KR20210126585A - 치료 또는 예방에서 사용하기 위한 디펜신 단편 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장, 폐, 피부, 입, 눈, 귀, 질 또는 다른 신체 표면의 마이크로바이옴을 조절하는 데 사용하기 위한 그리고/또는 인간 또는 다른 포유동물에서 항균제로서 사용하기 위한 항균 활성을 갖는 HD-5 또는 HNP-4로부터 유래된 신규한 펩타이드뿐만 아니라, 이러한 펩타이드를 함유한 약제에 관한 것이다.

Description

치료 또는 예방에서 사용하기 위한 디펜신 단편

본 발명은 알파 디펜신(defensin)으로부터 유래된 특정 펩타이드 서열 및 의학적 치료 및/또는 예방에서의 이의 용도에 관한 것이다.

혐기성 및 호기성 미생물, 특히, 박테리아 및 효소, 즉, 산소와 함께, 산소 없이 살거나 산소-내성인 단세포 미생물은 특히, 복강에서, 비뇨생식기에서, 피부 상에서 또는 입, 눈, 귀 및 턱 영역에서 다양한 임상상, 예를 들어, 상처 감염 및 농양, 패혈증, 감염증을 유발시킬 수 있다. 이에 따라, 이러한 병원성 종은 종종, 피부 및 구강 영역에서, 특히, 염증이 있는 피부/습진, 치주 조직, 눈 및 귀에서 및 위의 점막 주름의 위의 영역에서, 그리고 십이지장에서 이미 발견되며, 이는 이후에 국소 염증을 유발시키지만, 또한, 일부 환경에서, 전신 급성 및 만성 염증을 유발할 수 있다. 다소 얇게 콜로니화된 소장에서도, 다수의 조건 혐기성 생물은 소장의 고도로 민감한 점막의 병리학적 변화를 유발시킬 수 있으며, 직장에서, 세균총의 주요 부위, 틀림없이 호기성 박테리아가 우세하지만, 여기에서도 혐기성 대표예가 또한, 결장의 점막의 심각한 염증 반응을 유발시킬 수 있다. 칸디다(Candida) 아종은 또한, 많은 개체의 대변에서 발견되고, 잠재적으로 병원성이다.

현재, 특히, 이러한 질환은 항생제로 치료되는 데, 이는 주로 박테리아의 세포벽을 공격하고 파괴한다. 이러한 염증성 질환이 항생제로 치료될 때 발생하는 큰 문제는 사용되는 항생제에 대한 내성이 발달되고, 이는 최근에 더욱 진행되고 있다는 점이다. 이는 병원성 박테리아/미생물이 항생제 물질의 작용을 약화시키거나 완전히 중화시킬 수 있다는 것이다. 이후에 미생물이 일반적인 항생제에 대해 내성인 것으로 판명되는 경우에, 질환은 생명을 위협하게 될 수 있다. 과거에 다중 내성 박테리아 균주의 수가 크게 증가한 이유는 이의 빠른 성장 및 이의 짧은 배양 기간으로 인해 박테리아가 항생제를 중화시키기 위한 새로운 전략을 지속적으로 개발할 수 있다는 것이다. 이에 따라, 현재, 항생제 이외에, 예를 들어, 또한, 천연, 특히, 식물, 및 합성 오일 및 에멀션이 사용된다.

최근 몇 년 동안, 자연 면역 체계의 일부이고 미생물에 의한 감염증에 대한 상피 방어에 매우 중요한 항균 펩타이드는 연구 및 치료 기기에 대한 관심을 얻었다.

건강한 사람에서, 피부 및 점막은 미생물에 의한 감염증에 대한 물리적 장벽을 형성한다. 물리적 장벽은 건강한 피부의 각질층, 및 점막에서 점막층으로 구성되어 있으며, 여기서, 박리 및 점액 분비는 표면에 부착된 미생물의 연속 제거와 동시에, 표면의 일정한 재생을 야기시킨다. 피부에 또한 존재하는 지질과 상호작용하여, 이러한 물리적 장벽은 미생물이 살아있는 표피로 침투하는 것을 방지한다.

그러나, 이러한 물리적 장벽을 제쳐놓고, 건강한 피부 및 점막이 감염을 방어하기 위해 추가 인자가 또한 필요하며, 이러한 인자들 중에는 내인성 항균 펩타이드(antimicrobial peptide: AMP)가 있다. 리소자임은, 예를 들어, 비강 분비물에 존재하는 항균 펩타이드이고, 특히, 그람-양성 박테리아를 사멸시킬 수 있다. 또한, 장 점막에서 항균 펩타이드로서 디펜신이 알려져 있으며, 이의 존재는 특히 장 상피가 매우 많은 양의 박테리아에 노출된다는 점을 고려할 때 필요한 것으로 보인다. 미생물이 침투하기 어려운 점막층을 갖는 것 이외에, 장 점막은 인간 디펜신-5, 즉, 알파 디펜신을 분비하고, 다른 기능들 중에서, 장 점막의 연속 재생을 위해 중요한 줄기세포를 보호하는 파네스 세포(Paneth cell)를 함유한다. 인간에서, 오로지 알파- 및 베타-디펜신이 발현된다. 알파-디펜신이 주로 호중구뿐만 아니라 NK 세포 및 특정 T-림프구 서브세트에서 발현되지만, 인간 디펜신 5 및 디펜신 6은 오로지 소장의 파네스 세포에서 발현되며, 여기서, 이러한 것은 장 내강의 미생물 균형을 조절하고 유지하는 데 기여한다. 한편, 베타-디펜신은 가장 널리 분포되어, 여러 부류의 백혈구 및 상피 세포에 의해 분비된다. 추가로 알려진 AMP에는 서리아신(psoriasin)으로 알려진 펩타이드뿐만 아니라 인간에서 효과적인 내인성 광범위 항생제를 나타내는 RNas-7가 있다.

알려진 내인성 항균 펩타이드 이외에, 기존 기술에서 여러 항생제가 또한 알려져 있으며, 이러한 것들은 생물학적 기원의 물질 및 합성적으로 제조된 물질 둘 다를 포함하며, 이에 따라, 이는 (본래 의미에서와 같이) 진균 또는 박테리아의 자연적으로 형성된 저분자량 대사 산물, 또는 화학적으로 합성된 치료제 중 어느 하나이다.

특히, 천연 및 합성 항생제에 대한 내성의 발달로 미생물 감염성 질환을 치료하기 더욱 어렵게 된다는 사실을 비추어 볼 때, 또한, 부작용이 적고 제조 및 취급이 간편한 것에 주목할 만한 신규한 항균 활성제에 대한 필요성이 종종 제기된다.

위장 미세환경은 단세포층, 상피, 점액층, 국소 면역계, 및 마이크로바이옴으로 이루어지며, 이러한 4가지 성분은 함께, 건강한 시간 동안 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 인간 결장은 소화관 내용물 1 그램당 10¹¹ 내지 10¹²개의 세포의 고도로 조밀한 미생물 군집을 가지고 있으며, 인간 건강은 총괄적으로 소화관 미생물군으로서 공지된 장에서의 다양한 세트의 미생물과 밀접하게 연관된다. 한편으로, 피칼리박테리움 프로스니치(Faecalibacterium prausnitzii)를 갖는 경우, 예를 들어, 염증성 장 질환(IBD) 및 감염성 대장염의 경우와 같이, 이의 풍부함 및 유병률이 질환과 관련되어 있지만, 다른 한편으로, 점막 종, 예를 들어, 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis), 및 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri)가 대장염을 보호할 수 있음을 나타내었다.

결과로서, 감염증의 경우에 항생제를 적용할 때, 인간 결장에 있는 마이크로바이옴 조성물은 크게 영향을 받으며, 미생물 균형이 깨진다. 디펜신은 3개의 보존된 다이설파이드 결합에 의해 특징되는 작은 양이온성 분자이고, AMP의 주요 군을 나타낸다. 현재까지, 인간에서 6개의 알파-디펜신, 즉, 4개의 인간 호중구 펩타이드(HNP) 1, 2, 3 및 4, 및 2개의 인간 디펜신(HD) 5 및 6이 동정되었다. HNP가 전신 선천 면역에 참여하는 호중구의 무기고의 일부를 형성하지만, HD는 장내 파네스 세포에서 발현된다. 상기에 언급된 바와 같이, 소장에서, 파네스 세포는 미생물군 조성의 균형을 유지하고 2개의 α-디펜신 5(HD 5) 및 -6(HD 6)가 가장 풍부하지만, 다양한 AMP의 분비에 의한 침입 병원체로부터 숙주를 보호하는 데 중요한 역할을 한다.

단일 아미노산에서 HNP-1, HNP-2 및 HNP-3만이 차이가 나지만, HNP-4는 이의 서열에 있어서 다양하고, 하나의 추가 양전하를 가지고, HNP-1-3과 비교하여 개선된 살균 활성을 나타낸다^1-2. 전장 항균 펩타이드의 활성은 염 농도, pH 또는 레독스 전위를 포함하는 환경 조건에 영향을 받는다^3-6. 이의 강력한 항균 활성을 기초로 하여, 본 발명자들은 항균 능력을 갖는 새로운 치료제에 대한 전구체로서 HNP-4를 사용하였다. 정확하게 폴딩된 디펜신의 대규모 발현이 주요 문제이지만, 본 발명자들은 HNP-4의 작은 단편에 초점을 맞추었다. 본 발명자들은 전장 펩타이드를 소화시키기 위해 천연 발생 프로테아제를 사용하였고, 후속하여 생성된 단편을 동정하였다. 본 발명자들은 이의 항균 및 항진균 가능성에 대해 이러한 단편을 시험하였고, 이의 세포독성 및 용혈 능력을 분석하였다.

알파-디펜신의 항균 활성은 과거에 집중적으로 연구되어 왔으며, 이의 특정 서열의 변형이 이의 활성의 주요 변화에 기여할 수 있고, 심지어 항균 활성의 완전한 상실을 유발시킬 수 있다는 것이 인정되었다.

이에 따라, 본 발명에 의해 해결되는 문제는 신규하거나 대안적인 예방 및/또는 치료 방법을 제공하는 것으로서, 이에 의해 감염성 질환뿐만 아니라 장내 세균 불균형 상태와 관련된 다른 질환, 예를 들어, 대사 질환, 폐 질환, 비뇨생식기 질환, 입, 눈 및 귀의 질환 및 피부 질환이 예방되고/되거나 효과적으로 치료될 수 있다.

본 발명에 따르면, 이러한 문제 및 다른 문제는 항균 활성을 가지고 알파-디펜신 단편으로부터 유래된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 제공에 의해 해결되며, 이러한 펩타이드는 6 내지 27개, 특히, 더 짧은 펩타이드 단편으로 이루어지며, 이는 선형 펩타이드, 예를 들어, 7, 9, 11 또는 13개의 연속 아미노산을 갖는 선형 펩타이드로서 합성될 수 있다.

펩타이드에 대해서 공통적인 것은, 이러한 펩타이드가 자연 발생 알파 디펜신, HD-5 및 HNP-4의 단편이고, 자연 발생 펩타이드를 환원시키고 이를 프로테아제 활성을 이용하여 절단함으로써 생산될 수 있다는 점이다. 놀랍게도, 다수의 예측된 절단 부위를 포함하는 HD-6인 관련된 펩타이드는 동일한 조건 하에서 절단되지 않을 수 있다.

자연 발생 알파-디펜신의 이러한 짧은 단편은 이러한 것이 작은 선형 펩타이드로서 화학적으로 합성되어 전장 펩타이드의 제조와 비교하여 비용을 크게 감소시킬 수 있다는 장점을 갖는다. 또한, 이러한 펩타이드 중 수 개는 효과적인 농도에서 비-독성을 나타내면서, 자연 발생 전장 디펜신의 항생 효과를 유지하고 있다.

이러한 펩타이드는 장의 마이크로바이옴을 조절하기 위해 및/또는 건강한 마이크로바이옴의 주요 변화를 유도하고/이의 균형을 방해하지 않는 항균제로서 사용될 수 있다.

본 발명 내에서, 항균 시험에서, 한편으로 전장 펩타이드와 비교하여 특정(특히, 병원체) 박테리아에 대한 증가된 항균 효과를 가짐을 보였으며, 다른 한편으로, 미생물 다양성에 대한 새로이 동정된 펩타이드의 효과를 가지지 않은 알파-디펜신의 펩타이드 서열이 동정되었다.

이러한 결과는 미생물 감염증 및 박테리아 유발 질환, 심지어, 항생제-내성 박테리아에 의해 유발되는 그러한 질환들을 치료할 뿐만 아니라 박테리아 감염증을 예방하고 소화관 마이크로바이옴, 및 잠재적으로, 다른 상피 표면, 예를 들어, 폐, 피부, 비뇨생식기, 입, 눈, 귀, 등의 마이크로바이옴을 조절하기 위해 본 발명에 따른 펩타이드의 적용을 가능하게 한다.

이에 따라, 본 발명 내에서, 그리고 본 분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, "마이크로바이옴을 조절하는 것"은 소화관 및 상피 표면에 존재하는 미생물에 대한 펩타이드의 유익한 영향을 의미한다. 상기에 언급된 바와 같이, 소화관 미생물은 면역, 대사 및 신경 행동 특성을 포함하는 인간 건강의 여러 양태에 핵심이다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드와 관련하여, 소화관 마이크로바이옴의 박테리아 다양성 및 잠재적으로, 다른 상피 표면의 박테리아 다양성은 지지되고 촉진될 수 있다.

"소화관 마이크로바이옴"은 포유동물, 특히, 인간의 소화관을 의미한다. 이에 따라, 본 발명의 바람직한 실시형태는 인간의 소화관 마이크로바이옴을 조절하는 데 사용하기 위한 펩타이드에 관한 것이다.

본 발명의 펩타이드의 일 실시형태에 따르면, 알파-디펜신 단편은 HD-5 또는 HNP4의 단편이다.

처음에 언급된 바와 같이, HD-5는 소장의 파네스 세포에서 발현된다. 신호 펩타이드 및 프로도메인을 포함하여, HD-5는 아미노산 번호 63 내지 94를 포함하는 성숙 펩타이드와 함께, 94개의 아미노산을 포함한다.

또한 처음에 언급된 바와 같이, HNP4는 호중구의 과립에서 발현된다. 신호 펩타이드 및 프로도메인을 포함하여, HNP4는 아미노산 번호 64 내지 96을 포함하는 성숙 HNP4 펩타이드와 함께, 97개의 아미노산을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 HD-5로부터 유래된 6 내지 27개의 연속 아미노산으로 이루어지고, 첨부된 서열 목록의

서열 HD-5_1-9 ATCYCRTGR(서열번호 1) 또는

서열번호 1의 역서열, RGTRCYCTA(서열번호 2),

변형된 HD-5_1-9: Ac-atcycrtGr-NH₂(서열번호 5),

HD-5_1-13, ATCYCRTGRCATR(서열번호 34),

HD-5_1-28, ATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYR(서열번호 12),

HD-5_7-32, TGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(서열번호 14),

HD-5_10-32, CATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(서열번호 19),

HD-5_14-32, ESLSGVCEISGRLYRLCCR(서열번호 25),

HD-5_10-27, CATRESLSGVCEISGRLY(서열번호 28) 또는

HD-5_26-32, LYRLCCR(서열번호 41)로 이루어진다.

일반적으로, 아미노산 서열에 대하여, 대문자는 L-아미노산을 지정하며, 소문자는 D-아미노산을 지정한다.

바람직한 실시형태에서, 펩타이드는

ATCYCRTGR(서열번호 1),

RGTRCYCTA(서열번호 2),

Ac-atcycrtGr-NH₂(서열번호 5),

LYRLCCR(서열번호 41),

ATCYCRTGRCATR(서열번호 34),

ATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYR(서열번호 12), 또는

TGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(서열번호 14)의 서열로 이루어진다.

더욱 바람직하게는, 펩타이드는,

ATCYCRTGR(서열번호 1),

RGTRCYCTA(서열번호 2),

Ac-atcycrtGr-NH₂(서열번호 5), 또는

LYRLCCR(서열번호 41)의 서열로 이루어진다.

바람직한 펩타이드는 HD-5_1-9를 기초로 한 것:

ATCYCRTGR(서열번호 1),

RGTRCYCTA(서열번호 2), 또는

Ac-atcycrtGr-NH₂(서열번호 5)를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 7, 9, 11 또는 13개의 연속 아미노산으로 이루어진다.

본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 HD-5로부터 유래된 9개의 연속적인 아미노산으로 이루어지고, 바람직하게는, 첨부된 서열 목록의 서열 ATCYCRTGR(서열번호 1) 또는 서열번호 1의 역서열, RGTRCYCTA(서열번호 2)로 이루어진다.

본 발명의 다른 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 HNP4로부터 유래된 11개의 연속적인 아미노산으로 이루어지고, 바람직하게는, 서열 VCSCRLVFCRR(서열번호 3), 서열번호 3의 역서열, RRCFVLRCSCV(서열번호 4), 또는 변형된 HNP-4_1-11: Ac-vcscrlvfcrr-NH₂(서열번호 6)로 이루어진다.

일 실시형태에서, 본 발명은 환원된 HD5 또는 HNP-4를 프로테아제 활성, 예를 들어, 트립신 또는 키모트립신으로 처리하고 정제하는 것을 포함하는, 본 발명의 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

HD-5 또는 HNP4로부터 유래된, 본 명세서에 개시되고 기술된 펩타이드는 공생 미생물군, 예를 들어, 소화관 미생물군에 현저히 영향을 미치지 않으면서 동시에 병원성 박테리아에 대한 우수한 항균 활성을 나타내는 것으로 보였다.

바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 L- 및/또는 D-아미노산을 포함한다.

현재 및 일반적으로 이해되는 바와 같이, "L-아미노산"은 이의 피셔 투영법에서 좌측에 아미노기가 있는 특정 아미노산의 입체이성질체를 지칭하며, D-아미노산은 이의 피셔 투영법에서 우측에 아미노기가 있는 아미노산의 다른 입체이성질체를 지칭한다. 본 명세서의 서열에서, L-아미노산은 대문자로 표시되며, D-아미노산은 소문자로 표시된다.

대부분의 자연 발생 펩타이드가 L-배위의 아미노산으로 이루어지지만, D-아미노산은 단백질 가수분해 저하에 대한 강력한 내성을 나타낸다.

이에 따라, 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어진다.

다른 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 펩타이드는 L-아미노산으로 이루어진다.

다른 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 펩타이드는 D-아미노산과 L-아미노산의 혼합물, 바람직하게는, 교대하는 D-아미노산 및 L-아미노산으로 이루어지거나, 바람직하게는, 하나의 L-아미노산을 포함하며, 나머지 아미노산은 D-아미노산이다.

바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 N- 및/또는 C-말단 변형을 포함한다.

N- 및/또는 C-말단 변형과 관련하여, 예를 들어, 펩타이드의 자유 N-/C-말단 단부의 분해 및/또는 변형을 촉진시키는 환경에 존재하는 프로테아제로 인해, 예를 들어, 특히 그러한 환경에서 본 발명에 따른 펩타이드의 안정성 또는 반감기에 영향을 미치고/이를 향상시키는 것이 가능하다.

현재, 및 일반적으로 이해되는 바와 같이, C-말단(카복실-말단, 카복시-말단, C-말단 테일, C-말단 단부, 또는 COOH-말단으로도 알려짐)은 자유 카복실기(-COOH)에 의해 말단화된 아미노산 사슬(단백질 또는 폴리펩타이드)의 단부이고, N-말단(아미노-말단, NH₂-말단, N-말단 단부 또는 아민-말단으로도 알려짐)은 폴리펩타이드의 단부에 위치된 자유 아민기(-NH₂)를 지칭하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 개시부(start)이다. 펩타이드 서열을 기재하는 관례는 우측에 C-말단 단부를 기재하고, 서열을 N-에서 C-말단으로 기재한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드에서, C-말단 변형은 -아마이드, -산, -N-알킬-아마이드, -알데하이드, -에스터, -p-나이트로아닐라이드, 및 -7-아미노-4-메틸쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

이러한 변형과 관련하여, 펩타이드의 C-말단 단부는 펩타이드의 항균 활성을 주요한 정도로 영향을 미치지 않으면서 보호될 수 있다.

바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드에서, N-말단 변형은 아세틸-, 포르밀-, 피로글루타밀-, 지방산-, 우레아-, 카바메이트-, 및 알킬아민-으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

양쪽 단부, 즉, N-말단 및 C-말단이 전술한 변형 중 임의의 하나, 또는 단부 중 단 하나, 즉, N- 또는 C-말단 중 어느 하나로 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드에서, N-말단은 아세틸-(ac) 변형을 지니며, C-말단은 변형되지 않는다.

바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드에서, 펩타이드는 D-아미노산으로 이루어지고(또는 이를 포함하고), N-말단에, 아세틸-(ac) 변형을 지니고, C-말단은 변형되지 않는다.

N-말단 아세틸화와 관련하여, 펩타이드의 아미노 말단에서의 전하는 제거되며, 또한, 아세틸 변형과 관련하여, 펩타이드는 단백질에서 이의 천연 구조를 모방함을 의미한다. 또한, 변형은 엑소펩티다제로 인한 효소 분해에 대해 얻어진 펩타이드를 안정화시킨다.

바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 펩타이드는 N-말단 아세틸-변형 및 C-말단 아마이드-변형을 지닌다.

C-말단 아마이드 변형과 관련하여, 펩타이드는 단백질의 이의 천연 구조를 모방함을 의미한다. 또한, 이러한 변형은 펩타이드 분자에 추가 전하의 도입을 방지한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 펩타이드는 9개의 아미노산을 포함하며, 여기서, 8개의 아미노산은 D-아미노산이고, 1개의 아미노산은 L-아미노산이고, 더욱 바람직하게는, 이러한 펩타이드는 N-말단 아세틸-변형 및 C-말단 아마이드-변형을 포함한다.

바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 펩타이드는 11개의 아미노산을 포함하며, 여기서, 모든 아미노산은 D-아미노산이고, 더욱 바람직하게는, 이러한 펩타이드는 N-말단 아세틸-변형 및 C-말단 아마이드-변형을 포함한다.

다른 바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 펩타이드는 화학적으로 합성된 펩타이드 또는 생물학적으로 발현된 펩타이드이다.

펩타이드를 화학적으로 합성하기 위한 매우 다양한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 펩타이드의 화학적 합성이 전통적인 용액-상 기술을 이용하여 수행될 수 있지만, 이러한 것은 대부분의 연구 및 개발 환경에서 고체-상 방법으로 대체되었다. 펩타이드 합성의 개요는 예를 들어, 문헌[Stawikowski et al, ("Introduction to peptide synthesis", Cur. Prot. Prot. Sci., (2012), suppl. 69, 18.1.1-18.1.13)]⁷에서 확인될 수 있다.

본 발명의 사용을 위한 펩타이드의 실시형태에 따르면, 펩타이드는 산화된 또는 환원된 상태로 존재한다.

이와 관련하여, "산화된"은 시스테인, 메티오닌, 트립토판, 히스티딘 및 티로신과 같은 아미노산 잔기를 갖는 펩타이드에서 발생하는, 다이설파이드가 브릿징되는 펩타이드의 상태를 지칭한다. "환원된" 상태는 다이설파이드 결합이 형성되지 않은 펩타이드 형태를 나타낸다.

본 발명 내에서, "생물학적으로 발현된" 펩타이드는 상기 펩타이드(들)를 발현시키기 위해 변형된 유전적으로 조작된 숙주 세포에 의한 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드(들)의 발현을 포함할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 현재, 변형되거나 트랜스펙션되거나 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드를 인코딩하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 변형되거나 트랜스펙션될 수 있는 세포로서 정의된다.

다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드를 코딩하는 유전자를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 고려되는 코딩 서열이 생산되고, 후속하여 정제될 수 있는 비히클을 나타내지만, 또한, 적절한 뉴클레오타이드 코딩 서열로 변형되거나 트랜스펙션될 때, 인시튜로 본 발명의 유전자 산물을 사용하기 위한 펩타이드를 나타낸 세포를 나타낸다.

재조합 생산을 위해, 숙주 세포는 발현 시스템 또는 이의 일부 또는 본 발명의 사용하기 위한 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위해 유전자 조작될 수 있다. 숙주 세포 내에 폴리뉴클레오타이드의 도입은 문헌[Davis et al, Basic Methods in Molecular Biology, (2012)⁸, 및 Sambrook et al, 1989⁹]과 같은, 여러 표준 실험실 매뉴얼에 기술된 방법에 의해 달성될 수 있다.

이에 따라, 본 발명에 따른 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 숙주 세포 내에 안정하게 변형/트랜스펙션되는 벡터에 포함될 수 있다. 벡터에서, 본 발명의 펩타이드(들)를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 유도성 프로모터의 제어 하에 있으며, 이에 따라, 유전자/폴리뉴클레오타이드의 발현은 특이적으로 표적화될 수 있으며, 원하는 경우에, 유전자는 그러한 방식으로 과발현될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드를 생산하기 위해 매우 다양한 발현 시스템이 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 특히, 염색체, 에포솜 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들어, 박테리아 플라스미드로부터, 박테리오파지로부터, 트랜스포손으로부터, 효모 에피솜으로부터, 삽입 요소로부터, 효모 염색체 요소로부터, 바이러스로부터 유래된 벡터, 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예를 들어, 플라스미드와 박테리오파지 유전자 요소, 예를 들어, 코스미드 및 파지미드로부터 유래된 벡터를 포함한다. 발현 시스템은 발현을 조절할 뿐만 아니라 유발하는 제어 영역을 함유할 수 있다. 일반적으로, 숙주에서 폴리뉴클레오타이드를 유지, 전파 또는 발현시키고/시키거나 폴리펩타이드를 발현시키기에 적합한 임의의 시스템 또는 벡터는 이와 관련한 발현을 위해 사용될 수 있다. 적절한 DNA 서열은 예를 들어, 문헌[Sambrook et al](상기 참조)에 기술된 것과 같은 임의의 다양한 널리 공지되고 일상적인 기술에 의해 발현 시스템에 삽입될 수 있다.

바람직한 실시형태에 따르면, 본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드는 하기 중 적어도 하나로부터 선택된다:

HD-5_1-9: ATCYCRTGR(서열번호 1)

HD-5_1-9rev: RGTRCYCTA(서열번호 2)

HD-5_1-9mod: Ac-atcycrtGr-NH₂(서열번호 5)

HNP-4_1-11: VCSCRLVFCRR(서열번호 3)

HNP-4_1-11rev: RRCFVLRCSCV(서열번호 4)

HNP-4_1-11mod: Ac-vcscrlvfcrr-NH₂(서열번호 6)

본 발명의 다른 양태에 따르면, 마이크로바이옴을 조절하는 데 펩타이드의 사용은 장, 폐, 비뇨생식기, 입, 눈, 귀 또는 피부 또는 다른 병태 또는 장내 세균 불균형 상태와 관련된 질환의 치료 및/또는 예방에서의 사용으로 이루어진다.

상기에 언급된 바와 같이, 다양한 박테리아 미생물을 함유한, 건강한 소화관 마이크로바이옴은 온전한 소화관뿐만 아니라 포유동물, 특히, 인간의 전체 건강을 위해 필수적이다. 낮은 박테리아 다양성은 특히, 염증성 장 질환, 셀리악병 및 또한 비만 및 제2형 당뇨병과 같은 대사 질환과 같은 질환을 갖는 사람에서 재현 가능하게 관찰되었으며, 예를 들어, 암의 관문 저해제 치료의 효능은 또한, 마이크로바이옴에 의해 고도로 영향을 받으며, 심지어 CNS 질환, 예를 들어, 조현병이 마이크로바이옴에 의해 영향을 받는다는 것이 보고되었다. 다양성 감소와 질환 간의 연관성은, 온전한 생태계에서 기능적으로 관련된 미생물이 다른 누락된 종의 기능을 보완할 수 있기 때문에 종-풍부 소화관 생태계가 환경 영향에 대해 더 강력하다는 것을 나타낸다.

유전적으로 영향을 미치는 장 질환과는 별개로, 또한, 특정 식품 및 식이 패턴뿐만 아니라 약제는 소화관에서 상이한 타입의 박테리아의 풍부함에 영향을 미칠 수 있다. 종종 영양 또는 식이의 변화와 관련하여 소화관 마이크로바이옴에 대한 긍정적인 효과가 또한, 프리- 및 프로바이오틱 식품을 이용함으로써 관찰될 수 있지만, 본 발명에 따른 펩타이드는 이의 천연 기원으로 인해, 더 광범위하고 더욱 편리하고 고도로 효율적인 툴을 제공한다. 또한, 본 발명에 따른 펩타이드와 관련하여, 달리 영양 변화 및 영향에 매우 민감한 대상체의 치료가 가능하다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 펩타이드를 이용하여, 장 질환, 및 또한, 폐, 피부 및 뇌의 질환은 소화관의 천연 마이크로바이옴에 긍정적으로 영향을 미침으로써 효율적으로 예방하고/하거나 치료될 수 있다.

이에 따라, 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 염증성 장 질환, 특히, 크론병, 궤양성 대장염, 셀리악병, 괴사 소장결장염, 과민성 대장 증후군, 물갈이, 위장암 및 장 이식 편대 숙주병으로부터, 및 대사 질환, 바람직하게는, 당뇨병 및 전당뇨병, 비만, NAFLD, NASH, 이상지질혈증으로부터, 폐의 질환, 바람직하게는, 천식 및 COPD로부터, 및 뇌의 질환, 바람직하게는, 조현병, 파킨슨증, 양극성 장애, 자폐증 및 우울증으로부터 선택된 질환을 예방/치료하는 데 사용된다.

본 발명에 따른 펩타이드를 사용하여, 피부, 입, 눈, 귀, 질 또는 순환계의 단순 마이크로바이옴과 관련된 질환은 효율적으로 예방되고/되거나 치환될 수 있다.

이에 따라, 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 펩타이드는 패혈증, 아토피성 피부염, 주사비, 지루성 피부염, 습진, 종창, 포도상 구균 감염증, 칸디다증, 봉와직염, 농가진, 여드름, 모소낭포, 운동선수의 발, 백선, 연속종, 피부 림프종, 치주염, 충치, 안구 건조증, 쇼그렌병, 결막염, 안검염, 맥립종, 산립종, 안와 봉와직염, 누낭염, 안내염, 포도막염, 홍채염, 유돌염, 전정신경세포염, 수포성 고막염, 과립성 고막염, 외이염, 중이염, 세균성 질염, 편모충 질염, 칸디다, 비감염성 질염, 염증성 질염으로부터 선택된 질환을 예방/치료하는 데 사용된다.

다른 양태에 따르면, 본 명세서에 기술된 펩타이드는 또한, 다중 약물 내성 박테리아 유도 감염증에 대한 항균제로서 사용될 수 있다. 본 발명 내에서, 본 발명에 따른 펩타이드가 천연 소화관 마이크로바이옴에 긍정적으로 영향을 미치기 위해 사용될 수 있을 뿐만 아니라 다중 약물 내성 박테리아를 특이적으로 표적화하기 위한 툴로서 사용될 수 있으며, 이에 따라, 다중-약물 내성 박테리아에 의해 유발된 감염증을 치료/예방하기 위한 효율적인 툴로서 사용될 수 있다는 것이 확인되었다. 다른 목적에 따르면, 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제에 관한 것이다.

현재, 그리고, 당해 분야에서 일반적으로 이해되는 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 언급된 질환의 치료 분야에서 통상적으로 사용되고 본 발명에 따른 생성물의 살아 있는 존재에 대한 투여를 단순화하거나 가능하게 하고/하거나 이의 안정성 및/또는 활성을 개선시키는 임의의 부형제, 첨가제, 또는 비히클을 의미하는 것으로 이해된다. 약제 조성물은 또한, 결합제, 희석제 또는 윤활제를 도입할 수 있다. 약제학적 담체 또는 다른 첨가제의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약제 실무를 기초로 하여 이루어질 수 있다. 약제학적 허용되는 담체로서, 용매, 연장제, 또는 다른 액체 결합 매질, 예를 들어, 분산제 또는 현탁화제, 계면활성제, 등장제, 스프레더(spreader), 또는 유화제, 보존제, 캡슐화제, 고체 결합 매질이 개개 투약 요법에 가장 적합하고 마찬가지로 본 발명에 따른 화합물과 혼화 가능한 지의 여부에 따라 사용될 수 있다. 이러한 추가 구성성분의 개요는 예를 들어, 문헌[Rowe (Ed.) et al.: Handbook of Pharmaceutical Excipients, 7th edition, 2012, Pharmaceutical Press]¹⁰에서 확인될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 국소 투여를 위해 제형화될 때 피부-병태의 치료를 위해 사용될 수 있다. 국소 투여 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.

국소 투여를 위해 제형화될 때, 본 발명의 조성물은 국소 약제학적 또는 미용학적 조성물에서 통상적인 구성성분, 예를 들어, 담체, 비히클 또는 매질을 함유할 수 있다. 상세하게는, 담체, 비히클 또는 매질은 적용되는 조직, 예를 들어, 피부, 모발, 손발톱, 질, 요도, 귀, 구강, 비강, 호흡기계, 안구 영역 및/또는 점막에 적합하다. 본 발명의 조성물 및 성분은 감염된 조직과 접촉하거나 과도한 독성, 비혼화성, 불안정성, 알레르기 반응, 등 없이 일반적으로 환자에서 사용하기에 적합하다. 적절한 경우, 본 발명의 조성물은 고려되는 분야에서 통상적으로 사용되는 임의의 구성성분을 포함할 수 있다.

이의 형태의 측면에서, 본 발명의 조성물은 용액, 에멀션(마이크로에멀션을 포함함), 현탁액, 크림, 로션, 겔, 분말, 또는 조성물이 사용될 수 있는 피부 및 다른 조직에 적용하기 위해 사용되는 다른 통상적인 고체 또는 액체 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 추가 항균제, 보습제 및 수화제, 침투제, 보존제, 유화제, 천연 또는 합성 오일, 용매, 계면활성제, 세제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 방향제, 충전제, 증점제, 왁스, 냄새 흡수제, 염료, 착색제, 분말, 점도-조절제 및 물을 함유할 수 있고, 선택적으로, 마취제, 가려움증 방지 활성제, 식물 추출물, 컨디셔닝제, 농화제 또는 담화제, 광택제, 습윤화제, 운모, 미네랄, 폴리페놀, 실리콘 또는 이의 유도체, 자외선 차단제, 비타민, 및 식물의약을 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 지속 또는 장기 치료가 의도되는 경우에 유익할 수 있는 바와 같이, 장기간 동안 안정하도록 상기 구성성분과 제형화된다.

본 발명의 조성물은 제어-방출 또는 서방출 조성물의 형태일 수 있으며, 여기서, 추가 활성제와 함께 항균 펩타이드는 물질 내에 캡슐화되거나 달리 함유되며, 이에 따라, 이러한 것은 시간에 따른 제어된 방식으로 피부 또는 환부 상에 방출되도록 한다. 본 발명의 조성물은 매트릭스, 리포솜, 소포, 마이크로캡슐, 마이크로스피어, 등 내에 또는 그 위에, 또는 고체 미립자 물질 내에 또는 그 위에 함유될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여는 임의의 환부 또는 감수성 부위, 예를 들어, 다리, 어깨, 등(허리 포함), 겨드랑이, 손바닥, 발, 목, 서혜부, 등, 또는 손 또는 발, 팔꿈치, 팔뚝, 무릎, 다리 위쪽, 엉덩이, 몸통, 골반, 또는 감염의 치료 또는 예방이 요망될 수 있는 신체의 임의의 다른 부분에 수행될 수 있다. 이러한 치료는 또한, 상처 부위의 감염을 치료하거나 예방하기 위해 피부에 베인 상처, 찰과상 및 화상과 같은 상처를 치료하고/하거나 드레싱하기 위해 고려된다.

본 발명의 조성물은 약 4.5 내지 약 6.3 범위의 pH를 갖는 생리학적 환경에서 사용하기에 적합하며, 이에 따라, 조성물은 유사하거나 동등한 pH에서 제형화될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 실온에서 또는 냉장 조건 하에서 저장될 수 있다. 본 발명의 조성물은 항균 작용에 대해 효과적인 양의 항균 펩타이드를 함유한다. 일반적으로, 조성물은 약 0.01%(중량/부피) 내지 약 20% 항균 펩타이드를 함유한다. 특정 실시형태에서, 조성물은 약 0.5% 내지 약 10% 항균 펩타이드, 예를 들어, 약 0.5%, 약 1%, 약 5%, 또는 약 10% 항균 펩타이드를 함유한다.

본 발명에 따른 펩타이드의 특성, 특징, 및 장점은 마찬가지로 본 발명에 따른 약제에 적용한다. 이에 따라, 본 발명에 따른 펩타이드를 함유한 약제는 또한, 염증성 장 질환, 특히, 크론병, 궤양성 대장염, 셀리악병, 괴사성 소장결장염, 과민성 대장 증후군, 물갈이, 위장암 및 장 이식 편대 숙주병, 및 또한, 대사 질환, 바람직하게는, 당뇨병 및 전당뇨병, 비만, NAFLD, NASH, 이상지질혈증, 및 폐의 질환, 바람직하게는, 천식 및 COPD; 및 피부의 질환, 예를 들어, 아토피성 피부염, 주사비, 지루성 피부염, 습진, 종창, 포도상 구균 감염증, 칸디다증, 봉와직염, 농가진, 여드름, 모소낭포, 운동선수의 발, 백선, 연속종, 피부 림프종; 입의 질환, 예를 들어, 치주염 및 충치; 눈의 질환, 예를 들어, 안구 건조증, 쇼그렌병, 결막염, 안검염, 맥립종, 산립종, 안와 봉와직염, 누낭염, 안내염, 포도막염, 홍채염; 귀의 질환, 예를 들어, 유돌염, 전정신경세포염, 수포성 고막염, 과립성 고막염, 외이염, 중이염; 질의 질환, 예를 들어, 세균성 질염, 편모충 질염, 칸디다, 비감염성 질염, 염증성 질염뿐만 아니라 패혈증 및 정신 질환, 바람직하게는, 조현병, 파킨슨증, 양극성 장애, 우울증 또는 자폐증으로부터 선택된 질환을 치료하고/하거나 예방하는 데 사용될 수 있다.

다른 바람직한 실시형태에 따르면, 펩타이드는 다이머, 바람직하게는, 호모다이머로서 존재한다. 다이머는 바람직하게는, 공유 결합, 적합하게 다이설파이드 결합을 통해 결합된다.

펩타이드의 다이머화는 당해 분야에 공지되어 있다. 펩타이드 다이머화를 위해 현재 사용되는 화학은 비보호된 펩타이드들 간의 화학선택적 반응을 포함한다. 예에는 하기 결합, 예를 들어, Cys-말레이미드, 티오에터, 다이설파이드, 또는 트리아졸의 형성이 있다.

전술한 특성 및 하기에 언급되는 것들이 개개 경우에 명시된 조합으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 다른 조합으로 또는 분리된 방식으로 사용되는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명은 이제 본 발명의 추가적인 특성, 특징 및 장점을 가져오는 실시형태에 의해 추가로 설명된다. 실시형태는 순수한 예시적인 특성을 가지고, 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

특정 실시형태에서 언급된 특징들은 또한 개개 실시형태에서 적용 가능할 뿐만 아니라 본 발명의 임의의 실시형태의 맥락에서 분리된 방식으로 적용 가능한, 일반적으로 본 발명의 특징이다.

본 발명은 또한, 하기 도면을 참조하여 더욱 상세히 기술되고 설명된다.
도 1은 HD-6 나노네트(nanonet) 형성이 십이지장액에 의해 영향을 받지 않음을 입증하기 위한 실험 결과를 도시한 것이다: (A)는 2mM TCEP로 환원 후 십이지장액과 함께 인큐베이션된 HD-6의 크로마토그래프를 도시한 것이다. m/z 그래프 및 2-, 3-, 4-, 5- 및 6-배 양성자화된 이온 및 중성 질량과 함께 체류 시간으로 인해 단지 산화된 및 환원된 전장 펩타이드를 검출하였다. (B)는 200 ㎍/㎖ HD-6 또는 0.01% HAc(대조군) 및 십이지장액 또는 0.9% NaCl(대조군)과 함께 인큐베이션된 환원 비드를 도시한 것이다. 나노네트 형성은 이러한 네트가 0.9% NaCl과 함께 HD-6과 동일하게 보이기 때문에 영향을 받지 않았다. 배율 막대 = 0.2㎛.
도 2는 HD-5 및 십이지장액의 인큐베이션이 여러 상이한 단편으로 이어진 실험 결과를 도시한 것이다. HD-5를 2mM TCEP로의 환원 후에 십이지장액과 함께 인큐베이션하였다. (A)는 십이지장액과 함께 환원된 HD-5의 인큐베이션으로부터의 크로마토그램의 개요를 도시한 것이다. 모든 검출 가능한 단편을 회색(a-m)으로 표시하고, (B)에서 이의 체류 시간으로 인해 나열하였다. 검출된 이온 및 이의 중성 질량과 함께 모든 동정된 단편의 질량-대-전하(m/z) 그래프. 펩타이드 (a), (b), (c), (e), (i), (j), (k), (l) 및 (m)을 합성 및 이의 능력에 대한 더 자세한 조사를 위해 선택하였다. (C) 여기서, 선택된 단편을 이의 아미노산 서열 및 HD-5 서열에 대한 이의 분포와 함께(회색) 나열하였다.
도 3은 HD-5 단편이 공생 박테리아에 대한 항균 활성 펩타이드임을 입증한 실험의 결과를 도시한 것이다: (A)는 HD-5 단편에 대한 이의 감수성으로 인한 상이한 공생 박테리아의 시험을 요약한 표를 나타낸 것이다. 이러한 히트 맵에서, 모든 박테리아, 및 이에 대한 RDA에서의 단편의 활성을 나타내었다. RDA에서, 2㎍의 전장 및 4㎍의 각 단편을 사용하였다. 5㎜보다 큰 저해 영역은 고활성으로서, 2.5 내지 5㎜는 저활성으로서 결정되었으며, 2.5㎜는 펀칭된 웰의 직경으로서, 이에 따라, 활성 없음으로서 결정되었다. (B) 여기서, 다이어그램에서, (A)로부터의 본래 데이터를 적어도 3회 독립 실험으로부터의 평균 및 표준 편차로 나타내었다. (C)는 상이한 펩타이드의 작용 방식을 조사한 전자 현미경 사진을 도시한 것이다: 이. 콜라이(E. coli) MC1000을 모든 상이한 단편과 함께 인큐베이션하고, 투과 전자 현미경법을 수행하고, 얻어진 표현형을 분석하였다. 모든 사진의 배율 막대는 전장 펩타이드, HD-5_fl(1㎛)을 제외하고 0.5㎛였다.
도 4는 병원성 박테리아에 대한 상이한 단편의 항균 활성을 입증한 실험의 결과를 도시한 것이다: (A)는 병원성 박테리아에 대한 HD-5 단편의 항균 활성의 시험을 요약한 표를 도시한 것이다. 고활성(RDA > 5㎜에서 저해 영역), 저활성(2.5 내지 5㎜) 및 활성 없음(2.5㎜)을 갖는 히트 맵 시스템을 이용하였다. (B)는 적어도 3회의 독립 실험으로부터의 평균 및 표준 편차로 (A)의 데이터의 다이어그램을 도시한 것이다.
도 5는 시스테인 및 아르기닌 치환을 함유한 HD5_1-9가 이. 콜라이 및 에스. 아우레우스(S. aureus) 돌연변이체에 대한 임의의 항균 효과를 거의 나타나지 않음을 입증한 실험의 결과를 도시한 것이다. 18시간 후에 광학 밀도(OD₆₀₀)의 측정에 의해 (A) 이. 콜라이 BW 25113 돌연변이체 및 (B) 에스. 아우레우스 SA113 돌연변이체에 대한 HD5_1-9 및 이의 변이체의 최소 저해 농도(MIC)를 측정하였다. 3회 독립 실험으로부터의 결과를 +/- SEM과 함께 나타내었다.
도 6은 HD5_1-9 및 합성 HD5_1-9의 감소가 이의 항균 활성의 완전한 용해를 유발한다는 것을 요약한 실험의 다이어그램을 도시한 것이다. 18시간 후 광학 밀도의 측정에 의해 여러 농도의 환원된 및 산화된 HD5_1-9 및 다이머로의 (A) 이. 콜라이 BW 25113 및 (B) 에스. 아우레우스 SA113의 최소 저해 농도(MIC)를 결정하였다. 이후에, MIC를 확인하기 위해 박테리아를 플레이팅하였다. 3회 독립 실험으로부터의 결과를 +/- SEM과 함께 나타내었다.
도 7은 HD5_1-9 치료된 세포의 대사 활성의 감소가 거의 관찰되지 않음을 나타낸 실험 데이터의 다이어그램을 도시한 것이다. HD5_1-9 및 다이머 치료된 세포의 대사 활성을 분석하기 위해, WST-1 검정을 수행하였다. 세포주를 3.123 내지 100μM 농도의 HD5_1-9 또는 HD5_1-9 다이머로 자극시키고, 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 활성을 음성 대조군으로 정규화하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 2% Triton X-100으로 치료하였으며, 음성 대조군으로서 0.01% 아세트산으로의 치료를 사용하였다. 결과는 3회 독립 실험(A, B, C)의 평균 +/- SEM로 나타내었다.
도 8은 HD5_1-9의 항균 작용 방식을 도시한 것이다. HD5_1-9로 인해 유도된 세포벽 손상은 이. 콜라이 ATCC 25922와 에스. 아우레우스 SA113 간에 상이하다. HD5_1-9에 의해 유발된 박테리아 세포 손상을 검출하기 위해, 유세포 분석을 수행하였다. 1.5×10⁶개의 이. 콜라이 ATCC 25922 및 에스. 아우레우스 SA113을 상이한 농도의 HD5_1-9(6.25μM, 12.5μM 및 50μM)와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 박테리아를 염색하기 위해 (A) 프로피듐 요오다이드 또는 (B) 막-감수성 DiBAC₃(3) 염료를 사용하였다. 양성 대조군으로서 12.5μM hBD3을 사용하였으며, 미처리된 세포는 음성 대조군으로서 기능하였다. 3회 독립 실험으로부터의 결과를 +/- SEM과 함께 나타내었다. (C) HD5_1-9(200 ㎍/㎖) 치료된 이. 콜라이 MC1000의 형태학적 변화를 평가하기 위해 투과 전자 현미경법을 수행하였다. 비교를 위해, 전장 HD5(HD5_fl)를 사용하였으며, 0.01% 아세트산(HAc)으로의 치료는 음성 대조건으로서 기능하였다. 막대: 상부 좌측 패널: 1㎛; 상부 우측 및 하부 좌측: 0.5㎛; 하부 우측 패널: 2㎛.
도 9는 대변의 아커만시아(Akkermansia) 및 HD-5_1-9 치료에 대한 감수성에 대한 조사 및 실험 결과를 도시한 것이다: (A) HD-5_1-9 또는 PBS로 7일 동안 치료된 마우스로부터 수집된 대변 샘플에서 아커만시아 종의 양(0, 7, 14일)은 PBS 치료된 마우스와 비교하여 HD-5_1-9 치료된 동물에서 증가되었다(선형 혼합-효과 모델; p = 0.075). 여기서, 평균은 군당 n=6부터 80% 신뢰 구간으로 나타난 것이다. (B)에서, 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila)가 HD-5_1-9 치료에 대해 민감한 지를 시험하였다. (B)는 혐기성 병에서 37℃에서 72시간 인큐베이션 후에 미처리된 대조군과 비교된 % 단위의 성장률을 도시한 것이다. 아커만시아에 대한 HD-5_1-9로부터의 MIC는 이러한 검정에서 검출할 수 없었다. 그래프는 n=3의 평균 및 표준 편차를 나타낸 것이다.
도 10은 HD5_1-9 자극된 인간 PBMC의 전- 및 항-염증성 면역 반응을 도시한 것이다. 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 단리시키고, 10 ㎍/㎖ LPS(에스. 티피무리움(S. typhimurium))로 자극시키고, 상이한 농도의 HD5_1-9로 자극시키고, 24시간 동안 인큐베이션하였다. 다중-분석물 키트(LEGENDplex)에 의해 생산된 사이토카인의 수를 정량화하기 위해 PBMC의 상청액을 사용하였다. 하기 사이토카인들을 평가하였다: 전염증성 사이토카인 (A) TNF-α, (B) IFN-γ, (C) IL-1β, (D) IL-6, (E) IL-8 및 항염증성 사이토카인 (F) IL-10. 음성 대조군으로서 미처리된 세포를 사용하였으며, 사이토카인 농도를 음성 대조군으로 정규화하였다. 결과는 3회 독립 실험의 평균 +/- SEM으로 나타내었다. 통계 분석을 위해, Kruskal-Wallis 시험을 수행하였다. p>0.05 = ns; p≤0.05 = *; p≤0.01 = **; p≤0.001 = ***; p<0.0001 = ****.
도 11은 HD5_1-9 및 이의 다이머화된 형태의 독성 프로파일이 인간 세포주에 대한 세포독성 효과를 나타내지 않음을 도시한 것이다. (A) HD5_1-9 및 다이머의 대사 활성 및 (B) 세포독성을 WST-1 검정 및 LDH 검정을 이용하여 측정하였다. HT29-MTX-E12 세포를 3.123 내지 100mM 농도의 HD5_1-9 또는 HD5_1-9 다이머로 자극시키고, 48시간 동안 인큐베이션하였다. 활성을 음성 대조군 또는 양성 대조군으로 정규화하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 2% Triton X-100으로 치료하였으며, 0.01% 아세트산으로의 치료를 음성 대조군으로서 사용하였다. 결과는 3회 독립 실험의 평균 +/- SEM으로 나타내었다. (C) 또한, HD5_1-9의 용혈 활성을 분석하였다. 적혈구 현탁액을 상이한 농도의 HD5_1-9와 함께 인큐베이션하였다. 용혈 활성을 0.1% Triton X-100의 용혈 활성으로 정규화하였다. 실험을 2회 수행하였다.
도 12는 추가 tox 데이터를 도시한 것이다. 펩타이드 치료 후 TR146 세포의 세포독성 효과가 거의 관찰되지 않았다. HD5_1-9 및 다이머의 세포독성 효과를 평가하기 위해 LDH 검정을 수행하였다. 세포주를 3.123 내지 100μM의 농도의 HD5_1-9 또는 HD5_1-9 다이머로 자극시키고, 24시간 또는 48시간 동안 인큐베이션하였다. 활성을 양성 대조군으로 정규화하였다. 양성 대조군으로서, 세포를 2% Triton X-100으로 치료하였으며, 0.01% 아세트산으로의 치료를 음성 대조군으로서 사용하였다. 결과는 3회 독립 실험의 평균 +/- SEM으로 나타내었다. TR146 세포의 세포독성 효과를 (A) 24시간 및 48시간 후 HD5_1-9뿐만 아니라 (B) 24시간 및 48시간 후 HD5_1-9 다이머에 대해 평가하였다. 추가적으로, (C) HD5_1-9 및 다이머의 세포독성을 24시간 후에 HT29-MTX-E12 세포에서 측정하였다.
도 13A 및 도 13B는 전체 대변 미생물 군집을 도시한 것이다. HD5fl을 HD5_1-9와 비교하여 1주 치료 후 1주에 희생된 모든 마우스(군당 n = 12)를 이용한 가중된 및 비가중된(unweighted) UniFrac 거리의 PCoA.
도 14A 및 도 14B는 전체 소장 미생물 군집을 도시한 것이다. HD5fl을 HD5_1-9와 비교하여 1주 치료 후 1주에 희생된 모든 마우스(군당 n = 6)를 이용한 가중된 및 비가중된 UniFrac 거리의 PCoA.
도 15A 및 도 15B는 전장 및 단편화된 HD-5 치료에 의해 상이하게 영향을 받은 박테리아 속을 도시한 것이다. 모든 마우스를 사용하여 0, 7 및 14일에 대변 미생물군 상의 케이지(cage)에 대해 조정된 선형 혼합 모델(주석: 0 및 7일에 군당 n=12, 및 14일에 군당 n=6). 단지 유의미하게 상이한 속을 나타낸다.
도 16: 이. 콜라이 ATCC 25922 및 이. 콜라이 BW 25113뿐만 아니라 이의 LPS 돌연변이체에 대한 HD5_1-9의 항균 활성. (A) 이. 콜라이 BW 25113 돌연변이체의 세포벽 작제. 이. 콜라이 ATCC 25922는 전장 LPS를 함유하며, O-항원은 이. 콜라이 BW 25113에 누락되어 있다. 이. 콜라이 BW 25113 돌연변이체 ΔwaaG는 내부 코어에 일부 인산염 잔기가 결여된 ΔwaaY와는 상반되게 외부 코어가 누락되어 있다. 마지막 돌연변이체 ΔwaaP는 외부 코어를 함유하지만, 내부 코어에 인산염 잔기가 존재하지 않는다. (B) 18시간 후 광학 밀도를 이용하여 상이한 펩타이드 농도에서 이. 콜라이 ATCC 25922 및 이. 콜라이 BW 25113 돌연변이체에 대한 HD5_1-9의 최소 저해 농도(MIC)를 측정하였다. 평균 +/- SEM을 이용한 적어도 2회의 독립 실험으로부터의 결과를 나타낸다.
도 17: 에스. 아우레우스 SA113뿐만 아니라 이의 세포벽 돌연변이체에 대한 HD5_1-9의 항균 활성. (A) HD5_1-9의 전하-의존 항균 효과를 분석하기 위해 에스. 아우레우스 SA113 세포벽 돌연변이체를 사용하였다. 에스. 아우레우스 돌연변이체 ΔdltA는 D-알라닌이 결여되어 펩티도글리칸 층의 음전하를 더 많이 유도한다. 유사한 특징은 세포막의 음전하를 유발하는 L-라이신이 누락된 돌연변이체 ΔmprF를 보유한다. 에스. 아우레우스 돌연변이체 ΔtarH는 추가 테이코산을 함유하여 펩티도글리칸 층의 강화를 유발시킨다. (B) HD5_1-9의 최소 저해 농도(MIC)를 18시간 후 광학 밀도를 이용하여 상이한 펩타이드 농도에서 에스. 아우레우스 SA113 및 돌연변이체에 대해 측정하였다. +/- SEM과 함께 2회 독립 실험으로부터의 결과를 나타내었다.
도 18: HD5_1-9의 항균 효과는 그람-음성 박테리아에 대해 다이머 형태와 비교하여 차별된다. HD5_1-9 및 HD5_1-9-다이머의 최소 저해 농도(MIC)를 18시간 후 광학 밀도를 이용하여 상이한 펩타이드 농도에서의 상이한 살모넬라(Salmonella)에 대해 측정하였다. 평균 +/- SEM로의 적어도 2회 독립 실험으로부터의 결과를 나타내었다.
도 19: HD5_1-9의 항균 효과는 그람-양성 박테리아에 대해 다이머 형태와 비교하여 차별된다. HD5_1-9 및 HD5_1-9-다이머의 최소 저해 농도(MIC)를 18시간 후 광학 밀도를 이용하여 상이한 펩타이드 농도로 에스. 아우레우스 ATCC25923 및 임상 단리물 에스. 아우레우스 USA300에 대해 측정하였다. 평균 +/- SEM로의 적어도 2회 독립 실험으로부터의 결과를 나타내었다.
도 20: 환원된 HNP-4를 트리신에 의해 소화시켰다. (A)는 2mM TCEP로 환원시킨 후 트립신과 함께 환원된 HNP-4의 인큐베이션으로부터의 크로마토그램의 개요를 나타낸 것이다. 모든 검출 가능한 단편을 적색 또는 회색(a-j)으로 표시하였고, 이의 체류 시간으로 나열하였다. 전장 펩타이드를 (i) 및 단편 HNP-4_1-11(d)로서 표시하였다.
도 21: HNP4-유도체는 공생 및 병원성 박테리아에 대한 높은 항균 활성을 나타낸다.
본 발명자들은 RDA를 이용하여 공생 및 병원성 박테리아에 대한 동정된 단편 및 이의 변형된 버전의 항균 가능성을 분석하였다. 히트 맵을 보면, 5㎜ 보다 큰 저해 영역은 고도로 활성인 것으로 결정되었으며, 2.5 내지 5㎜는 낮은 활성으로서 결정되었으며, 2.5㎜의 직경(펀칭된 웰의 직경)은 활성 없음으로서 표시되었다. 히트 맵은 적어도 3회 독립 실험을 기초로 한 것이다.
도 22: HNP-41-11 및 HNP-41-11mod만이 고농도에서 최소 세포독성 및 용혈 활성을 나타낸다. 본 발명자들은 (A) CaCo2/TC7 또는 (B) HT29 MTX E 29 세포에 대한 HNP-4_1-11 및 HNP-4_1-11mod의 세포독성 활성을 조사하였다. 본 발명자들은 웰당 1500개의 세포를 시딩하고, 이를 24시간 후에 상이한 펩타이드 농도로 처리하였다. 살아 있는 세포는 CellTiter Glo2.0 검정을 이용하여 96시간 처리 후 결정되었다. (C) 0.1% Triton-X 처리와 비교하여 펩타이드의 인간 적혈구에 대한 용혈 활성.

물질 및 방법

박테리아 균주

에이. 바우만니(A. baumannii) 4-MRGN, 케이. 뉴모니애(K. pneumoniae) 4-MRGN, 피. 에루기노사(P. aeruginosa) ATCC27853, 이. 파에시움(E. faecium) 475747, 비. 롱검(B. longum), 엘. 퍼멘텀(L. fermentum), 엘. 살리바리우스(L. salivarius) 및 에스. 살리바리우스 살리바리우스(S. salivarius salivarius)를 Robert-Bosch-Hospital(독일 슈투트가르트 소재)로부터 임상 단리물로서 획득하였다. 아커만시아 뮤시니필라, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 168trpC 및 에스. 아우레우스 USA300을 Institut fur Mikrobiologie und Infektionsmedizin(독일 튀빙겐 소재)으로부터 받았다. 비. 아돌레센티스(B. adolescentis) Ni3,29c, 비. 브레베(B. breve)를 Ardeypharm에서 제공하였다. 비. 불가투스(B. vulgatus) DSM1447을 DSMZ로부터 획득하였으며, 엘. 람노수스(L. rhamnosus)를 InfektoPharm(독일 헤펜하임 소재)에서 제공하였다. 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli) ATCC 25922를 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(독일 본 소재)로부터 획득하였다. 살모넬라 종의 임상 단리물뿐만 아니라 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) USA300, 스타필로코커스 아우레우스 ATCC 25923, 스타필로코커스 아우레우스 SA133 및 이의 돌연변이체를 Medical Microbiology and Hygiene의 연구소(독일 튀빙겐 소재)에 의해 제공하였다. 에셰리키아 콜라이 BW25113뿐만 아니라 이의 돌연변이체를 Microbiology and Infection Medicine의 학부 연구소(독일 튀빙겐 소재)로부터 획득하였다. 펩타이드 모든 실험을 위한 펩타이드, 산화된 펩타이드 HD-5 및 HD-6(Peptide Institute, 일본 오사카 소재)을 사용하였다. 모든 단편, 즉, HD-5_1-9 및 HNP-4_1-11, HD-5_1-13, HD-5_1-28, HD-5_7-32, HD-5_10-32, HD-5_14-32, HD-5_10-27 및 HD-5_26-32(본 발명의 모든 펩타이드)를 EMC microcollections GmbH(독일 튀빙겐 소재)에 의해 합성하였다. 모든 펩타이드를 유사한 농도로 0.01% 아세트산(HAc)에 용해시켰다.

하기 서열(본 발명에 따른 펩타이드)을 시험하였다(N->C-말단):

HD-5_1-9: ATCYCRTGR(서열번호 1)

HD-5_1-9rev: RGTRCYCTA(서열번호 2)

HD-5_1-9mod: Ac-atcycrtGr-NH₂(서열번호 5)

HNP-4_1-11: VCSCRLVFCRR(서열번호 3)

HNP-4_1-11rev: RRCFVLRCSCV(서열번호 4)

HNP-4_1-11mod: Ac-vcscrlvfcrr-NH₂(서열번호 6)

위내시경 검사 동안 십이지장액의 수집.

인간 십이지장액을 3명의 건강한 개인으로부터 일상적인 위내시경 검사 동안 수집하였다. 십이지장을 0.9% NaCl 용액으로 세척하였고, 이를 재수집하였다. 환자는 정보를 들은 후 서명 및 정보 동의를 제공하였다. 샘플 수집은 독일 튀빙겐의 대학 병원의 윤리 위원회에 의해 이미 승인받았다.

LC/MS를 이용한 HD-5 및 HD-6의 단편에 대한 스크리닝

2.5㎍의 HD-5 또는 HD-6을 37℃에서 15분 동안 2mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀을 함유한 50mM NH₄HCO₃ 완충제(pH 8.0)(Fluka) 중에서 인큐베이션하였다. 그 후에, 인간 십이지장액을 첨가하고, 37℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, 폼산 및 아세토나이트릴을 각각 0.5% 및 10%의 최종 농도로 첨가하고, 질량 분석법에 의해 샘플을 분석하였다. 질량 분석법은, LC/MS 시스템으로서 55℃ 칼럼 온도에서 0.4 ㎖/분의 흐름을 갖는 Agilent Advanced Bio Peptide Map(2.1×150㎜, 2.7㎛) 칼럼을 구비한 Agilent 1200 시리즈 HPLC, 및 질량 분석을 위한 6540 UHD Q-TOF LC/MS 시스템(Agilent)을 이용하여 수행하였다. 샘플을 0.1% 폼산 중 아세토나이트릴의 구배에 의해 분리하였다. 구배는 4분 동안 2% 아세토나이트릴에서 시작하고, 이후에, 35분 동안 45%까지 증가시켰다. 질량 분광 분석을 양이온 극성과 함께 100 내지 3400 m/z의 단일 MS 모드에서 수행하고, Agilent MassHunter Quantitative Analysis B 06.00 소프트웨어에 의해 분석하였다.

주사 전자 현미경법

주사 전자 현미경법을 전술한 바와 같이 수행하였다. 간단하게, 단백질 A 코팅된 비드(Spherotech Inc.)를 37℃에서 1.5시간 동안 1%(w/v) TSB를 함유한 10mM 나트륨 인산염 완충제 중에서 환원된 HD-6(200 ㎍/㎖)과 함께 인큐베이션하여, 네트를 형성하였다. 본 발명자들은 후속하여, 37℃에서 추가 30분 동안 십이지장액과 함께 전체 샘플을 인큐베이션하였다. 대조군으로서, 0.01% 아세트산(HAc)을 사용하였다. 비드를 원심분리하고, Karnovsky 시약에서 고정시켰다. 샘플을 PBS로 세척하고, H₂O 중 1% OsO₄로 추가로 고정시켰다. 이후에, 이를 100% 에탄올로 탈수시키고, CO₂로부터 임계점까지 건조시키고, Developmental Biology(독일 튀빙겐 소재)의 Max Planck Institute에서 주사 전자 현미경법에 의해 분석하였다.

투과 전자 현미경법

투과 전자 현미경법 실험을 전술한¹¹ 바와 같이 수행하였다. 6×10⁸ cfu 이. 콜라이 MC1000를 2시간 동안 200 ㎍/㎖의 각 펩타이드와 함께 인큐베이션하였다. 박테리아를 Karnovsky 고정제에서 고정시키고, 아가로스에 임베딩하고, 응고시키고, 작은 블록으로 절단하고, 다시 Karnovsky 용액에서 고정하였다. 고정후 및 글리시드 에터에 임베딩 후, 블록을 울트라-마이크로톰을 이용하여 절단하였다. 절편(30㎚)을 구리 그리드 상에 놓고, Zeiss LIBRA 120 투과 전자 현미경을 이용하여 분석하였다.

방사상 확산 검정

모든 펩타이드의 항균 활성을 액체 트립신 대두 브로쓰(TSB)(Becton Dickinson)에서 대수상 성장된 박테리아(혐기성 병에서 AnaeroGen, Oxoid를 갖는 혐기성 박테리아)에 대해 짧게 기술된 문헌[Lehrer et al ¹²]으로부터의 변형된 방사상 확산 검정으로 시험하였다. 10mM 나트륨 인산염 완충제(pH 7.4)에서 여러 세척 단계 후에, 검정당 4×10⁶ cfu/㎖를 사용하였다. 동정된 펩타이드 단편의 항균 효과를 측정하기 위해, 박테리아를 0.3 ㎎/㎖ TSB 분말 및 1%(w/v) 저 EEO-아가로스를 함유한 10mM 나트륨 인산염(pH 7.4)(Applichem) 중에서 인큐베이션하였다. 이후에, 펩타이드 단편을 펀칭된 웰에 피펫팅하고, 37℃에서 3시간 동안 확산시켰다. 그 후에 10mM 나트륨 인산염 완충제 중 6% TSB(w/v) 및 1% 아가로스를 함유한 영양소 풍부 겔을 제1 겔의 상부에 부었다. 24시간 후에, 저해 영역을 측정하였다. 본 발명자들은 음성 대조군으로 0.01% 아세트산을 사용하였으며, 이는 펀칭된 웰의 직경보다 큰 저해 영역을 나타내지 않았다. 모든 실험을 적어도 3회 수행하였다.

탁도 브로쓰 검정

시험된 박테리아를 1× TSB 브로쓰에서 밤새 인큐베이션하고, 원심분리하고, 1%(w/v) TSB 브로쓰를 함유한 10mM 나트륨 인산염 완충제로 세척하였다. 5×10⁵ cfu/㎖ 박테리아를 1%(w/v) TSB를 함유한 10mM 나트륨 인산염 완충제 중에 상이한 펩타이드 농도로 혼합하고(최종 부피 100㎕), 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 본 발명자들은 100㎕의 2× TSB 브로쓰를 첨가하고, 600㎚에서 광학 밀도를 측정하였다(Spark 10M, 오스트리아 테칸 소재). 박테리아 성장을 12시간 동안 모니터링하였으며, 혐기성 병에서 37℃에서 인큐베이션한 아커만시아 뮤시니필라를 제외하고, 30분마다 측정 동안 흔들어주면서 37℃에서 성장시키고, 성장을 72시간 동안 측정하였다.

세포벽 표적에서 이. 콜라이 및 에스. 아우레우스 균주의 살균 활성 실험뿐만 아니라 HD5 다이머 실험을 이전에 기술된 바와 같이 평가하였다. 대수상 박테리아를 원심분리(2500 rpm, 10분, 4℃)에 의해 수집하고, 1%(w/v) TSB 브로쓰를 함유한 10mM 나트륨 인산염 완충제로 2회 세척하고, OD600㎚(OD600 = 0.1)에서의 광학 밀도를 측정하였다. 대략 5×10⁵ CFU/㎖ 박테리아를 37℃에서 2시간 동안 1%(w/v) TSB 브로쓰를 함유한 10mM 나트륨 인산염 완충제 중 100㎕의 최종 부피에서 일련 펩타이드 농도(1.17 내지 150μM)로 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 100㎕의 6% TSB(w/v)를 첨가하고, 흡광도를 600㎚에서 측정하고(스위스 테칸 소재), 18시간 동안 모니터링하였다. 그 후에, 생존 가능한 박테리아의 수를 미생물학적으로 측정하기 위해 LB-플레이트 상에 웰당 100㎕를 플레이팅하였다. 살균 활성을 LC99.9으로서 표현하였으며, 이는 박테리아의 99.9% 이상 사멸된 최저 농도이다. 실험을 적어도 3회 독립적으로 반복하였다.

세포 독성 검정

CaCo2/TC7(X,X) 및 HT29 MTX E29(X,X)를 96 웰 플레이트에서 90㎕ 배지(1500개 세포/웰) 중에 시딩하고, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 상이한 농도로의 펩타이드 처리를 시작하였으며(0.01% 아세트산 중에 용해된 10㎕의 부피), 세포를 96시간 동안 인큐베이션하였다. 미처리된 및 1% Triton-X 처리된 세포를 대조군으로서 사용하였다. 인큐베이션 후에, 본 발명자들은 100㎕의 CellTiter Glo2.0 용액을 첨가하고, 본 발명자의 측정 프로토콜을 시작하였다. 측정을 Spark 10M(Tecan)에서 수행하였으며, 12분 동안 연속적으로 흔들어 주면서 시작하고, 이후에, 웰당 1초로부터의 통합 시간으로 발광 측정을 수행하였다. 실험을 2회 수행하였다.

용혈 검정

용혈 활성을 기존 프로토콜¹³ 후에 측정하였다. 본 발명자들은 2명의 자발적 공여자(샘플 수집은 독일 튀빙겐의 대학 병원의 윤리 위원회에 의해 이미 승인됨)로부터 혈액을 획득하고, 1㎖ 혈액을 PBS로 2회 세척하였다. 그 후에, 본 발명자들은 1000g에서 혈액을 원심분리하고, PBS 중 1%(v/v) 혈액 현탁을 수행하였다. 혈액 현탁액을 37℃에서 1시간 동안 상이한 펩타이드 농도(최종 농도 0.5%)로 인큐베이션하였다. 이후에, 샘플을 10분 동안 1000 g에서 원심분리하고, 상청액을 수집하고, 414㎚에서 측정하였다. 용혈 활성을 0.1% Triton X-100의 용혈 활성에 대해 측정하였다. 이러한 실험을 2회 수행하였다.

생체내 미생물군 분석

미생물군 조성에 대한 기능적 영향의 개념 증명을 평가하기 위해, HD-5_1-9를 케이지당 3마리의 군으로 하우징된 9주령의 건강한 사료 공급 수컷 마우스에 투여하였다. 마우스를 실험 시작 전에 3주 동안 순응시키고, 케이지당 평균 체중을 기준으로 실험 군으로 계층화하여, 군 간에 동일한 체중 분포를 보장하였다. 더욱 상세하게, 야생형 C57BL/6J 마우스를 7일 동안 100㎕ PBS 용액 중에 투여된 7.19 ㎍/마우스 HD-5_1-9로 경구 위관영양법에 의해 치료하였다. 대조군 마우스를 동일한 부피의 PBS로 치료하였다. 초기에, 7일 실험을 군당 6마리의 마우스로 수행하였다. 이러한 결과를 기초로 하여, 소화관 미생물 조절의 시간적 영향을 연구하기 위해 또한, 군당 6마리의 마우스를 포함한 새로운 연구를 설계하였다. 이러한 연구에서, 1주의 경구 위관영양법 후에, 7일 세척 기간을 포함하였다. 새로운 대변 샘플을 0, 7 및 14일(처리군 및 대조군 각각 n=6) 오전 9시 개개 마우스로부터 수집하고 동시에 체중을 측정하였다. 14일에, 마우스를 안락사시키고, 소장 내용물을 수집하였다.

박테리아 DNA를 0, 7 및 14일에 수집된 스냅-냉동된 대변으로부터 추출하였으며, 소장의 내용물을 제조업체 설명서에 따라 NuceloSpin 96 soil 키트(Macherey-Nagel)에 의해 부검 시에 추출하였다. BGI, Europe은 사내 표준 운영 절차를 이용하여 후속 실험실 제조 및 DNA 시퀀싱을 수행하였다. 간단하게, 샘플당 30 ng의 박테리아 DNA를 V4 16S rDNA 영역을 표적화하는 Illumina 어댑터와 함께 프라이머: 515F:GTGCCAGCMGCCGCGGTAA(서열번호 7), 806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT(서열번호 8)를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 산물을 이후에, AmpureXP 비드(AGENCOURT)로 정제하여 비특이적인 산물을 제거하였다. 평균 분자 길이를 Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent DNA 1000 Reagents)에 의해 측정하였다. DNA 정량화를 HiSeq2500 시스템 상에서의 페어 엔드 시퀀싱(pair end sequencing) 전에 실시간 정량적 PCR(EvaGreen™)에 의해 평가하였다.

리드(read)의 가공 및 품질 관리를 R 패키지 DADA2, 버전 1.4.0¹⁴을 이용하여 수행하였으며, 정방향 및 역방향 프라이머를 리드로부터 제거하였다. 다음으로, 잔류하는 콜링되지 않은 염기(uncalled base) 또는 2개 초과의 예상된 오류를 함유한 모든 리드를 제거하였다. 그 후에, DADA2 오류 모델을 1백만개 리드의 랜덤 서브세트로부터 학습하였다. 이후에, 모든 서열의 노이즈를 제거하기 위해, 즉, ASV를 추론하기 위해 이러한 오류 모델을 이용하였다. 이후에 노이즈 제거된 리드(ASV)를 병합하고, 정방향 리드와 역방향 리드 간의 하나 이상의 상반되는 염기를 갖는 리드 쌍을 제거하였다. 251개 염기보다 더 짧고 254개 염기보다 더 긴 ASV를 폐기하였다. 이후에, 키메라 서열을 함수 "removeBimeraDenovo"를 이용하여 검출하고 제거하였다. 마지막으로, 리드(ASV)를 Silva 참조 16S rRNA 유전자 데이터베이스, 버전 132를 이용하여 킹돔(kingdom)에서 속 수준으로 분류하여, 모든 샘플에서 모든 ASV의 리드 카운트를 갖는 ASV 테이블을 구성하였다. 모든 동물 프로토콜을 Laval 대학 동물 관리 및 취급 위원회에 의해 기술된 가이드라인에 따라 수행하였다. C57BL/6J 수컷 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME)를 병원체-부재, 온도-제어된 환경에서 12:12시간 낮-밤 사이클로 하우징하고, 본 발명자의 사육장에서 5주간 수용(3주 적응 및 2주 실험 프로토콜) 동안 표준 설치류 사료(Harlan Teklad T-2018)를 자유롭게 공급하였다.

통계 분석

마이크로바이옴 분석을 제외하고, 모든 분석을 GraphPad Prism 7로 분석하였다. p < 0.05의 값은 통계학적으로 유의미한 것으로 간주되었다. 모든 결과는 평균 및 이의 ± 표준 편차로서 나타내었으며, 평균의 표준 오차와 함께 또는 80% 신뢰 구간으로서, 도면 범례에 나타내었다. 생물정보 분석을 R Studio(R version 3.4.2 및 R Studio version 1.0.136) 및 패키지 phyloseq 1.22.3¹⁵, metagenomeSeq 1.20.0¹⁶, vegan 2.4-4¹⁷, Ime4 1.1-15 및 ggplot2 2.2.1¹⁸을 이용하여 수행하였다. 본 발명자의 마우스 연구를 위해, 본 발명자들은 케이지-조정된 p-값을 이용하였다.

소프트웨어

인 실리코 소화 분석을 위해, SIB Bioinformatics Resource Portal(https://web.expasy.org/peptide_mass/)로부터의 ExPASy PeptideMass 툴을 이용하였다.

결과

천연 인간 십이지장액은 HD-5를 소화시키며, HD-6을 형성하는 나노네트는 프로테아제 내성이다.

파네스 세포 디펜신이 자연 발생 티오레독신 시스템에 의해 환원될 수 있기 때문에, 단백질 분해 소화에 대한 이의 감수성을 조사하였다. 실험 절차를 개시하기 전에, 장 프로테아제에 의한 HD-5 및 HD-6의 가능한 단편화를 조사하였다. 이에 따라, 트립신, 키모트립신 또는 둘 다의 조합으로 HD-5 및 HD-6의 인 실리코 소화를 수행하기 위해 ExPASY(SIB Bioinformatics Resource Portal)의 PeptideMass 모듈을 이용하였고, 최대 5개의 누락된 절단을 허용하였다. 이의 개개 질량을 기초로 하여 하기 표 1에 가능한 단편을 나열하였다.

표 1: 트립신 또는 키모트립신 또는 둘 다의 조합으로 파네스 세포 HD-5 및 HD-6의 인 실리코(일반 문자) 및 생체외(진한 문자) 십이지장 점액 인큐베이션 후 실제, 최대 5개의 누락된 절단 및 500 Da보다 큰 단편. ExPASy PeptideMass 모듈로 상이한 서열의 결정. 인간 십이지장 점액과 함께 인간 펩타이드의 인큐베이션 후 질량 분석법으로 동정될 수 있는 단편은 진한색이다. 표에서 제1 라인은 2개의 펩타이드를 지정하며, 이는 또한 동정될 수 있다.

이론상으로, 두 파네스 세포 디펜신 둘 다는 프로테아제에 대해 민감한 것으로 보이고, HD-6은 HD-5와 비교하여 더욱 단편화하는 경향을 보였다(표 1). 제2 단계에서, HD-5 또는 HD-6을 환원시키기 위해 환원제 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)을 사용하였으며, 펩타이드를 자연 발생 십이지장액에 접종하였으며, 이는 단백질 분해 활성인 것으로 알려져 있다. 질량-분광 분석을 수행한 후에, HD-6에 대한 2mM TCEP로의 일부 환원이 확인되었으며, 이는 이전에 공개된 연구와 일치한 것이다. 2개의 전장 형태 HD-6_ox(이론치: 3705.49 Da) 및 HD-6_red(3711.54 Da) 이외에, 놀랍게도, 다른 단편은 동정되지 않았으며, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-배 양성자화된 이온을 지시하는 질량-대-전하-비율(m/z)에 의해 동정 가능하다. 이러한 놀라운 관찰은, 단백질 분해 절단 부위가 생물정보학적으로 예측되었기 때문에 이유가 아직 명확하지 않았지만 HD-6_red가 단백질 분해 소화에 대해 보호된다는 것을 나타낸다. 이의 레독스 상태와 독립적인 HD-6의 두 형태 모두(HD-6_ox 및 HD-6_red)가 나노네트를 형성할 수 있다는 것이 알려져 있다. 이에 따라, 네트 형성이 프로테아제 분해에 대해 보호하고, 이에 따라, 관찰된 펩타이드 보호에 대한 기계론적 설명을 제공할 수 있다고 가설을 세웠다. 나노네트 형성이 더욱 안정한 구조로 이어지는 지를 명확히 하기 위해, 십이지장액과 함께 인큐베이션된 환원된 HD-6으로부터의 주사 전자 현미경법을 수행하였다(도 1). 이러한 가설과 일치하게, 십이지장액 인큐베이션과 독립적으로 동일한 나노네트를 관찰하였다(도 1B). 종합해 보면, 나노네트 형성이 단백질 분해 소화로부터 HD-6을 보호하는 데 적어도 기여하는 것으로 보인다. 다음으로, 제2 및 더욱 풍부한 파네스 세포 디펜신, HD-5를 동일한 실험 설정에서 연구하였다. 2mM TCEP 및 십이지장액과 함께 인큐베이션 후에, HD-5_ox는 검출 한계 미만(LOD)이었으며, HD-5_red는 매우 풍부하였다. HD-5가 나노네트를 형성할 수 없지만, HD-6과는 달리, 십이지장액이 HD-5에 대한 차등적인 효과를 갖는다는 것이 놀랍게도 관찰되었다. 공지된 프로테아제 절단 부위와 일치하여, HD-5를 첨가하기 전에 존재하지 않았던 상이한 단편이 동정되었다(도 2A, 표에서 진한 문자로 강조됨). 이러한 단편을 분석하고, 이의 질량-대-전하 비와 함께 나열하였으며, 이의 질량을 갖는 상이한 관찰된 양성자화된 이온은 각 단편에 대해 나타내었다(도 2B). 동정된 단편을 이의 중성 질량 및 체류 시간과 함께 나열하였으며, 이는 십이지장액으로의 HD-5의 단편화가 전체 펩타이드 서열로부터 유래된 풍부한 단편으로 이어짐을 나타냈다. 그러나, 여전히, 검출 가능한 양의 전장 HD-5_red를 발견하였으며, 이는 단백질 분해 소화가 불완전함을 시사하는 것이다. Zn^{2 +}가 단백질 분해 소화로부터 HD-5_red를 보호할 수 있다는 것이 알려져 있으며, 이는 실제로, 본 발명자의 환경에서 확인되었다(데이터는 미제시됨). 요약하면, 십이지장액이 놀랍게도 HD-5 및 HD-6에 상이하게 영향을 미치고 있으며, 국소 미세환경에서 조건의 변화가 디펜신 단편화에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 참고로, HD-6 나노네트 형성은 환원된 전장 펩타이드의 파괴에 대해 보호하는 것으로 보이고, HD-6의 환원이 항균 활성을 언마스킹하는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 환원은 파네스 세포 디펜신 둘 다의 활성을 변화시키지만, HD-6이 직접 항균 활성을 증가시키는 반면, HD-5는 잠재적인 생활성 항균 활성을 갖는 생활성 펩타이드 단편을 형성하기 위해 장 프로테아제에 의해 소화된다.

HD-5 단편은 방사상 확산 검정에서 항균 활성을 나타낸다

HD-5 단편으로부터 항균 활성을 시험하기 위해, 선택된 단편을 화학적으로 합성하여 시험관 내에서 항균 기능을 조사하였다(도 2C). 공생 소화관 및 병원성 박테리아에 대한 여러 방사상 확산 검정을 4㎍의 상이한 단편 및 2㎍의 전장 펩타이드로 수행하였다. 흥미롭고도 놀랍게도, 다양한 정도까지 대부분의 HD-5 유래 단편이 공생 및 병원성 박테리아에 대해 항균적으로 활성적이라는 것이 관찰되었다. 추가적으로, 상이한 단편이 적용된 박테리아 균주에 대한 개별 활성 패턴을 나타내었다는 것이 확인되었다(도 3A 및 도 3B). 예상되는 바와 같이, 전장 HD-5는 광범위한 항균 활성을 나타내었다. 여전히 그리고 놀랍게도, HD-5_1-9는 항균 활성뿐만 아니라 모든 시험된 박테리아에 대해 활성적이기 때문에 다기능성(versatility)의 측면에서 가장 활성 펩타이드로서 동정되었다. HD-5_1-9와는 상반되게, HD-5_1O-27은 측정 가능한 활성을 나타내지 않았다. 참고로, HD-5_1-13, HD-5_1-28, HD-5_7-32 및 HD-5_26-32는 또한, HD-5_1-9보다 더 낮은 정도로 이지만 항균 특성을 나타내었다. 펩타이드 치료된 박테리아의 얻어진 표현형을 추가로 평가하기 위해, 이. 콜라이 MC1000을 모든 단편과 함께 인큐베이션하고, 투과 전자 현미경법(transmission electron microscopy: TEM)(도 3C)을 수행하였다. HD-5_fl 치료가 박테리아 세포 외피 둘레의 분리된 내부막 및 작은 소포 구조를 유도한다는 것이 관찰되었다(도 8). 흥미롭게도, 박테리아는 놀랍게도, 모순된 작용 방식을 나타내는 HD-5 상이한 단편과 함께 인큐베이션 후 상이한 통상적 표현형을 나타내었다. HD-5_1-9에 대하여, 박테리아의 하나의 극에서 추가적인 큰 액포 구조를 갖는 분리된 내부막이 관찰될 수 있으며, HD-5_1-13 및 HD-5_1-28 치료는 박테리아 내측에 더 큰 응집물을 초래하였다(도 8). 이러한 발견은 상이한 부류의 박테리아 표현형을 나타내며, 이러한 다양성은 작은 서열 차이(예를 들어, HD-5_1-9 및 HD-5_1-13)가 숙주 미생물 상호작용의 상이한 메커니즘을 초래할 가능성이 있음을 시사한다.

주목할 만하고도 놀랍게도, 이러한 관찰은 상이한 펩타이드의 항균 활성이 특정 군의 박테리아에 적용되지 않음을 보여주었다. 일 예로서, 비피도박테리아 균주, 비. 아돌레센티스 및 비. 롱검은 펩타이드에 대해 매우 민감하였지만, 비. 브레베는 그러하지 않았다. 종합적으로, 상기에 언급된 결과는 파네스 세포 HD-5의 단백질 분해 소화가 공생 소화관 박테리아를 조절하는 작은, 항균 활성 단편을 야기시킴을 나타낸다.

다음에, 병원성 그람-양성 및 그람-음성 박테리아(도 4A 및 도 4B)에 대한 항균 활성을 조사하였다. 여기에서, 이전에 시험된 공생 박테리아와 유사하게, 단편이 항균적으로 활성을 나타내었지만 항균 효과가 단편들 중에서 크게 다양하였다는 것이 확인되었다. 놀랍게도, HD-5_1-9, HD-5_1-13, HD-5_7-32 및 HD-5_fl이 모든 시험된 박테리아의 성장에 대한 강력한 효과를 가지며, HD-5_1-28, HD-5_1O-32 및 HD-5_26-32와 같은 다른 단편이 상이한 균주의 측면에서 단지 최소 활성적이거나 더욱 선택적이었다는 것이 관찰되었다. 상반되게, HD-5_14-32 및 HD-5_1O-27은 시험 조건 하에서 시험된 박테리아에 대해 불활성이었다. 흥미롭게도, HD-5_1O-32의 활성은 2개의 그람-양성 박테리아로 제한되었다. 제1 실험에 기술된 발견(도 3)과 일치하고, 공생을 사멸시키는 이의 효능의 측면에서, HD-5_1-9는 그람 상태와 독립적으로 모든 시험된 균주에 대해 활성적이었으며, 이는 이러한 특정 단편이 박테리아 장벽 위반에 대해 매우 보호적임을 시사한다. 상반되게, HD-5_1-13은 케이. 뉴모니애 3-MRGN을 제외하고, 시험된 병원성 박테리아를 강력하게 조절하였다. 이러한 결과를 종합하면, 파네스 세포 HD-6이 아닌 HD-5의 단백질 분해 소화가 다수의 짧은 및 활성 항균 단편의 생성을 초래함을 나타낸다. 이러한 놀라운 발견의 중요성은 국소 환경 조건에 따라 단일 전장 펩타이드를 기초로 하여 이러한 단편이 항균 변화를 넓히기 때문에, 매우 중요함을 입증할 수 있다.

HD-5 단편, 및 항생제-내성 박테리아에 대한 이의 최소 저해 농도

잠재적인 항생제 치료 용도를 위해 이러한 단편의 잠재성을 추가로 조사하기 위해, 본 발명자들은 상이한 항생제-내성 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 균주에 대한 본 발명자의 펩타이드의 최소 저해 농도(MIC)를 측정하였다. 전술한 RDA 실험의 결과는 공생 및 병원성 박테리아에 대한 유망한 항균 활성을 나타내었다. 상이한 HD-5 단편의 항균 능력을 더욱 상세히 이해하기 위해, 본 발명자들은 이러한 펩타이드의 MIC를 결정하기 위해 탁도 브로쓰 검정을 수행하였다. 본 발명자들은 MIC를, 모든 실험 동안 박테리아 성장이 12시간 후에 검출되지 않는 농도로서 결정하였다. 이러한 파라미터를 이용하여, 본 발명자들은 HD-5_1-9, HD-5_1-13, HD-5_1-28, HD-5_7-32 및 HD-5_1O-32의 항균 활성을 검출할 수 있었다(하기 표 2 참조).

표 2: 병원성 박테리아에 대한 μM 및 ㎍/㎖ 단위의 HD-5 단편의 MIC. 각 실험을 적어도 3회 수행하였다. MIC를 12시간의 인큐베이션 후 매 실험에서 어떠한 박테리아 성장 없는 농도로서 결정하였다.

이러한 단편과 전장 펩타이드의 MIC(μM 단위)를 비교하면, 대부분의 디펜신 단편은 놀랍게도, 전장 펩타이드 정도로 활성을 나타내었다. 그러나, 펩타이드 단편의 MIC 농도(㎍/㎖)를 비교할 때, 더 적게 요구되며, 이러한 농도를 기초로 하여, 특히 HD-5_1-9는 전장 펩타이드보다 더욱 활성을 나타내었다. 참고로, 관찰된 MIC는 에이. 바우만니 4-MRGN 및 이. 파에시움 475747에 대한 HD-5_1-9를 제외하고, 비교적 높은데, 이는 장내 장벽에서 항균 활성 물질의 역할이 선와(crypt)와 같이 고농도를 갖는 부위로 제한되는 것을 나타낸다. 이의 생체내 기능적 능력을 명확히 하기 위해, 특히, 파네스 세포가 자연적으로 장관에 위치되어 있기 때문에 이의 장내 마이크로바이옴 조절 기능을 조사하고자 하였다.

HD5_1-9 작용 모드가 다이설파이드 결합 및 전하 의존적인지를 조사하기 위해 그람-음성 및 -양성 박테리아뿐만 아니라 칸디다 종(Fejl! Et bogmaerke kan ikke henvise til sig selv.)에 대한 최소 저해 농도에 의해 항균 활성을 결정하였다. 이에 따라, 시스테인의 α-아미노부티르산(Abu)으로의 교환 및 아르기닌의 시트룰린(Cit)으로의 치환을 포함하는 HD5_1-9의 여러 변이체를 합성하였다. 추가적으로, HD5_1-9의 역(RGTRCYCTA) 및 랜덤(CTRATYCRG) 아미노산 구조를 시험하였다. HD5_1-9는 이. 콜라이 BW 25113에 대한 강력한 살균 효과를 나타내었으며, HD5_1-9는 에스. 엔테리카 세로바 엔테리티디스(S. enterica serovar Enteritidis)에 대한 더 적은 항균 활성을 나타내었다. 유사한 효과는 그람-음성 박테리아 둘 다에 대한 역 변이체 RGTRCYCTA에 대해 관찰되었다. HD5_1-9 변이체는 놀랍게도, 서열이 랜덤인 경우 및 시스테인 또는 아르기닌 아미노산이 결여될 때 시험된 그람 음성 박테리아에 대한 이의 항균 활성을 상실하였다. 두 스타필로코커스 종 모두에 대해, HD5_1-9 또는 이의 변이체에 대해 살균 효과가 측정되지 않았다. 반대로, HD5_1-9는 이. 패칼리스에 대한 강력한 박테리아 활성을 나타내었다. 그러나, HD5_1-9의 시스테인 및 아르기닌 치환뿐만 아니라 랜덤 서열 RGTRCYCTA 및 CTRATYCRG은 살균 효과의 완전한 소멸(dissolving)을 초래한다. 이. 패칼리스와는 달리, HD5_1-9 또는 이의 변이체는 이. 파에시움에 대한 살균 효과를 나타내지 않았다. HD5_1-9 및 변이체의 항균 활성을 추가적으로 24시간 후 2개의 칸디다 종에 대해 조사하였다. 진균 성장의 저해는 낮은 항균 스펙트럼을 나타내는 시. 트로피칼리스(C. tropicalis)에 대해 관찰될 수 있다. HD5_1-9의 시스테인 및 아르기닌 치환은 진균 성장 저해에 대해 효과를 가지지 않았다. 유사한 효과는 시. 알비칸스(C. albicans)에 대해 관찰되었으며, HD5_1-9 및 변이체는 항균 활성을 나타내지 않았다. 요약하면, 결과는 항균 효과를 유도하기 위해 본 시스테인 및 아르기닌 잔기 및 HD-5_1-9의 본래 아미노산 구조의 중요성을 강하게 강조한다.

하기 표 3은 시험된 박테리아 및 칸디다 종에 대한 HD5_1-9의 항균 활성을 나타낸다. 18시간 또는 24시간 후에 광학 밀도를 이용하여 상이한 HD5_1-9 농도로 이. 콜라이 BW 25113, 에스. 엔테리카 세로바 엔테리티디스, 에스. 아우레우스 SA113, 에스. 에피데르미디스 에반스(S. epidermidis Evans) 1916, 이. 패칼리스 ATCC 19433, 이. 파에시움 ATCC 19434, 시. 트로피칼리스 ATCC 4563 및 시. 알비칸스 ATCC 10231의 최소 저해 농도(MIC)를 결정하였다. 3회 독립 실험으로부터의 결과를 나타내었다:

하기 표 4는 또한, 본 발명에 따른 HNP-4 단편의 효과를 나타낸 것이다. 이러한 표로부터, 본 발명에 따른 HNP-4 펩타이드 단편이 HD-5_1-9 펩타이드와 유사한 항균 거동을 나타낸다는 것을 볼 수 있었다.

표 4: 하기 표 4는 시험된 박테리아 및 칸디다 알비칸스에 대한 HD5_1-9, HD5_1-9;mod, HNP-4_1-11 및 HNP-4_{1- 11;mod}의 항균 활성을 나타낸 것이다. 12시간 후 광학 밀도를 이용하여 상이한 펩타이드 농도에서의 에이. 바우만니 4-MRGN, 에이. 바우만니 DSM 30007, 이. 파에시움 475747, 이. 파에시움 DSM 20477, 케이. 뉴모니애 3-MRGN, 케이. 뉴모니애 DSM 301404, 피. 에루기노사 4-MRGN, 피. 에루기노사 ATCC 27853, 피. 에루기노사 PA01, 피. 에루기노사 XP AT1, 피. 에루기노사 XPAT2, 에스. 아우레우스 USA300, 에스. 아우레우스 ATCC 25923, 에스. 엔테르티디스(S. entertidis), 이. 콜라이 BW 25113, 와이. 엔테로콜리티카(Y. enterocolitica), 및 시. 알비칸스 525L의 최소 저해 농도(MIC)를 결정하였다. 3회 독립 실험으로부터의 결과를 나타내었다:

HD-5 _1-9 치료는 특정 박테리아 속에 영향을 미치지만 미생물 다양성에 영향을 미치지 않는다

동정된 HD-5 단편의 마이크로바이옴 조절 기능을 조사하기 위해, 먹이가 공급된 마우스를 경구로 7일 동안 HD-5_1-9 또는 PBS로 치료하고(7.19 ㎍/마우스), 이후에 7일 동안 세척 단계를 수행하였다. 2 군의 마우스의 미생물군 조성은 기준선에서 구별할 수 없었다(Bray Curtis-거리를 이용한 Adonis PERMANOVA, p = 0.22). 7일의 HD-5_1-9 치료 후에, 대조군과 비교하여 대변 샘플에서 전체 미생물군 조성에서 경계선 차이가 존재하였지만(Bray Curtis-거리를 이용한 Adonis PERMANOVA, p = 0.08), 군의 기준선 미생물군과 유사하지 않았다(Bray Curtis-거리를 이용한 Adonis PERMANOVA, p = 0.38, 데이터는 미제시됨). HD-5가 소장의 파네스 세포에 의해 자연적으로 분비되기 때문에, 본 발명자들은 이에 따라 부검 시에 소장의 미생물 군집을 조사하였다. HD5_1-9 치료된 마우스는 7일 세척 단계 후 대조군과 비교하여 소장에서 미생물 군집 구조의 통계적 변화를 나타내지 않았다(Bray Curtis-거리를 이용한 Adonis PERMANOVA, p = 0.09, 데이터는 미제시됨). 결과는 HD-5_1-9가 놀랍게도 현저한 항균 효능에도 불구하고 건강한 먹이 공급된 마우스에서 전체 대변 미생물군 조성을 변화시키지 않음을 시사하는 초기 실험과 일치하였다(도 12).

대변 미생물군 조성물의 Shannon 다양성은 기준선에서 군 간에 동일하였고(윌콕슨 시험, p = 1), 7일의 HD-5_1-9 치료(윌콕슨 시험, p = 0.18) 후 및 14일에 세척 후(Wlcoxon 시험, p = 0.07)(데이터는 미제시됨) 유사하였다. 소장 미생물군의 다양성은 마찬가지로, 14일에 2개의 군 간에 유사하였지만(Wlcoxon 시험, p = 0.45, 도 5B 우측), 7일에는 그러하지 않았으며, 여기서, HD-5_1-9 치료된 마우스는 놀랍게도, 비히클 위관영양된 대조군 마우스와 비교하여 증가된 박테리아 다양성을 나타내었다(p = 0.004, 데이터는 미제시됨).

실험 설계는 또한, 잠재적인 공동-케이징 효과에 대해 계층화하는 선형 혼합 모델 및 동일한 마우스로부터 반복된 샘플링을 이용하여 대변 샘플의 페어드 분석(paired analyses)을 수행할 수 있게 하였다. 대변 샘플에서 몇 개의 저-풍부 미생물 속에 대한 HD-5_1-9의 유의미한 효과가 확인되었다. 더욱 상세하게, 파라수테렐라(Parasutterella) 속 및 칸디다투스 스토쿠에피추스(Candidatus Stoquefichus)의 상대적 존재비의 증가가 관찰된 반면, 라크노스피라세아에(Lacnospiraceae) 과 및 하이드로게노아나에로박테리움(Hydrogenoanaerobacterium)의 GCA-900066575는 HD-5_1-9 치료에 의해 감소되었다. 속 아커만시아는 대변 샘플에서 HD-5_1-9에 의해 경계선 증가되었으며(선형 혼합 모델, p = 0.0754, (데이터는 미제시됨)), 이는 아커만시아가 HD-5_1-9 치료에 의해 상세하게 증가되었다(선형 혼합 모델, p = 0.0748)는 초기 실험의 발견을 확인하였다. 소장 미생물군은 14일에 2 군 사이에 대체로 유사하였으며, 아커만시아의 상대적 존재비는 HD-5_1-9(선형 혼합 모델, p = 0.0085)에 의해 증가되었는데, 이는 종래 실험으로부터의 본 발명자의 결과와 매칭된 것이다(선형 혼합 모델, p = 0.017). 또한, 루미코카세아에(Ruminococcaceae) 과의 속 루미노코커스_1(Ruminococcus_1) 속은 상대적 존재비에서 증가된 반면, 인테스티니모나스(Intestinimonas), 클로스트리디아세아에(Clostridiaceae) 과의 ASF356, 및 루미코카세아에 과의 루미코카세아에_UCG-013은 상대적 존재비에서 감소되었다(데이터는 미제시됨).

종합하면, 이러한 결과는, HD-5_1-9가 놀랍게도, 건강한 먹이-공급된 마우스에서 전체 군집 구조 또는 다양성에 영향을 미치지 않으면서, 대변 미생물군에서 특정의 낮은-풍부 박테리아의 양을 변경시킴을 나타낸다.

추가적으로, 탁도 브로쓰 검정에서 에이. 뮤시니필라(A. muciniphila)가 HD-5_1-9에 민감한 지의 여부를 시험하였다. 이러한 발견은, 심지어 작은 농도의 HD-5_1-9가 에이. 뮤시니필라의 성장을 약간 감소시키지만, 박테리아를 사멸시키지 않았음을 나타낸다(도 9B).

HD5_1-9의 전- 및 항-염증 효과를 시험하였으며, IFN-γ 및 IL-8을 감소시키는 용량 의존 경향과 함께 낮은 항-염증 효과가 존재하였다는 사실에도 불구하고, 이는 통계학적으로 유의미하지 않았고, IL-10을 증가시키는 용량 의존 경향도 존재하지 않았다(도 10).

HD5_1-9의 독성 효과를 또한, 다수의 시험관내 실험에서 시험하였지만(도 11 및 도 12), HD5_1-9가 짧은 선형 펩타이드임에도 불구하고, 놀랍게도, 독성이 관찰되지 않았다.

이. 콜 라이 BW 25113 및 에스. 아 우레우스 SA113의 돌연변이체의 세포벽 표적의 동정

HD5_1-9의 작용 기전을 이. 콜라이 BW 25113 및 에스. 아우레우스 SA113의 세포벽 돌연변이를 사용하여 식별하였다. 목적은 세포벽의 구성성분이 HD5_1-9의 결합에 중요한 지, 및 전하가 중요한 역할을 하는지의 여부를 분석하는 것이다. 탁도 검정을 상기에 기술된 바와 같이 수행하였다. MIC를 결정함으로써 상이한 LPS 구조를 갖는 이. 콜라이 균주를 조사하였다(도 16). 야생형 이. 콜라이 BW 25113뿐만 아니라 이. 콜라이 ATCC 25922를 대조군으로서 사용하였다. 마지막은 이. 콜라이 BW 25113과 유사한 세포벽 조성물을 함유하지만, 추가적으로, 이에 따라, O-항원은 전장 LPS를 보유한다. 돌연변이체 이. 콜라이 BW 25113 ΔwaaG는 야생형과 내부 막에서 동일한 양의 인산염 잔기를 함유하고, 이에 따라, 유사한 전하를 보유하지만, 외부 코어는 누락되어 있다. 돌연변이체 ΔwaaY는 외부 코어를 포함하며, 내부 코어에서 일부 인산염 잔기는 누락되어 있다. 마지막 이. 콜라이 돌연변이체 ΔwaaP는 외부 막도 지니고 있지만, 내부 막에 인산염 잔기를 보유하지 않아서, 내부 막의 더 많은 양전하를 유발시킨다¹⁹.

HD5_1-9의 항균 활성을 상이한 이. 콜라이 균주 및 돌연변이체에 대해 분석하였다. 전장 LPS를 갖는 이. 콜라이 ATCC 25922는 O 항원이 결여된 시험된 이. 콜라이 BW25113만큼 HD5_1-9에 대해 높은 감수성을 나타내었다. 박테리아 세포벽에 대한 HD5_1-9 결합 동안 외부 코어의 기능을 명확하게 하기 위해, 돌연변이체 ΔwaaG를 사용하였다. MIC의 결정은 이. 콜라이 ATCC 25922 및 이. 콜라이 BW25113과 같은 ΔwaaG에 대한 HD5_1-9의 유사한 항균 효과를 나타낸다. 놀랍게도, 하나의 내부 코어 인산염이 결여된 이. 콜라이 ΔwaaY, 및 2개의 내부 코어 인산염이 결여된 이. 콜라이 ΔwaaP는 HD5_1-9에 대하 더 내성적이지 않았다. 이러한 관찰은 정전기적 상호작용으로 인해 세포벽에서 양이온성 항균 펩타이드가 음이온성 인지질과 상호작용하는 것이 알려져 있기 때문에 놀라운 것이다. 세포벽의 내부 코어에 이러한 음전하의 결여는 일반적으로, 박테리아 세포벽 상에 펩타이드가 결합하는 능력을 감소시킬 것이다. 그러나, HD5_{1 -9}는 놀랍게도, 모든 기술된 이. 콜라이 돌연변이체에 대해 대략 12.5μM의 농도에서 살균 효과를 나타낸다. 항균 활성이 세포벽의 음전하에 따라 달라질 뿐만 아니라, 추가 결합 부위가 그람-음성 박테리아에 존재하여야 한다는 것이 설명될 수 있다.

상이한 세포벽 돌연변이를 갖는 다양한 에스. 아우레우스 SA113 균주에 대해 HD5_1-9 및 변이체의 항균 활성을 조사하였다(도 17). 목적은, HD5_1-9가 그람-양성 박테리아의 세포벽에 얼머나 결합할 수 있는 지 및 전하가 HD5_1-9의 항균 활성에 결정적인 역할을 하는지의 여부를 조사하기 위한 것이다. 제1 돌연변이체 ΔdltA는 펩티도글리칸 층에서 D-알라닌을 함유하지 않고, 펩티도글리칸 층의 더욱 음전하를 초래한다²⁰. 돌연변이체 ΔmprF는 L-라이신을 결여하여, 세포막의 더욱 음전하를 초래한다²¹. 마지막 돌연변이체 ΔtarH는 추가적으로 벽 테이코산을 함유하여, 펩티도글리칸의 강화를 유발한다²². HD5_1-9는 야생형 균주 에스. 아우레우스 SA113에 대한 성장 저해를 나타내지 않으며, 더욱 음성의 펩티도글리칸 층을 함유한 에스. 아우레우스 ΔdltA 돌연변이체는 6.25μM에서 MIC를 나타내어 HD5_1-9에 대해 훨씬 더 민감하였다(도 15). HD5_1-9는 또한 L-라이신이 결여된 ΔmprF 돌연변이체에 대한 살균 효과를 나타내었으며, 이는 박테리아 세포막의 더욱 음전하를 야기시킨다. 그러나, 놀랍게도, 에스. 아우레우스 ΔtarH 돌연변이체에서 추가 테이코산으로 인한 펩티도글리칸 층의 강화는 HD5_1-9의 항균 효과를 감소시켰다.

이러한 결과는 그람-양성 박테리아에 대한 HD5_1-9의 결합을 위한 세포벽 전하의 중요성을 강조하는 반면, 세포벽 전하는 그람-음성 박테리아에 대한 결합을 위해 덜 중요한 것으로 보인다.

상이한 박테리아에 대한 HD5 _1-9 및 HD5 _1-9 - 다이머의 항균 활성의 특징분석

HD5는 류신 잔기를 보유하여, 다이머를 형성할 수 있다. HD5의 류신 치환은 항균 활성의 감소 및 미생물을 사멸시키는 능력을 야기시키는데, 이는 HD5의 다이머화가 이의 기능에 중요함을 나타낸다(Rajabi et al., 2008, 2012; Szyk et al., 2006)^23-25. 또한, HD5의 시스테인 잔기는 다이설파이드 또는 수소 결합으로 다이머를 구성할 수 있다. 연구에서는 HD5의 시스테인 돌연변이가 산화성 폴딩, 항균 활성, 그람-음성 박테리아 막 침투능뿐만 아니라 단백질 분해 안정성에 영향을 미친다(Wanniarachchi et al., 2011)²⁶.

이에 따라, 또한 HD5_1-9가 시스테인 잔기의 존재로 인해 다이머를 형성할 수 있다고 가정하는 것이 합리적이다. HD5_1-9의 2개의 모노머를 다이설파이드 결합을 통해 연결하여 다이머화를 야기시켰다. 목적은 선택된 박테리아에 대해 모노머 형태와 비교하여 이의 다이머 형태로 구조화된 HD5_1-9의 항균 활성을 조사하는 것이다. HLPC 및 질량 분석법은 2058의 MW를 갖는 것으로서 다이머를 동정하였으며, 이는 2개의 모노머 간에 하나의 다이설파이드 브릿지의 존재와 일치한다.

HD5_1-9와 동일한 농도로 치료된 그람 양성 박테리아(에스. 아우레우스 종) 및 그람-음성 박테리아(살모넬라 종)에 대한 탁도 검정에서 최소 저해 농도를 결정하였다.

수행된 실험은, HD5_1-9의 항균 활성이 놀랍게도 시험된 박테리아에 대해 이의 다이머 형태와 유사하거나 심지어 더 양호하다는 것을 나타내었다. HD5_1-9뿐만 아니라 그의 다이머 형태의 항균 활성은 상이한 살모넬라 종에 대해 거의 동일하다(도 18). 그러나, 놀랍게도, 다이머화된 HD5_1-9는 모노머 형태의 HD5_1-9와 비교하여 에스. 아우레우스 종에 대한 훨씬 더 큰 살균 활성을 나타내었다(도 19). 이는 HD5_1-9의 2개의 형태에 대한 놀라운 상이한 작동 모드를 의미한다.

트립신 소화 후 신규한 HNP -4 단편의 동정

본 발명자들은 HNP-4를 2mM TCEP와 함께 인큐베이션하여 다이설파이드 결합을 열어서 단백질 분해 소화에 민감한 보다 선형의 구조를 야기시킨다. 본 발명자들은 LC/MS 방법을 통해 환원된 HNP-4를 인큐베이션한 트립신을 분석하고, 여러 단편을 검출할 수 있었다(도 20A). 관찰된 이온 및 이의 질량 대 전하 비율에 따르면, 본 발명자들은 이러한 단편을 명확하게 동정할 수 있었으며, 이는 트립신의 절단 부위를 기초로 하여 N-말단 영역에 주로 위치되어 있다. AMP의 순 전하가 이의 항균 활성에 중요한 역할을 할 수 있다는 것이 일반적으로 받아들여지기 때문에, 본 발명자들은 +3의 양성 순 전하를 갖는 HNP-4_1-11에 집중하였다.

HNP -4 _1-11 의 항균 효능

짧은 선형 펩타이드의 자연적 안정성이 약하기 때문에, 본 발명자들은 HNP-4_1-11의 추가적인 변형된 형태(HNP-4_{1- 11mod})를 사용하였다. 여기에서, 본 발명자들은 L-아미노산을 D-아미노산으로 교환하고, N-말단(아세틸화) 및 C-말단(아마이드화)을 변형하였다. 두 변형 모두는 안정성의 증가를 야기시켜야 하며^{27 -28}, 이에 따라, 잠재적으로 더 강력한 항균 활성을 야기시켜야 한다. HNP-4_fl, HNP-4_1-11 및 HNP-4_{1- 11mod}의 항균 활성을 분석하기 위해, 본 발명자들은 서브세트의 상이한 공생 및 병원성 박테리아에 대해 RDA를 사용하였다. 본 발명자의 시험된 펩타이드 모두는 대부분의 시험된 박테리아에 대해 강력한 항균 활성을 나타내었다(도 21). RDA가 상이한 펩타이드의 일반 항균 활성을 결정하기 위한 적합한 검정이지만, 상이한 펩타이드 간의 비교는 아가로스 겔에서 이의 상이한 능력(예를 들어, 확산)에 따라 가능하지 않다. 이에 따라, 본 발명자들은 다음으로 병원성(일부 다중-약물 내성) 그람 음성 및 양성 박테리아 및 하나의 진균 균주에 대한 HNP-4_fl, HNP-4_1-11 및 HNP-4_{1- 11mod}의 MIC를 결정하기 위해 탁도 브로쓰를 사용하였다(표 5). 모든 펩타이드가 시험된 박테리아에 대한 항균 활성을 나타내었지만(유일한 제외: 케이. 뉴모니애 DSM30104에 대한 HNP-4_fl), HNP-4_1-11은 놀랍게도 HNP-4_fl과 동일한 몰인데, 이는 HNP-4_fl을 생산하기 위한 천연 복합체의 항균 효능이 오로지 첫번째 11개의 아미노산(HNP-4_1-11)에 의존적임을 나타낸다. 이러한 선형 단편의 향상된 살균 효능을 추가로 가리키면, 비-변형된 버전에 비해 증가된 안정성을 나타낼 것으로 예상되는 HNP-4_1-11mod는 HNP-4_fl 및 HNP-4_1-11 둘 다에 대해 우수하며, MIC는 자연 발생 전장 펩타이드에 대하 관찰된 것보다 수배 더 낮다. 이에 따라, 본 발명자들은 트립신 소화에 의해 전장 펩타이드의 항균 활성을 촉발시켰으며, 이에 의해, 본 발명자들은 몰 기준으로 전장 펩타이드를 초과하여, 주목할 만한 항균 잠재력을 갖는 단일 단편을 동정하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 다중-약물-내성 및 비-내성 균주 간에 동일하게 효능이 있는 펩타이드의 항균 효능을 관찰하였다. 이에 따라, AMP의 단백질 분해 소화는 항생제-내성 박테리아를 극복하기 위한 새로운 전략을 유발시킬 수 있는 새로운 활성 서열을 생성시키기 위해 사용될 수 있다.

HNP -4 _1-11 및 HNP -4 _{1- 11mod} 의 세포독성 및 용혈 효과

치료제로서 생체내 적용을 위한 HNP-4_1-11 및 HNP-4_{1- 11mod}의 가능성을 결정하기 위해, 본 발명자들은 2개의 상이한 세포주를 이용하여 이의 세포독성 능력을 조사하였다. 본 발명자가 단지 더 높은 펩타이드 농도에서 CaCo2/TC7 세포에 대한 최소 세포독성 효과를 관찰하였지만(도 22A), HT29 MTX E29 세포는 두 시험된 펩타이드-유도체 모두에 더욱 민감하였다(도 22B). 중요하게는, 낮은 농도(예를 들어, HNP-4_{1- 11mod}가 강력한 항균 효과를 갖는 경우, 12.5μM)에서, 단편은 단지 보통의 세포독성을 나타내었다. 본 발명자들은 상기 펩타이드의 용혈 활성을 추가적으로 시험하였다(도 22C). HNP-4_{1- 11mod}가 150μM에서 20% 용혈 효과를 가지만(살균 효능을 위해 필요한 최고 농도를 훨씬 능가함으로써), 18.75μM 이하에서, 즉, 최고 생물학적 관련 농도에서 무시할 정도의 독성이 존재하였다. 이에 따라, 1.25μM에서 80% 용혈 효과를 나타낸 꿀벌 독소, 멜리틴(Melittin)과 비교하여, HNP-4_1-11 및 HNP-4_{1- 11mod} 둘 다는 낮은 용혈 활성을 나타내었다. 결론적으로, 식별된 세포독성 농도는 해당하는 살균 농도보다 더 큰 크기를 갖는다.

요약

상기에 제시된 연구 및 발명 내에서, 알파-디펜신 및 프로테아제에 대한 이의 감수성과 관련한 여러 새로운 발견이 이루어졌다. HD-6의 인 실리코 소화에서 알 수 있듯이, HD-6이 십이지장액에서 자연 발생 프로테아제에 의해 영향을 받지 않았다는 것은 오히려 놀라운 것이었다. HD-6과는 달리, HD-5는 분해되었으며, 이의 단편은 놀랍게도, 공생 및 병원성 박테리아에 대해 항균 활성을 포함하였다.

HD-5 단편의 항균 스펙트럼의 결정은 공생 및 병원성 박테리아 둘 다에 대해 높은 항균 활성을 나타내었다. 항균 스펙트럼은 모 펩타이드의 스펙트럼과 상이할 뿐만 아니라 HD5 단편 간에 상이하였으며, 이에 따라, 이러한 것은 HD-5 단편은 추가적인 박테리아 사멸 또는 미생물군 조절 능력을 부가하는 것으로 보인다. 이러한 흥미롭고 놀라운 현상은 또한, 수 개의 디펜신이 장의 상이한 부분에서 매우 상이한 공생 콜로니화를 어떻게 조절하거나 지지할 수 있는 지의 이해에 기여한다.

본 연구 및 본 발명 내에서, HD5_1-9, HD5_1-13, HD5_1-28, HD5_7-32, HD5_{1O -32}, HD5_14-32, HD5_1O-27 및 HD5_26-32가 미생물군 조절 효과를 갖는 것으로 보였다. 일부 낮은 풍부한 박테리아 균주에 대한 효과 외에도, 본 결과는 놀랍게도 HD5_1-9로 경구 치료된 마우스만이 치료받지 않은 마우스와 비교하여 증가된 양의 에이. 뮤시니필라를 가짐을 보였으며, 또한, 다른 박테리아와는 달리, 에이. 뮤시니필라는 탁도 브로쓰 검정에서 HD5_1-9에 대해 민감하지 않았는데, 아커만시아 종이 마이크로바이옴 분석에서 증가되었다는 발견과 일치한다. 에이. 뮤시니필라에 대한 이러한 놀라운 영향은 HD-5 펩타이드에서 전장에 대해 이전에 기술된 것이 없다. 이것은 전장 펩타이드와 이의 단편 간에 상이한 스펙트럼을 분명이 보여준다.

본 연구 및 본 발명은 그람-양성 박테리아에 대한 HD5_1-9의 결합을 위한 세포벽 전하의 중요성을 강조하며, 세포벽 전하는 그람-음성 박테리아에 대한 결합을 위해 덜 중요한 것으로 보인다. 수행된 실험은 더욱 놀랍게도, 다이머화된 HD5_1-9가 HD5_1-9의 모노머 형태와 비교하여 에스. 아우레우스 종에 대한 훨씬 더 양호한 살균 활성을 나타냄을 입증하였다. 이는 HD5_1-9의 2가지 형태에 대한 상이한 작동 모드를 의미한다.

HNP-4_1-11은 놀랍게도 HNP-4_fl과 동일한 몰인데, 이는 HNP-4_fl을 생산하기 위한 천연 복합물의 항균 효능이 오로지 첫번째 11개의 아미노산(HNP-4_{1- 11})에 의존적임을 나타낸다. 놀랍게도 그리고 선형 단편의 향상된 살균 효능을 추가로 가리키는 경우에, 비-변형된 버전에 비해 증가된 안정성을 나타내는 것으로 예상된 HNP-4_{1- 11mod}는 HNP-4_fl 및 HNP-4_1-11 둘 다에 비해 우수하였으며, MIC는 자연 발생 전장 펩타이드에 대해 관찰된 것보다 수배 더 낮다. 이에 따라, 본 발명자들은 트립신 소화에 의해 전장 HNP-4 펩타이드의 항균 활성을 촉발하였으며, 이에 의해, 본 발명자들은 몰 수준에서 전장 펩타이드를 능가하는, 놀라운 항균 가능성을 갖는 단일 단편을 동정하였다. 놀랍게도, 본 발명자들은 펩타이드의 항균 효능이 다중-약물-내성 균주와 비-내성 균주 간에 동일하게 효율적인 것으로 관찰하였다.

이의 미생물군 조절 능력 이외에, 항균 활성 펩타이드에 대한 다른 중요한 분야는 급속하게 증가하는 항생제-내성 박테리아의 수이다. 본 명세서에서 동정된 펩타이드 단편의 항균 스펙트럼은 다중 약물 내성 박테리아에 대한 새로운 항생제의 소스로서 이러한 펩타이드를 사용할 수 있다. 또한, 이러한 쉽고 저렴하게 펩타이드 단편을 생산한다는 발견은 마이크로바이옴 조성을 치료학적으로 조작하고 소장의 크론병과 같은 파네스 세포 관련 질환을 치료하는 새로운 대안적인 방법이다.

참조문헌:

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<211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys 1 5 10 15 Glu Ile Ser Gly Arg Leu 20 <210> 23 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile 1 5 10 15 Ser Gly Arg Leu Tyr 20 <210> 24 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys 1 5 10 15 Glu Ile Ser Gly Arg 20 <210> 25 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu 1 5 10 15 Cys Cys Arg <210> 26 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg 1 5 10 15 Leu Tyr Arg <210> 27 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile 1 5 10 15 Ser Gly Arg <210> 28 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg 1 5 10 15 Leu Tyr <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg 1 5 10 15 <210> 30 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu 1 5 10 15 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg 1 5 10 15 <210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg 1 5 10 15 <210> 33 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr 1 5 10 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg 1 5 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu 1 5 10 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg 1 5 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Tyr Arg Leu Cys Cys Arg 1 5 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg 1 5 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Ala Thr Cys Tyr Cys Arg 1 5 <210> 45 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Arg Leu Cys Cys Arg 1 5 <210> 46 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Cys Arg Thr Gly Arg 1 5 <210> 47 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu 20 25 30 <210> 48 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu 20 25 30 <210> 49 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe 20 25 <210> 50 <211> 28 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg 20 25 <210> 51 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe 20 25 <210> 52 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg 20 25 <210> 53 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met 1 5 10 15 Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu 20 25 <210> 54 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly 1 5 10 15 Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu 20 <210> 55 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser 1 5 10 15 Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met 20 <210> 56 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met 1 5 10 15 Gly Ile Asn His Arg Phe 20 <210> 57 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly 1 5 10 15 Thr Cys Thr Val Met 20 <210> 58 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met 1 5 10 15 Gly Ile Asn His Arg 20 <210> 59 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly 1 5 10 15 Ile Asn His Arg Phe 20 <210> 60 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His 1 5 10 15 Arg Phe Cys Cys Leu 20 <210> 61 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly 1 5 10 15 Ile Asn His Arg 20 <210> 62 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser 1 5 10 15 Tyr <210> 63 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His 1 5 10 15 Arg Phe <210> 64 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His 1 5 10 15 Arg <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys 1 5 10 15 Leu <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr 1 5 10 15 <210> 67 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr 1 5 10 15 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu 1 5 10 15 <210> 69 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr 1 5 10 <210> 70 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe 1 5 10 <210> 71 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg 1 5 10 <210> 72 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr 1 5 10 <210> 73 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met 1 5 10 <210> 74 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe 1 5 10 <210> 75 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr 1 5 10 <210> 76 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg 1 5 10 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr 1 5 <210> 79 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu 1 5 <210> 80 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr 1 5 <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg 1 5 <210> 82 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 83 Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Ala Phe Thr Cys His Cys Arg 1 5 <210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 85 Thr Cys His Cys Arg Arg 1 5 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Homom sapiens <400> 86 Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr 1 5 <210> 87 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 87 Gly Ile Asn His Arg Phe 1 5 <210> 88 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Thr Cys His Cys Arg 1 5 <210> 89 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Gly Thr Cys Thr Val Met 1 5 <210> 90 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 90 Arg Ser Cys Tyr 1 <210> 91 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is (2S)-2-aminobutanoic acid (Abu) <400> 91 Ala Thr Xaa Tyr Cys Arg Thr Gly Arg 1 5 <210> 92 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is (2S)-2-aminobutanoic acid (Abu) <400> 92 Ala Thr Cys Tyr Xaa Arg Thr Gly Arg 1 5 <210> 93 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X is (2S)-2-aminobutanoic acid (Abu) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X is (2S)-2-aminobutanoic acid (Abu) <400> 93 Ala Thr Xaa Tyr Xaa Arg Thr Gly Arg 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X is citrullin (Cit) <400> 94 Ala Thr Cys Tyr Cys Xaa Thr Gly Arg 1 5 <210> 95 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X is citrullin (Cit) <400> 95 Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Xaa 1 5 <210> 96 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X is citrullin (Cit) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X is citrullin (Cit) <400> 96 Ala Thr Cys Tyr Cys Xaa Thr Gly Xaa 1 5 <210> 97 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide <400> 97 Arg Gly Thr Arg Cys Tyr Cys Thr Ala 1 5 <210> 98 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthesized peptide <400> 98 Cys Thr Arg Ala Thr Tyr Cys Arg Gly 1 5

Claims (22)

1. 항균 활성을 갖는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 HD-5의 단편이고, 상기 펩타이드는,
   ATCYCRTGR(서열번호 1),
   RGTRCYCTA(서열번호 2),
   Ac-atcycrtGr-NH₂(서열번호 5),
   LYRLCCR(서열번호 41),
   ATCYCRTGRCATR(서열번호 34),
   ATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYR(서열번호 12),
   TGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(서열번호 14),
   CATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(서열번호 19),
   ESLSGVCEISGRLYRLCCR(서열번호 25), 또는
   CATRESLSGVCEISGRLY(서열번호 28)
   의 서열로 이루어진, 펩타이드.
2. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는,
   ATCYCRTGR(서열번호 1),
   RGTRCYCTA(서열번호 2),
   Ac-atcycrtGr-NH₂(서열번호 5),
   LYRLCCR(서열번호 41),
   ATCYCRTGRCATR(서열번호 34),
   ATCYCRTGRCATRESLSGVCEISGRLYR(서열번호 12), 또는
   TGRCATRESLSGVCEISGRLYRLCCR(서열번호 14)
   의 서열로 이루어진, 펩타이드.
3. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는,
   ATCYCRTGR(서열번호 1),
   RGTRCYCTA(서열번호 2),
   Ac-atcycrtGr-NH₂(서열번호 5), 또는
   LYRLCCR(서열번호 41)
   의 서열로 이루어진, 펩타이드.
4. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는,
   ATCYCRTGR(서열번호 1),
   RGTRCYCTA(서열번호 2), 또는
   Ac-atcycrtGr-NH₂(서열번호 5)
   의 서열로 이루어진, 펩타이드.
5. 제1항에 있어서, 상기 펩타이드는 ATCYCRTGR(서열번호 1), 또는 RGTRCYCTA(서열번호 2), 바람직하게는, ATCYCRTGR(서열번호 1)의 서열로 이루어진, 펩타이드.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드가 시스틴-브릿지를 통해 연결된 호모다이머이고, 바람직하게는, 상기 호모다이머는 HD-5_1-9(서열번호 1)의 다이머인, 펩타이드.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, N-말단 변형, 바람직하게는, 아세틸-, 포르밀-, 피로글루타밀-, 지방산-, 우레아-, 카바메이트-, 및 알킬아민으로부터 선택된 N-말단 변형을 포함하는, 펩타이드.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 변형, 바람직하게는, -아마이드, -산, -N-알킬-아마이드, -알데하이드, -에스터, -p-나이트로아닐라이드, 및 -7-아미노-4-메틸쿠마린으로 이루어진 군으로부터 선택된, C-말단 변형을 포함하는, 펩타이드.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 D- 및/또는 L-아미노산으로 이루어지거나 이를 포함하는, 펩타이드.
10. 항균 활성을 갖는 펩타이드로서, 상기 펩타이드는 VCSCRLVFCRR(서열번호 3), 서열번호 3, RRCFVLRCSCV(서열번호 4) 또는 Ac-vcscrlvfcrr-NH₂(서열번호 6)의 서열로 이루어진, HNP-4의 단편인, 펩타이드.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 N- 및/또는 C-말단 변형을 포함하며, 바람직하게는, 상기 변형은 N-말단 아세틸 변형 및/또는 C-말단 아마이드 변형인, 펩타이드.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 펩타이드를 제조하는 방법으로서, 환원된 HD5 또는 HNP-4를 프로테아제 활성화시키고 나서 정제하는 단계를 포함하는, 방법.
13. 제12항에 있어서, 상기 프로테아제는 트립신 또는 키모트립신인, 방법.
14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 분자내 다이설파이드의 생성을 통한 상기 펩타이드의 다이머화를 더 포함하는, 방법.
15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 N- 또는 C-말단의 변형을 더 포함하는, 방법.
16. 마이크로바이옴(microbiome)의 조절에서 사용하기 위한 또는 장, 폐, 피부, 입, 눈, 귀, 질 또는 CNS 병태 또는 장내 세균 불균형 상태(dysbiotic condition)와 관련된 다른 질환의 치료 및/또는 예방에서 사용하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 펩타이드.
17. 제16항에 있어서, 상기 질환은 염증성 장 질환, 특히, 크론병, 궤양성 대장염, 셀리악병, 괴사 소장결장염, 과민성 대장 증후군, 물갈이, 위장암, 및 장 이식 편대 숙주병, 또한 당뇨병 및 전당뇨병과 같은 대사 질환, 비만, NAFLD, NASH, 이상지질혈증; 폐의 질환, 특히, 천식 및 COPD; 피부의 질환, 특히, 아토피성 피부염, 주사비, 지루성 피부염, 습진, 종창, 포도상 구균 감염증, 칸디다증, 봉와직염, 농가진, 여드름, 모소낭포, 피부 림프종, 운동선수의 발, 백선 및 연속종; 입의 질환, 특히, 치주염 및 충치; 눈의 질환, 특히, 안구 건조증, 쇼그렌병, 결막염, 안검염, 맥립종, 산립종, 안와 봉와직염, 누낭염, 안내염, 포도막염, 홍채염; 귀의 질환, 특히, 유돌염, 전정신경세포염, 수포성 고막염, 과립성 고막염, 외이염, 중이염; 질의 질환, 특히, 세균성 질염, 편모충 질염, 칸디다, 비감염성 질염, 염증성 질염, 패혈증 및 정신 질환, 특히, 조현병, 파킨슨증, 양극성 장애, 우울증 또는 자폐증으로부터 선택되는, 펩타이드.
18. 파킨슨병의 예방 또는 치료를 위한, 리소자임과 조합한 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 펩타이드.
19. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 항균제, 특히, 다중 약물 내성 박테리아 유도 감염증에 대한 항균제로서 사용되는, 펩타이드.
20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩타이드는 경구로, 비경구로 또는 국소로 투여되는, 펩타이드.
21. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 펩타이드 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제.
22. 제21항에 있어서, 상기 입, 눈, 귀, 피부 또는 질에 대한 국소 투여를 위해 제형화되는, 약제.

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