CN117074581A - 一种同时检测6种免疫抑制剂浓度的血样前处理方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种同时检测6种免疫抑制剂浓度的血样前处理方法，所述血样前处理方法包括：将待处理血样、内标物和蛋白沉淀剂混合并取清液进行稀释，得到待测样品；其中，所述6种免疫抑制剂为硫唑嘌呤、6‑巯基嘌呤、6‑甲基巯基嘌呤、6‑硫鸟嘌呤、6‑硫鸟嘌呤核苷和咪唑立宾。本公开提供的样本前处理仅需50μL血清，节约成本同时简化前处理步骤；本公开提供的血样前处理方法简单快捷，能够在尽可能短的时间内完成血样的前处理，便于后续的检测。

Description

一种同时检测6种免疫抑制剂浓度的血样前处理方法

技术领域

本公开涉及血药检测技术领域，尤其涉及一种同时检测6种免疫抑制剂浓度的血样前处理方法。

背景技术

目前测定血液中硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲基巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷、咪唑立宾等免疫抑制剂的含量通常可以采用高效液相色谱质谱联用法，但是并没有同时检测上述物质的方法，同时，已被报道的文献方法大多存在着样品量需求较大，标准曲线前处理需添加基质、单物质检测等问题，上述问题会增加检测难度降低检测效率，尚不适于大通量的样本检测。

而对于血药浓度检测，在检测前，需要先对血液或者血浆/血清样品进行样品前处理，目前，常用的血液样品前处理的方法主要有：有机溶剂提取法、固相萃取法和二者联用的方法。但是若需要同时检测血液中多种药物浓度时，由于不同样品之间的极性相差较大，可能无法实现多种药物在同一条件下进行样品前处理，进而无法满足同时检测多种药物浓度的要求。

因此，需要提供一种能够同时实现多种免疫抑制剂浓度检测的血样前处理方法，以备后续的样品检测。

发明内容

为了解决上述技术问题，本公开提供了一种同时检测6种免疫抑制剂浓度的血样前处理方法。

第一方面，本公开提供了一种同时检测6种免疫抑制剂浓度的血样前处理方法，所述血样前处理方法包括：

将待处理血样、内标物和蛋白沉淀剂混合并取清液进行稀释，得到待测样品；

其中，所述6种免疫抑制剂为硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲基巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷和咪唑立宾。

相比于目前现有的前处理工艺复杂，并且不能同时处理6种免疫抑制剂而言，本公开提供的血样前处理方法仅是利用简单的蛋白沉淀剂进行处理，后续再利用稀释剂进行稀释，即可完成整个血样前处理过程，简单快捷，并且能够极大程度的降低基质效应和溶剂效应。

本公开提供的血样前处理方法能够实现6种免疫抑制剂浓度的待测血样的同时处理，最后检测能够一针出6种免疫抑制剂的检测结果，且分析时间短，能够极大程度的提高检测效率并且降低了血样前处理的难度，因此，本公开提供的血样前处理方法能够适用于高通量样品的前处理。

本公开提供的血样前处理方法得到的待测样品能够利用液相色谱或者液相色谱-质谱联用的方法进行后续的检测，本公开并不对后续的检测方法进行任何限定，任何能够实现检测的方法均能够应用。

作为本公开的一种优选技术方案，所述稀释使用的溶剂为纯水。

作为本公开的一种优选技术方案，所述清液与纯水的体积比为1:(1-5)，例如1:2、1:3、1:4等。

若稀释倍数较小，则无法完全避免基质效应和溶剂效应，若稀释过量，则会导致目标物的检测信号较弱。

作为本公开的一种优选技术方案，所述蛋白沉淀剂选自甲醇和/或乙腈。

作为本公开的一种优选技术方案，所述待处理血样与所述蛋白沉淀剂的体积比为1:(5-10)，例如1:6、1:7、1:8、1:9等。

在本公开中，待处理血样和蛋白沉淀剂的体积比在此范围内能够保证前处理的处理效果，能够尽可能的去除杂质，使样品更加稳定；若蛋白沉淀剂的添加量过低，则有可能导致杂质沉淀不完全，若蛋白沉淀剂含量过高，则会导致待处理血样被过多稀释，即待测样品中的待测物浓度过低，进而导致后续检测的困难。

作为本公开的一种优选技术方案，所述6种免疫抑制剂的内标物分别为硫唑嘌呤-d3、6-甲基巯基嘌呤-d3、6-巯基嘌呤-13C,15N2。

通过本公开限定的血样前处理条件，能够使得在仅使用3种内标物的前提下完成样品检测，节约了内标成本，且简化了前处理难度。

在本公开中，硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷和咪唑立宾对应的内标为硫唑嘌呤-d3；6-甲基巯基嘌呤和6-硫鸟嘌呤对应的内标为6-甲基巯基嘌呤-d3；6-巯基嘌呤对应的内标为6-巯基嘌呤-13C,15N2。

作为本公开的一种优选技术方案，在所述内标工作液中，硫唑嘌呤-d3的浓度为3.0μg/mL，6-甲基巯基嘌呤-d3的浓度为22.5μg/mL，6-巯基嘌呤-13C,15N2的浓度为3.0μg/mL。

作为本公开的一种优选技术方案，所述待处理血样为血浆或血清。

作为本公开的一种优选技术方案，所述血样前处理方法包括：

将待处理血样、内标工作液和蛋白沉淀剂混合，离心取上清液，然后利用纯水对上清液进行稀释，得到所述待测样品；

其中，所述内标工作液为含有所述6种免疫抑制剂的内标物的溶液。

作为本公开的一种优选技术方案，所述待处理血样和所述内标工作液的体积比为(5-10):1，例如6:1、7:1、8:1、9:1等。

作为本公开的一种优选技术方案，所述内标工作液利用稀释剂由内标母液稀释得到，所述内标母液是利用溶剂分别溶解所述6种免疫抑制剂各自的内标物标准品得到。

内标工作液的制备方法为目前本领域常用的制备方法，因此，本公开不进行过多的内标工作液的限定，任何能够可以得到所述内标工作液的制备方法均可用于被公开。

作为本公开的一种优选技术方案，所述稀释剂为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液的浓度为60-80％，所述60-80％可以为65％、70％、75％、80％等。

本公开实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

(1)本公开提供的样本前处理仅需50μL血清，节约成本同时简化前处理步骤；

(2)本公开提供的血样前处理方法简单快捷，能够在尽可能短的时间内完成血样的前处理，便于后续的检测。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。

为了更清楚地说明本公开实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本公开实施例3所述标准溶液的色谱图；

图2为本公开实施例3所述待进样样品的色谱图；

图3为本公开对比例1所述标准溶液的色谱图；

图4为本公开对比例3所述标准溶液的色谱图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本公开的上述目的、特征和优点，下面将对本公开的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本公开，但本公开还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本公开的一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

本实施例提供了一种标准工作液的制备方法。

(1)配制6种免疫抑制剂标准品母液

天平精密称量6-硫鸟嘌呤(浓度95.00％)标准品5.87mg于10mL棕色玻璃瓶中，加入2mL纯水、900μL甲醇及100μL 1mol/L NaOH，溶解、混匀得到浓度为1859μg/mL的母液；

天平精密称量硫唑嘌呤(浓度99.30％)标准品1.974mg于2mL冻存管中，加入1mL纯水及10μL 1mol/L NaOH，溶解、混匀得到浓度为1941μg/mL的母液；

天平精密称量6-巯基嘌呤(浓度98.00％)标准品4.038mg于2mL冻存管中，加入1.5mL纯水及30μL 1mol/L NaOH，再加入100μL DMSO，溶解、混匀得到浓度为2428μg/mL的母液；

天平精密称量6-硫鸟嘌呤核苷(浓度96.00％)标准品1.38mg于2mL冻存管中，加入1mL DMSO，溶解、混匀得到浓度为1250μg/mL的母液；

天平精密称量6-甲基巯基嘌呤(浓度98.00％)标准品1.382mg于2mL冻存管中，加入1.5mL甲醇水溶液(甲醇:水＝1:1)及20μL 1mol/L NaOH，溶解、混匀得到浓度为1328μg/mL的母液；

天平精密称量咪唑立宾(浓度98.00％)标准品1.202mg于2mL冻存管中，加入1mL甲醇及200μL纯水，溶解、混匀得到浓度为982μg/mL的母液。

(2)取上述6种待测免疫抑制剂的母液，利用甲醇:水＝7:3的稀释剂配制标准中间液，标准中间液混合，并再次利用稀释剂(甲醇:水＝7:3)进行稀释得到具有7种级别浓度的标准工作液，具体见表1：

表1

实施例2

本实施例提供了一种内标工作液的制备方法。

(1)配制内标储备液

6-甲基巯基嘌呤-d3(浓度98.00％)标准品规格为2.50mg，加入1.98mL甲醇:水＝1:1溶液及20μL 1mol/L NaOH，溶解、混匀得到浓度为1225μg/mL的母液；

硫唑嘌呤-d3(浓度97.00％)标准品规格为1.00mg，加入1mL甲醇:水＝1:1溶液，溶解、混匀得到浓度为970μg/mL的母液；

6-巯基嘌呤-13C,15N2(浓度96.00％)标准品1.00mg，加入0.894mL甲醇:水＝1:1溶液及10μL 1mol/L NaOH，溶解、混匀得到浓度为860μg/mL的母液。

(2)将母液混合，然后利用甲醇:水＝7:3的稀释剂稀释，得到内标工作液，具体见表2：

表2

内标	内标工作液浓度(μg/mL)
		6-甲基巯基嘌呤-d3	22.5
硫唑嘌呤-d3	3.0
		6-巯基嘌呤-13C,15N2	3.0

实施例3

本实施例提供了一种样本处理方法。

(1)配制标准溶液

a.内标工作液和标准工作液在室温下放置30min，以平衡至室温；

b.取8支1.5mL离心管，分别编号为L7-L1、空白，用微量移液器(量程：0.5-10μL)吸取5μL内标工作液加入到编号L7-L1的离心管中，空白的离心管中加入5μL甲醇:水＝7:3的稀释剂；

c.用微量移液器(量程：0.5-10μL)吸取各标准品工作液5μL，加入相应编号的离心管中，编号为空白的离心管中加入5μL稀释剂(甲醇:水＝7:3)，准确吸取45μL纯水和300μL甲醇到上述各离心管中，2000r/min混匀1min；

d.混匀后取上清液50μL至1.5mL塑料离心管中，加入150μL纯水，2000r/min涡旋混匀1min；

e.取微量移液器(量程：10-100μL)，吸取混合液100μL至96孔板中，待进样。

(2)待测血样前处理

a.样品采集

样本类型：多种血浆均可；

容器和添加剂类型：多种容器均可；

采集与处理：静脉采血，3500r/min离心10min，及时分离血浆作为待处理血样；

保存方法：避光，冷藏；

b.样品处理

移液枪移取5μL内标工作液至1.5mL塑料离心管中，加入50μL待处理血样和300μL甲醇，2000r/min涡旋混匀5min，然后14000r/min离心10min，取上清液50μL至1.5mL塑料离心管中，加入150μL纯水混合，2000r/min涡旋混匀1min，作为待进样样品。

实施例4

本实施例提供了一种样本处理方法。

与实施例3的区别在于，在本实施例的步骤(2)-b中：待测血样前处理中的蛋白沉淀剂为乙腈，对应性的替换标准溶液中使用的蛋白沉淀剂(步骤(1)-c)。

实施例5-6

本实施例提供了一种样本处理方法。

与实施例3的区别在于，在本实施例的步骤(2)-b中：上清液和纯水的稀释倍数为1倍(实施例5)、5倍(实施例6)，对应性的改变标准溶液中的稀释倍数。

对比例1

本对比例提供了一种样本处理方法。

与实施例3的区别在于，在本对比例的步骤(2)-b中：待测血样前处理中的蛋白沉淀剂为高氯酸，对应性的替换标准溶液中使用的蛋白沉淀剂(步骤(1)-c)。

对比例2

本对比例提供了一种样本处理方法。

与实施例3的区别在于，在本对比例中，的步骤(2)-b不包括稀释的步骤，为：移液枪移取5μL内标工作液至1.5mL塑料离心管中，加入50μL待处理血样和300μL甲醇，2000r/min涡旋混匀5min，然后14000r/min离心10min，取上清液作为待进样样品，对应性的省略标准溶液稀释的步骤(省略步骤(1)-d)。

对比例3

本对比例提供了一种样本处理方法。

与实施例3的区别在于，在本对比例的步骤(2)-b中：上清液和纯水的稀释倍数为7倍，对应性的改变标准溶液中的稀释倍数。

性能分析1

(1)参照实施例3-6和对比例1-3的提供的血样前处理方法进行前处理，并利用如下检测方法进行检测：

使用高效液相色谱-质谱联用仪对标准溶液进行检测，分别建立6种免疫抑制剂的标准曲线；

在建立标准曲线时，以目标物的峰面积和其对应内标峰面积的比值为Y，以目标物的浓度和其对应内标浓度的比值为X；

使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样品进行检测，并利用建立的标准曲线确定待测样品中6种免疫抑制剂的浓度。

检测参数为：

A、检测仪器为AB SCIEX Jasper HPLC MS TRIPLE QUAD 4500MD；

色谱分析所使用的色谱柱为Waters cortecs T3，T3 3.0×100mm，2.7μm；

流动相：A相为含0.5％甲酸的10mmol/L甲酸铵水溶液，B相为甲醇；

分析色谱柱采用梯度洗脱方式，流速为0.4mL/min，柱温为40℃，进样量为1μL；分析时间5.0min，梯度洗脱条件见表3：

表3

对于质谱条件，采用AB SCIEX 4500MD检测器，电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，多反应监测(MRM)，具体参数见表4，离子对参数见表5。

表4

表5

检测结果如下：

a、实施例3提供的标准溶液中硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲基巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷和咪唑立宾的色谱图见图1，血浆样品中硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲基巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷和咪唑立宾的色谱图见图2，在图1和图2中，从左往右依次为咪唑立宾、6-硫鸟嘌呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷、硫唑嘌呤和6-甲基巯基嘌呤的色谱峰。

由图可知，本公开提供的血样前处理方法结合液相色谱-质谱检测条件，能够准确的分离并检测6种免疫抑制剂的含量。由图可知，各免疫抑制剂的保留时间如下表6所示：

表6

免疫抑制剂	保留时间/min
		硫唑嘌呤	3.05
6-巯基嘌呤	1.98
		6-甲基巯基嘌呤	3.23
6-硫鸟嘌呤	1.76
		6-硫鸟嘌呤核苷	2.31
咪唑立宾	1.27
		6-甲基巯基嘌呤-d3	3.23
硫唑嘌呤-d3	3.05
		6-巯基嘌呤-13C,15N2	1.98

b、对实施例3-6提供的标准溶液的检测色谱图与实施例3和4提供的色谱图类似，因此可知，本公开提供的检测条件能够满足检测要求；

c、对比例1对于各目标待测物的提取率较低，后续液相色谱测试信号低，色谱图见图3(标准溶液)，由实施例3、7和对比例1的对比可知，利用酸类沉淀蛋白各物质提取差，信号低不能满足定量要求；

d、由实施例3和对比例2的对比可知，采用对比例2方法进行前处理，咪唑立宾的溶剂效应强，峰型差；且咪唑立宾、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷基质效应强，准确度不合格；

e、由实施例3和对比例3的对比可知，采用对比例3方法进行前处理，咪唑立宾的信号低，检测限高，达不到定量要求，标准溶液的色谱图见图4；且咪唑立宾、6-硫鸟嘌呤核苷基质效应改变，与内标基质效应不一致导致准确度不合格。

(2)参照(1)提供的检测方法，对标准溶液建立的标准曲线等进行线性分析，结果见表7：

表7

由表7可知，利用本公开提供的血样前处理方法，同时结合检测方法，检测范围广，且线性相关性好。实施例4-6的线性范围与实施例3的线性范围类似。

同时得到的检测限和定量限结果见表8：

表8

由表7-8可知，本公开提供的前处理方法同时配合检测方法，检测限和定量限等各项指标均符合要求。

需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种同时检测6种免疫抑制剂浓度的血样前处理方法，其特征在于，所述血样前处理方法包括：

将待处理血样、内标物和蛋白沉淀剂混合并取清液进行稀释，得到待测样品；

其中，所述6种免疫抑制剂为硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲基巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、6-硫鸟嘌呤核苷和咪唑立宾。

2.根据权利要求1所述的血样前处理方法，其特征在于，所述稀释使用的溶剂为纯水。

3.根据权利要求2所述的血样前处理方法，其特征在于，所述清液与纯水的体积比为1:(1-5)。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的血样前处理方法，其特征在于，所述蛋白沉淀剂选自甲醇和/或乙腈。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的血样前处理方法，其特征在于，所述待处理血样与所述蛋白沉淀剂的体积比为1:(5-10)。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的血样前处理方法，其特征在于，所述6种免疫抑制剂的内标物分别为硫唑嘌呤-d3、6-甲基巯基嘌呤-d3、6-巯基嘌呤-13C,15N2；

和/或，所述待处理血样为血浆或血清。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的血样前处理方法，其特征在于，所述血样前处理方法包括：

将待处理血样、内标工作液和蛋白沉淀剂混合，离心取上清液，然后利用纯水对上清液进行稀释，得到所述待测样品；

其中，所述内标工作液为含有所述6种免疫抑制剂的内标物的溶液。

8.根据权利要求7所述的血样前处理方法，其特征在于，所述待处理血样和所述内标工作液的体积比为(5-10):1。

9.根据权利要求7或8所述的血样前处理方法，其特征在于，所述内标工作液利用稀释剂由内标母液稀释得到，所述内标母液是利用溶剂分别溶解所述6种免疫抑制剂各自的内标物标准品得到。

10.根据权利要求9所述的血样前处理方法，其特征在于，所述稀释剂为甲醇水溶液，所述甲醇水溶液的浓度为60-80％。