CN117064885A - 荜茇酰胺在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种荜茇酰胺在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用，涉及生物医药技术领域。本发明通过小鼠动物模型实验研究发现：荜茇酰胺可改善CVB3导致的小鼠病毒性心肌炎心功能损伤，对心脏组织的病变有良好的保护作用。本发明还明确荜茇酰胺能够抑制CVB3导致的细胞焦亡现象，抑制炎症反应的发展，为病毒性心肌炎的治疗提供新的药物研发途径和药物作用靶点，具有十分重要的药用价值。

Description

荜茇酰胺在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药的技术领域，具体涉及一种荜茇酰胺在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。
背景技术
病毒性心肌炎(Viral Myocarditis，VMC)指病毒侵染心肌细胞后，导致心肌局限性或弥散性炎性病变，造成心肌损伤的心血管疾病。流行病学研究表明，每百万人中就有10到22人患有病毒性心肌炎，尤其是儿童和青年。病毒性心肌炎可引起细胞坏死，心肌纤维化，射血分数降低和室性心律失常。病毒性心肌炎可能是急性或者或爆发性发作，患者表现出心悸等症状。在临床阶段和动物模型数据中被广泛认可的病毒性心肌炎的发病机制分为为急性感染期、亚急性免疫期、恢复期或慢性心肌病期三个阶段。导致病毒性心肌炎的主要病原体是柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3)，其感染机体的发病机制尚未弄清，缺乏治疗CVB3所致病毒性心肌炎有效药物。查阅文献发现，天然药物治疗病毒感染在很早被使用，众多天然药物的单体成分对治疗病毒性心肌炎有良好的作用。例如，石哲玮等研究了汉黄芩苷对柯萨奇B3病毒诱导的病毒性心肌炎小鼠炎症反应的影响，结果表明汉黄芩苷使心肌组织中的病毒滴度降低，改善了小鼠的心肌组织结构，炎症因子IL-6、IL-1β的表达通过调控AKT/NF-κB通路而降低。
荜茇酰胺(Piperlongumine，PL)又名荜茇明碱，是生物碱类化合物，最
初分离自胡椒科植物荜茇(Piperlongum Linn)的根，呈白色或米黄色的固体结晶，在自然界中主要以反式结构存在，是其活性形式。随着研究的逐渐深入，发现荜茇酰胺具有抗肿瘤、抗炎、抗焦虑等多种药理作用。荜茇酰胺在抗肿瘤方面显示强大的药理活性，它能通过miR-34b-3p/TGFBR1途径抑制非小细胞肺癌细胞的生长。在人前列腺癌细胞系中，荜茇酰胺可影响黏着斑激酶FAK的表达与分布，显著降低细胞对细胞外间质的黏附，并引起强烈的前列腺癌细胞DNA损伤反应，抑制人前列腺癌细胞的迁移、增殖、侵袭。现有研究表明，荜茇酰胺通过增加ERK磷酸化诱导人结肠癌细胞系HT-29细胞死亡。荜茇酰胺抗炎方向有报道，Huang等发现荜茇酰胺可通过下调促炎细胞因子环氧合酶-2和IL-6及上皮-间充质转化相关因子β-catenin和蜗牛蛋白的表达，抑制DSS诱导的小鼠结肠炎的炎症反应。在脂多糖诱导的急性肺损伤模型中，荜茇酰胺直接与MD2结合，抑制MD2/TLR4复合物的形成，减轻脂多糖诱导的小鼠肺损伤、炎症细胞浸润和炎症反应。然而，目前尚无关于荜茇酰胺对CVB3所致病毒性心肌炎的相关研究和报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种荜茇酰胺在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用，荜茇酰胺能够改善CVB3导致的小鼠病毒性心肌炎心功能损伤，对心脏组织的病变有良好的保护作用，荜茇酰胺还能够抑制CVB3导致的细胞焦亡现象，抑制炎症反应的发展。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种荜茇酰胺在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。
优选地，所述病毒性心肌炎是由柯萨奇病毒B3引起。
优选地，所述荜茇酰胺能够改善病毒性心肌炎引起的心功能损伤。
优选地，所述荜茇酰胺能够抑制心肌细胞焦亡。
优选地，所述荜茇酰胺能够降低炎症因子水平。
更优选地，所述炎症因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1。
本发明还提供了一种治疗病毒性心肌炎的药物，所述药物的有效成分包括荜茇酰胺，以及药学上可接受的辅料。
优选地，所述荜茇酰胺的给药浓度为2.5～20μM。
优选地，所述辅料包括稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
更优选地，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、汤剂、口服液、注射剂或栓剂。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
(1)本发明构建了CVB3的心肌炎实验小鼠模型，从小鼠的活动状态、毛发、体重初步观察到CVB3诱导的心肌炎发展进程，以及经过荜茇酰胺干预后有较好的恢复情况，提高了心肌炎小鼠左心室缩短分数和每分搏出量，有利于心脏功能的恢复。对小鼠心脏组织进行HE染色，发现荜茇酰胺治疗后的心肌炎小鼠的心脏斑块明显减少，HE染色结果显示治疗后小鼠心脏组织炎性浸润面积降低、细胞纹路逐渐清晰。试验结果证实荜茇酰胺对心肌炎小鼠的炎症反应有抑制作用。本发明还进行了Western Blot实验检测焦亡蛋白NLRP3、GSDMD/GSDMD-N、Pro-caspase-1/caspase、ASC、IL-1β相对表达量，结果表明荜茇酰胺降低了这些焦亡蛋白的升高。说明荜茇酰胺可能是通过抑制CVB3诱导的心肌细胞焦亡而减少下游炎症因子IL-1β的活化与释放。荜茇酰胺能缓解CVB3诱导的病毒性心肌炎炎症反应，并通过抑制心肌细胞焦亡发挥治疗作用。
(2)本发明探究了荜茇酰胺抑制焦亡的相关通路，通过网络药理学相关手段与文献查询筛选出P13K、MEK、JNK、JAK/STAT、NF-κB、p38六个可能的通路，利用相关通路抑制剂进行处理，发现NF-κB的抑制剂干预后，NLRP3炎症小体表达显著降低，利用NF-κB抑制剂和荜茇酰胺共同处理发现焦亡相关蛋白NLRP3等蛋白表达均显著降低，且荜茇酰胺可呈剂量依赖性的抑制NF-κB通路中的关键分子的磷酸化，该实验结果表明荜茇酰胺可能通过NF-κB通路抑制CVB3诱导的细胞焦亡。本发明探究了荜茇酰胺(PL)对CVB3诱导的小鼠病毒性心肌炎(VMC)的作用，明确其在病毒感染后诱发的心肌细胞焦亡中所发挥的作用及其分子机制，为病毒性心肌炎的治疗提供思路与依据。
附图说明
图1为荜茇酰胺对HL-1的细胞毒性作用；
图2为荜茇酰胺抑制CVB3诱导的HL-1细胞炎症反应，其中A代表TNF-α的相对表达量，B代表IL-1β的相对表达量，C代表IL-6的相对表达量，D代表MCP-1的相对表达量；
图3为荜茇酰胺抑制CVB3诱导的HL-1细胞焦亡反应，其中A代表焦亡相关蛋白GSDMD/GSDMD-N、pro-caspase-1/caspase-1、ASC、IL-1β、NLRP3的Western Blot检测结果，B-H依次代表使用Imag J软件对NLRP3、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β、pro-caspase-1、caspase-1和ASC蛋白条带灰度值扫描和GraphPad Prism 8.0软件统计分析结果；
图4为荜茇酰胺改善病毒性心肌炎小鼠状态结果；
图5为荜茇酰胺对病毒性心肌炎小鼠心脏功能的保护作用，其中A代表超声心动图技术检测各分组小鼠心脏功能，B代表利用GraphPad Prism 8.0软件对超声心动图数据进行统计分析，绘制心脏每分输出量(CO)柱状图；
图6为各处理组小鼠心脏外观图；
图7为各处理组小鼠心脏组织切片HE染色结果；
图8为荜茇酰胺对病毒性心肌炎小鼠心肌组织中炎症因子的抑制作用，其中A代表TNF-α的相对表达量，B代表IL-1β的相对表达量，C代表IL-6的相对表达量，D代表MCP-1的相对表达量；
图9为荜茇酰胺抑制病毒性心肌炎小鼠的心肌组织的焦亡，其中A为心肌组织中焦亡相关蛋白GSDMD/GSDMD-N、pro-caspase-1/caspase-1、ASC、IL-1β、NLRP3的Western Blot检测结果，B～H依次为使用Imag J软件对ASC、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β、pro-caspase-1、caspase-1和NLRP3蛋白条带灰度值扫描和GraphPad Prism 8.0软件统计分析结果；
图10为荜茇酰胺靶点与病毒性心肌炎靶点的可视化分析交集靶点；
图11为数据库筛选后荜茇酰胺靶点与病毒性心肌炎靶点的Veen图；
图12为KEGG通路富集分析气泡图；
图13为STRING数据库分析交集靶点信息；
图14为Cytoscape3.7.2软件进行可视化分析筛选的核心靶点；
图15为荜茇酰胺治疗细胞焦亡通路的筛选，其中A为不同处理试剂下NLRP3蛋白的Western Blot检测结果，B为使用Imag J软件对NLRP3蛋白条带灰度值扫描和GraphPadPrism 8.0软件统计分析结果；
图16为NF-κB通路抑制剂MG-132与荜茇酰胺作用后细胞中焦亡蛋白的变化，其中A为焦亡相关蛋白的Western Blot检测结果，B-H为焦亡相关蛋白的相对表达量；
图17荜茇酰胺抑制NF-κB通路蛋白的作用。其中A为通路相关蛋白的Western Blot检测结果，B-E为通路相关蛋白的相对表达量。
具体实施方式
本发明提供了一种荜茇酰胺在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。在本发明中，对所述荜茇酰胺的来源不作特殊限定，所述可以通过植物中提取，也可通过化学合成。在本发明的具体实施例中，所述荜茇酰胺由武汉科技大学药化实验室合成。
在本发明中，所述病毒性心肌炎是由柯萨奇病毒B3引起。
在本发明中，所述荜茇酰胺能够改善病毒性心肌炎引起的心功能损伤。本发明采用心脏超声心动图评估药物治疗后小鼠心脏功能恢复情况，与对照组相比，病毒组的心脏每分输出量(CO)有明显的下降，其余各组无显著变化；与病毒组相比，CVB3+2.5mg/kg PL、CVB3+5mg/kg PL、CVB3+10mg/kg PL组和CVB3+DEX组均有明显升高；且给药治疗组之间无明显差异。说明荜茇酰胺可改善CVB3导致的小鼠病毒性心肌炎心功能损伤。
在本发明中，所述荜茇酰胺能够抑制心肌细胞焦亡。CVB3感染后会导致组织细胞焦亡，释放大量炎性因子。本发明利用Wsetern Blot手段检测焦亡相关蛋白NLRP3、GSDMD/GSDMD-N、Pro-caspase-1/caspase、ASC、IL-1β表达水平，结果显示，CVB3感染小鼠后焦亡蛋白水平上升，荜茇酰胺能显著降低焦亡水平。
在本发明中，所述荜茇酰胺能够降低炎症因子水平。本发明对CVB3引起的HL-1细胞炎症反应的抑制作用进行RT-qPCR实验检测，结果显示，对照组和10μM的荜茇酰胺组没有显著差异，感染CVB3病毒后，细胞炎症水平上升，荜茇酰胺的治疗降低了细胞炎症水平，并随剂量的增加炎症抑制效果增强，且地塞米松组治疗效果不及高剂量荜茇酰胺组。说明荜茇酰胺呈现剂量依赖性的抑制CVB3引起的细胞炎症反应。
在本发明中，所述炎症因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1。
本发明还提供了一种治疗病毒性心肌炎的药物，所述药物的有效成分包括荜茇酰胺，以及药学上可接受的辅料。对于本发明治疗病毒性心肌炎药物的给药时间和给药次数需要根据病情的具体诊断结果而定，这在本领域技术人员掌握的技术范围之内。
在本发明中，所述荜茇酰胺的给药浓度优选为2.5～20μM；更优选为3～15μM。
在本发明中，所述辅料包括稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
在本发明中，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、汤剂、口服液、注射剂或栓剂。根据动物病情以及用药部位可以将荜茇酰胺制备成合适的药物制剂以方便用药。在本发明中，作为一种可以实施的方式，当荜茇酰胺制备成注射液时，药物可接受的载体可以为注射用水、氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸、甘油、乙醇、丙二醇等；上述荜茇酰胺注射液还可以根据药物的性质加入适宜的附加剂，如渗透压调节剂、pH值调节剂、增溶剂、治疗氧剂、抑菌剂、乳化剂、助悬剂等，其中所述增溶剂为聚乙二醇400、吐温-80中的任意一种或两种。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
荜茇酰胺浓度对HL-1细胞的影响
将HL-1细胞接种于96孔板中(每孔1×104个细胞)，孵育24h后，将细胞暴露于新鲜制备的2％胎牛血清PL溶液中，梯度浓度为0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80、160μM培养24h。去除培养基，每孔加入10μL CCK-8溶液和100μL 2％FBS，在37℃的培养箱中继续培养4h。酶标仪检测细胞在450nm波长处的吸光度值，计算PL对细胞活力的影响:细胞活力(％)＝(处理组A450值-空白组A450值)/(对照组A450值-空白组A450值)×100％。
根据图1结果显示，荜茇酰胺的浓度在低于20μM时，对HL-1细胞基本没有毒性，不影响细胞的正常生长；在高于20μM时，细胞死亡逐渐增加，至40μM时全部死亡。提示荜茇酰胺的给药浓度在20μM以下时，对HL-1细胞的生存基本无影响，后续实验中依据此实验结果，采用2.5、5、10μM的剂量进行细胞实验。
实施例2
荜茇酰胺对CVB3诱导的HL-1细胞炎症的作用
当HL-1细胞密度达到70％～80％时，用1mL 0.25％胰酶消化细胞，并接种在6孔板(每孔1×105细胞)中经相应处理后取样进行Western blot和RT-qPCR实验。24h后，HL-1细胞在2％FBS条件下用1×104TCID50的CVB3处理2h，建立细胞VMC模型。对照组用2％FBS培养基处理2h。感染后去除原液加入含2.5μM、5μM、10μM荜茇酰胺或1μM地塞米松(DEX)的2％FBS培养基处理VMC模型细胞24h，收样。
根据图2结果显示，对照组和10μM的荜茇酰胺组中炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α和炎性趋化因子MCP-1没有显著差异，感染CVB3病毒后，细胞炎症水平上升，荜茇酰胺的治疗降低了细胞炎症水平，并随剂量的增加炎症抑制效果增强，且地塞米松组治疗效果不及高剂量荜茇酰胺组。说明荜茇酰胺呈现剂量依赖性的抑制CVB3引起的细胞炎症反应。图2中结果表示为Mean+SEM，NS代表与control组相比无统计学差异，***(P<0.001)代表与control组相比有统计学意义，#(P<0.05)、##(P<0.01)、###(P<0.001)代表与CVB3组相比有统计学意义。
实施例3
荜茇酰胺对CVB3诱导的HL-1细胞焦亡的作用
设置control组、CVB3组、CVB3+DMSO组、CVB3+PL组，于6孔板中进行不同处理收样。其中，CVB3组用1×104TCID50 CVB3处理；CVB3+DMSO组用1×104TCID50 CVB3处理2h后，加入与药物等体积的DMSO(溶剂)；CVB3+PL组中荜茇酰胺的干预剂量为10μM，处理感染CVB3病毒的HL-1细胞24h。利用Western Blot检测焦亡相关蛋白GSDMD/GSDMD-N、pro-caspase-1/caspase-1、ASC、IL-1β、NLRP3的相对表达量，使用Imag J软件对蛋白条带灰度值扫描和GraphPad Prism 8.0软件统计分析。根据图3结果表明，CVB3组和CVB3+DMSO组无差异，CVB3的感染引起细胞焦亡蛋白表达上升，荜茇酰胺处理后焦亡相关蛋白水平下降，表明荜茇酰胺能抑制CVB3导致的细胞焦亡现象。图3B～H中结果表示为Mean+SEM，**(P<0.01)、***(P<0.001)代表与control组相比有统计学意义，#(P<0.05)、##(P<0.01)代表与CVB3组相比有统计学意义。
实施例4
CVB3感染后病毒性心肌炎小鼠模型建立
第0天对照组和10mg/kgPL组Balb/c小鼠腹腔注射不含CVB3的DMEM培养基0.12mL，其余小鼠腹腔注射含1×106TCID50 CVB3的DMEM培养基0.12mL建立小鼠VMC模型。24h后观察，小鼠出现活动状态变差，体重不变或下降，饮食减少等状况，则病毒心肌炎小鼠造模成功。其中，Balb/c小鼠(4周龄，10～14g，雄性)购自湖北省实验动物中心。
荜茇酰胺对病毒性心肌炎小鼠状态的改善
将小鼠随机分组，每组6只，分为control组、10mg/kg PL组、CVB3感染组、CVB3+2.5mg/kg PL组、CVB3+5mg/kg PL组、CVB3+10mg/kg PL组和0.5mg/kg地塞米松阳性组。对10mg/kg PL组、CVB3+2.5mg/kg PL组、CVB3+5mg/kgPL组、CVB3+10mg/kg PL组和地塞米松0.5mg/kg分组的小鼠从第1天开始腹腔注射给药体积200μL和相应分组的荜茇酰胺剂量和地塞米松剂量，每2天腹腔给药1次，第1,3,5天给药。对照组和CVB3感染组在相同的时间腹腔注射相同体积的药物溶媒。将感染病毒后的小鼠与对照组小鼠分笼饲养，每笼鼠6只，每天记录小鼠的体重，观察小鼠生存状态，毛发等，在第7天对小鼠进行心脏超声检测，取血后用颈椎脱臼法处死小鼠，测量小鼠体重，并收集心脏和血液标本。
Balb/c小鼠腹腔注射病毒时间记为第0天，第1，3，5天腹腔注射荜茇酰胺或地塞米松，观察小鼠生活状态，每日记录小鼠体重变化。以时间为横坐标，小鼠体重为纵坐标，绘制体重变化。根据图4的结果显示，10mg/ml荜茇酰胺组体重变化较对照组无明显差异，小鼠接种病毒后体重下降，注射荜茇酰胺后随给药剂量的增加体重恢复增加，且荜茇酰胺高剂量组体重较对照药地塞米松恢复略多。结果表明，荜茇酰胺的干预对CVB3诱导的小鼠状态和体重改变有保护作用。
荜茇酰胺对病毒性心肌炎小鼠心脏功能的保护作用
采用心脏超声心动图评估药物治疗后小鼠心脏功能恢复情况，制作超声心动图步骤：小鼠吸入异氟醚进行麻醉，使用配备18MHz线阵超声换能器的1100超声诊断仪进行超声心动图检查。超声探头定位于二尖瓣水平的胸骨旁切面，用于成像心脏长轴。获取M型图像，分别测量心脏每分钟输出量(CO)、左心室射血分数(EF)、左心室缩短分数(FS)、收缩末期容积(ESV)、舒张末期容积(EDV)、左室收缩期内径(LVIDs)、舒张期内径(LVIDd)。计算EF为(EDV-ESV)/EDV，FS为(LVIDd-LVIDs)/LVIDd。利用GraphPad Prism 8.0软件对超声心动图数据进行统计分析，绘制心脏每分输出量(CO)柱状图。图5B中结果表示为Mean+SEM，NS代表与control组相比无统计学差异，**(P<0.01)代表与control组相比有统计学意义，#(P<0.05)、##(P<0.01)代表与CVB3组相比有统计学意义。
根据图5结果所示，与对照组相比，病毒组的心脏每分输出量(CO)有明显的下降，其余各组无显著变化；与病毒组相比，CVB3+2.5mg/kg PL、CVB3+5mg/kg PL、CVB3+10mg/kgPL组和CVB3+DEX组均有明显升高；且给药治疗组之间无明显差异。说明荜茇酰胺可改善CVB3导致的小鼠病毒性心肌炎心功能损伤。
荜茇酰胺对病毒性心肌炎小鼠心肌组织的保护作用
于第7天麻醉处死各组小鼠，取心脏，观察小鼠心脏外观变化。根据图6结果显示，CVB3病毒组较对照组和10mg/kg荜茇酰胺组，心脏外膜有大面积不规则形状白色斑块坏死区域，低、中、高剂量荜茇酰胺组随着剂量增加白色斑块区域面积逐步减少，地塞米松组病灶面积与中剂量荜茇酰胺组治疗效果无明显差异，劣于高剂量荜茇酰胺组治疗效果。
采用H&E染色检测技术，把心脏组织切片进行HE染色后于显微镜下观察心肌组织炎性浸润面积。结果如图7所示，对照组和10mg/kg组荜茇酰胺组心肌细胞的形态规则，纹理清晰，病毒组心肌细胞出现溶解和死亡现象，有大量的炎性细胞浸润，给低、中、高剂量荜茇酰胺治疗，呈剂量依赖的减少心肌组织中的炎性浸润，高剂量组和地塞米松组和对照组无明显差异。实验表明，荜茇酰胺对心脏组织的病变有良好的保护作用，且剂量增加治疗作用增加。图7中结果表示为Mean+SEM，NS代表与control组相比无统计学差异，***(P<0.001)代表与control组相比有统计学意义，#(P<0.05)、##(P<0.01)、###(P<0.001)代表与CVB3组相比有统计学意义。
荜茇酰胺对病毒性心肌炎小鼠心肌组织中炎症因子的抑制作用
病毒性心肌炎的发生发展过程中伴随着炎症因子的大量产生，本发明采用RT-qPCR技术对小鼠心肌细胞中炎性趋化因子MCP-1和炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平进行检测。结果如图8所示，感染CVB3的心脏组织中MCP-1、IL-1β、IL-6、TNF-α的表达水平增加，荜茇酰胺治疗后炎症因子表达下降，且下降水平和剂量有关，高剂量荜茇酰胺的治疗效果优于地塞米松。
实施例5
荜茇酰胺对病毒性心肌炎小鼠心肌组织焦亡的作用
把18只Balb/c小鼠随机分为control组、CVB3组、CVB+PL组，第0天CVB3组和CVB3+PL组腹腔注射CVB3病毒液，第1，3，5天CVB3+PL组腹腔注射10mg/kg荜茇酰胺200μl，第7天处死取小鼠心脏组织。利用Western Blot检测心肌组织中焦亡相关蛋白GSDMD/GSDMD-N、pro-casepase-1/caspase-1、ASC、IL-1β、NLRP3的相对表达量。使用Imag J软件对蛋白条带灰度值扫描和GraphPad Prism 8.0软件统计分析，结果表示为Mean+SEM，*(P<0.05)、**(P<0.01)、***(P<0.001)代表与control组相比有统计学意义，#(P<0.05)、##(P<0.01)、###(P<0.001)代表与CVB3组相比有统计学意义。
CVB3感染后会导致组织细胞焦亡，释放大量炎性因子。根据图9结果显示，CVB3感染小鼠后焦亡蛋白水平上升，荜茇酰胺能显著降低焦亡水平。结果表明荜茇酰胺是通过抑制心肌细胞焦亡，降低炎症因子水平来减轻心肌炎症。
实施例6
本发明利用网络药理学手段在TCMSP、ChEMBL、STITCH数据库中寻找到123种可能被荜茇酰胺作用的靶点(图10)，在DisGeNET、GeneGards、OMIM数据库中检索出2045个病毒性心肌炎基因靶点，利用Bioinformatics绘制Veen图，交集得到39个潜在的治疗靶点(图11)。
KEGG通路富集分析
本发明运用DAVID数据库对荜茇酰胺与病毒性心肌炎交集靶点进行KEGG信号通路富集分析，找到122条信号通路，根据Pvalue值选取显著性差异较大的前20条绘制气泡图(图12)，其中富集到MAPK通路的有IKBK、MEK1(MAP2K1)、p38MAPK(MAPK14)等10个靶点，富集到Hepatitis B信号通路的有IKBKB，MAP2K1，MAPK8等11个靶点。
蛋白互作(PPI)网络
本发明利用STRING数据库分析交集靶点信息(图13)，筛选具有核心作用的靶点分子，并利用Cytoscape3.7.2软件进行可视化分析筛选出SRC、MAPK1、MAPK14、PTGS2、MAPK8、NOS2、CYBB、MAP2K1、IKBKB、TYK2、PARP1、RPS6KB1、JAK3、PIK3CD这14个较为核心的靶点(图14)，并给后续实验提供参考。
实施例7
荜茇酰胺治疗作用中细胞焦亡上游通路的筛选实验
CVB3感染HL-1细胞2h后，加入10μM荜茇酰胺进行处理，同时分别加入PI3K抑制剂(LY294002)、MEK抑制剂(U0126)、JNK抑制剂(SP600125)、JAK/STAT抑制剂(AG490)、NF-κB抑制剂(MG-132)、p38抑制剂(HY-10256)，各浓度均为5μM，24h后收取蛋白质样本进行WesternBlot检测。结果表示为Mean+SEM，***(P<0.001)代表与control组相比有统计学意义，###(P<0.001)代表与CVB3组相比有统计学意义。(P<0.05)、/>(P<0.01)、/>(P<0.001)代表与CVB3+PL组相比有统计学意义，ns代表与CVB3+PL组相比没有统计学意义。
本发明通过网络药理学筛选初步确定了6个可能的上游通路，分别是P13K、MEK(MAP2K1)、JNK(MAPK8)、JAK/STAT、NF-κB、p38MAPK(MAPK14)通路，其中PI3K的一个亚基是PIK3CD，NF-κB受IKKB激活形成磷酸化NF-κB，这些通路对病毒性心肌炎炎症的发生发展承担重要作用。用系列通路抑制剂进行干扰，采取Wesrern Blot技术检测HL-1细胞的焦亡情况。结果如图15显示，细胞感染CVB3病毒，用荜茇酰胺和不同抑制剂同时进行处理后，NF-κB通路抑制剂MG-132组抑制NLRP3的表达最为显著，与荜茇酰胺组的抗焦亡效果无显著差异。因此，本发明推测NF-κB通路抑制剂和荜茇酰胺协同抑制CVB3诱导的HL-1细胞焦亡。
实施例8
荜茇酰胺通过NF-κB通路抑制CVB3诱导的细胞焦亡
为了进一步验证荜茇酰胺可通过抑制NF-κB通路来发挥抗焦亡作用，本发明用CVB3感染HL-1细胞2h后，加入10μM荜茇酰胺和100nM的NF-κB通路抑制剂MG-132处理24h后收取蛋白样。结果表示为Mean+SEM，***(P<0.001)代表与control组相比有统计学差异，##(P<0.01)、###(P<0.001)代表与CVB3组相比有统计学差异。ns代表与CVB3+PL组相比没有统计学差异。
本发明从蛋白水平出发检测NF-κB通路蛋白IKKβ、p-IKKβ、NF-κB和p-NF-κB以及NLRP3等焦亡相关蛋白的表达，结果如图16和图17所示。使用NF-κB通路抑制剂MG-132处理后，细胞内的焦亡蛋白NLRP3、GSDMD/GSDMD-N、Pro-caspase-1/Caspase-1、ASC、IL-1β的表达明显降低，同时荜茇酰胺治疗组细胞内的焦亡蛋白也显著降低(图16)。同时，用不同剂量的荜茇酰胺处理后，细胞内的IKKβ、p-IKKβ、NF-κB和p-NF-κB通路蛋白表达明显被抑制(图17)。结果表明，NF-κB通路在CVB3诱导的心肌细胞焦亡中发挥了关键作用，且荜茇酰胺可能通过抑制NF-κB通路及其磷酸化水平来缓解CVB3诱导的细胞焦亡。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.荜茇酰胺在制备治疗病毒性心肌炎药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述病毒性心肌炎是由柯萨奇病毒B3引起。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荜茇酰胺能够改善病毒性心肌炎引起的心功能损伤。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荜茇酰胺能够抑制心肌细胞焦亡。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荜茇酰胺能够降低炎症因子水平。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述炎症因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP-1。
7.一种治疗病毒性心肌炎的药物，其特征在于，所述药物的有效成分包括荜茇酰胺，以及药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述荜茇酰胺的给药浓度为2.5～20μM。
9.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述辅料包括稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
10.根据权利要求7～9任意一项所述的药物，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂、汤剂、口服液、注射剂或栓剂。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114073693A (zh) * 2020-08-10 2022-02-22 华南理工大学 荜茇酰胺在抑制nlrp3炎症小体活化中的应用

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