CN117050986A - 具有免疫刺激活性的CpG寡聚核苷酸及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供多种去甲基化CpG寡聚核苷酸及应用。本发明共设计了多种不同类型的CpG寡聚核苷酸序列，并对这些序列进行修饰，修饰包括但不限于硫代、甲氧基、氟、纳米粒子或其它修饰；这些序列能有效激活人体或动物免疫系统，具有广谱预防和治疗病原微生物感染包括但不限于病毒、细菌、真菌、寄生虫导致的疾病的功能；具有作为人或动物抗感染性疫苗佐剂的功能；具有广谱单药治疗恶性肿瘤，作为肿瘤治疗联合用药及作为肿瘤疫苗佐剂的功能；可以通过系统性或局部给药达到治疗疾病的目的。

Description

具有免疫刺激活性的CpG寡聚核苷酸及其用途
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及多种CpG寡聚核苷酸及其用途。
背景技术
先天免疫系统是人体或哺乳动物检测和抵抗病毒、细菌、寄生虫、毒素等入侵或感知创伤的第一道防线。人体的先天免疫系统由体表屏障、鼻黏膜的纤毛粘液及表达众多Toll样受体的免疫细胞组成。目前人体中发现的Toll样受体有11个，微生物进入人体后，可触发单个或数个Toll样受体而激发先天免疫系统，进而产生大量的I型干扰素及激活NK细胞等先天免疫细胞，达到清除病原微生物的目的。
TLR-9为最重要的Toll样受体之一，其配体是去甲基化的病毒或细菌的含有CpG的DNA片段。病毒或细菌的CPG片段进入细胞的内体，和TLR-9结合后激活的一系列信号传递会产生大量的I型干扰素、募集NK细胞、树突样细胞及其他相关的免疫反应。
CpG寡聚脱氧核糖核苷酸(oligodeoxyribonucleotides，ODN)可直接激活浆细胞样树突状细胞、B细胞等细胞。由此产生的免疫反应的特征在于产生Th1细胞因子和促炎细胞因子以及多反应性免疫球蛋白。这种先天免疫反应为抗原特异性适应性免疫奠定了基础。因此免疫刺激寡核苷酸可用于治疗、预防或改善免疫系统缺陷(例如，肿瘤或癌症或病毒、真菌、细菌或寄生虫感染)引起的疾病。
通过改善抗原呈递细胞的功能，CpG ODN有助于体液和细胞疫苗特异性免疫应答的产生。临床前研究表明，当全身或粘膜给药时，CpG ODN可显著提高免疫反应，从而提高传染病疫苗、癌症疫苗的活性。临床试验表明，CpG ODN具有良好的安全性，并增加了共用疫苗的免疫原性。
从2019年的原始毒株开始，SARS-Cov-2经历了alpha,beta,delta和omicron毒株的演变，传染性越来越强，传染率从最初alpha的RO为2到omicron的RO为10。现有研究表明，SARS-cov-2越来越强的传染力和它基因组里越来越少的CpG含量有关。人体中锌指抗病毒蛋白(zinc finger antiviral protein，ZAP)是先天免疫的一个重要机制：它可识别并特异性结合病毒的CpG二核苷酸并招募其他蛋白质来降解病毒RNA基因组。而SARS-CoV-2通过一系列突变，减少了基因组中CpG的数量，使其能逃逸机体先天免疫系统的识别和降解。此外，SARS-Cov-2也产生一些物质抑制I型干扰素的激活，使其逃逸先天免疫系统的攻击。因此当人体暴露在存在SARS-CoV-2感染风险的环境中时，通过体外补充含有CpG的ODN，将有希望恢复人体对SARS-CoV-2的免疫反应，进而减少感染风险。
很多病毒或其他病原微生物感染人类时，往往从上呼吸道和鼻粘膜开始，在局部大量繁殖后下行到下呼吸道和肺部，引起肺炎。如SARS-Cov-2进入鼻腔黏膜后，和黏膜上皮的纤毛细胞表达的ACE2受体结合然后进入细胞，利用宿主细胞大量繁殖病毒。当黏膜先天免疫力强时，强大的I型干扰素可直接杀灭和抑制病毒的繁殖，将病毒局限在上呼吸道并减少病毒颗粒，防止了病毒的下行和肺部感染(肺炎)的发生，同时减少了人群间的传播。当鼻黏膜免疫力低下时，病毒将快速繁殖并下行到肺部引起肺炎，同时产生大量病毒颗粒，引起人群间的传播。
如在SARS-Cov-2感染前或感染后初期从鼻腔黏膜喷入含CPG的寡聚核苷酸，可刺激鼻腔黏膜的免疫系统(Nose associated lymphoid tissue,NALT)产生强大的先天免疫(I/II/III型干扰素的产生)和Th1免疫反应(DC，NK和CD8T细胞的激活，IL-12的产生)，将病毒抑制或杀灭，使感染局限于上呼吸道，无法下行到肺部引发肺炎。
现有临床前研究表明将CpG ODN应用于呼吸道感染性疾病的预防和治疗是一个非常有效的策略。因此，亟需临床开发具备阻断呼吸道病毒感染和传播的新型CpG ODN。
此外，目前CpG ODN虽然在肿瘤治疗和传染性疾病预防中是一种强有力的Th1型免疫刺激物，但其作为人或动物疫苗佐剂的应用仍很有限，仅有Dynavax公司的CpG 1018获批用于乙肝疫苗的生产，更多安全、高效的CpG ODN疫苗佐剂亟待研发。
发明内容
为解决上述问题，本发明公开了多种具有免疫刺激活性的CpG寡聚核苷酸及其应用。本发明提供了多种不同类型的CpG ODN。
在一个方面，本公开提供了CpG寡聚核苷酸，其包含选自SEQ ID NO:9-14、1-8和15-18的任一种的序列。
在一些实施方案中，所述CpG寡聚核苷酸的序列中还包含修饰，所述修饰选自例如但不限于，硫代修饰、甲氧基修饰和氟代修饰。在一些实施方案中，所述CpG寡聚核苷酸中的至少一个磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。
在一些实施方案中，所述CpG寡聚核苷酸中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。
在一些实施方案中，所述CpG寡聚核苷酸为单链或双链。
在一个方面，本公开提供了一种缀合物，其包含前述权利要求中任一项所述的CpG寡聚核苷酸缀合于纳米粒子。所述纳米粒子选自但不限于，PLGA、壳聚糖、脂质体和脂质模块。
在一些实施方案中，所述CpG寡聚核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键缀合于纳米粒子。
在一个方面，本公开提供了一种组合物，其包含本文的CpG寡聚核苷酸或缀合物，以及药学上可接受的载剂。
在一个方面，本公开提供了本文的CpG寡聚核苷酸或缀合物用作佐剂的用途。
在一个方面，本公开提供了本文的CpG寡聚核苷酸与MF59或ISA201组合用作佐剂的用途。所述佐剂可以是用于疫苗的佐剂。
在一个方面，本公开提供了本文的CpG寡聚核苷酸或缀合物在制备提高免疫细胞增殖功能或提高免疫细胞细胞因子释放功能的药物中的应用。
在一个方面，本公开提供了本文的CpG寡聚核苷酸或缀合物在制备预防或治疗病毒感染、细菌感染性疾病、真菌感染性疾病或寄生虫感染性疾病的药物中的应用。所述病毒感染可选自例如COVID-19感染、流感病毒感染和呼吸道合胞病毒感染。
在一些实施方案中，所述细菌感染性疾病或真菌感染性疾病或寄生虫感染性疾病发生在呼吸道。
在一个方面，本公开提供了本文的CpG寡聚核苷酸或缀合物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的应用。
在一个方面，本公开提供了本文的CpG寡聚核苷酸或缀合物在制备疫苗组合物中的应用。
在一些实施方案中，所述疫苗组合物为人用或动物用疫苗组合物，例如猪用疫苗组合物。所述疫苗组合物可以是预防或治疗病毒感染、细菌感染性疾病、真菌感染性疾病或寄生虫感染性疾病的疫苗组合物。
本发明还涉及以下实施方案：
1.含有未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤的免疫刺激性寡聚核苷酸，大小在10到50个碱基之间，该寡聚核苷酸由未经修饰或经过修饰的核苷酸单体组成，修饰类型包括硫代修饰、甲氧基修饰、氟修饰或纳米粒子修饰，纳米粒子修饰包括PLGA，壳聚糖和脂质体。
2.CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为以下八个C型CpG寡聚脱氧核苷酸中的任一个或序列中含有以下八个中的任一个：5’-T-C-G-T-C-G-C-G-T-T-C-G-C-C-G-C-C-T-T-C-G-A-A-G-G-C-G-G-3’；
5’-T-C-G-T-C-G-C-G-A-A-C-G-C-C-G-C-G-T-A-C-G-T-A-C-G-C-G-G-3’；
5’-T-C-G-T-C-G-C-G-A-T-C-G-C-C-G-C-G-A-T-C-G-A-T-C-G-C-G-G-3’；
5’-T-C-G-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-C-G-C-C-G-G-T-T-C-G-A-A-C-C-G-G-3’；5’-T-C-G-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-C-G-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-
3’；
5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-G-T-C-G-T-T-G-T-C-G-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3’；
5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-G-T-C-G-C-C-G-C-G-T-A-C-G-T-A-C-G-C-G-G-3’；
5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-G-T-C-G-C-C-G-C-G-T-T-C-G-A-A-C-G-C-G-G-3’。
3.根据实施方案2所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有硫代修饰。
4.根据实施方案2所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有氟代修饰。
5.根据实施方案2所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有甲氧基修饰。
6.根据实施方案2所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有纳米粒子修饰，纳米粒子包括PLGA、壳聚糖、脂质体。
7.CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为以下六个B型CpG寡聚脱氧核苷酸中的任一个或序列中含有以下六个中的任一个：
5’-T-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-3’；
5’-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-3’；
5’-T-C-G-C-C-C-G-T-C-G-C-C-A-G-C-G-A-G-G-C-G-T-T-T-3’；
5’-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-T-G-T-C-G-T-C-G-T-T-3’；
5’-T-C-G-A-C-G-T-C-G-T-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-3’；
5’-T-C-G-A-C-G-A-C-G-T-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-T-3’。
8.根据实施方案7所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有硫代修饰。
9.根据实施方案7所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有氟代修饰。
10.根据实施方案7所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有甲氧基修饰。
11.根据实施方案7所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有纳米粒子修饰，纳米粒子包括PLGA、壳聚糖、脂质体。
12.CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为以下两个A型CpG寡聚脱氧核苷酸中的任一个或序列中含有以下两个中的任一个：
5’-G-G-G-G-C-G-C-G-A-C-G-C-G-T-C-G-C-G-G-G-G-G-G-3’；
5’-G-G-G-G-G-C-G-A-C-G-C-G-T-C-G-C-G-G-G-G-G-3’。
13.根据实施方案12所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有硫代修饰。
14.根据实施方案12所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有氟代修饰。
15.根据实施方案12所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有甲氧基修饰。
16.根据实施方案12所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有纳米粒子修饰，纳米粒子包括PLGA、壳聚糖、脂质体。
17.CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列为以下两个P型CpG寡聚脱氧核苷酸中的任一个或序列中含有以下两个中的任一个：
5’-T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-T-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3’；
5’-T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-A-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3’。
18.根据实施方案17所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有硫代修饰。
19.根据实施方案17所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有氟代修饰。
20.根据实施方案17所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有甲氧基修饰。
21.根据实施方案17所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有纳米粒子修饰，纳米粒子包括PLGA、壳聚糖、脂质体。
22.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在提高机体免疫治疗药物中的应用。
23.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在具有提高免疫细胞增殖功能的药物中的应用。
24.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在具有提高免疫细胞细胞因子释放功能药物中的应用。
25.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在预防和治疗病毒对机体感染的药物中的应用。
26.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在预防和治疗COVID-19感染的药物中的应用。
27.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在预防和治疗流感病毒感染的药物中的应用。
28.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在预防和治疗SARS-Cov感染的药物中的应用。
29.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在具有预防和治疗呼吸道细菌感染性疾病功能的药物中的应用。
30.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在具有预防和治疗呼吸道真菌感染性疾病功能的药物中的应用。
31.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在具有预防和治疗呼吸道寄生虫感染性疾病功能的药物中的应用。
32.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在治疗肿瘤药物中的独立应用。
33.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在具有治疗肿瘤药物中的联合应用。
34.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在具有预防和治疗肿瘤药物中作为佐剂的应用。
35.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在人用疫苗药物中的应用。
36.如实施方案1-21任意一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在动物用疫苗药物中的应用。
37.如实施方案1-36任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为鼻喷给药、肺部吸入、口服、肛门给药、生殖道给药、皮下注射、肿瘤内注射或静脉注射。
本发明还提供了CpG ODN在预防和治疗其他病毒对机体感染的药物中的应用。
附图说明
图1为CpG ODN对小鼠脾细胞增殖的影响结果图。每种CpG ODN采用三种浓度，从左至右分别为3.2μM、0.8μM、0.2μM。
图2为CpG ODN对小鼠脾细胞细胞因子分泌的影响结果图，(A)：IL-6，(B)：TNF-α。每种CpG ODN采用三种浓度，从左至右分别为3.2μM、0.8μM、0.2μM。
图3为CpG ODN对不同猪供体的PBMC增殖的影响结果图。
图4为CpG ODN 09、CpG ODN 11对猪PBMC增殖的影响结果图。
图5为CpG ODN对猪PBMC IFN-γ分泌的影响结果图。(A)：CpG ODN的浓度为5μg/mL，(B)：CpG ODN的浓度为10μg/mL。
图6为CpG ODN对健康人PBMC IFN-α(A)、IL-6(B)分泌的影响结果图。
图7为血清中S蛋白特异性IgG检测结果图。
图8为血清中S蛋白特异性IgG1和IgG2a检测结果图。
图9为免疫相关细胞因子检测结果图。
图10为抗原特异性细胞增殖检测结果图。
图11为仔猪PEDV免疫IgG检测结果图。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文引用的所有专利、专利申请和其他出版物均通过引用全文并入。如果本文中提出的定义与通过引用并入本文的专利、专利申请和其他出版物中提出的定义相冲突，则以本文中提出的定义为准。
如本文使用的，术语“CpG寡聚核苷酸”、“CpG ODN”和“CpG免疫刺激核酸”可互换使用，指含有至少一个非甲基化胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸基序的寡核苷酸。本公开的CpG寡聚核苷酸包括多类CpG ODN，例如A类、B类、C类或P类CpG ODN，如Bode等人，2011，Expert RevVaccines，10(4):499–511中描述的。本文中所提供的核苷酸序列包括核苷酸之间通过磷酸二酯键或者通过硫代磷酸酯键相连接。
A类CpG ODN也称为D型，能诱导浆细胞样树突状细胞激活，但在刺激B细胞方面相对较弱，其含有磷酸二酯CpG二核苷酸的回文序列以及5’和/或3’端的聚G基序。
B类CpG ODN也称为K型，能激活B细胞但是在诱导浆细胞样树突状细胞激活方面相对较弱。B类CpG核酸典型地是完全稳定的并且在特定的优选的碱基序列中包括未甲基化的CpG二核苷酸。B类CpG免疫刺激核酸在分别于2001年2月27日和2001年5月29日公开的USP6,194,388B1和6,239,116B1有描述。
C类CpG ODN能激活B细胞和浆细胞样树突状细胞并能诱导I型、III型干扰素的分泌，C类CpG核酸典型地是完全稳定的，包含B类型的序列和富含GC的回文结构或近似回文结构。C类CpG ODN中的一些具有传统的“刺激性”CpG序列和“富含GC的”或“B细胞中和”基序。这些组合基序核酸具有介于传统的“B类”和“A类”CpG ODN的效果之间的免疫刺激效果。
P类CpG ODN通常由全硫代磷酸酯主链完全稳定化，并且包含两个回文序列和多个CpG二核苷酸。
CpG寡聚核苷酸
CpG ODN作为Toll样受体9(TLR9)的激动剂，可以刺激表达TLR9的细胞并激活下游天然免疫反应通路，一方面诱导浆细胞样树突状细胞的I型和III型干扰素表达，另一方面激活B细胞，促使炎症因子分泌，从而增强体液免疫和细胞免疫反应。可被内吞体摄取，引起干扰素分泌增多，并通过促进抗原的交叉提呈，有效活化抗原特异性T细胞。
本发明理性设计并通过固相合成法制备了多条不同类型的CpG序列，然后利用离子交换色谱、反相色谱或电泳等方法进行纯化分离，得到纯化产物，再使用超滤设备将纯化产物脱盐和浓缩，通过冻干，得到白色、类白色至淡黄色疏松终产品。然后通过小鼠脾细胞、猪PBMC、人PBMC评估各个CpG ODN的免疫刺激活性。具体来说，基于Balb/c小鼠脾细胞检测各个CpG ODN对IL-6、TNF-α等细胞因子释放的刺激作用；基于Balb/c小鼠脾细胞检测CpGODN对脾细胞增殖的促进作用；基于猪PBMC检测各个CpG ODN对猪脾细胞增殖的促进作用；基于猪PBMC细胞检测各个CpG ODN对IFN-γ释放的刺激作用；基于人PBMC细胞检测各个CpGODN对IFN-α、IL-6释放的刺激作用；基于Balb/c小鼠评估了CpG ODN对猪流行性腹泻S蛋白亚单位疫苗的免疫增强作用；基于仔猪评估了CpG ODN对猪流行性腹泻S蛋白亚单位疫苗的免疫增强作用。
本发明共设计了18条不同类型的CpG ODN序列(参见表1)，并对这些序列进行初步纯化及脱盐。核酸修饰的类型包括但不限于硫代修饰、甲氧基修饰、氟修饰或纳米粒子修饰。纳米粒子修饰包括但不限于聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)修饰、壳聚糖修饰和脂质体修饰。SEQ ID No：1-8为含有回文结构且任选地含有修饰例如硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、纳米粒子修饰或其他化学修饰的C型CpG ODN，ODN 2395为该类型CpG对照；SEQ IDNo：9-14为不含回文结构且任选地含有修饰例如全硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、纳米粒子修饰或其他化学修饰的B型CpG ODN，ODN 2006为该类型CpG对照；SEQ ID No：15、16为含有回文结构、首尾为多聚G结构，且任选地含有修饰例如部分硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、纳米粒子修饰或其他化学修饰的A型CpG ODN，ODN 2216为该类型CpG对照；SEQ IDNo：17、18为由两个回文结构组成，且任选地含有修饰例如硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、纳米粒子修饰或其他化学修饰的P型CpG ODN序列，ODN 21798为该类型CpG对照。GC序列为不含CpG的ODN序列。
表1CpG ODN序列
表2对照ODN序列
在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID NO:1-8中任一项所示的核苷酸序列的CpGODN。进一步地，所述CpG ODN还包含修饰，例如硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、纳米粒子修饰或其他化学修饰。在一些实施方案中，所述CpG ODN中至少一个磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。
在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID No：9-14中任一项所示的核苷酸序列的CpG ODN。进一步地，所述CpG ODN还包含修饰，例如硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、纳米粒子修饰或其他化学修饰。在一些实施方案中，所述CpG ODN中至少一个磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。在一些实施方案中，所述CpG ODN中所有的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。
在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID No：15-16中任一项所示的核苷酸序列的CpG ODN。进一步地，所述CpG ODN还包含修饰，例如硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、纳米粒子修饰或其他化学修饰。在一些实施方案中，所述CpG ODN中至少一个磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。
在一些实施方案中，提供了包含SEQ ID No：17-18中任一项所示的核苷酸序列的CpG ODN。进一步地，所述CpG ODN还包含修饰，例如硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、纳米粒子修饰或其他化学修饰。在一些实施方案中，所述CpG ODN中至少一个磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。
与其他佐剂联用
MF59或MF59类似物是早批准使用的临床佐剂之一，是一种水油乳剂佐剂，主要由角鲨烯、吐温80和Span85组成，其水包油设计明显降低了粘度，增强了人体耐受性。角鲨烯属于油相成分，广泛分布于动植物及人体内，兼具生物兼容性和可降解性的特点。吐温80和Span85是表面活性剂，增强了乳剂的稳定性。MF59是病毒类疫苗的理想佐剂，当其在与流感、HIV等疫苗联合使用时，可明显增强抗体滴度，且在不同人群中耐受性均良好。其能促进抗原摄取、招募大量免疫细胞进入注射部位，并且能招募单核细胞和中性粒细胞提呈抗原并将其转运入淋巴结。当其与CpG联合使用时，其诱导了高于单独佐剂的抗体滴度和Th1型应答。
另一方面，Montanide(ISA)佐剂是做得最好的商业化W/O乳剂，ISA含有提纯的矿物油或角鲨烯油，与甘露醇酯作为乳化剂，副作用小，被广泛用于兽用疫苗的生产和研发。例如在鸡新城疫疫苗和猪肺炎支原体亚单位疫苗、猪和牛灭活口蹄疫疫苗以及由各种病毒和细菌感染的养殖鱼类疫苗中使用的都是Montanide的W/O佐剂。在双相乳剂水包油包水(W/O/W)中，含有内部水滴的油滴分散成连续的水相，这种乳剂可以同时提供抗原从外部水相的快速释放和从内部水相的延长释放，可以快速、持续地刺激免疫细胞。目前市场上的W/O/W型乳剂还比较少，兽用疫苗中应用最广泛的就是ISA201和ISA206，与抗原在温和条件下混合后制备疫苗，保护不同种类的牲畜免受几种经济上重要的病原体(如流感病毒和口蹄疫病毒)感染。
在一方面，本发明提供了MF59和CpG的组合用于制备猪流行性腹泻疫苗组合物。本发明人发现，当MF59和CpG组合使用时，能显著提高抗原的免疫原性，具有很好的协同作用。同时采用MF59(或MF59类似物)与CpG ODN两种佐剂能够协同性地诱导抗原特异性的细胞免疫应答，所产生的疫苗组合物具有强的诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答的能力。
在一方面，本发明提供了ISA201和CpG的组合用于制备猪流行性腹泻疫苗组合物。本发明人发现，当ISA201和CpG组合使用时，能显著提高抗原的免疫原性，具有很好的协同作用。
本发明的有益效果
本发明全新设计并合成了多条CpG序列，这些序列能有效激活人体或动物免疫系统，具有广谱预防和治疗病原微生物感染的功能，能广泛用于大规模的流行性呼吸道传染病的预防和轻症患者的治疗；具有提高共用疫苗的免疫原性的功能，能作为人或动物疫苗佐剂应用；具有提高机体先天和后天免疫力杀灭肿瘤细胞的功能，能用于肿瘤的治疗包括单一疗法和联合疗法；可以通过系统性或局部给药达到治疗疾病的目的。
下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：CpG ODN分子的设计与合成
本发明共设计了18条不同类型的CpG ODN序列如下，并采用固相合成法进行化学合成，后经过氨解、纯化、脱盐和浓缩、分装冻干等工艺过程，得到最终产品。具体操作如下：
(1)固相合成：由计算机控制进行固相合成，由4步反复的合成步骤(脱三苯甲基、偶联、硫化、盖帽)和最后一步脱磷酸骨架的保护基团组成；
(2)氨解：在合成后，使用氨水或有机胺将寡核苷酸从载体上切落，寡聚核苷酸溶解于溶液中，并切除同3’端第一个碱基连接的通用连接基团和脱去碱基上氨基的保护基团；
(3)纯化：将氨解得到的粗品用离子交换色谱、反相色谱或电泳等方法进行纯化分离，得到纯化产物；
(4)脱盐和浓缩：使用超滤设备将纯化的产物脱盐和浓缩；
(5)分装、冻干：通过冻干，得到白色、类白色至淡黄色疏松体。
核酸修饰的类型包括但不限于硫代修饰、甲氧基修饰、氟修饰或纳米粒子修饰。纳米粒子修饰包括但不限于PLGA、壳聚糖和脂质体。序列1-8为含有回文结构，硫代修饰(任选地含有甲氧基修饰、氟修饰或纳米粒子修饰)的C型CpG ODN，ODN 2395为该类型CpG对照；9-14为不含回文结构、含有全硫代修饰(任选地含有甲氧基修饰、氟修饰或纳米粒子修饰)的B型CpG ODN，ODN 2006为该类型CpG对照；15、16为含有回文结构、首尾为多聚G结构，部分硫代修饰(任选地含有甲氧基修饰、氟修饰或纳米粒子修饰)的A型CpG ODN，ODN 2216为该类型CpG对照；17、18为由两个回文结构组成，硫代修饰(任选地含有甲氧基修饰、氟修饰或纳米粒子修饰)的P型CpG ODN序列，ODN 21798为该类型CpG对照；GC序列为不含CpG的ODN序列。
序列1：5’-T-C-G-T-C-G-C-G-T-T-C-G-C-C-G-C-C-T-T-C-G-A-A-G-G-C-G-G-3’；
序列2：5’-T-C-G-T-C-G-C-G-A-A-C-G-C-C-G-C-G-T-A-C-G-T-A-C-G-C-G-G-3’；
序列3：5’-T-C-G-T-C-G-C-G-A-T-C-G-C-C-G-C-G-A-T-C-G-A-T-C-G-C-G-G-3’；
序列4：5’-T-C-G-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-C-G-C-C-G-G-T-T-C-G-A-A-C-C-G-G-3’；
序列5：5’-T-C-G-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-C-G-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3’；
序列6：T-C-G-T-C-G-T-T-T-G-T-C-G-T-T-G-T-C-G-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G；
序列7：5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-G-T-C-G-C-C-G-C-G-T-A-C-G-T-A-C-G-C-G-G-3’；
序列8：5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-G-T-C-G-C-C-G-C-G-T-T-C-G-A-A-C-G-C-G-G-3’；
序列9：5’-T-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-3’；
序列10：5’-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-3’；
序列11：5’-T-C-G-C-C-C-G-T-C-G-C-C-A-G-C-G-A-G-G-C-G-T-T-T-3’；
序列12：5’-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-T-G-T-C-G-T-C-G-T-T-3’；
序列13：5’-T-C-G-A-C-G-T-C-G-T-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-3’；
序列14：5’-T-C-G-A-C-G-A-C-G-T-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-T-3’；
序列15：5’-G-G-G-G-C-G-C-G-A-C-G-C-G-T-C-G-C-G-G-G-G-G-G-3’；
序列16：5’-G-G-G-G-G-C-G-A-C-G-C-G-T-C-G-C-G-G-G-G-G-3’；
序列17：5’-T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-T-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3’；
序列18：5’-T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-A-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3’；
ODN 21798：5'-T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3'；
ODN 2395：5'-T-C-G-T-C-G-T-T-T-T-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3'；
ODN 2006：5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-T-G-T-C-G-T-T-T-T-G-T-C-G-T-T-3’；
ODN 2216：5’-G-G-G-G-G-A-C-G-A-T-C-G-T-C-G-G-G-G-G-G-3’；
ODN 684：5’-T-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-T-C-3’；GC：5’-T-G-G-C-C-A-A-G-C-T-T-G-G-G-C-C-C-C-T-T-G-C-A-A-G-G-G-C-C-3’。
实施例2：基于小鼠脾细胞检测CpG ODN对免疫细胞增殖的影响
(1)准备BALB/c小鼠2只；
(2)用异氟烷麻醉动物，并通过宫颈脱位杀死动物；
(3)在无菌条件下切除脾脏，并置于含有0.2％BSA的PBS中；
(4)将小鼠脾脏匀浆，并将脾细胞重新悬浮在RPMI 1640培养基中；
(5)将脾细胞接种在96孔圆底板(5×106个细胞/mL，90μL/孔)中；
(6)按实验设计加入不同浓度的CPG，每组3个复孔，每孔10μL相应药物；
(7)使用PBS及GC序列作为阴性对照；
(8)并在37℃、加湿5％ CO2培养箱中培养72小时，进行细胞增殖检测。
实验结果如图1所示，序列CpG ODN 04、CpG ODN 09及ODN2395均能有效刺激小鼠脾细胞的增殖，且CpG ODN 09的作用效果强于CpG ODN 04和ODN 2395。
实施例3：基于小鼠脾细胞检测CpG ODN对IL-6、TNF-α分泌的影响
(1)按照实施例2的方式获取小鼠脾细胞；
(2)将脾细胞接种在96孔圆底板中(5×106个细胞/mL，90μL/孔)；
(3)按实验设计加入不同浓度的CPG，每组3个复孔，每孔10μL相应药物；
(4)使用PBS及GC序列作为阴性对照；
(5)并在37℃、加湿5％CO2培养箱中培养16小时；
(5)收获培养上清并通过ELISA检测试剂盒测量IL-6、TNF-α分泌水平。
实验结果如图2所示，序列CpG ODN 09能有效刺激小鼠脾细胞的IL-6及TNF-α的分泌，且表现出一定的剂量依赖性。
实施例4：CpG ODN对猪PBMC增殖的影响
(1)获取不同白猪(来自农户散养)的猪血并分离PBMC；
(2)将分离后4×106细胞/mL的PBMC接入96孔板中，每孔50μL，加入20μg/mL、10μg/mL的不同CpG ODN每孔50μL，最终刺激物浓度为配制浓度的一半，分别为5μg/mL、10μg/mL，每个浓度做三个平行样，同时设置阴性对照空(不添加CpG ODN刺激)；
(3)将细胞置于5％二氧化碳培养箱中继续培养72h，于实验终止前4h每孔加入10μL CCK-8溶液，继续培养4h；
(4)取出孔板后，于450nm波长处测量每个孔的吸光度OD值。CpG ODN刺激PBMC增殖的能力由刺激指数(stimulation index，SI)表示，SI＝刺激组的平均OD值/对照组的平均OD值，SI越高，表示细胞增殖能力越强。
实验结果如图3、图4所示，从图3中，可以发现CpG ODN 09、CpG ODN 11均能有效刺激猪PBMC的增殖，特别当给药剂量为在5μg/mL时，它们对猪PBMC的促增殖能力显著强于其他序列，且它们对不同猪的PBMC的促增殖能力基本保持一致。从图4中，可以发现CpG ODN09、CpG ODN 11对猪PBMC的增殖促进能力表现出一定的剂量依赖性。本试验结果有力证明了CpG ODN 09、CpG ODN 11作为猪等兽用疫苗佐剂的有效性。
实施例5：CpG ODN对猪PBMC IFN-γ分泌的影响
(1)按照猪IFN-γELISPOTBASIC kit(ALP)、用于ELISPOT的BCIP/NBT-plus底物的说明书准备ELISOPT所需试剂耗材，包被猪IFN-γ抗体并封闭；
(2)分别加入50μL 10μg/mL和20μg/mL的CpG ODN到ELISPOT板中，每个样设置3个复孔，同时设置5μg/mL的刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)作为阳性对照和PBS阴性对照组；
(3)将4×106细胞/mL的猪PBMC加入不同刺激物的孔中，每孔50μL，然后放入培养箱，37℃，5％ CO2培养24h；
(4)用PBST洗板4～6遍以完全去除细胞，每次200μL；
(5)用含0.5％胎牛血清PBS稀释生物素标记的检测抗体P2C11-biotin至终浓度0.5μg/mL，然后每孔加入100μL，室温孵育2h；
(6)去除板中的抗体，每孔200μL无菌PBS清洗孔板5遍；
(7)用0.5％胎牛血清的PBS稀释链霉亲和素-ALP(streptavidin-ALP)，每孔加入100μL，室温孵育1h；
(8)去除板中的抗体，每孔200μL无菌PBS清洗孔板5遍；
(9)显色：显色液BCIP/NBT经0.22μm的滤膜过滤后，每孔加入100μL显色液，避光显色5～10min；
(10)终止显色：当多数孔内出现明显斑点时，终止显色并将孔板置于ELISPOT斑点计数仪中计数分析。
实验结果如图5所示，当CpG ODN浓度在5μg/mL时，与阴性对照组相比，CpG ODN09、CpG ODN 10、CpG ODN 11、CpG ODN 12、CpG ODN 13、CpG ODN 14显示出强大的刺激IFN-γ分泌的活性。在5μg/mL的给药浓度下，与ODN 684相比，CpG ODN 09、CpG ODN 10、CpG ODN11、CpG ODN 12、CpG ODN 14表现出更优的刺激IFN-γ分泌的活性。当CpG ODN浓度在10μg/mL时，与阴性对照组相比，CpG ODN 09、CpG ODN 10、CpG ODN 11、CpG ODN 12、CpG ODN 13、CpG ODN14同样显示出强大的刺激IFN-γ分泌的活性。在10μg/mL的给药浓度下，与ODN 684相比，CpG ODN 09、CpG ODN 10、CpG ODN 11、CpG ODN 12表现出更优的刺激IFN-γ分泌的活性。这表明本发明设计的CpG ODN对猪有着强大的免疫激活能力，可以做为有效的猪等兽用疫苗佐剂或者直接作为抗病毒药物使用。
实施例6：CpG序列对健康人PBMC IFN-α、IL-6分泌的影响
(1)取一定量100μM的CpG ODN溶液，用RPMI 1640完全培养基配制成一定浓度母液，然后按照2倍比例用完全培养基稀释；
(2)获取适量冻存健康人PBMC细胞；
(3)按2×105细胞/孔进行96孔板铺板，每孔加入相应不同浓度的CpG ODN样品，每组3个复孔，同时设置PBS空白对照孔；
(4)置于37℃、5％ CO2培养箱中培养16h；
(5)离心收集上清；
(6)按照ELISA检测说明书检测IFN-α、IL-6。
实验结果如图6所示。图6A表明本发明设计的各个CpG ODN大部分都能有效激活人PBMC分泌IFN-α，特别是CpG ODN 03、CpG ODN 05、CpG ODN 15有较强的激活能力，这展示了这些序列有优秀的抗病原微生物潜能，可用于相关药物的开发。图6B表明设计的CpG ODN09序列能有效刺激健康人PBMC细胞的细胞因子IL-6的分泌，且有较好的剂量依赖性，这些都是加强疫苗抗原的体液和细胞适应性免疫应答产生的有利因素。本研究表明CpG ODN 09在低浓度情况下，能有效激活B细胞和浆细胞样树突状细胞，且能有效刺激IL-6的分泌，这展示了其潜在的疫苗佐剂潜力，将CpG ODN 09与人或动物疫苗联用，有望发挥强大的免疫增强功能。
实施例7：CpG ODN亚单位疫苗配制、小鼠免疫及效果评价
(1)获取猪流行性腹泻S蛋白亚单位抗原；
(2)按照下表，利用CpG ODN 09和S蛋白亚单位及基础佐剂进行Balb/c小鼠分组及免疫：
表3Balb/c小鼠免疫分组
(3)对免疫后7、14、21、28、42天的小鼠进行眶下静脉采血；
(4)利用ELISA检测S蛋白特异性IgG抗体；
(5)免疫后第28天，小鼠麻醉后摘取脾脏，获取免疫后小鼠脾细胞；
(6)将小鼠脾细胞稀释至4×106细胞/mL，500μL/孔铺24孔板；加入纯化后的S蛋白至终浓度为10μg/mL；
(7)置于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养24h；
(8)收获上清液，1000r/min离心10min的上清液进行细胞因子检测；
(9)收获毒种，并测定TCID50；
(10)将待检血清样品56℃水浴灭活30min后，用MEM培养液进行2倍系列稀释从1﹕8至1﹕512，与指示毒(200TCID50/0.1mL)等量混合，置37℃中和1h后加入已长成良好单层Vero细胞的96孔板细胞培养板，同时设阴性血清对照、阳性血清对照、未中和病毒对照和正常细胞对照，置37℃、5％CO2的培养箱中培养5～7日并逐日观察并记录CPE，以能抑制50％以上细胞出现CPE的血清最高稀释度的倒数判定为该血清抗体效价。
IgG抗体水平检测结果如图7所示，从图中可以看出MF59与CpG ODN 09联用，早期可显著提高抗体水平，至第42天时依旧没有下降趋势，且CpG ODN 09提高MF59佐剂组的抗体水平在一定范围内呈现剂量依赖性。此外ISA201与CpG ODN 09联用时，CpG ODN 09在早期能够显著提高抗体水平，5μg/mL为最佳作用浓度。
血清中S蛋白特异性IgG1和IgG2a检测结果如图8所示，从图中可知CpG ODN09联合MF59佐剂使用时，可显著转换免疫类型，偏向于Th 1型细胞免疫，且CpG ODN 09联合MF59佐剂使用时，可有效减缓随着时间的延长而出现IgG2a/IgG1的比值迅速下降的趋势。当CpGODN 09联合ISA201佐剂使用时，可显著转换免疫类型，偏向于Th 1型。
免疫相关细胞因子检测结果如图9所示，与单独使用MF59相比，联合20μg CpG ODN09后，与不加佐剂组(对照组)比可显著提高IL-10(P<0.001)、IFN-γ(P<0.05)、IL-4(P<0.05)、IL-2(P<0.05)细胞因子的分泌。IL-4(Th 2型应答)与IFN-γ(Th 1型应答)的比率通常用于分析产生的免疫应答的Th 2或Th 1偏向，本研究IFN-γ/IL-4的比值为4，血清抗体IgG 2a/IgG 1比值为1.65，说明使用CpG ODN 09后诱导了强烈的Th 1型免疫应答。
抗原特异性细胞增殖检测结果如图10所示，MF59和MF59+CpG ODN 09刺激淋巴细胞增殖能力强于不加佐剂免疫组(P<0.05，P<0.01)，MF59+CpG 09后刺激淋巴细胞增殖效果显著高于单独MF59(P<0.05)。
中和抗体检测结果如表3所示。中和抗体检测24h，阴性对照组即出现PEDV病变的典型的荷包体结构，48h出现大量典型的荷包体结构。中和抗体检测结果显示，CpG ODN 09联合MF59佐剂可显著提高中科抗体效价由1：64至1:512。
本实验在小鼠上验证了CpG ODN 09作为兽用疫苗佐剂的应用潜力。
表4中和抗体检测结果
实施例8：CpG亚单位疫苗配制、免疫及效果评价
(1)获取猪流行性腹泻S蛋白亚单位抗原；
(2)按照下表，利用CpG ODN 09和S蛋白亚单位及基础佐剂进行仔猪分组及免疫：
表5仔猪免疫分组
(3)对免疫后14、21、35、42天的仔猪进行静脉采血；
(4)利用ELISA检测S蛋白特异性IgG抗体。
仔猪IgG抗体水平检测结果如图11所示，从图中可以看出MF59与CpG ODN 09联用，早期可显著提高抗体水平，至第42天时依旧保持在较高位，且MF59与CpG ODN 09联用的效果显著高于阳性对照苗的免疫效果。本试验展示了CpG ODN 09作为兽用疫苗佐剂的可行性和高免疫增强活性。
本领域技术人员将进一步认识到，在不脱离其精神或中心特征的情况下，本发明可以以其他具体形式来实施。由于本发明的前述描述仅公开了其示例性实施方案，应该理解的是，其他变化被认为是在本发明的范围内。因此，本发明不限于在此详细描述的特定实施方案。相反，应当参考所附权利要求来指示本发明的范围和内容。

Claims (19)

1.CpG寡聚核苷酸，其包含选自下组的任一种的序列：
(A)5’-T-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-3’(SEQ ID NO:9)；
5’-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-3’(SEQ ID NO:10)；
5’-T-C-G-C-C-C-G-T-C-G-C-C-A-G-C-G-A-G-G-C-G-T-T-T-3’(SEQ ID NO:11)；
5’-T-C-G-T-C-G-T-C-G-T-T-G-T-C-G-T-C-G-T-T-3’(SEQ ID NO:12)；
5’-T-C-G-A-C-G-T-C-G-T-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-3’(SEQ ID NO:13)；
5’-T-C-G-A-C-G-A-C-G-T-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-T-3’(SEQ ID NO:14)；
(B)5’-T-C-G-T-C-G-C-G-T-T-C-G-C-C-G-C-C-T-T-C-G-A-A-G-G-C-G-G-3’(SEQ IDNO:1)；
5’-T-C-G-T-C-G-C-G-A-A-C-G-C-C-G-C-G-T-A-C-G-T-A-C-G-C-G-G-3’(SEQ ID NO:2)；
5’-T-C-G-T-C-G-C-G-A-T-C-G-C-C-G-C-G-A-T-C-G-A-T-C-G-C-G-G-3’(SEQ ID NO:3)；
5’-T-C-G-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-C-G-C-C-G-G-T-T-C-G-A-A-C-C-G-G-3’(SEQ IDNO:4)；
5’-T-C-G-C-G-A-C-G-T-T-C-G-T-C-G-T-C-G-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3’(SEQ IDNO:5)；
5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-G-T-C-G-T-T-G-T-C-G-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3’(SEQID NO:6)；
5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-G-T-C-G-C-C-G-C-G-T-A-C-G-T-A-C-G-C-G-G-3’(SEQ IDNO:7)；
5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-G-T-C-G-C-C-G-C-G-T-T-C-G-A-A-C-G-C-G-G-3’(SEQ IDNO:8)；
(C)5’-G-G-G-G-C-G-C-G-A-C-G-C-G-T-C-G-C-G-G-G-G-G-G-3’(SEQ ID NO:15)；
5’-G-G-G-G-G-C-G-A-C-G-C-G-T-C-G-C-G-G-G-G-G-3’(SEQ ID NO:16)；和
(D)5’-T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-T-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3’(SEQ ID NO:17)；
5’-T-C-G-T-C-G-A-C-G-A-T-A-C-G-G-C-G-C-G-C-G-C-C-G-3’(SEQ ID NO:18)。
2.权利要求1所述的CpG寡聚核苷酸，其还包含修饰，所述修饰选自硫代修饰、甲氧基修饰和氟代修饰。
3.权利要求1或2所述的CpG寡聚核苷酸，其中所述CpG寡聚核苷酸中的至少一个磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。
4.权利要求3所述的CpG寡聚核苷酸，其中所述CpG寡聚核苷酸中的所有磷酸二酯键被硫代磷酸酯键取代。
5.权利要求1-4中任一项所述的CpG寡聚核苷酸，其为单链或双链。
6.一种缀合物，其包含前述权利要求中任一项所述的CpG寡聚核苷酸缀合于纳米粒子。
7.权利要求6所述的缀合物，其中所述纳米粒子选自PLGA、壳聚糖、脂质体和脂质模块。
8.权利要求6或7所述的缀合物，其中所述CpG寡聚核苷酸经由磷酸二酯键或硫代磷酸酯键缀合于纳米粒子。
9.一种组合物，其包含权利要求1-5中任一项的CpG寡聚核苷酸或权利要求6-8中任一项的缀合物，以及药学上可接受的载剂。
10.权利要求1-5中任一项的CpG寡聚核苷酸或权利要求6-8中任一项的缀合物用作佐剂的用途。
11.权利要求1-5中任一项的CpG寡聚核苷酸与MF59或ISA201组合用作佐剂的用途。
12.权利要求1-5任一项所述的CpG寡聚核苷酸或权利要求6-8中任一项的缀合物在制备提高免疫细胞增殖功能或提高免疫细胞细胞因子释放功能的药物中的用途。
13.权利要求1-5任一项所述的CpG寡聚核苷酸或权利要求6-8中任一项的缀合物在制备预防或治疗病毒感染、细菌感染性疾病、真菌感染性疾病或寄生虫感染性疾病的药物中的用途。
14.权利要求13的用途，其中所述病毒感染选自COVID-19感染、流感病毒感染和呼吸道合胞病毒感染。
15.权利要求13的用途，其中所述细菌感染性疾病或真菌感染性疾病或寄生虫感染性疾病发生在呼吸道。
16.权利要求1-5任一项所述的CpG寡聚核苷酸或权利要求6-8中任一项的缀合物或权利要求9的组合物在制备用于预防或治疗肿瘤的药物中的用途。
17.权利要求1-5任一项所述的CpG寡聚核苷酸或权利要求6-8中任一项的缀合物在制备疫苗组合物中的用途。
18.权利要求17的用途，其中所述疫苗组合物为人用或动物用疫苗组合物，例如猪用疫苗组合物。
19.权利要求17的用途，其中所述疫苗组合物为预防或治疗病毒感染、细菌感染性疾病、真菌感染性疾病或寄生虫感染性疾病的疫苗组合物。
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