CN117106007A - 裂环羽扇豆烷衍生物及其在制备多靶点肿瘤血管生成和侵袭转移抑制剂中的应用 - Google Patents

裂环羽扇豆烷衍生物及其在制备多靶点肿瘤血管生成和侵袭转移抑制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了裂环羽扇豆烷衍生物及其在制备多靶点肿瘤血管生成和侵袭转移抑制剂中的应用，属于药物制备技术领域。本发明运用半合成的方式得到了一系列新颖的多靶点肿瘤血管生成和侵袭转移抑制剂，所述的多靶点为激活FoxO1、Rap1、TSP1的同时抑制PDK1、Id1，可用于预防、治疗和缓解FoxO1、PDK1、Rap1、Id1和TSP1介导的相关疾病。通过药理实验验证了FoxO1、Rap1和TSP1的激动作用，PDK1、Id1的抑制作用，可以通过进一步的实验将此类化合物开发为应用于预防、治疗和缓解FoxO1、PDK1、Rap1、Id1和TSP1介导的相关疾病的药物。

Description

裂环羽扇豆烷衍生物及其在制备多靶点肿瘤血管生成和侵袭 转移抑制剂中的应用
技术领域
本发明涉及药物制备技术领域，特别是涉及裂环羽扇豆烷衍生物及其在制备多靶点肿瘤血管生成和侵袭转移抑制剂中的应用。
背景技术
恶性肿瘤患者的主要死亡原因是肿瘤出现广泛转移、继发感染以及大出血等。恶性肿瘤一般很难达到完全治愈的情况，而且在发病早期机体基本无不良症状，随着病情的进展，一经发现基本就到了肿瘤中晚期。而且恶性肿瘤增殖扩散速度极快，一旦发现得不到有效的治疗和控制，恶性肿瘤就会出现广泛浸润、转移和恶化，患者寿命急剧缩短，一般采取放化疗方式来对局部的病灶做清扫。恶性肿瘤治疗期间继发感染风险较高，放疗化疗导致患者免疫力低下，同时影响食欲，造成营养不良，进而导致继发性感染，进一步增加患者死亡几率。部分器官性的肿瘤还可能压迫局部血管和神经，或生长受限，因压迫造成肿瘤破裂，引起继发性大出血，也是造成肿瘤患者死亡的原因。
肿瘤血管形成是肿瘤细胞诱导的微血管生长及肿瘤血液循环建立的过程。肿瘤的生长、恶化、浸润和转移与新血管生成密切相关。新血管生成与肿瘤的生长不是两个独立的过程，两者之间存在着相互促进的关系。一方面，肿瘤细胞通过分泌某些特异性促血管生成因子，诱发新的毛细血管从周围组织内的宿主血管壁长出，并朝向肿瘤生长，进一步深入到肿瘤组织内部；另一方面，新形成的血管为肿瘤的生长、转移和恶化提供必需的营养、氧气以及代谢产物排除的通道，同时也为肿瘤转移提供通路，起到了支持肿瘤生长、转移的作用。随着肿瘤发生机制研究的不断深入，肿瘤血管形成在肿瘤发展中的重要地位及抗血管生成治疗肿瘤的作用成为肿瘤治疗的一个全新领域。
肿瘤细胞是不均一的，经过数月或数年的血管前期后，其中一部分细胞变为血管生成表型细胞，开始分泌血管生成刺激因子。目前认为这一变化和如下因素有关：低氧、糖缺乏、原癌基因和抑癌基因；细胞密度。细胞培养发现细胞密度高时血管生成刺激因子增加；动物实验发现血管生成与肿瘤间质组织压力高密切相关。此外，还包含细胞内低pH，酸浓度高等因素相关。
肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程，一般包括血管内皮基质降解、内皮细胞移行、内皮细胞增殖、内皮细胞管道化分支形成血管环和形成新的基底膜等步骤。由于肿瘤组织这种新生血管结构及功能异常，且血管基质不完善，这种微血管容易发生渗漏，因此，肿瘤细胞不需经过复杂的侵袭过程而直接穿透到血管内进入血流并在远隔部位形成转移。越来越多的研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。
肿瘤的侵袭和转移是肿瘤发病和死亡的主要原因。肿瘤细胞侵入周围组织和血管系统是肿瘤转移的第一步，该过程受到肿瘤局部微环境中的信号分子的趋化引导。Rap1对血管新生的调控主要是调节内皮细胞对促进血管新生因素刺激的反应，Rap1的激活会下调分化抑制因子Id1(inhibitor of differentiation,Id1)，而Id1负向调节血小板应答蛋白-1(TSP1)，TSP1则是一种血管生成抑制剂。Rap1在多种细胞过程中发挥作用，包括细胞粘附、迁移、极性、分化、生长和血管生成。Id1蛋白具有多种生物学功能，尤其对血管新生起重要作用，它一直是癌症血管新生研究的热点。Id1能够通过诱导细胞增殖迁移及加速细胞周期参与肿瘤性血管新生，在肿瘤血管生成和转移中起重要作用。TSP1还通过募集血管平滑肌细胞生长毛细血管来促进血管成熟。TSP1作为血管生成抑制因子，为Id1转录抑制的关键目标。PDK1在调节细胞迁移方面具有重要作用。PDK1与由PI3-K激活产生的PIP3结合，进而在Akt的Thr308位点将其磷酸化，导致Akt的部分激活，进一步抑制FoxO产生的促凋亡信号。PDK1是调控细胞迁移相关作用的一个重要机制。FoxO是Forkhead蛋白家族的一个亚群，它在哺乳动物细胞中分别由四个截然不同的基因编码组成FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6。其中，FoxO1是FoxO家族中发现最早的成员之一，在一些诸如细胞凋亡、DNA损伤/修复、应激、血管生成、糖代谢和肿瘤发生等过程中发挥着关键性的作用。
肿瘤的生物学过程增殖与转移，包括肿瘤生长、抑制细胞死亡、侵袭、转移及肿瘤血管生成，分属不同调控模块，受相对独立的调控机制调控，不同模块间衔接，构成了对机体的恶性影响。尽管相对于增殖，肿瘤转移很低效，但超过90％的肿瘤相关死亡源于肿瘤转移。目前的细胞毒类化疗药物种类虽较多，体外能有效的抑制肿瘤的快速增殖或直接杀死肿瘤细胞，但能有效阻断肿瘤转移的药物却较少，且临床治疗效果有限。如何制备得到一种可以显著抑制肿瘤细胞血管生成和侵袭转移的抑制剂成为本领域技术人员亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供裂环羽扇豆烷衍生物及其在制备多靶点肿瘤血管生成和侵袭转移抑制剂中的应用，以解决上述现有技术存在的问题。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明的技术方案之一：裂环羽扇豆烷衍生物，结构式如式Ⅱ或式Ⅲ所示：
其中，Rb选自以下结构中的任意一种：
结构a中Y为S、O或NH，结构b中的Y为NH；
Rc选自C1～C9烷基；
X选自以下结构中的任意一种：-(CH2)n-，其中n取1～10中的任意整数。
本发明的技术方案之二：一种上述裂环羽扇豆烷衍生物的制备方法，所述制备方法选自以下任意一种：
方法1，当Rb中的Y为NH时，所述裂环羽扇豆烷衍生物的制备方法为：
将式Ⅰ所示化合物先和Br-X-Br发生取代反应，再和经过Boc基团保护的Rb-H发生取代反应，脱除Boc基团得到式Ⅱ所示化合物；
或者，将式Ⅰ所示化合物先和Rc-OH发生酯交换反应，再和Br-X-Br发生取代反应，最后和经过Boc基团保护的Rb-H发生取代反应，脱除Boc基团得到式Ⅲ所示化合物；
方法2，当Rb中Y为S或O时，所述裂环羽扇豆烷衍生物的制备方法为：
将式Ⅰ所示化合物先和Br-X-Br发生取代反应，再和Rb-H发生取代反应，得到式Ⅱ所示化合物；
式Ⅱ所示化合物的反应方程式如下：
或者，将式Ⅰ所示化合物先和Rc-OH发生酯交换反应，再和Br-X-Br发生取代反应，最后和Rb-H发生取代反应，得到式Ⅲ所示化合物；
X选自以下结构中的任意一种：-(CH2)n-，其中n取1～10中的任意整数；
Rb选自以下结构中的任意一种：
结构a中Y为S、O或NH，结构b中的Y为NH；
Rc选自C1～C9烷基。
进一步地，所述取代反应在苄基三乙基溴化铵、碳酸钠存在条件下搅拌进行；
所述酯交换反应在酸性条件下加热回流。
本发明的技术方案之三：一种药物组合物，包括上述裂环羽扇豆烷衍生物、裂环羽扇豆烷衍生物的光学异构体、裂环羽扇豆烷衍生在物学上可接受的盐或裂环羽扇豆烷衍生物的溶剂化物。
进一步地，所述药物组合物，还包括，药学上可接受的载体；所述药物组合物为片剂、丸剂、粉针剂、半固体制剂或液体制剂。
进一步地，所述载体包括蛋白、叶酸、抗体和纳米材料中的一种或多种。
更进一步地，所述药物组合物为片剂时，还包括以下材料中的任意一种或多种：黏合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂；
所述药物组合物为粉针剂时，还包括以下材料中的任意一种或多种：溶剂、增溶剂、助溶剂、等渗调节剂、pH值调节剂、抗氧剂、乳化剂、吸附剂和络合剂；
所述药物组合物为丸剂时，还包括以下材料中的任意一种或多种：润湿剂、粘合剂、吸收剂和稀释剂；
所述药物组合物为半固体制剂时，还包括基质；
所述药物组合物为液体制剂时，还包括以下材料中的任意一种或多种：防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂和着色剂。
本发明的技术方案之四：一种上述裂环羽扇豆烷衍生物或上述药物组合物在制备多靶点肿瘤细胞血管生成和侵袭转移抑制剂中的应用。
本发明的技术方案之五：一种上述裂环羽扇豆烷衍生物或上述药物组合物在制备预防、治疗和缓解PDK1、FoxO1、Rap1、Id1和TSP1介导相关的肿瘤的药物中的应用。
本发明的技术方案之六：一种上述裂环羽扇豆烷衍生物或上述药物组合物在制备FoxO1、Rap1、TSP1激动剂，和PDK1、Id1抑制剂中的应用。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明的裂环羽扇豆烷衍生物具有极强地抑制癌细胞增殖、侵袭、迁移和血管生成能力。
(2)本发明的裂环羽扇豆烷衍生物是目前羽扇豆烷型三萜类化合物中的两种特殊的3,4-裂环3,11-环合羽扇豆烷型三萜(通式II)和1,4-呋喃氧环羽扇豆烷型三萜(通式III)类衍生物。在此结构基础上，运用化学手段进行结构修饰和改造，形成了一类具有多靶点肿瘤血管生成和侵袭转移抑制剂样作用的裂环羽扇豆烷衍生物。
(3)本发明运用半合成的方式得到了一系列新颖的多靶点肿瘤血管生成和转移抑制剂，所述的多靶点为激活FoxO1、Rap1、TSP1的同时抑制PDK1、Id1，可用于预防、治疗和缓解FoxO1、PDK1、Rap1、Id1和TSP1介导的相关疾病。通过药理实验验证了其具有FoxO1、Rap1和TSP1激动作用，及PDK1、Id1的抑制作用，可以通过进一步的实验将此类化合物开发为应用于预防、治疗和缓解FoxO1、PDK1、Rap1、Id1和TSP1介导的相关疾病的药物。
(4)本发明的能够激活FoxO1、Rap1和TSP1的同时抑制PDK1、Id1的裂环羽扇豆烷衍生物的结构基础在于：1)片段1：3,4-裂环-3,11-环合羽扇豆烷型三萜(II的母核)，或1,4-呋喃氧环羽扇豆烷型三萜(III的母核)；2)片段2：n＝1-10，Y为S/O/NH；3)上述片段1与片段2通过片段1的28位以酯键相连。以上条件均为本发明所涉及裂环羽扇豆烷衍生物具有“激活FoxO1、Rap1和TSP1的同时抑制PDK1、Id1”活性的必要条件。片段1和片段2的结构发生变化，以及片段1和片段2连接位置发生改变，如片段2连接在片段1的C-1和/或C11，均无法达到具有本发明所述的“激活FoxO1、Rap1和TSP1的同时抑制PDK1、Id1”活性的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物对细胞迁移活性的影响；
图2为本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物对细胞侵袭活性的影响；
图3为本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物对体外对毛细血管形成的影响；
图4为本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物对Rap1蛋白表达量的影响；
图5为本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物对Id1蛋白表达量的影响；
图6为本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物对TSP1蛋白表达量的影响；
图7为本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物对PDK1蛋白表达量的影响；
图8为本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物对FoxO1蛋白表达量的影响。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明以下实施例中所使用的溶剂及其合成药品可经市售所得。所用的缩写具有如下各自的定义：AC，丙酮；ACN，乙腈；MeOH，甲醇；EtOH，乙醇；PrOH，丙醇；PeOH，戊醇；HeOH，庚醇；NaOH，氢氧化钠；HCl，盐酸；TEBA：苄基三乙基溴化铵；reflux，回流；stir，搅拌。
实施例1
通式Ⅱ化合物Ⅱ-1、Ⅱ-2、Ⅱ-3、Ⅱ-4、Ⅱ-5和Ⅱ-6的合成
将化合物I(chiisanogenin，485mg，1.0mmol)溶于AC(10mL)中，加入二溴甲烷(522μL，3.0mmol)、TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅱ-1(n＝1)，白色粉末，收率为90％；C31H45BrO5.MS：[M]+576.25341。
化合物Ⅱ-2(n＝3)、Ⅱ-3(n＝4)、Ⅱ-4(n＝5)、Ⅱ-5(n＝6)和Ⅱ-6(n＝10)的合成方法与化合物Ⅱ-1(n＝1)相同，只是把二溴甲烷替换成1，3-二溴丙烃、1，4-二溴丁烃、1，5-二溴戊烃、1，6-二溴已烃、1，10-二溴癸烷，反应后减压回收，层析分离得到中间体Ⅱ-2(n＝3)，收率为78％；C33H49BrO5.MS：[M]+604.27359。
化合物Ⅱ-3(n＝4)，收率为82％；C34H51BrO5.MS：[M]+618.29461。
化合物Ⅱ-4(n＝5)，收率为75％；C35H53BrO5.MS：[M]+632.31255。
化合物Ⅱ-5(n＝6)，收率为83％；C36H55BrO5.MS：[M]+646.32582。
化合物Ⅱ-6(n＝10)，收率为80％；C40H63BrO5.MS：[M]+702.38621。
实施例2
通式Ⅱ化合物Ⅱ-1-1及其水合物和Ⅱ-2-1(裂环羽扇豆烷衍生物)的合成
将化合物Ⅱ-1(m＝1，n＝1，522mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加入2-噻吩乙胺(381mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅱ-1-1(m＝1，n＝1)，白色粉末，收率为75％。C37H53NO5S.MS：[M]+623.36693.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.15(d,J＝5.3,1.8Hz,1H),6.89(dd,J＝6.2,5.3Hz,1H),6.56(dd,J＝6.2,1.8Hz,1H),5.21(dd,J＝8.6,3.1Hz,1H),4.76(d,J＝2.4Hz,2H),4.73(1H),4.72(2H),4.68(1H),4.18(1H),3.86(1H),3.11(3H),2.93(1H),2.98(1H),2.81(1H),2.68(1H),2.56(1H),2.01(1H),1.91(2H),1.80(1H),1.78-1.71(5H),1.74-1.67(6H),1.71-1.63(3H),1.66-1.50(3H),1.53-1.41(3H),1.44-1.35(1H),1.06(s,2H),1.01(d,J＝5.3Hz,6H).
将Ⅱ-1-1(623mg，1.0mmol)溶于5mL丙酮，过滤，滤液加水1.5mL混匀，静止，缓慢析出沉淀，过滤，残渣环境湿度室温下干燥，得白色结晶性粉末(Ⅱ-1-1水合物)，收率88％。经X-单晶衍射测定其结构为Ⅱ-1-1的一水合物C37H53NO5S H2O。结构鉴定过程略。
将化合物Ⅱ-2(m＝2，n＝3，606mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加入2-噻吩乙胺((381mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅱ-2-1(m＝2，n＝3)，白色粉末，收率为91％。C39H57NO5S.MS：[M]+651.94157.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.16(dd,J＝5.3,1.7Hz,1H),6.91(dd,J＝6.2,5.3Hz,1H),6.69(dd,J＝6.2,1.8Hz,1H),5.28(dd,J＝8.6,5.9Hz,1H),4.67(2H),4.59(1H),4.45(2H),4.33(1H),4.08(1H),3.78(1H),3.11(3H),2.89(1H),2.98(1H),2.81(1H),2.73(1H),2.51(1H),2.01(1H),1.93(2H),1.85(1H),1.78-1.73(5H),1.73-1.67(6H),1.71-1.64(3H),1.67-1.50(3H),1.54(3H),1.45(1H),1.07(2H),0.89(6H).
实施例3
通式Ⅱ化合物Ⅱ-3-1(裂环羽扇豆烷衍生物)的合成
在2-(2-吡咯基)乙胺(110mg,1.0mmol)中加入Cbz-Cl(0.513mL，3.0mmol)、碳酸钾(276mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，再溶于ET3N中加入Boc2O(411mg,3.0mmol)，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，充入氢气得2-(Boc-2-吡咯基)乙胺，白色粉末。
将化合物Ⅱ-3(620mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加入2-(Boc-2-吡咯基)乙胺(330mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，再溶于氯仿的三氟乙酸溶液(氯仿和三氟乙酸的体积比为1:1)室温搅拌4h，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅱ-3-1，白色粉末，收率为79％。C40H60N2O5.MS：[M]+648.45137.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.15(d,J＝6.6Hz,1H),6.82(dd,J＝6.6,3.5Hz,1H),6.12(d,J＝6.4Hz,1H),6.03(dd,J＝6.4,3.5Hz,1H),5.21(1H),4.82(2H),4.81(1H),4.72(2H),4.71(1H),4.16(1H),3.85(1H),3.26(1H),3.13(2H),2.94(2H),2.81(1H),2.71(1H),2.57(1H),2.01(1H),1.92(2H),1.81(14H),1.68(2H),1.65(3H),1.51(3H),1.42(1H),1.04(2H),1.01(6H).
实施例4
通式Ⅱ化合物Ⅱ-4-1(裂环羽扇豆烷衍生物)的合成
将化合物Ⅱ-4(634mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加入Boc-色胺(780mg，3.0mmol，制备方法同实施例3)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，再溶于氯仿的三氟乙酸溶液(氯仿和三氟乙酸的体积比为1:1)室温搅拌4h，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅱ-4-1，白色粉末，收率为75％。C45H64N2O5.MS：[M]+712.48524.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.98(d,J＝7.1Hz,1H),7.65(m,1H),7.31(d,J＝7.7Hz,1H),7.15(m,2H),5.21(1H),4.85(2H),4.81(1H),4.77(2H),4.71(1H),4.16(1H),3.87(1H),3.11(2H),3.12(1H),2.95(2H),2.81(1H),2.69(1H),2.55(1H),2.09(1H),1.93(2H),1.82(1H),1.77(13H),1.75(2H),1.64(1H),1.61(1H),1.57(1H),1.51(3H),1.43(1H),1.06(2H),1.01(6H).
实施例5
通式Ⅱ化合物Ⅱ-5-1和Ⅱ-6-1(裂环羽扇豆烷衍生物)的合成
将化合物Ⅱ-5(m＝5，n＝6，648mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加入2-呋喃乙胺(333mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅱ-5-1(m＝5，n＝6)，白色粉末，收率为85％。C42H63NO6.MS：[M]+677.46681.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.24(t,J＝1.6Hz,1H),6.18(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H),6.05(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H),5.21(1H),4.86(2H),4.81(1H),4.76(2H),4.71(1H),4.16(1H),3.85(1H),3.15(1H),3.04(2H),2.84(3H),2.68(1H),2.57(1H),2.01(1H),1.91(2H),1.78(22H),1.43(1H),1.05(2H),1.05(6H).
将化合物Ⅱ-6(m＝6，n＝10，704mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加入2-呋喃乙胺(333mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅱ-6-1(m＝6，n＝10)，白色粉末，收率为79％。C46H71NO6.MS：[M]+733.52631.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.26(t,J＝1.5Hz,1H),6.14(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H),6.05(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H),5.18(1H),4.79(2H),4.83(1H),4.75(2H),4.71(1H),4.13(1H),3.84(1H),3.14(1H),3.04(2H),2.83(3H),2.72(1H),2.55(1H),2.01(1H),1.92(2H),1.81-1.44(22H),1.43(1H),1.04(2H),0.95(6H).
实施例6
通式Ⅲ化合物Ⅲ-1、Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-5的合成
将化合物I(485mg，1.0mmol)溶于80vol.％(体积分数)MeOH 6vol.％HCl水溶液(30mL)中，随后加热回流4h，反应结束后取出，减压回收溶剂，干燥后得到化合物Ⅲ-1(m＝1，n＝0)，淡黄色粉末，收率为77％；C31H48O6.MS：[M]+516.34486。
化合物Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-5的合成方法与化合物化合物Ⅲ-1相同，只是把80vol.％MeOH6vol.％HCl水溶液替换成80vol.％EtOH 6vol.％HCl水溶液、80vol.％PrOH6vol.％HCl水溶液、80vol.％PeOH 6vol.％HCl水溶液、80vol.％NeOH 6vol.％HCl水溶液，分别获得以下产物：
化合物Ⅲ-2(m＝1，n＝1)，白色粉末，收率为61％，C32H50O6.MS：[M]+530.36358；
化合物Ⅲ-3(m＝1，n＝2)，白色粉末，收率为67％，C33H52O6.MS：[M]+544.37385；
化合物Ⅲ-4(m＝1，n＝4)，白色粉末，收率为69％，C35H56O6.MS：[M]+572.40832；
化合物(Ⅲ-5，m＝1，n＝9)，白色粉末，收率为62％，C40H66O6.MS：[M]+642.95901。
实施例7
通式Ⅲ化合物Ⅲ-1-1和Ⅲ-1-1-1(裂环羽扇豆烷衍生物)的合成
将化合物Ⅲ-1(517mg，1.0mmol)溶于AC(10mL)中，加入1,3-二溴丙烷(606μL，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅲ-1-1，白色粉末，收率为77％。C34H53BrO6.MS：[M]+636.30512.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.71(m,2H),4.77(h,J＝1.6Hz,1H),4.72(h,J＝1.6Hz,1H),4.21(1H),4.21(1H),3.65(2H),2.89(1H),2.67(2H),2.18(1H),2.03(1H),1.92(2H),1.84(1H),1.77-1.70(6H),1.67(2H),1.71-1.46(9H),1.45(1H),1.22(3H),1.16(3H),1.02(3H),0.91(6H).
将化合物Ⅲ-1-1(638mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加Boc-色胺(780mg，3.0mmol，制备方法同实施例3)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，再溶于氯仿的三氟乙酸溶液(氯仿和三氟乙酸的体积比为1:1)室温搅拌4h，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅲ-1-1-1，淡黄色粉末，收率为65％。C44H64N2O6.MS：[M]+716.47588.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.89(d,J＝7.1Hz,1H),7.65(m,1H),7.33(d,J＝7.7Hz,1H),7.15(2H),4.86(2H),4.74(1H),4.71(1H),4.19(1H),4.12(1H),3.63(2H),3.12(3H),2.96(2H),2.83(1H),2.67(2H),2.14(1H),2.02(1H),1.92(2H),1.83(1H),1.73(1H),1.75(6H),1.71(4H),1.63(1H),1.58(3H),1.55(1H),1.53(1H),1.46(1H),1.38(1H),1.22(3H),1.15(3H),1.01(3H),0.95(6H).
实施例8
通式Ⅲ化合物Ⅲ-2-1和Ⅲ-2-1-1(裂环羽扇豆烷衍生物)的合成
将化合物Ⅲ-2(531mg，1.0mmol)溶于AC(10mL)中，加入1,4-二溴丁烷(648mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅲ-2-1，白色粉末，收率为80％。C36H57BrO6.MS：[M]+664.34156.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.69(2H),4.73(t,J＝1.7Hz,1H),4.68(t,J＝1.7Hz,1H),4.18(1H),4.20(1H),4.13(1H),4.06(1H),2.82(1H),2.65(2H),2.17(1H),2.02(1H),1.95(2H),1.80(1H),1.74(7H),1.71(1H),1.58(9H),1.44(1H),1.27-1.21(6H),1.17(3H),1.05(3H),0.91(5H).
将化合物Ⅲ-2-1(666mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加入2-(Boc-2-吡咯基)乙胺(330mg，3.0mmol，制备方法同实施例3)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，再溶于氯仿的三氟乙酸溶液(氯仿和三氟乙酸的体积比为1:1)室温搅拌4h，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅲ-2-1-1，淡黄色粉末，收率为79％。C42H66N2O6.MS：[M]+694.49583.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ9.09(d,J＝6.6Hz,1H),6.81(dd,J＝6.6,3.5Hz,1H),6.12(dd,J＝6.6Hz,1H),6.04(1H),4.86(2H),4.75(1H),4.69(1H),4.20(1H),4.18(1H),4.14(1H),4.07(1H),3.25(1H),3.12(2H),2.84(2H),2.81(1H),2.66(2H),2.20(1H),2.01(1H),1.82(2H),1.81-1.46(19H),1.46(1H),1.21(6H),1.16(3H),1.07(3H),0.97(5H).
实施例9
通式Ⅲ化合物Ⅲ-3-1和Ⅲ-3-1-1及其盐酸盐(裂环羽扇豆烷衍生物)的合成
将化合物Ⅲ-3(545mg，1.0mmol)溶于AC(10mL)中，加入1,5-二溴戊烷(690mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅲ-3-1，白色粉末，收率为76％。C38H61BrO6.MS：[M]+692.36127.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.75(2H),4.76(1H),4.72(1H),4.21(1H),4.22(1H),4.05(2H),2.81(1H),2.64(2H),2.22(1H),2.01(1H),1.92(2H),1.84(1H),1.77-1.65(10H),1.75(1H),1.62(3H),1.68(1H),1.61-1.46(5H),1.46(1H),1.24(3H),1.17(3H),1.06(3H),1.02-0.91(8H).
将化合物Ⅲ-3-1(694mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加入2-呋喃乙胺(333mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅲ-3-1-1，淡黄色粉末，收率为74％。C44H69NO7.MS：[M]+723.51151.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.26(t,J＝1.5Hz,1H),6.15(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H),6.07(dd,J＝4.9,1.6Hz,1H),4.83(2H),4.75(1H),4.71(1H),4.23(1H),4.15(1H),4.05(2H),3.11(1H),3.02(2H),2.89(3H),2.61(2H),2.21(1H),2.02(1H),1.91(2H),1.81-1.62(11H),1.72-1.56(5H),1.61-1.54(1H),1.58(2H),1.56(2H),1.46(1H),1.22(3H),1.17(3H),1.05(3H),1.01-0.91(8H).
将Ⅲ-3-1-1(1mmoL)溶于ACN(5mL)中，搅拌下持续通入无水氯化氢气体，析出结晶，直至结晶不增长为止(8h左右)，过滤，残渣ACN洗涤3次，残渣室温下干燥，得白色结晶性固体(Ⅲ-3-1-1盐酸盐)，产率72％。经X-射线单晶衍射，确定其结构为Ⅲ-3-1-1盐酸盐C44H69NO7 HCl。结构确证过程略。
实施例10
通式Ⅲ化合物Ⅲ-4-1和Ⅲ-4-1-1(裂环羽扇豆烷衍生物)的合成
将化合物Ⅲ-4(573mg，1.0mmol)溶于AC(10mL)中，加入1,6-二溴癸烷(732mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅲ-4-1，白色粉末，收率为69％。C45H75BrO6.MS：[M]+790.47512.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.75(2H),4.76(tq,J＝1.7,0.8Hz,1H),4.71(tq,J＝1.7,0.9Hz,1H),4.20(1H),4.22(1H),4.01(2H),2.83(1H),2.61(2H),2.15(1H),2.02(1H),1.96(2H),1.81-1.72(5H),1.75-1.70(2H),1.74-1.66(2H),1.71-1.64(3H),1.65(1H),1.63(1H),1.66(2H),1.57(2H),1.51(2H),1.45-1.31(5H),1.22(3H),1.17(3H),1.05(3H),0.96(5H),0.97(3H).
将化合物Ⅲ-4-1(736mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加入2-噻吩乙胺(381mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到化合物Ⅲ-4-1-1，淡黄色粉末，收率为58％。C51H83NO6S.MS：[M]+837.59136.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.15(dd,J＝5.3,1.7Hz,1H),6.91(dd,J＝6.2,5.3Hz,1H),6.64(dd,J＝6.2,1.8Hz,1H),4.85(2H),4.76(1H),4.71(1H),4.19(1H),4.21(1H),4.02(2H),3.12(3H),3.03(1H),2.98(1H),2.82(1H),2.61(2H),2.16(1H),2.02(1H),1.92(2H),1.81(1H),1.74(1H),1.75-1.69(6H),1.72-1.64(4H),1.64(2H),1.61(1H),1.58(2H),1.55(2H),1.50(1H),1.43(1H),1.39(1H),1.33(3H),1.22(3H),1.14(3H),1.05(3H),0.93(5H),0.85(3H).
实施例11
通式Ⅲ化合物Ⅲ-5-1和Ⅲ-5-1-1(裂环羽扇豆烷衍生物)的合成
将化合物Ⅲ-5(643mg，1.0mmol)溶于AC(10mL)中，加入二溴甲烷(522mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到白色粉末(Ⅲ-5-1)，收率72％。C41H67BrO6.MS：[M]+734.41603.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ5.79(2H),4.71(1H),4.69(1H),4.23(1H),4.14(1H),4.11(1H),4.02(1H),2.81(1H),2.58(2H),2.21(1H),2.02(1H),1.96(2H),1.81(1H),1.75(7H),1.68(1H),1.65-1.46(9H),1.42(1H),1.27-1.21(6H),1.15(3H),1.05(3H),0.97(5H).
将化合物Ⅲ-5-1(734mg，1.0mmol)溶于ACN(10mL)中，加入2-噻吩乙胺(381mg，3.0mmol)，加入TEBA(227mg，1.0mmol)和碳酸钠(212mg，2.0mmol)，室温搅拌12h，减压回收溶剂，得到固体，硅胶柱层析分离，干燥后得到淡黄色粉末(Ⅲ-5-1-1)，收率为67％。C47H75NO6S.MS：[M]+781.53129.1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.15(dd,J＝5.3,1.7Hz,1H),6.91(dd,J＝6.2,5.3Hz,1H),6.64(dd,J＝6.2,1.8Hz,1H),4.91(2H),4.77(1H),4.71(1H),4.21(1H),4.19(1H),4.15(1H),4.10(1H),3.12(3H),3.03(1H),2.98(1H),2.86(1H),2.61(2H),2.20(1H),2.03(1H),1.91(2H),1.82-1.47(18H),1.45-1.37(1H),1.27-1.21(6H),1.16(3H),1.05(3H),0.92(5H).
实施例12
生物活性测试：
(一)细胞实验
(1)实验材料：
细胞株：人源三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)、人源肺癌细胞系(A549)、人源前列腺癌细胞系(PC-3M)和人脐静脉内皮细胞系(HUVEC)购自于武汉普诺赛生命科技有限公司。
检测试剂盒：人Ras相关蛋白1(Rap1)ELISA试剂盒和小鼠DNA结合蛋白抑制剂(Id1)ELISA试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)；人血小板反应蛋白1(TSP1)ELISA检测试剂盒、丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1(PDK1)ELISA检测试剂盒和叉头框蛋白O1(FoxO1)ELISA检测试剂盒(上海江莱生物科技有限公司)。
(2)实验方法
A.细胞培养及毒性测定：MDA-MB-231在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的DMEM中培养，PC-3M和A549在含有10％FBS、100U/mL青霉素和100mg/mL链霉素的1640中培养，培养温度为37℃、CO2浓度为5％。细胞以5×103细胞/孔的密度接种在96孔板中。当细胞融合达到60～70％时，加入本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物处理48h。并向每个孔中添加10μL CCK-8，并在37℃下培养2h，使用微孔板读取器测量吸光度。
B.酶活性测定：按步骤A培养条件优选给药剂量处理48h后的细胞利用细胞刮刀进行收集。随后用PBS洗涤1遍。按照每100万细胞加入100～200μL裂解液的比例进行裂解。随后4℃，12000g离心10min，取上清用于酶活性的测定。
C.细胞迁移和侵袭：①细胞迁移：细胞(MDA-MB-231、PC-3M、A549)以1×105细胞/孔的密度接种在6孔板中，于培养箱中培养24h。弃去原培养基，加入100μL的胰蛋白酶进行细胞消化1～2min，终止消化后，离心后加入无血清培养基或含药无血清培养基(含1μM裂环羽扇豆烷衍生物)调整细胞密度至5×105/mL。随后取细胞密度为5×105/mL细胞悬液100μL加入Transwell小室，孔板下室则加入600μL含20％FBS的培养基。培养24h后取出Transwell小室，弃去孔中培养液，PBS洗2遍，甲醇固定30min，将小室适当风干。然后用0.1％结晶紫染色20min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。②细胞侵袭：侵袭步骤与迁移步骤相同，仅在接种细胞前，将Transwell小室底部膜的上室面包被一层基质胶。
D.血管生成拟态实验检测
将细胞(MDA-MB-231、PC-3M、A549)以1×105细胞/孔的密度接种在6孔板中，于培养箱中培养24h后，弃去原培养基加入2mL含有1μM裂环羽扇豆烷衍生物的培养基置于培养箱培养48h后，移去培养基，加入无血清培养基置于培养箱中24h后，收集条件培养基。提前一天从-20℃冰箱将基质胶取出放置于4℃，并将实验所需的枪头、EP管置于-20℃备用。将Matrigel加到预冷的24孔板中，枪头旋转加胶每孔300μL，避免产生气泡，37℃下培养箱内孵育30min。胰酶消化HUVEC细胞，细胞计数并制成1×105/mL的细胞悬液，24孔板内每孔加入300μL胰酶消化HUVEC细胞悬液，放入培养箱培养24h后，移去培养基，加入条件培养基，培养24h后，取出24孔板置于显微镜下观察细胞的形态及管道形成情况，拍照并计数管状结构数量。
E.FoxO1、PDK1、Rap1、Id1和TSP1蛋白的表达：将细胞(MDA-MB-231、PC-3M、A549)以1×105细胞/孔的密度接种在6孔板中，于培养箱中培养24h后，弃去原培养基加入2mL含有1μM裂环羽扇豆烷衍生物的培养基置于培养箱培养48h后，用预冷PBS洗涤3次，加入裂解液裂解5min，然后以12000g离心10min。使用BCA蛋白质试剂盒测定各组上清液的浓度。将各组的蛋白质浓度调平至等浓度(1mg/mL)，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移至聚偏氟乙烯膜。使用5％脱脂乳封闭膜2h。随后，添加一级抗体(FoxO1、PDK1、Rap1、Id1和TSP1抗体与稀释液比值为1:1000)，并在4℃下过夜处理。用Tris缓冲盐水和吐温20缓冲液清洗膜，并在室温下与二级抗体孵育2h。用超灵敏ECL(Beyotime，中国上海)观察所有膜，并使用图像分析仪获取图像。以β-肌动蛋白抗体为对照，使用ImageJ软件分析蛋白印迹。
(3)实验结果
A.细胞毒活性
表1裂环羽扇豆烷衍生物对不同癌细胞的细胞毒性
从表1中可以看出，本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物对不同癌细胞均具有很强的细胞毒作用。
B.酶活性
利用ELISA检测方法对酶活性进行测定，并得出本发明制备的中间化合物以及裂环羽扇豆烷衍生物的半数抑制浓度或半数有效浓度(细胞内酶活性与空白组相比)，结果见表2。
表2衍生物对MDA-MB-231细胞内Rap1蛋白酶的半数有效浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表2中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对MDA-MB-231细胞内Rap1蛋白酶具有显著地激活作用。
表3衍生物对MDA-MB-231细胞内Id1蛋白酶的半数抑制浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表3中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对MDA-MB-231细胞内Id1蛋白酶具有显著地抑制作用。
表4衍生物对MDA-MB-231细胞内TSP1蛋白酶的半数有效浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表4中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对MDA-MB-231细胞内TSP1蛋白酶具有显著地激活作用。
表5衍生物对MDA-MB-231细胞内PDK1蛋白酶的半数抑制浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表5中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对MDA-MB-231细胞内PDK1蛋白酶具有显著地抑制作用。
表6衍生物对MDA-MB-231细胞内FoxO1蛋白酶的半数有效浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表6中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对MDA-MB-231细胞内FoxO1蛋白酶具有显著地激活作用。
表7衍生物对A549细胞内Rap1蛋白酶的半数有效浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表7中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对A549细胞内Rap1蛋白酶具有显著地激活作用。
表8衍生物对A549细胞内Id1蛋白酶的半数抑制浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表8中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对A549细胞内Id1蛋白酶具有显著地抑制作用。
表9衍生物对A549细胞内PDK1蛋白酶的半数抑制浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表9中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对A549细胞内PDK1蛋白酶具有显著地抑制作用。
表10衍生物对A549细胞内FoxO1蛋白酶的半数有效浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表10中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对A549细胞内FoxO1蛋白酶具有显著地激活作用。
表11衍生物对A549细胞内TSP1蛋白酶的半数有效浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表11中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对A549细胞内TSP1蛋白酶具有显著地激活作用。
表12衍生物对PC-3M细胞内Rap1蛋白酶的半数有效浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表12中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对PC-3M细胞内Rap1蛋白酶具有显著地激活作用。
表13衍生物对PC-3M细胞内Id1蛋白酶的半数抑制浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表13中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对PC-3M细胞内Id1蛋白酶具有显著地抑制作用。
表14衍生物对PC-3M细胞内TSP1蛋白酶的半数有效浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表14中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对PC-3M细胞内TSP1蛋白酶具有显著地激活作用。
表15衍生物对PC-3M细胞内PDK1蛋白酶的半数抑制浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表15中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对PC-3M细胞内PDK1蛋白酶具有显著地抑制作用。
表16衍生物对PC-3M细胞内FoxO1蛋白酶的半数有效浓度
注：A≤20μM；25μM＜B≤200μM；C＞200μM。
从表16中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-2-1-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1、Ⅱ-1-1水合物、Ⅲ-3-1-1盐酸盐对PC-3M细胞内FoxO1蛋白酶具有显著地激活作用。
C.对细胞迁移和细胞侵袭活性
采用Transwell方法进行细胞迁移和细胞侵袭活性验证，结果见图1和图2(注：与对照组相比，**p<0.01)。
从图1和图2中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-1-2-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1可以显著的抑制MDA-MB-231、A549和PC-3M细胞的迁移和侵袭能力。
D.外对毛细血管形成的影响
采用体外小管形成实验进行形成毛细血管官腔能力的验证，结果见图3(注：与对照组相比，**p<0.01)。
从图3中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-1-2-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1可以显著的抑制MDA-MB-231、A549和PC-3M细胞的小管生成能力。
E.对相关蛋白活性的影响
采用蛋白印迹法进行相关蛋白的活性验证，结果见图4～8(注：与对照组相比，**p<0.01)。
从图4～8中可以看出，裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-1-2-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1均可以使MDA-MB-231、A549和PC-3M细胞内FoxO1、Rap1和TSP1蛋白表达量升高，而使PDK1、Id1蛋白表达量降低。
本发明制备的裂环羽扇豆烷衍生物Ⅱ-1-1、Ⅱ-2-1、Ⅱ-3-1、Ⅱ-4-1、Ⅱ-5-1、Ⅱ-6-1、Ⅲ-1-1-1、Ⅲ-1-2-1、Ⅲ-3-1-1、Ⅲ-4-1-1、Ⅲ-5-1-1具有极强地抑制癌细胞增殖、迁移、侵袭和小管生成能力，其抗肿瘤作用是通过激活FoxO1、Rap1和TSP1，同时抑制PDK1、Id1蛋白酶活力，升高血管生成抑制因子，从而抑制肿瘤血管生成和迁移。
实施例13
药代动力学测试
动物实验：选用24只SD大鼠，雌雄各半(7～8周龄，体重200～220g)。随机分为6组，每组4只。经静脉注射或者灌胃相同剂量(20mg/kg)的药物(裂环羽扇豆烷衍生物)，以评价受试药物在其体内的药代动力学性质。
大鼠采用标准条件饲养，在12h白天/12h黑夜的条件下，给予维持饲料喂养。受试药物(裂环羽扇豆烷衍生物)用0.5％羧甲基纤维素钠或者二甲基亚砜配制。将相同剂量(20mg/kg)的裂环羽扇豆烷衍生物静脉注射。给药后0、0.083、0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24h尾静脉取血，所得血样4℃，5000rpm离心15min后分离血浆和红细胞，加肝素-20℃冻存。
利用LC-MS/MS检测血浆中各化合物的浓度，药代动力学参数基于每只动物在不同时间点的血药浓度进计算。
结果发现，本发明的各裂环羽扇豆烷衍生物均具有较好的药代动力学性质。
实施例14
片剂制备
试剂：淀粉(药用级，天津市津东天正精细化学试剂厂)；枸橼酸(上海麦克林生化科技有限公司)；硬脂酸镁(上海麦克林生化科技有限公司)。
①10％淀粉浆的制备：将0.25g枸橼酸溶于25mL纯水中，加入2.5g淀粉分散均匀，加热使其糊化，即得10％淀粉浆。
②制粒：取适量的裂环羽扇豆烷衍生物粉末与淀粉混合均匀，加入适量10％淀粉浆混合并研磨均匀，制软材，过16目筛制粒，在50～60℃下干燥1h。16目筛整粒后加入适量润滑剂硬脂酸镁，用直径为10mm的浅冲头压制成片剂。
结果发现，所得片剂颜色呈米白色，颜色均匀，薄厚均匀一致，硬度适中。片重和崩解的时间符合要求。
说明裂环羽扇豆烷衍生物所制片剂符合要求，可作为片剂使用。
实施例15
混悬型注射剂制备
试剂：聚乳酸(PLA，上海甄准生物科技有限公司)；聚乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA，上海源叶生物科技有限公司)；泊洛沙姆188(西安天正药用辅料有限公司)；二氯甲烷、甲醇、乙腈等(天津天泰化学品有限公司)。
制备方法：
①制备聚合物微粒：称取适量的裂环羽扇豆烷衍生物和载体(PLA/PLGA)置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL的二氯甲烷溶解，28℃减压蒸馏除去大部分有机溶剂，再在40℃条件下真空干燥24h直至溶剂全部去除，粉碎，过孔径为150μm的筛网，得到裂环羽扇豆烷衍生物聚合物微粒。
②制备裂环羽扇豆烷衍生物混悬注射剂：将2.5g上述产物在持续搅拌条件下分散在250mL含有10g/L的泊洛沙姆188稳定剂的水溶液中，使分散完全。将药物分散液进行研磨至所需粒径，取出得到裂环羽扇豆烷衍生物聚合物微粒混悬液，3000r/min离心1min，并用10mL稳定剂水溶液分散，使制剂浓缩至约为25g/L。
结果发现，所得混悬注射剂粒径均匀，制剂含水量、表面粒径均符合规定。体外缓释效果较佳，稳定性较好。
说明裂环羽扇豆烷衍生物所制混悬注射剂符合要求，可作为混悬注射剂使用。
实施例16
粉针剂制备
试剂：枸橼酸钠(上海麦克林生化科技有限公司)；亚硫酸钠(西安天正药用辅料有限公司)；β-环糊剂(上海麦克林生化科技有限公司)。
制备方法：
①制备聚合物微粒：称取适量的裂环羽扇豆烷衍生物和载体(PLA/PLGA)置于50mL圆底烧瓶中，加入5mL的二氯甲烷溶解，28℃减压蒸馏除去大部分有机溶剂，再在40℃条件下真空干燥24h直至溶剂全部去除，粉碎，过孔径为150μm的筛网，得到裂环羽扇豆烷衍生物聚合物微粒。
②制备裂环羽扇豆烷衍生物粉针剂：取上述产物添加不多于66％辅料在注射用水中搅拌，调整pH值和溶液体积，加入适量活性炭无菌过滤，滤液分装到西林瓶中，按冷冻干燥法直接制得成品。或采用喷雾干燥法或冷冻干燥法制得无菌粉末，进一步分装制得成品。
结果发现，制得的粉针剂剂量准确、外观色泽均匀、形态饱满。
说明裂环羽扇豆烷衍生物所制粉针剂符合要求，可作为粉针剂使用。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (9)

1.裂环羽扇豆烷衍生物，其特征在于，结构式如式Ⅱ或式Ⅲ所示：
其中，Rb选自以下结构中的任意一种：
结构a中Y为S、O或NH，结构b中的Y为NH；
Rc选自C1～C9烷基；
X选自以下结构中的任意一种：-(CH2)n-，其中n取1～10中的任意整数。
2.一种权利要求1所述的裂环羽扇豆烷衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法选自以下任意一种：
方法1，当Rb中的Y为NH时，所述裂环羽扇豆烷衍生物的制备方法为：
将式Ⅰ所示化合物先和Br-X-Br发生取代反应，再和经过Boc基团保护的Rb-H发生取代反应，脱除Boc基团得到式Ⅱ所示化合物；
或者，将式Ⅰ所示化合物先和Rc-OH发生酯交换反应，再和Br-X-Br发生取代反应，最后和经过Boc基团保护的Rb-H发生取代反应，脱除Boc基团得到式Ⅲ所示化合物；
方法2，当Rb中Y为S或O时，所述裂环羽扇豆烷衍生物的制备方法为：
将式Ⅰ所示化合物先和Br-X-Br发生取代反应，再和Rb-H发生取代反应，得到式Ⅱ所示化合物；
或者，将式Ⅰ所示化合物先和Rc-OH发生酯交换反应，再和Br-X-Br发生取代反应，最后和Rb-H发生取代反应，得到式Ⅲ所示化合物；
其中，式Ⅰ所示化合物结构式为：
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述取代反应在苄基三乙基溴化铵、碳酸钠存在条件下搅拌进行；
所述酯交换反应在酸性条件下加热回流。
4.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的裂环羽扇豆烷衍生物、裂环羽扇豆烷衍生物的光学异构体、裂环羽扇豆烷衍生物在药学上可接受的盐或裂环羽扇豆烷衍生物的溶剂化物。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，还包括，药学上可接受的载体；所述药物组合物为片剂、丸剂、粉针剂、半固体制剂或液体制剂。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述载体包括蛋白、叶酸、抗体和纳米材料中的一种或多种。
7.一种权利要求1所述的裂环羽扇豆烷衍生物或权利要求4～6任一项所述的药物组合物在制备多靶点肿瘤细胞血管生成和侵袭转移抑制剂中的应用。
8.一种权利要求1所述的裂环羽扇豆烷衍生物或权利要求4～6任一项所述的药物组合物在制备预防、治疗和缓解PDK1、FoxO1、Rap1、Id1和TSP1介导相关的肿瘤的药物中的应用。
9.一种权利要求1所述的裂环羽扇豆烷衍生物或权利要求4～6任一项所述的药物组合物在制备FoxO1、Rap1、TSP1激动剂，和PDK1、Id1抑制剂中的应用。
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