CN117085129A - 一种光敏剂脱镁叶绿酸盐a的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光敏剂脱镁叶绿酸盐a的应用，具体涉及制备预防和/或治疗酪氨酸酶相关的疾病的药物、护肤品或化妆品方面的应用，将PhA介导的低剂量光动力治疗应用于皮肤表面黑色素沉着，实现调节黑色素过度产生，最终达到皮肤美白祛斑的效果。因此可以将其制备成药物或者化妆品、护肤品，用于黑色素抑制、皮肤美白等方面。
Description
技术领域
本发明涉及一种光敏剂脱镁叶绿酸盐a的应用，属于光化学反应领域。
背景技术
光动力治疗（photodynamic therapy, PDT）是用光敏剂结合特定激发波长的光照治疗皮肤疾病的一种新方法。光敏剂定位涂抹于皮肤后，被特定波长的光照激发后，将光的能量传递给氧分子，引发细胞内的一系列生理生化改变。近年来研究发现，天然植物提取物如脱镁叶绿酸盐a（pheophorbide a, PhA）具有一定的光敏活性作用，基于此研制高效、低毒的新型理想光敏剂介导的光动力治疗倍受人们的普遍青睐。
黑色素是在黑色素细胞内特定的结构中合成的，这种结构称为黑色素小体。黑色素细胞的一般特征是具有合成黑色素和转移到相邻角质形成细胞的能力。也就是说，黑色素在黑色素细胞成熟后，转移到角质形成细胞中，角质形成细胞内储存的黑色素决定了皮肤的颜色。黑色素沉着是一种常见的影响亚洲人面部外观的皮肤问题，比如黄褐斑、雀斑、炎症后色斑等，目前尚无特效药。其治疗措施主要从抑制黑色素细胞增生，防止黑色素颗粒形成，加速黑色素颗粒降解及降低黑色素细胞活性等方面入手。
黑色素合成是一个复杂的生物过程，涉及一系列复杂的酶和化学反应。这一过程中涉及的酶主要是酪氨酸酶（TYR）。它在黑色素合成中起主要作用，催化黑色素合成的一个限速步骤，而酪氨酸酶的下调是开发黑色素生成抑制剂的最突出途径。因此，近年来开发了许多针对酪氨酸酶的抑制剂。
发明内容
对此，本发明设计将PhA介导的低剂量光动力治疗（阳性对照：苯硫脲，PTU）应用于皮肤表面黑色素沉着，实现调节黑色素过度产生，最终达到皮肤美白祛斑的效果。因此可以将其制备成药物或者化妆品、护肤品，用于黑色素抑制、皮肤美白等方面。
本发明公开了光敏剂PhA在制备预防和/或治疗酪氨酸酶相关疾病的药物中的应用。
进一步地，预防和/或治疗酪氨酸酶相关疾病的药物为酪氨酸酶抑制剂的药物。
更进一步地，所述的药物为抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的药物。
本发明同时公开了光敏剂PhA在制备护肤品或化妆品方面的应用。
进一步地，护肤品或化妆品为抑制酪氨酸酶、美白、抗氧化或抗衰老的护肤品或化妆品。
有益效果
1.本发明提出了一种将光敏剂PhA用于小剂量光动力治疗，具有黑色素抑制能力，同时具有良好的安全性和稳定性。
2.低剂量PhA-PDT能够作为抑制剂抑制酪氨酸酶活性，能够抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶活性和黑色素的合成，应用效果通过试验验证，具有很好的美白祛斑作用。
3.本申请对于研究高效低毒的光敏剂有重要的意义，以期为临床开发新型的黑色素抑制药物或者化妆品奠定理论和实验基础。
附图说明
图1为不同光治疗剂量下HaCaT细胞和B16F10细胞的细胞活力曲线图；（a）为HaCaT细胞；（b）为B16F10细胞；
图2为不同光治疗剂量下B16F10细胞上清液中黑色素含量柱状图；*P<0.05， **P<0.01，与正常对照组相比；## P<0.01，与阳性对照组PTU相比；
图3为不同光治疗剂量下B16F10细胞内酪氨酸酶的相对活性柱状图；**P<0.01，与正常对照组相比；
图4为不同光治疗剂量下对B16F10细胞银氨染色呈现黑色素分布图；（a）为阴性对照；（b）为 阳性对照（PTU）；（c）为0.05μM PhA-PDT（0.5J/cm2）；（d）为0.2μM PhA-PDT（0.5J/cm2）；（e）为0.8μM PhA-PDT（0.5J/cm2）；
图5为体内实验豚鼠背部皮肤黑色素沉着情况图；（a）为UVB照光前；（b）为UVB照光后；图（b）中，1 对照区域；2 溶剂对照区域；3 阳性对照PTU区域；4 PhA-PDT治疗区域；
图6为体内实验豚鼠背部正常（无UVB照射）皮肤组织切片银氨染色呈现黑色素分布图；
图7为体内实验豚鼠背部阴性对照（UVB照射）皮肤组织切片银氨染色呈现黑色素分布图；箭头所指棕色颗粒为基底层黑色素；
图8为体内实验豚鼠背部溶剂对照（溶剂、UVB照射）皮肤组织切片银氨染色呈现黑色素分布图；
图9为体内实验豚鼠背部阳性对照（PTU、UVB照射）皮肤组织切片银氨染色呈现黑色素分布图；
图10为体内实验豚鼠背部PhA-PDT治疗（PDT、UVB照射）皮肤组织切片银氨染色呈现黑色素分布图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的材料及试剂，若无特殊说明，均为普通市售产品。
实施例1
PhA的光动力激发
脱镁叶绿酸盐a（PhA）：
光源：红光640-660 nm；光功率为0.04 W/cm2。
实施例2
细胞增殖评价低剂量光动力治疗的细胞毒性：以人角质形成细胞（HaCaT细胞）和小鼠黑色素瘤细胞（B16F10细胞）为研究对象，设计一系列剂量的PhA-PDT治疗方案，通过CCK8细胞毒性试验，测试细胞毒性，确定其安全剂量范围。
具体地，将HaCaT细胞和B16F10细胞以每孔1×105个/mL的细胞密度接种在96孔板中，每孔添加100μL细胞液，并将其置于37℃、5% CO2培养箱中培养24h使细胞贴壁；24小时后HaCaT细胞使用高糖DMEM维持培养基（含2%胎牛血清、1%青链霉素双抗、97%基础DMEM培养基）、B16F10细胞使用RPMI-1640维持培养基（含2%胎牛血清、1%青链霉素双抗、97%基础RPMI-1640培养基）配制的光敏剂PhA溶液替换原培养基，PhA的浓度分别为：0 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.4 μM、0.8 μM、1.6 μM，每个浓度设置3个复孔；不同浓度的PhA 溶液与细胞共培养1h后，取出含有PhA的培养液，加入不含有血清和不含有酚酞的培养液进行不同剂量的红光光照，光照的剂量为0 J/cm2、 0.5 J/cm2、 1 J/cm2、 2 J/cm2。其中以0 μM PhA和0 J/cm2光照孔为阴性对照组。以不含任何细胞的培养组为空白组。光照后，将培养板放入培养箱48h。培养结束后，分别加入10μL CCK8溶液到96孔板的孔中，并将96孔板置于培养箱中培养1 h。培养结束后使用酶标仪测试96孔板每孔中的溶液在450nm处吸光值（OD），并按照如下公式计算细胞活力。
细胞活力 (%) = (ODs- ODb) / (ODc- ODb) × 100 %；
如上述公式所示，ODs、ODb和ODc分别代表样本组、空白组和阴性对照组的吸光值。
细胞活力结果如图1所示，选取PhA 0 - 0.8 μM，红光剂量为0.5J/cm2为之后黑色素生成抑制一系列实验的安全剂量范围。
实施例3
B16F10细胞黑色素生成检测：通过对B16F10细胞上清液中黑色素含量的测定及B16F10细胞内黑色素含量的测定，确定多肽对黑色素生成的影响。
（1）B16F10细胞上清液中黑色素含量测量
在6孔板中，每孔加入细胞密度5×105个/mL的B16F10细胞悬液，于37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入用无血清无酚红RPMI-1640维持培养基配制的不同浓度的PhA溶液，PhA溶液的浓度分别为0 μM、0.05 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.4 μM、0.8 μM，取出含有PhA的培养液加入无血清无酚红的培养液进行红光光照，光照剂量为0 J/cm2或0.5 J/cm2，以0 μM PhA和0 J/cm2红光剂量为阴性对照组（Control）。以无酚红RPMI-1640维持培养基配制的50μM的苯硫脲（PTU）溶液为阳性对照组，每组处理都设置3个重复孔。培养48h后，吸取上清液到新的96孔板，用酶标仪在490nm处测量上清液的吸光值（OD）。
（2）B16F10细胞内黑色素含量测量
按照上述操作吸取上清液后，贴壁的细胞用PBS缓冲液清洗2次，每孔加入100μL1M NaOH溶液，80℃的水浴锅中溶解2小时，设定酶标仪波长为490 nm，检测该波长下溶液的吸光值（OD）。
黑色素能够吸收490nm波长的光，酶标仪所测的吸光度值越高，说明黑色素含量越高。其中黑色素相对含量按照如下公式计算得到：
黑色素含量（%）=OD给药组/OD阴性对照组×100%
式中，OD给药组为PhA-PDT的细胞处理组的平均吸光值；OD阴性对照组为阴性对照组的平均吸光值。
黑色素含量结果如图2所示，分析可知：低剂量下PhA-PDT对B16F10细胞上清液黑色素的抑制情况呈现出浓度依赖性，均能够在一定程度上抑制B16F10细胞黑色素的生成与分泌。
实施例4
B16F10细胞内酪氨酸酶活力检测：
在24孔板中，每孔加入细胞密度1×105个/mL的B16F10细胞悬液，于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入用无酚红RPMI-1640维持培养基配制的不同浓度PhA溶液，PhA溶液的浓度分别为0 μM、0.05 μM、0.1 μM、0.2 μM、0.4 μM、0.8 μM，取出含有PhA的培养液加入无血清无酚红的培养液进行红光光照，光照剂量为0 J/cm2或0.5J/cm2，以0 μM PhA和0 J/cm2红光剂量为阴性对照组（Control）。以无酚红RPMI-1640维持培养基配制的50μM的苯硫脲（PTU）溶液为阳性对照，每个浓度都设置3个重复孔。细胞培养48h后，弃去培养基，PBS缓冲液清洗细胞2次；每孔加200μL 1% TritonX-100，将24孔板置于4℃冰箱30min裂解；将裂解液转移至EP管，12000转离心20min，取100μL上清液于96孔板中；每孔再加50μL浓度为4mM 的L-DOPA，37℃培养箱培养10h；酶标仪490nm处检验吸光值（OD），按照如下公式计算细胞内酪氨酸酶活性。
酪氨酸酶活性（%）=OD给药组/OD阳性对照组×100%；
式中，OD给药组为PhA-PDT的细胞处理组的平均吸光值；OD阴性对照组为阴性对照组的平均吸光值。
酪氨酸酶的相对活性如图3所示，分析可知：低剂量范围下，PhA-PDT可以抑制B16F10细胞内酪氨酸酶的活性。
实施例5
B16F10细胞银氨染色呈现黑色素分布：
在24孔板中，每孔加入细胞密度1×105个/mL的B16F10细胞悬液，于37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，弃去原培养基，加入用无酚红RPMI-1640维持培养基配制的不同浓度PhA溶液，PhA溶液的浓度分别为0 μM、0.05 μM、0.2 μM、0.8 μM，取出含有PhA的培养液加入无血清无酚红的培养液进行红光光照，光照剂量为0 J/cm2或0.5 J/cm2，以0 μM PhA和0 J/cm2红光剂量为阴性对照组（Control）。以无酚红RPMI-1640维持培养基配制的50μM的PTU溶液为阳性对照，每个浓度都设置3个重复孔。将9ml蒸馏水与3ml 10%硝酸银溶液混合完全。随后小心地逐滴加入浓缩氢氧化铵（25-30%），每滴加入后轻轻旋转。混合物先变为深棕色，然后逐渐透明。在此过程中，混合物会出现一层细小的沉淀物，当沉淀完全溶解后即可使用。将刚混合好的氨银溶液放入58-60℃的水浴槽中，使其平衡。每孔细胞用1ml 4%中性多聚甲醛固定15min，用蒸馏水洗涤3次。每个培养皿中加入2mL Fontana氨银溶液（事先平衡温度），在55℃的水浴中放置30分钟，用蒸馏水清洗细胞3次。将切片置于500ul 0.2%氯化金溶液中孵育30秒，用蒸馏水清洗细胞3次。室温将其浸泡在2mL 5%硫代硫酸钠中1-2min，自来水冲洗2min，用蒸馏水再次冲洗细胞2次。置于500ul核快红溶液中孵育5分钟，自来水冲洗2min，用蒸馏水再次冲洗细胞2次。无水乙醇冲洗3次。使用封片剂封片后倒置显微镜下观察。如图4，（a）为阴性对照；（b）为 阳性对照（PTU）；（c）为0.05μM PhA-PDT（0.5J/cm2）；（d）为0.2μM PhA-PDT（0.5J/cm2）；（e）为0.8μM PhA-PDT（0.5J/cm2）；从图中可以看出PhA-PDT治疗能够改善B16F10细胞内黑色素颗粒含量。从图4可以看出，红光照射后的空白组B16F10细胞内黑色素颗粒黑色较深，含量较高；加入PTU的阳性药对照组B16F10细胞内黑色素颗粒颜色明显变浅，含量降低；0.05 μM PhA-PDT的治疗组与阴性对照组相比，B16F10细胞内黑色素颗粒颜色变浅，含量降低；0.2 μM、0.8 μM PhA-PDT治疗组与0.05 μM PhA-PDT的治疗组相比，B16F10细胞内黑色素颗粒颜色更浅，含量更低，并且随着PhA浓度的升高，B16F10细胞内黑色素颗粒颜色越浅，含量越低。
实施例6
偶联多肽对体内豚鼠色沉模型的改善：
（1）建立紫外线照射诱导色素沉着的豚鼠模型
选择健康的雌性未怀孕花色豚鼠（3只），清洁级。豚鼠使用刮刀及脱毛膏使豚鼠背部皮肤充分暴露。随后用亚甲基蓝在背部分区。用紫外线光疗仪（徐州市科诺医学设备有限责任公司）照射豚鼠裸露的背部皮肤，每次照射前背部实验区域皮肤剃毛，调整焦距，使用紫外线光疗仪照射，照射剂量为900mJ/cm2，2mW/ cm2每3天照射1次，连续照射18天每只豚鼠裸露的背部皮肤，照射总剂量为5400 J/cm2，成功建立紫外线照射诱导色素沉着的豚鼠模型。
（2）光动力治疗准备
使用PBS缓冲液配制浓度为0.4 μM的PhA溶液；红光光照剂量为0.5 J/cm2。
（3）分组治疗
于造模成功后立即给予治疗，每3天PhA-PDT治疗1次，连续治疗18天。除PhA-PDT光动力治疗组外，还设置了阴性对照区域：只UVB光照，不涂PBS缓冲液，不用任何药物；溶剂对照区域：UVB光照的同时涂抹PBS缓冲液，不加任何药物；阳性对照组：UVB光照的同时涂抹PBS缓冲液及PTU。
（4）黑色素沉着变化观察和标本切取
取材前通过拍摄豚鼠外观照片观察豚鼠背部色素沉着变化情况，然后取豚鼠背部皮肤组织标本放入4%多聚甲醛溶液中固定。其中4%多聚甲醛溶液中固定的豚鼠皮肤组织行黑色素颗粒Fontana-Masson法染色。
经过治疗后，豚鼠背部皮肤组织黑色素沉着情况如图5所示。分析可知：（a）为UVB照光前，豚鼠裸露的背部皮肤红润白皙，（b）为UVB照光后，皮肤明显变黑，其中，1号区域为阴性对照区域，2号区域为溶剂对照区域，3号区域为阳性对照区域，4号区域为PhA-PDT治疗区域。治疗后取下1，2，3，4号区域内皮肤组织的同时，取相同大小且未接受UVB光照处理的皮肤组织作为正常组进行黑色素颗粒染色，图6-图10结果说明小剂量PhA-PDT治疗对豚鼠UVB色沉模型具有阳性效果，能够改善豚鼠背部表皮组织黑色素沉着情况。
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种光敏剂脱镁叶绿酸盐a在制备预防和/或治疗酪氨酸酶相关疾病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，预防和/或治疗酪氨酸酶相关疾病的药物为酪氨酸酶抑制剂的药物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物为抑制黑色素瘤细胞内酪氨酸酶的药物。
4.一种光敏剂脱镁叶绿酸盐a在制备护肤品或化妆品方面的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，护肤品或化妆品为抑制酪氨酸酶、美白、抗氧化或抗衰老的护肤品或化妆品。
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