CN117100850A - 一种用于水痘-带状疱疹病毒感染的重组腺病毒疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于水痘‑带状疱疹病毒感染的重组腺病毒疫苗，含有名称为rAd26‑gE‑T‑Foldon或rChAd63‑gE‑T‑Foldon的重组腺病毒，其中，rAd26‑gE‑T‑Foldon含有重组腺病毒载体pAd26‑gE‑T‑Foldon；rChAd63‑gE‑T‑Foldon含有重组腺病毒载体pChAd63‑gE‑T‑Foldon，其中，gE‑T为编码gE蛋白和水痘‑带状疱疹病毒MHC‑II限制性抗原表位肽T的序列，其中，所述水痘‑带状疱疹病毒MHC‑II限制性抗原表位肽T选自SEQ ID NO.1～13及其组合。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域。本发明公开了一种用于水痘-带状疱疹病毒感染的重组腺病毒疫苗，所述疫苗包括MHC-II限制性抗原表位肽、gE。
背景技术
水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus，VZV)，属人类疱疹病毒α亚科，又称人类疱疹病毒3型(human herpes virus types 3，HHV-3)，属于双链DNA病毒，是水痘和带状疱疹(herpes zoster，HZ)的病原体。VZV初次感染一般是在幼儿时期，引起水痘，具有极强的传染性，水痘很少会发展到严重的情况，最终会发展为自限性疾病。在初次感染VZV后，病毒可终身潜伏在宿主神经元细胞中，在随着年龄增长，机体免疫力低下时病毒重新激活并在成年后引起带状疱疹(herpes zoster，HZ)。带状疱疹的症状是全身酸痛，严重的会出现烧灼样疼痛或是电击样疼痛，被称为带状疱疹后遗神经痛(PHN)。
水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus，VZV)是包膜病毒，包膜上含有多种糖蛋白，例如gE、gI、gB、gH、gC等，这些糖蛋白在病毒成熟与包装发挥着重要作用。其中gE蛋白对于病毒复制是必须的，并且是感染细胞和病毒包膜上含量最丰富的糖蛋白，gE蛋白是宿主免疫系统识别的最主要糖蛋白，可诱导细胞免疫和体液免疫。gE蛋白兼有T细胞和B细胞表位，针对VZV抗原研究主要集中在VZV gE蛋白上。野生型gE蛋白一般为623个氨基酸，有包含亲水胞外区(含信号肽)、跨膜疏水区和胞内区，而VZV gE的3个抗原决定簇均分布在胞外区，而其中的两个抗原决定簇编码区e1和c1，是具有较高的保守性。
目前上市的带状疱疹疫苗仅有两款，默沙东的带状疱疹减毒活疫苗(Zostavax)和GSK带状疱疹亚单位疫苗(Shingrix)。默沙东的带状疱疹减毒活疫苗所含病毒株为OKA减毒株，目前有多个国家已批准50岁以上人群接种带状疱疹减毒活疫苗。减毒活疫苗是有致病性较弱的活病毒，因此受试者存在因接种疫苗而引发带状疱疹，减毒活疫苗对一些免疫力低下的人群是受限的。GSK带状疱疹亚单位疫苗的抗原为VZV gE胞外区，并添加AS01B佐剂，已证实可有效预防带状疱疹及其并发症，免疫效果也优于带状疱疹减毒活疫苗。有研究显示，GSK带状疱疹亚单位疫苗间隔两个月进行2次佐剂免疫组效果优于单剂免疫或2剂无佐剂免疫组，前者gE特异性CD4+、T细胞数量是后两组3倍以上。这就表明免疫剂量对细胞免疫提升无显著差异，同时也体现出佐剂对免疫效果起着重要作用。重组蛋白需要有在表现良好的佐剂系统下能够刺激机体产生较高的细胞免疫和体液免疫。
细胞免疫在机体对抗水痘-带状疱疹病毒感染过程中起着非常关键的影响，尤其是CD4+T细胞免疫应答在病毒免疫防疫中发挥着重要作用。为了增强机体针对水痘-带状疱疹病毒的CD4+T细胞免疫应答，可有目的的对水痘-带状疱疹病毒糖蛋白进行MHC II限制性抗原表位肽筛选，而MHC II限制性抗原表位肽可刺激CD4+T细胞进一步分化，从而进行调节免疫反应，清楚入侵机体内的病原体。
在疫苗的研究中，腺病毒载体以其基因信息清楚，易于操作且可以插入大片段的外源基因；能有效增值，病毒滴度高；可以诱导机体产生强力的体液免疫和细胞免疫；同时腺病毒载体还具有佐剂的效果，因而可刺激机体产生更强的免疫反应。复制缺陷型腺病毒只能在特定的细胞系复制，安全性好，已经被用于多种疫苗研发。目前，研究最为透彻和应用最为广泛的是人5型腺病毒，然而人5型腺病毒在人群中自然感染的比率比较高，固有免疫限制了其进一步的应用。
因此，人腺病毒稀有血清型和非灵长类血清型腺病毒成为了疫苗开发的另一个突破口。目前，基于人Ad26和黑猩猩腺病毒(chimpanzee adenovirus，ChAd)的重组腺病毒疫苗已经相继上市，且单针免疫可以起到良好的免疫效果。进一步显示了包括人稀有血清型和非人灵长类腺病毒载体等用于疫苗研究的安全性和可行性。
通过构建水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽及其糖蛋白整合疫苗，可以实现较高的CD4+T细胞免疫应答，为水痘-带状疱疹病毒疫苗研发拓阔研究思路。我们选择人稀有血清型的26型腺病毒和黑猩猩63型腺病毒作为载体，并对这两个腺病毒进行改造(rAd26和rChAd63)，构建可表达水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E(gE)及MHC II限制性抗原表位肽的复制缺陷型重组腺病毒，进一步提高安全性，用于水痘-带状疱疹病毒感染的预防。
发明内容
本发明的目的在于提供水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽及其在疫苗制备中的应用。为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种重组腺病毒疫苗，含有名称为rAd26-gE-T-Foldon和/或rChAd63-gE-T-Foldon的重组腺病毒，其中，rAd26-gE-T-Foldon含有重组腺病毒载体pAd26-gE-T-Foldonr；rChAd63-gE-T-Foldon含有重组腺病毒载体pChAd63-gE-T-Foldon。
在一种实施方案中，其中，gE-T为编码gE蛋白和水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽T的氨基酸序列，其中，所述水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽T选自SEQ ID NO.1～13及其组合。
在一种实施方案中，其中，所述gE为tPA-gE其序列为SEQ ID NO.14所示序列，所述T为抗原复合物T，其序列为SEQ ID NO.15～20所示序列，其中抗原复合物T优选SEQ IDNO.20，所述Foldon其序列为SEQ ID NO.21所示序列，所述重组腺病毒编码的序列包括SEQID NO.22所示序列。
在一种实施方案中，其中，所述重组腺病毒载体为质粒pcDNA3.1-gE-T-Foldon经同源重组方法与骨架质粒整合得到，其中所述骨架质粒为pAd26和pChAd63。
在一种实施方案中，其中，编码水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽与gE蛋白的氨基酸序列，通过linker连接，所述linker选自：刚性linker、柔性linker、IRES连接肽、2A连接肽及其他形式的linker中的一种。
一种质粒，所述质粒为pcDNA3.1-gE-T-Foldon。
一种重组腺病毒载体，选自：pAd26-gE-T-Foldon或pChAd63-gE-T-Foldon。
一种重组腺病毒表达系统，选自：真核表达系统、酵母表达系统、大肠杆菌表达系统及昆虫细胞表达系统。
在一种实施方案中，所述细胞为HEK293细胞。
本发明进一步提供一种水痘-带状疱疹病毒(OKA株)MHC-II限制性抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO.1～13或其组合。优选的，所述的抗原表位肽，选自T1，T2，T3，T4，T5，T6，氨基酸序列分别对应于：
一种gE-T多肽，选自gE-T1，gE-T2，gE-T3，gE-T4，gE-T5，gE-T6，其对应的氨基酸序列如下：
在一种实施方案中，包括本发明所述的重组腺病毒疫苗的制备方法：
(1)合成可表达gE-T-Foldon氨基酸序列的质粒pcDNA3.1-gE-T-Foldon；
(2)将步骤(1)所述质粒通过同源重组方法与骨架质粒整合在一起，获得重组腺病毒载体pAd26-gE-T-Foldon或pChAd63-gE-T-Foldon；
(3)将步骤(2)所述重组腺病毒载体经过Pac I酶切线性化，得到线性化质粒，采用所述线性化质粒转染至包装细胞如HEK293细胞；
(4)培养步骤(3)所述细胞；
(5)收获从步骤(4)所述细胞释放的复制缺陷型重组腺病毒rAd26-gE-T-Foldon或rChAd63-gE-T-Foldon。
本发明进一步包括将上述重组腺病毒rAd26-gE-T-Foldon或rChAd63-gE-T-Foldon制备成疫苗制剂，所述疫苗制剂为注射剂，其中可以根据需要加入必要的疫苗载体或疫苗佐剂。
本发明对水痘-带状疱疹病毒的8种糖蛋白进行MHC-II限制性抗原表位肽筛选，将表位肽进行随机组合。组合后的表位肽复合物称为：T，其通过linker与经过改造后的gE融合蛋白连接在一起，称为：gE-T，利用VaxiJen软件进行抗原性打分，选取评分较高的表位肽复合物最后在其组合片段C-末端添加Foldon序列，使得抗原复合物以三聚体的形式表达，称为：gE-T-Foldon。
本发明提供了pcDNA3.1-gE-T-Foldon质粒，其含有优化设计后的编码水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽与gE蛋白的氨基酸序列。所述重组腺病毒表达载体为质粒pcDNA3.1-gE-T-Foldon经同源重组方法与骨架质粒整合得到，其中所述骨架质粒为pAd26和pChAd63。
本发明提供了一种水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽与gE蛋白的氨基酸序列和重组腺病毒载体，其表达SEQ ID NO.22所示蛋白，
本发明重组腺病毒为复制缺陷型重组腺病毒，其由上述重组腺病毒载体制备而成，所述复制缺陷型重组腺病毒为rAd26-gE-T-Foldon和rChAd63-gE-T-Foldon。
本发明提供了针对水痘-带状疱疹病毒的疫苗，其活性成分为上述复制缺陷型重组腺病毒。
本发明提供了表达一种水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽与gE蛋白的氨基酸序列及含有其氨基酸序列的重组腺病毒载体、重组腺病毒及构建方法，得到的复制缺陷型重组腺病毒能够感染真核细胞，从而实现水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽与gE蛋白在真核细胞中表达的目的，为进一步研究水痘-带状疱疹病毒疫苗打好基础。
以下为本发明中出现的术语作进一步的解释和说明：
腺病毒：存在于人和其它哺乳动物以及禽类的眼、上呼吸道及消化道内等部位的直径为70～90nm，呈二十面体立体对称无包膜的DNA病毒；
重组腺病毒：复制缺陷的腺病毒，只可以在特定细胞系复制的腺病毒，免疫人体只感染而不复制的腺病毒。
腺病毒疫苗：将外源基因克隆至腺病毒载体中，并于特定细胞系包装出的复制缺陷型腺病毒制备的疫苗。
rAd26：人26型腺病毒
gE：此处特指水痘-带状疱疹病毒gE基因或gE糖蛋白；
T：T细胞表位肽复合物；
Foldon：T4噬菌体fibritin蛋白质的结构域
rChAd63：重组黑猩猩63型腺病毒
pAd26：人26型腺病毒骨架质粒
pChAd63：黑猩猩63型腺病毒骨架质粒
水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽：水痘-带状疱疹病毒II型主要组织相容性复合体抗原表位肽；
信号肽：是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链；
tPA：组织纤溶酶原激活物信号肽
pcDNA3.1：质粒pcDNA3.1
linker：连接基团；
刚性linker：具有相对坚硬结构，可以有效将蛋白结构域分开的连接基团；
柔性linker：不影响蛋白结构域的相互作用或者相互距离的连接基团；
IRES：内部核糖体进入位点；
2A：一种平均长度18-22个氨基酸短肽，存在于多种病毒中；
质粒：任何染色体外的遗传决定物质；
载体：指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子；
表达盒：启动子，靶基因，和报道基因组成，能在特定组织中表达并易于检测的一组DNA序列；
真核表达系统：是通过DNA重组技术，在酵母、昆虫细胞、真核细胞(如CHO、293细胞等)等中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因的一类表达系统；
酵母表达系统：是通过DNA重组技术，在酵母菌中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因的一个表达系统；
大肠杆菌表达系统：是通过DNA重组技术，在大肠杆菌中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因的一个表达系统；
昆虫细胞表达系统：是通过DNA重组技术，在昆虫细胞中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因的一个表达系统；
HEK293细胞：人胚胎肾细胞293；
骨架质粒：包含启动子、终止子、抗性基因等重要信息的质粒；
包装细胞：用于病毒扩增或复制的细胞系；
缺陷型重组腺病毒：只在特殊细胞系复制的腺病毒；
抗原组合：二种及以上抗原的组合；
抗原表位复合物：多表位肽的组合；
序列1：水痘-带状疱疹病毒gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列2：水痘-带状疱疹病毒gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列3：水痘-带状疱疹病毒gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列4：水痘-带状疱疹病毒gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列5：水痘-带状疱疹病毒gH蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列6：水痘-带状疱疹病毒gH蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列7：水痘-带状疱疹病毒gI蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列8：水痘-带状疱疹病毒gI蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列9：水痘-带状疱疹病毒gK蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列10：水痘-带状疱疹病毒gL蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列11：水痘-带状疱疹病毒gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列12：水痘-带状疱疹病毒gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽序列13：水痘-带状疱疹病毒gN蛋白MHC-II限制性抗原表位肽
序列14：优化后水痘-带状疱疹病毒gE蛋白氨基酸序列(gE)
序列15：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白和gC蛋白所筛选的4条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列(gE-T1)
序列16：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gC蛋白和gB蛋白所筛选的4条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列(gE-T2)
序列17：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的5条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列(gE-T3)
序列18：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白及gH蛋白所筛选的6条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列(gE-T4)
序列19：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白、gH蛋白、gI蛋白、gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的8条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列(gE-T5)
序列20：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白、gH蛋白、gI蛋白、gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的13条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列(gE-T6)
序列21：T4噬菌体fibritin蛋白质的结构域Foldon的氨基酸序列序列22：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白、gH蛋白、gI蛋白、gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的13条MHC-II限制性抗原表位肽及Foldon的氨基酸序列串联组合而成的氨基酸序列(gE-T6-Foldon)
序列23：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白和gC蛋白所筛选的4条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(gE-T1)
序列24：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gC蛋白和gB蛋白所筛选的4条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(gE-T2)
序列25：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的5条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(gE-T3)
序列26：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白及gH蛋白所筛选的6条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(gE-T4)
序列27：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白、gH蛋白、gI蛋白、gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的8条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(gE-T5)
序列28：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白、gH蛋白、gI蛋白、gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的13条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(gE-T6)
序列29：水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白、gH蛋白、gI蛋白、gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的13条MHC-II限制性抗原表位肽及Foldon的氨基酸序列串联组合而成的氨基酸序列翻译后的核苷酸序列(gE-T6-Foldon)
附图说明
图1为本发明水痘-带状疱疹病毒抗原表达盒示意图；
图2为本发明重组腺病毒载体质粒pAd26-gE-T-Foldon经限制性核酸内切酶Kpn I单酶切鉴定图和限制性核酸内切酶EcoR V单酶切鉴定图；pChAd63-gE-T-Foldon经限制性核酸内切酶Spe I单酶切鉴定图；
图3为拯救重组腺病毒形成的细胞病变结果图；
图4为实施例6重组腺病毒免疫动物后血清抗体检测结果图；
图5为实施例6重组腺病毒免疫动物后细胞免疫效果检测结果图；
具体实施方式
本发明提供了所述水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1～13任一所示；将所述改造gE氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；MHC-II限制性抗原表位复合物与gE通过linker进行连接，组合片段C-末端添加Foldon序列，抗原组合物氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明中，所述可表达水痘-带状疱疹病毒的MHC-II限制性抗原表位肽与gE抗原组合物(gE-T-Foldon)氨基酸序列的质粒通过人工合成获得，本发明对所述人工合成的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
本发明还提供了两种复制缺陷型重组腺病毒载体，所述复制缺陷型重组腺病毒载体为pAd26和pChAd63。将上述方案中所述的gE-T-Foldon质粒通过同源重组的方式整合在重组腺病毒载体上。
本发明还提供了一种制备如上所述复制缺陷型腺病毒载体和如上所述重组腺病毒的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建含有可表达gE-T-Foldon氨基酸序列的pcDNA3.1-gE-T-Foldon质粒；
(2)将步骤(1)所述载体通过同源重组方法与骨架质粒整合在一起，获得重组腺病毒载体；
(3)将步骤(2)所述重组腺病毒载体经过Pac I酶切线性化，得到线性化质粒，采用所述线性化质粒转染至HEK293细胞；
(4)培养步骤(3)的HEK293细胞，至出现明显细胞病变，如细胞皱缩、变大变圆、聚集成葡萄珠状；
(5)收获从步骤(4)所述细胞释放的复制缺陷型重组腺病毒。
本发明提供了一种水痘-带状疱疹病毒疫苗，包含上述方案所述的复制缺陷型重组腺病毒。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，并非全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位的预测
1.1查询NCBI网站收录的水痘-带状疱疹病毒(OKA株)氨基酸序列(GenBank:AB097933.1)中的gB、gC、gH、gI、gK、gL、gM及gN糖蛋白氨基酸酸序列，利用MHC-II结合工具(http://tools.iedb.org/mhcii/)，对以上8种糖蛋白进行MHC-II限制性抗原表位的预测。所采用的预测方法为IEDB Recommended所推荐的共识方法，该方法对给定MHC分子使用最佳可能。选择每个蛋白所筛选MHC-II限制性抗原表位排名靠前的短肽进行抗原组合。具体所筛出MHC-II限制性抗原表位序列信息如表1所示。
表1水痘-带状疱疹病毒8种糖蛋白MHC-II限制性抗原表位肽
实施例2、gE蛋白的改造与抗原组合物的构建
2.1将gE蛋白的原始信号肽(1aa-30aa)更改为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA，以进一步提升gE蛋白的表达水平，同时去掉gE蛋白的跨膜区和胞内区(547位氨基酸开始)，具体改造后gE蛋白氨基酸序列信息见SEQ ID NO.14，核苷酸序列见SEQ ID NO.23，其中1bp-66bp为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA，67bp-1614bp为gE蛋白的胞外区。
2.2将筛选得到的MHC-II限制性抗原表位用GPGPG进行连接，形成抗原表位复合物T。将抗原表位复合物与改造的gE通过刚性linker(EAAAK)进行连接，命名为gE-T，并利用VaxiJen软件进行抗原性打分，评分高于0.4即表示组合物具有抗原性，表2所示为优化后的gE连接抗原表位复合物的几种随机组合的抗原性评分。
表2gE-T的抗原性评分结果
由上表可知，gE-T1，gE-T2，gE-T3，gE-T4，gE-T5，gE-T6均具有免疫原性，可以作为疫苗使用。
其中gE-T1为水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白和gC蛋白所筛选的4条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列，氨基酸序列信息见SEQ ID NO.15。gE-T1核苷酸序列信息见SEQ ID NO.24，其中1bp-66bp为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA；67bp-1614bp为gE蛋白的胞外区；1615bp-1629bp为刚性linker(EAAAK)的核苷酸序列；1630bp-1674bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.1的核苷酸序列；1675bp-1689bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1690bp-1734bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.2的核苷酸序列；1735bp-1749bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1750bp-1794bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.3的核苷酸序列；1795bp-1809bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1810bp-1854bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.4的核苷酸序列。
其中gE-T2为水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gC蛋白和gB蛋白所筛选的4条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列，氨基酸序列信息见SEQ ID NO.16。gE-T2核苷酸序列信息见SEQ ID NO.25，其中1bp-66bp为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA；67bp-1614bp为gE蛋白的胞外区；1615bp-1629bp为刚性linker(EAAAK)的核苷酸序列；1630bp-1674bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.3的核苷酸序列；1675bp-1689bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1690bp-1734bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.4的核苷酸序列；1735bp-1749bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1750bp-1794bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.1的核苷酸序列；1795bp-1809bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1810bp-1854bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.2的核苷酸序列。
其中gE-T3为水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的5条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列，氨基酸序列信息见SEQ ID NO.17。gE-T3核苷酸序列信息见SEQ ID NO.26，其中1bp-66bp为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA；67bp-1614bp为gE蛋白的胞外区；1615bp-1629bp为刚性linker(EAAAK)的核苷酸序列；1630bp-1674bp为gK蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ IDNO.9的核苷酸序列；1675bp-1689bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1690bp-1734bp为gL蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.10的核苷酸序列；1735bp-1749bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1750bp-1794bp为gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.11的核苷酸序列；1795bp-1809bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1810bp-1854bp为gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.12的核苷酸序列；1855bp-1869bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1870bp-1914bp为gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.13的核苷酸序列。
其中gE-T4为水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白及gH蛋白所筛选的6条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列，氨基酸序列信息见SEQ ID NO.18。gE-T4核苷酸序列信息见SEQ ID NO.27，其中1bp-66bp为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA；67bp-1614bp为gE蛋白的胞外区；1615bp-1629bp为刚性linker(EAAAK)的核苷酸序列；1630bp-1674bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.1的核苷酸序列；1675bp-1689bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1690bp-1734bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.2的核苷酸序列；1735bp-1749bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1750bp-1794bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.3的核苷酸序列；1795bp-1809bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1810bp-1854bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.4的核苷酸序列；1855bp-1869bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1870bp-1914bp为gH蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.5的核苷酸序列；1915bp-1929bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1930bp-1974bp为gH蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.6的核苷酸序列。
其中gE-T5为水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白、gH蛋白、gI蛋白、gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的8条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列，氨基酸序列信息见SEQ ID NO.19。gE-T5核苷酸序列信息见SEQ ID NO.28，其中1bp-66bp为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA；67bp-1614bp为gE蛋白的胞外区；1615bp-1629bp为刚性linker(EAAAK)的核苷酸序列；1630bp-1674bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.1的核苷酸序列；1675bp-1689bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1690bp-1734bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.3的核苷酸序列；1735bp-1749bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1750bp-1794bp为gH蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.5的核苷酸序列；1795bp-1809bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1810bp-1854bp为gI蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.7的核苷酸序列；1855bp-1869bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1870bp-1914bp为gK蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.9的核苷酸序列；1915bp-1929bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1930bp-1974bp为gL蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.10的核苷酸序列；1975bp-1989bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1990bp-2034bp为gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ IDNO.11的核苷酸序列；2035bp-2049bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2050bp-2094bp为gN蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.13的核苷酸序列。
其中gE-T6为水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白、gH蛋白、gI蛋白、gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的13条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列，氨基酸序列信息见SEQ ID NO.20。gE-T6核苷酸序列信息见SEQ ID NO.29，其中1bp-66bp为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA；67bp-1614bp为gE蛋白的胞外区；1615bp-1629bp为刚性linker(EAAAK)的核苷酸序列；1630bp-1674bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.1的核苷酸序列；1675bp-1689bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1690bp-1734bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.2的核苷酸序列；1735bp-1749bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1750bp-1794bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.3的核苷酸序列；1795bp-1809bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1810bp-1854bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.4的核苷酸序列；1855bp-1869bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1870bp-1914bp为gH蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.5的核苷酸序列；1915bp-1929bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1930bp-1974bp为gH蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.6的核苷酸序列；1975bp-1989bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1990bp-2034bp为gI蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ IDNO.7的核苷酸序列；2035bp-2049bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2050bp-2094bp为gI蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.8的核苷酸序列；2095bp-2109bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2110bp-2154bp为gK蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.9的核苷酸序列；2155bp-2169bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2170bp-2214bp为gL蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.10的核苷酸序列；2215bp-2229bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2230bp-2274bp为gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.11的核苷酸序列；2275bp-2289bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2290bp-2334bp为gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.12的核苷酸序列；2335bp-2349bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2350bp-2394bp为gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.13的核苷酸序列。
选取MHC-II限制性抗原表位的抗原组合物gE-T6作为候选抗原gE-T，具体氨基酸序列信息见SEQ ID NO.20，随后在组合片段C-末端添加Foldon序列，使其形成三聚体结构，抗原组合物氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示，其核苷酸序列信息见SEQ ID NO.30，其中gE-T6-Foldon为水痘-带状疱疹病毒gE蛋白与水痘-带状疱疹病毒gB蛋白、gC蛋白、gH蛋白、gI蛋白、gK蛋白、gL蛋白、gM蛋白及gN蛋白所筛选的13条MHC-II限制性抗原表位肽进行串联组合而成的氨基酸序列，在C-末端添加Foldon序列，氨基酸序列信息见SEQ ID NO.22。gE-T6-Foldon核苷酸序列信息见SEQ ID NO.30，其中1bp-66bp为组织纤溶酶原激活物信号肽tPA；67bp-1614bp为gE蛋白的胞外区；1615bp-1629bp为刚性linker(EAAAK)的核苷酸序列；1630bp-1674bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.1的核苷酸序列；1675bp-1689bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1690bp-1734bp为gB蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.2的核苷酸序列；1735bp-1749bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1750bp-1794bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.3的核苷酸序列；1795bp-1809bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1810bp-1854bp为gC蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ IDNO.4的核苷酸序列；1855bp-1869bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1870bp-1914bp为gH蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.5的核苷酸序列；1915bp-1929bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1930bp-1974bp为gH蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.6的核苷酸序列；1975bp-1989bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；1990bp-2034bp为gI蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.7的核苷酸序列；2035bp-2049bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2050bp-2094bp为gI蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.8的核苷酸序列；2095bp-2109bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2110bp-2154bp为gK蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.9的核苷酸序列；2155bp-2169bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2170bp-2214bp为gL蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.10的核苷酸序列；2215bp-2229bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2230bp-2274bp为gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ IDNO.11的核苷酸序列；2275bp-2289bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2290bp-2334bp为gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.12的核苷酸序列；2335bp-2349bp为linker(GPGPG)的核苷酸序列；2350bp-2394bp为gM蛋白MHC-II限制性抗原表位肽SEQ ID NO.13的核苷酸序列；2395bp-2481bp为稳定三聚体构象的Foldon氨基酸序列SEQ ID NO.29的核苷酸序列。
实施例3、疫苗设计方案
本发明实施例中所用腺病毒载体为经改造后的人稀有血清型的26型腺病毒和黑猩猩63型腺病毒，与相对应野生型腺病毒比较，改造后的腺病毒缺失了与病毒复制相关的部分E1基因和全部E3基因，构建得到的重组腺病毒只能在含E1基因表达细胞系(HEK293细胞)中进行复制。重组腺病毒在感染动物或人之后可表达插入的外源基因，但不能进行复制，实现复制缺陷的特性，并体现其安全性。
本发明构建的重组腺病毒含有水痘带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽和改造后gE蛋白(抗原组合物)表达盒，所表达的序列位于巨细胞病毒(CMV)启动子和SV40多聚腺苷酸尾终止序列之间，在抗原组合物序列前加入利于基因高效表达的Kozak序列，如图1所示，其中Kozak序列为GCCACC。
复制缺陷型重组腺病毒载体pAd26和pChAd63及pcDNA3.1-gE-T-Foldon由北京六合华大基因科技有限公司合成。
实施例4、重组腺病毒载体构建
重组腺病毒载体质粒pAd26-gE-T-Foldon和pChAd63-gE-T-Foldon构建
(1)以质粒pcDNA3.1-gE-T-Foldon为模板，通过PCR获得含有可与pAd26骨架质粒进行重组的CMV-gE-T-Foldon-SV40片段1和可与pChAd63骨架质粒进行重组的CMV-gE-T-Foldon-SV40片段2，PCR引物如下：
F-26S-G：TGGTACCGTCGACGCGGCCGCTCGAGCCTAAGCT R-26S-G：ATCAGTT ATCTAGATCCGGTGGATCGG ATATCTTAT F-63S-G：ACTCTTGAGTGCCAGCGAGTAGAGTTTACTGTAAT R-63S-G：CTGGAGCCGAACTCCGTCCCGTTGCGTTAAGATAC
(2)将pAd26骨架质粒用限制性核酸内切酶Xba I及pChAd63骨架质粒用限制性核酸内切酶Hpa I酶切，通过乙醇沉淀获得载体，与纯化后的CMV-gE-T-Foldon-SV40片段1和CMV-gE-T-Foldon-SV40片段2进行用Seamless Cloning Kit试剂盒进行分别同源重组，将重组产物转化至DH10B感受态细胞，氨苄抗性平板筛选克隆，挑取克隆进行菌液PCR鉴定，阳性克隆提取质粒；pAd26-gE-T-Foldon质粒经Kpn I单酶切鉴定和EcoR V单酶切鉴定，如图2a所示；pChAd63-gE-T-Foldon经Spe I单酶切鉴定，如图2b所示，将正确质粒送去测序鉴定，测序正确质粒即为重组腺病毒载体质粒pAd26-gE-T-Foldon和pChAd63-gE-T-Foldon。
实施例5、重组腺病毒包装及鉴定
重组腺病毒包装
(1)将重组腺病毒载体质粒pAd26-gE-T-Foldon和pChAd63-gE-T-Foldon分别用限制性核酸内切酶Pac I酶切，乙醇沉淀回收线性化质粒；
(2)HEK293细胞铺于六孔板，待细胞丰度达70％时进行转染；
(3)质粒准备：将4μg线性化质粒和10μl Lipofectamine 2000脂质体分别和250μl无血清DMEM培养基混匀，室温静置5min，随后将两种混合液混匀在一起，室温静置20min；
(4)将混合液加入至培养HEK293细胞的六孔板中，37℃培养5h后更换培养液含有2％小牛血清的DMEM培养基，37℃培养；
(5)每间隔24h观察细胞状态及细胞出毒情况，出毒现象为细胞变大变圆，如图3所示(图a为空白细胞，图b为细胞病变图)，待细胞大部分病变时，进行收毒。
(6)将出毒的细胞在-80℃冰箱和37℃水浴锅反复冻融三次，使得重组腺病毒从细胞中释放出来，4000rpm，离心10min，收集上清，即为第一代毒种(P1)，作为后续扩大培养的毒种。
所包装的重组腺病毒，即为rAd26-gE-T-Foldon和rChAd63-gE-T-Foldon，同时构建表达gE原始序列的重组腺病毒rAd26-gE和rChAd63-gE。
实施例6、重组腺病毒动物免疫实验
6.1动物免疫
将日龄相同的，体重相近的雌性BALB/c小鼠随机分为三组，每组5只，其中第一组以rAd26-gE-T-Foldon初次免疫，rChAd63-gE-T-Foldon加强免疫；第二组以rAd26-gE初次免疫，rChAd63-gE加强免疫；第三组为生理盐水组。试验处理：第0天通过肌肉注射进行初次免疫，免疫后21天通过肌肉注射进行加强免疫，免疫后35天采集小鼠血清和脾细胞分别进行血清抗体检测及细胞免疫效果检测。
6.2血清抗体检测
纯化的gE蛋白以200ng/ml包被至酶标板，ELISA方法检测免疫后BALB/c小鼠血清针对gE蛋白的IgG抗体效价，结果如图4所示，重组腺病毒rAd26-gE-T-Foldon初次免疫，rChAd63-gE-T-Foldon加强免疫组和rAd26-gE初次免疫和rChAd63-gE加强免疫组，免疫后BALB/c小鼠的血清均产生较高的血清抗体。
6.3细胞免疫检测
6.3.1脾细胞制备
1)取完成免疫程序的小鼠于生物安全柜中采集脾脏；
2)将脾脏经纱网研磨至淋巴细胞分离液中，将悬液转移至15ml离心管中，将离心机升降速调为最低，1000rpm离心20min；
3)离心结束吸取分离得到的淋巴细胞至1640培养基；
4)淋巴细胞再次以1000rpm离心10min；
5)弃上清，用1640培养基重悬细胞，并进行细胞计数，备用。
6.3.2ELISPOT方法检测细胞标有效果
用预包被IFN-γ的ELISPOT板子进行检测，刺激抗原为gE蛋白及由南京金斯瑞生物科技有限公司合成的SEQ ID NO.1～13，共13种短肽。
1)在生物安全柜中向预包被IFN-γ的ELISPOT 96孔板加入200μl 1640培养基，室温静置10min，弃去培养基；
2)将细胞悬液以100μl/孔加入至相应实验孔，设立阳性孔和阴性孔，每孔加入的细胞数量为3×105个，同时设立空白对照孔，各设2个复孔；
3)实验孔中加入抗原刺激物混合物(每种刺激物0.5μg)，37℃，5％培养箱孵育20h；
4)将细胞液弃去，向96孔板中加入预冷的去离子水，置于4℃冰箱10min；
5)弃去液体，用洗液将板子洗涤5次，每次停留1min，并用吸水纸吸干多余液体；
6)将生物素标记的抗体用抗体稀释液稀释，加入至96孔板，37℃孵育1h；
7)用洗液将板子洗涤5次，每次停留1min，并用吸水纸吸干多余液体；
8)AEC显色工作液液现配现用，加入至96孔板，室温显色20min；
9)观察斑点形成情况，弃掉液体，用去离子子水洗涤板子5次，自然晾干96孔板，待其干燥后，进行斑点读数。
结果分析：如图5所示的细胞免疫检测结果可见，含有MHC-II多肽组合的重组腺病毒rAd26gE-T-Foldon与rChAd63gE-T-Foldon免疫组小鼠相较与重组腺病毒rAd26gE和rChAd63gE免疫组小鼠在免疫接种后可刺激小鼠产生较高的细胞免疫反应
以上所述仅是本发明的优先实施方式，但其并不是仅局限于实施方式中所列举的应用，应当指出，对于熟悉本技术领域的技术人员，可轻易的实现优化改进，都应在本发明的保护范围之内，本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种重组腺病毒疫苗，含有名称为rAd26-gE-T-Foldon或rChAd63-gE-T-Foldon的重组腺病毒，其中，rAd26-gE-T-Foldon含有重组腺病毒载体pAd26-gE-T-Foldon；rChAd63-gE-T-Foldon含有重组腺病毒载体pChAd63-gE-T-Foldon，其中，gE-T为编码gE蛋白和水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽T的序列，其中，所述水痘-带状疱疹病毒MHC-II限制性抗原表位肽T选自选自任意一组或多组SEQ ID NO.1～13的抗原表位肽T，在多组时两组之间通过GPGPG连接。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒疫苗，其中，所述T选自：T1-T6，所述gE其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.14；所述Foldon其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.21；所述gE-T选自：gE-T1，gE-T2，gE-T3，gE-T4，gE-T5，gE-T6；所述重组腺病毒载体为质粒pcDNA3.1-gE-T-Foldon经同源重组方法与骨架质粒整合得到，其中所述骨架质粒为pAd26和pChAd63。
3.多核苷酸序列，其特征在于：为编码SEQ ID NO.1～22的任意氨基酸序列的序列。
4.多核苷酸序列，其特征在于：为SEQ ID NO.23-30的任意序列。
5.一种质粒，其特征在于，所述质粒为pcDNA3.1-gE-T-Foldon。
6.一种重组腺病毒载体，选自：pAd26-gE-T-Foldon或pChAd63-gE-T-Foldon。
7.一种重组腺病毒表达系统，选自：真核表达系统、酵母表达系统、大肠杆菌表达系统及昆虫细胞表达系统。
8.权利要求7所述的重组腺病毒表达系统，所述细胞为HEK293细胞。
9.一种水痘-带状疱疹病毒(OKA株)MHC-II限制性抗原表位肽，其特征在于：选自T1，T2，T3，T4，T5，T6，氨基酸序列分别对应于：
10.一种gE-T多肽，其特征在于，选自gE-T1，gE-T2，gE-T3，gE-T4，gE-T5，gE-T6，其对应的氨基酸序列如下：
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