＨＤ－５は、ロイシン残基を所有しており、二量体を形成することができる。ＨＤ５のロイシン置換は、抗菌活性および微生物を殺傷する能力の低下を引き起こし、ＨＤ５の二量体化がその機能にとって重要であることを示している（Ｒａｊａｂｉら、２００８年、２０１２年；Ｓｚｙｋら、２００６年）^{２３－２５}。さらに、ＨＤ５のシステイン残基は、ジスルフィド結合または水素結合により二量体を構成することができる。研究では、ＨＤ５のシステイン変異は、酸化的フォールディング、抗菌活性、グラム陰性菌の膜透過性、およびタンパク質分解の安定性に影響を与えることが示されている（Ｗａｎｎｉａｒａｃｈｃｈｉら、２０１１年）^２６。

したがって、システイン残基の存在により、ＨＤ５_１－９も二量体を形成できると仮定することは合理的である。ＨＤ５_１－９の２つの単量体は、ジスルフィド結合を介して連結し、二量体化をもたらした。この目的は、選択された細菌に対する単量体型と比較した、二量体型に構造化されたＨＤ５_１－９の抗菌活性を調査することであった。ＨＰＬＣおよび質量分析は、２つの単量体間に１つのジスルフィド架橋が存在することと一致するＭＷ２０５８を有するものとして二量体を同定する。

最小阻害濃度は、ＨＤ５_１－９と同じ濃度で処理されたグラム陽性菌（黄色ブドウ球菌種）およびグラム陰性菌（サルモネラ菌種）の濁度アッセイにおいて決定した。

実施された実験は、ＨＤ５_１－９の抗菌活性が驚くべきことにその二量体形態に類似しているか、または試験された細菌に対してさらに優れていることを示した。ＨＤ５_１－９の抗菌活性およびその二量体の形態は、様々なサルモネラ種に対してほぼ同じである（図１８）。しかし、驚くべきことに、二量体化したＨＤ５_１－９は、ＨＤ５_１－９の単量体型と比較して、黄色ブドウ球菌種に対してはるかに優れた殺菌活性を示した（図１９）。これは、ＨＤ５_１－９の２つの形態の驚くべき異なる作用機序を意味する。
トリプシン消化後の新規ＨＮＰ－４断片の同定

ＨＮＰ－４を２ｍＭ ＴＣＥＰとインキュベートして、ジスルフィド結合を開き、これにより、タンパク質分解消化を受けやすいより直線的な構造をもたらした。トリプシンでインキュベートした還元型ＨＮＰ－４をＬＣ／ＭＳ法で分析し、いくつかの断片を検出することができた（図２０Ａ）。観察されたイオンおよびそれらの質量電荷比によれば、これらの断片を明確に同定することができ、これらの断片は、トリプシンの切断部位に基づいて、ほとんどがＮ末端領域内にある。ＡＭＰの正味電荷が抗菌活性に重要な役割を果たし得ることは一般に認められているため、＋３の正の正味電荷を有するＨＮＰ－４_１－１１に焦点を当てた。
ＨＮＰ－４_１－１１の抗菌効果

短い直鎖ペプチドの自然な安定性は弱いため、ＨＮＰ－４_１－１１の追加の修飾型（ＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}）を使用した。ここでは、Ｌ－アミノ酸をＤ－アミノ酸と交換し、Ｎ末端（アセチル化）およびＣ末端（アミド化）を修飾した。両方の修飾により、安定性が向上するものとする^{２７－２８}。したがって、より強力な抗菌活性が得られる可能性がある。ＨＮＰ－４_ｆｌ、ＨＮＰ－４_１－１１、およびＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}の抗菌活性を分析するために、様々な共生病原性細菌のサブセットに対してＲＤＡを使用した。試験したペプチドはすべて、試験した細菌のほとんどに対して強力な抗菌活性を示した（図２１）。ＲＤＡは、様々なペプチドの一般的な抗菌活性を決定するための適切なアッセイであるが、アガロースゲルでの様々な能力（拡散など）に応じて、様々なペプチドを比較することはできない。したがって、次に濁度ブロスアッセイを使用して、病原性（一部の多剤耐性菌）グラム陰性菌およびグラム陽性菌および１つの真菌株に対するＨＮＰ－４_ｆｌ、ＨＮＰ－４_１－１１、およびＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}のＭＩＣを決定した（表５）。すべてのペプチドが、試験した細菌に対して抗菌活性を示したが（唯一の例外：クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＤＳＭ３０１０４に対するＨＮＰ－４_ｆｌ）、ＨＮＰ－４_１－１１が、ＨＮＰ－４_ｆｌと驚くほど等モルであり、これは、ＨＮＰ－４ｆｌを生成するための天然の複合体ＨＮＰの抗菌効果は、最初の１１のアミノ酸（ＨＮＰ－４_１－１１）にのみ依存していることを示している。この直鎖断片の殺菌効果の向上をさらに指摘すると、非修飾型よりも安定性の向上を呈することが予想されるＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}は、ＨＮＰ－４_ｆｌおよびＨＮＰ－４_１－１１の両方よりも優れており、ＭＩＣは、天然に存在する全長ペプチドで観察されたものの数分の１であった。このように、トリプシン消化によって全長ペプチドの抗菌活性が解放され、これによって、モルレベルで全長ペプチドの抗菌活性を超える顕著な抗菌力を有する単一の断片を同定した。驚くべきことに、ペプチドの抗菌効果は、多剤耐性株と非耐性株との間で同等に効率的であることが観察された。したがって、ＡＭＰのタンパク質分解消化を使用して、抗生物質耐性菌を克服するための新規戦略につながる可能性のある新規活性配列を生成することができる。

ＨＮＰ－４_１－１１およびＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}の細胞毒性および溶血効果

ＨＮＰ－４_１－１１およびＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}の治療剤としてのｉｎ ｖｉｖｏ用途の可能性を判断するために、２つの異なる細胞株を使用して、それらの細胞毒性能力を調査した。より高いペプチド濃度でＣａＣｏ２／ＴＣ７細胞に対するわずかな細胞毒性効果のみが観察されたが（図２２Ａ）、ＨＴ２９ ＭＴＸ Ｅ２９細胞は両方の試験ペプチド誘導体に対してより感受性が高かった（図２２Ｂ）。重要なことに、低濃度（例えば、１２．５μＭ、ＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}が強力な抗菌効果を有する）では、断片は、中程度の細胞毒性のみ呈した。さらに、ペプチドの溶血活性を調べた（図２２Ｃ）。ＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}は、１５０μＭで（殺菌効果に必要とされる最高濃度をはるかに超えている）２０％の溶血効果を示すが、１８．７５μＭ以下、すなわち生物学的に関連する最高濃度では、毒性はごくわずかであった。したがって、１．２５μＭで８０％の溶血効果を示したミツバチ毒素であるメリチンと比較して、ＨＮＰ－４_１－１１およびＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}は両方とも低い溶血活性で現れた。

結論として、同定された細胞毒性濃度は、対応する殺菌濃度よりもはるかに高かった。
まとめ

上記の研究および発明の範囲内で、アルファディフェンシンおよびプロテアーゼに対するそれらの感受性に関するいくつかの新しい発見がなされた。ＨＤ－６のｉｎ ｓｉｌｉｃｏ消化からわかるように、ＨＤ－６が十二指腸液中に天然に存在するプロテアーゼの影響を受けなかったことはかなり驚くべきことであった。ＨＤ－６とは異なり、ＨＤ－５は分解され、その断片には、驚くべきことに、共生細菌および病原性細菌に対する抗菌活性が含まれていた。

ＨＤ－５断片の抗菌スペクトルの測定により、共生細菌および病原性細菌の両方に対して高い抗菌活性が明らかになった。抗菌スペクトルは、母ペプチドのスペクトルとは異なり、ＨＤ－５断片間でも異なっていたため、これらのＨＤ－５断片は、さらなる細菌の死滅またはマイクロバイオータの調節能力を加えているようである。この興味深く驚くべき現象は、いくつかの腸ディフェンシンが腸の様々な部分で非常に異なる共生コロニー形成をどのように調節できるかまたはサポートできるかを理解することにも寄与する。

本研究および本発明において、ＨＤ５_１－９、ＨＤ５_１－１３、ＨＤ５_１－２８、ＨＤ５_７－３２、ＨＤ５_{１０－３２}、ＨＤ５_{１４－３２}、ＨＤ５_{１０－２７}およびＨＤ５_{２６－３２}がマイクロバイオータ調節効果を所有することが示された。いくつかの低存在量の細菌株への影響に加えて、本発明の結果は、驚くべきことに、ＨＤ５_１－９が経口投与されたマウスのみが、未処理のマウスと比較して、アッケルマンシアムシニフィラの量が増加し、さらに他の細菌とは異なり、アッケルマンシアムシニフィラは、濁度ブロスアッセイにおいて、ＨＤ５_１－９に対して感受性を示さないことを示した。このことは、アッケルマンシアム属が、マイクロバイオーム分析において増加した所見に適合している。アッケルマンシアムシニフィラに対するこのような驚くべき影響は、ＨＤ－５ペプチドの全長についてはこれまでに記載されていない。これは、全長ペプチドとその断片間の異なるスペクトルを強調している。

本研究および本発明は、ＨＤ５_１－９のグラム陽性菌への結合に対する細胞壁電荷の重要性を強調しているが、細胞壁電荷は、グラム陰性菌への結合については重要性が低いと考えられる。実施された実験はさらに驚くべきことに、二量体型ＨＤ５_１－９が、ＨＤ５_１－９の単量体型と比較して黄色ブドウ球菌種に対してはるかに優れた殺菌活性を示したことを実証した。これは、ＨＤ５_１－９の２つの形態の異なる作用機序を意味する。

ＨＮＰ－４_１－１１は、驚くべきことにＨＮＰ－４_ｆｌと等モルであり、これは、天然の複合体を生成するＨＮＰ－４_ｆｌの抗菌効果が、最初の１１のアミノ酸（ＨＮＰ－４_１－１１）にのみ依存していることを示している。驚くべきことに、この直鎖断片の殺菌効果の向上をさらに指摘すると、非修飾型よりも安定性の向上を呈することが予想されるＨＮＰ－４_{１－１１ｍｏｄ}は、ＨＮＰ－４_ｆｌおよびＨＮＰ－４_１－１１の両方よりも優れており、ＭＩＣは、天然に存在する全長ペプチドで観察されたものの数分の１であった。このように、トリプシン消化によって全長ＨＮＰ－４ペプチドの抗菌活性が放出され、モルレベルで全長ペプチドの抗菌活性を超える顕著な抗菌力を有する単一の断片を同定した。驚くべきことに、ペプチドの抗菌効果は、多剤耐性株と非耐性株との間で同等に効率的であることが観察された。

それらのマイクロバイオータ調節能力に加えて、抗菌活性ペプチドの別の重要な分野は、抗生物質耐性細菌の数が急速に増加していることである。本明細書で同定されたペプチド断片の抗菌スペクトルは、これらのペプチドを多剤耐性菌に対する新しい抗生物質の供給源として使用できるようになる。また、これらの簡単で安価なペプチド断片の発見は、マイクロバイオーム組成を治療的に操作し、小腸のクローン病などのパネート細胞関連疾患を治療するための新しい代替アプローチである。
参考文献
1. Lehrer, R. I. & Lu, W. a-Defensins in human innate immunity. lmmunol. Rev. 245, 84-112 (2012).
2. Ericksen, B., Wu, Z., Lu, W. & Lehrer, R. I. Antibacterial Activity and Specificity of the Six Human a-Defensins. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 269-275 (2005).
3. Schroeder, B. 0. et al. Reduction of disulphide bonds unmasks potent antimicrobial activity of human 13‐defensin 1. Nature 469, 419‐423 (2011).
4. Chu, H. et al. Human a‐defensin 6 promotes mucosal innate immunity through self‐assembled peptide nanonets. Science 337, 477‐481 (2012).
5. Schroeder, B. 0., Stange, E. F. & Wehkamp, J. Waking the wimp: redox‐modulation activates human beta‐defensin 1. Gut Microbes 2, 262‐266 (2011).
6. Wendler, J. et al. Bacterial periplasmic oxido-reductases are essential for the activity of oxidized human antimicrobial 13-defensin 1. Infect. lmmun. IAl.00875-17 (2018) doi:10.1128/IAl.00875-17.
7. Stawikowski, M. & Fields, G. B. Introduction to peptide synthesis. Curr Protoc Protein Sci Chapter 18, Unit 18.1 (2012).
8. Davis, L. Basic Methods in Molecular Biology. (Elsevier, 2012).
9. Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual.
Molecular cloning: a laboratory manual. (1989).
10. Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Cook, W. G. & Fenton, M. E. Handbook of Pharmaceutical Excipients. (Pharmaceutical Press, 2012).
11.Schroeder, B. 0. et al.Reduction of disulphide bonds unmasks potent antimicrobial activity of human 13-defensin 1.Nature 469, 419-423 (2011).
12. Lehrer, R. I., Rosenman, M., Harwig, S. S., Jackson, R. & Eisenhauer, P. Ultrasensitive assays for endogenous antimicrobial polypeptides. J. lmmunol. Methods 137, 167-173 (1991).
13. Oddo, A. & Hansen, P. R. Hemolytic Activity of Antimicrobial Peptides. Methods Mol. Biol. 1548, 427--435 (2017).
14. Callahan, B. J. et al. DADA2: High-resolution sample inference from lllumina amplicon data. Nat. Methods 13, 581-583 (2016).
15. McMurdie, P. J. & Holmes, S. phyloseq: An R Package for Reproducible Interactive Analysis and Graphics of Microbiome Census Data. PLoS One 8, (2013).
16. Paulson, J. N., Stine, 0. C., Bravo, H. C. & Pop, M. Differential abundance analysis for microbial marker-gene surveys. Nature Methods 10, 1200-1202 (2013).
17. Oksanen, J. et al. vegan: Community Ecology Package. (2018).
18. ggplot2 - Elegant Graphics for Data Analysis (2nd Edition) I Gomez-Rubio I Journal of Statistical Software. doi:10.18637/jss.v077.b02.
19. Baba, T. et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mo/ Syst Biol 2, 2006.0008 (2006).
20. Weidenmaier, C. et al. Lack of wall teichoic acids in Staphylococcus aureus leads to reduced interactions with endothelial cells and to attenuated virulence in a rabbit model ofendocarditis. J. Infect. Dis.191, 1771-1777 (2005).
21. Peschel, A. & Collins, L. V. Staphylococcal resistance to antimicrobial peptides of mammalian and bacterial origin. Peptides 22, 1651-1659 (2001).
22. Wanner, S. et al. Wall teichoic acids mediate increased virulence in Staphylococcus aureus. Nat Microbiol 2, 16257 (2017).
23. Rajabi, M. et al. The conserved salt bridge in human alpha-defensin 5 is required for its precursor processing and proteolytic stability. J. Biol. Chem. 283, 21509- 21518 (2008).
24.Rajabi, M. et al. Functional determinants of human enteric a-defensin HOS: crucial role for hydrophobicity at dimer interface. J. Biol.Chem.287, 21615-21627 (2012).
25. Szyk, A. et al. Crystal structures of human alpha-defensins HNP4, HOS, and HD6.
Protein Sci. 15, 2749-2760 (2006).
26. Wanniarachchi, Y. A., Kaczmarek, P., Wan, A. & Nolan, E. M. Human Defensin 5 Disulfide Array Mutants: Disulfide Bond Deletion Attenuates Antibacterial Activity Against Staphylococcus aureus. Biochemistry 50, 8005-8017 (2011).
27. Hong, S. Y., Oh, J. E. & Lee, K. H. Effect of D-amino acid substitution on the stability, the secondary structure, and the activity of membrane-active peptide. Biochem. Pharmacol. 58, 1775-1780 (1999).
28. Brinckerhoff, L. H. et al. Terminal modifications inhibit proteolytic degradation of an immunogenic MART-1(27-35) peptide: implications for peptide vaccines. Int. J.Cancer83, 326-334 (1999).

Claims (17)

1. 抗菌活性を有するペプチドであって、
   配列
   ＡＴＣＹＣＲＴＧＲ（配列番号１）、
   ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ（配列番号２）、
   Ａｃ－ａｔｃｙｃｒｔＧｒ－ＮＨ_２（配列番号５）、
   ＶＣＳＣＲＬＶＦＣＲＲ（配列番号３）、
   ＲＲＣＦＶＬＲＣＳＣＶ（配列番号４）、
   Ａｃ－ｖｃｓｃｒｌｖｆｃｒｒ－ＮＨ _２ （配列番号６）、
   ＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号４１）、
   ＡＴＣＹＣＲＴＧＲＣＡＴＲ（配列番号３４）、
   ＡＴＣＹＣＲＴＧＲＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲ（配列番号１２）、
   ＴＧＲＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号１４）、
   ＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号１９）、
   ＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号２５）、または
   ＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹ（配列番号２８）からなるペプチド。
2. 配列
   ＡＴＣＹＣＲＴＧＲ（配列番号１）、
   ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ（配列番号２）、
   Ａｃ－ａｔｃｙｃｒｔＧｒ－ＮＨ_２（配列番号５）、
   ＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号４１）、
   ＡＴＣＹＣＲＴＧＲＣＡＴＲ（配列番号３４）、
   ＡＴＣＹＣＲＴＧＲＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲ（配列番号１２）、または
   ＴＧＲＣＡＴＲＥＳＬＳＧＶＣＥＩＳＧＲＬＹＲＬＣＣＲ（配列番号１４）からなる、請求項１に記載のペプチド。
3. 配列
   ＡＴＣＹＣＲＴＧＲ（配列番号１）、
   ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ（配列番号２）、または
   Ａｃ－ａｔｃｙｃｒｔＧｒ－ＮＨ_２（配列番号５）からなる、請求項１に記載のペプチド。
4. 配列
   ＡＴＣＹＣＲＴＧＲ（配列番号１）、または
   ＲＧＴＲＣＹＣＴＡ（配列番号２）からなる、請求項１に記載のペプチド。
5. 配列
   ＶＣＳＣＲＬＶＦＣＲＲ（配列番号３）、
   ＲＲＣＦＶＬＲＣＳＣＶ（配列番号４）、または
   Ａｃ－ｖｃｓｃｒｌｖｆｃｒｒ－ＮＨ _２ （配列番号６）からなる、請求項１に記載のペプチド。
6. 前記ペプチドが、ジスルフィド結合を介して連結されたホモ二量体である、請求項１～５のいずれか一項に記載のペプチド。
7. アセチル－、ホルミル－、ピログルタミル－、脂肪酸－、尿素－、カルバメート－、およびアルキルアミンから選択されるＮ末端修飾を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載のペプチド。
8. －アミド、－酸、－Ｎ－アルキル－アミド、－アルデヒド、－エステル、－ｐ－ニトロアニリド、および－７－アミノ－４－メチルクマリンからなる群のうちの１つから選択されるＣ末端修飾を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載のペプチド。
9. 前記ペプチドが、Ｄ－アミノ酸および／もしくはＬ－アミノ酸からなるか、またはＤ－アミノ酸および／もしくはＬ－アミノ酸を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のペプチド。
10. 前記ペプチドが、Ｎ末端および／またはＣ末端修飾を含み、前記修飾が、Ｎ末端アセチル修飾および／またはＣ末端アミド修飾である、請求項１～９のいずれか一項に記載のペプチド。
11. マイクロバイオームの調節に使用するための、または皮膚、口、腸、肺、目、耳、膣もしくはＣＮＳの状態もしくは異常に関連する他の疾患の治療および／もしくは予防に使用するための、請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチド。
12. 前記疾患が、皮膚の疾患、口の疾患、炎症性腸疾患、代謝性疾患、肺疾患、目の疾患、耳の疾患、膣の疾患、敗血症、および精神疾患から選択される、請求項１１に記載の使用のためのペプチド。
13. 前記疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎、セリアック病、壊死性腸炎、過敏性腸症候群、海外旅行者下痢症、消化器癌、糖尿病および前糖尿病、肥満、ＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、脂質異常症、ぜん息、ＣＯＰＤ、アトピー性皮膚炎、酒さ様皮膚炎、脂漏性皮膚炎、湿疹、癰、ブドウ球菌感染症、カンジダ症、蜂巣炎、伝染性膿痂疹、尋常性ざ瘡、毛巣洞、皮膚リンパ腫、水虫、白癬、伝染性軟属腫、歯周炎、虫歯、ドライアイ、シェーグレン病、結膜炎、眼瞼炎、麦粒腫、霰粒腫、眼窩周囲蜂巣炎、涙嚢炎、眼内炎、ブドウ膜炎、虹彩炎、乳様突起炎、前庭神経炎、水疱性鼓膜炎、顆粒性脊髄炎、外耳炎、中耳炎、細菌性膣炎、トリコモナス膣炎、カンジダ、非感染性膣炎、炎症性膣炎、敗血症、統合失調症、パーキンソニズム、双極性障害、うつ病、ならびに自閉症から選択される、請求項１２に記載の使用のためのペプチド。
14. 前記ペプチドが、抗菌剤として使用される、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の使用のためのペプチド。
15. 前記ペプチドが経口的に、非経口的に、または局所的に投与される、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の使用のためのペプチド。
16. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
17. 口、目、耳、皮膚、または膣への局所投与用に配合されている、請求項１６に記載の医薬組成物。

Images