CN116200394A - CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用。本发明的CpG寡聚脱氧核苷酸具有如SEQ ID NO.3‑6、9任一条所示的序列，优选具有如SEQ ID NO.3‑6所示的序列。本发明的CpG寡聚脱氧核苷酸能有效激活人体或动物免疫系统，具有广谱预防和治疗病原微生物感染的功能；具有提高共用疫苗的免疫原性的功能，能作为人或动物疫苗佐剂应用。

Description

CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及CpG寡聚脱氧核苷酸及其应用。
背景技术
疫苗可分为全病原体疫苗及亚单位疫苗：全病原体疫苗是传统疫苗，由病毒颗粒、细菌或其他病原体组成，该等病原体在培养基中生长，以减毒形式或者被灭活以破坏其致病能力。亚单位疫苗主要包括重组蛋白疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等，通常被归类为创新型疫苗。创新型疫苗由于它们的安全性和容易扩大生产的特性已成为更具吸引力的疫苗。然而，这些疫苗由于只使用生物体的特定部分而只能产生微弱的免疫应答。因此，需要佐剂和传递系统以合适的方式传递抗原并且激发强烈的免疫反应。
佐剂是加入到疫苗抗原中可以增强、调节抗原免疫原性的物质，佐剂有诸多优点，如减少免疫针次、减少抗原用量、增强免疫反应等。传统铝盐佐剂，包括氢氧化铝和磷酸铝和其组合物的应用最为广泛。自从1926年被发现至今已使用接近100年，能激活Th2型免疫反应，即体液免疫反应。但在实际应用中，单独使用低剂量的铝盐佐剂对疫苗的免疫增强作用有限，而提高剂量的铝盐佐剂在使用时常出现注射部位肿胀、出现肉芽肿、发烧、疼痛、发生过敏等副反应。因此，研制更为广谱、安全、有效又兼具可大规模生产的理想佐剂迫在眉睫。
CpG-ODN是人工合成的含有非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的寡脱氧核苷酸(ODN)，可模拟细菌DNA刺激多种哺乳动物包括人的免疫细胞。根据不同的化学结构和生物学特性，不同类型的CpG-ODN的结构特征与免疫效应各有不同，一般分为A、B、C三类。A类CpG-ODN以含有CpG二核苷酸的回文序列为核心，两端为poly G尾，磷酸二酯键骨架为部分硫代修饰，通过回文序列和poly G形成高级结构，能够活化浆细胞样树突状细胞诱生大量I型干扰素，对B细胞活性弱。B类CpG-ODN是一种全硫代修饰的线性CpG ODN，对B细胞有很强的免疫刺激活性，但不能活化浆细胞样树突状细胞。C类CpG-ODN是一类全硫代修饰的CpGODN，能通过回文序列形成二聚体，兼具A型和B型CpG-ODN的活性，既能活化浆细胞样树突状细胞，又能活化B细胞。
CpG ODN的免疫刺激活性具有结构特异性，影响其免疫刺激活性的因素有多种，至今仍有许多环节尚待进一步探讨。目前研究较多的有骨架结构、侧翼序列、末端Ploy G修饰和基序数量和位置。骨架结构包括寡核苷酸链的长度和骨架修饰，但关于何种长度有利于形成较强的免疫刺激作用尚没有定论。例如，Yamamot等人认为具有刺激作用的序列长度最短为30个碱基，然而，Zuhai K等人认为具有刺激作用的序列最短可以为15个碱基。另有报道称链长度在20bp、21bp和24bp时免疫刺激作用较强，而在16bp、27bp和30bp时免疫刺激作用较弱，但实际研究时也发现了多种不符合此规律的情况。此外，CpG ODN免疫刺激作用强弱与其游离的5’端关系密切，大多数研究者认为TLR9受体对CpG ODN的识别和结合是5’端依赖的，但有人将ODN的5’端和3’端相连形成环状结构后活性依然存在，说明CpG ODN免疫刺激作用强弱与结构的关系也没有定论。而且，虽然本领域公认CpG基序在序列中的数量、距离远近、空间连接和5’端碱基组成，均对CpG ODN的免疫刺激活性具有影响。但至今尚无系统的分析，无法确定何种设计原则必然能提升免疫刺激作用。
现有的CpG寡聚脱氧核苷酸，已经在临床上作为免疫增强剂或者疫苗佐剂使用的有CpG 1018、CpG7909和CpG55.2等，但其免疫增强效果仍有进一步提升的必要。
发明内容
本发明的目的主要在于提供能有效激活人体或动物免疫系统，具有广谱预防和治疗病原微生物感染功能的CpG寡聚脱氧核苷酸序列。
本发明的具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供CpG寡聚脱氧核苷酸，其具有如SEQ ID NO.3-6、9任一条所示的序列。优选具有如SEQ ID NO.3-6所示的序列。
本发明的CpG寡聚脱氧核苷酸是含有未甲基化胞嘧啶鸟嘌呤的免疫刺激性寡聚核苷酸，大小在10到100个碱基之间，该寡聚核苷酸由未经修饰或经过修饰的核苷酸单体组成。其具有广谱预防和治疗病原微生物感染包括但不限于病毒、细菌、真菌、寄生虫导致的疾病的功能；具有作为人或动物抗感染性疫苗佐剂的功能；可以通过系统性或局部给药达到预防和治疗疾病的目的。
本发明的CpG寡聚脱氧核苷酸是人工合成得到的白色、类白色至淡黄色疏松CpGODN纯化产物。本发明基于小鼠血清中抗体水平检测CpG ODN对IgG的激活作用，基于小鼠脾细胞检测CpG ODN对细胞增殖的影响，基于小鼠脾脏淋巴细胞检测CpG ODN对IFNγ和IL-2+等细胞因子释放的刺激作用，验证了其对B细胞和T细胞的功效。
本发明的CpG寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN序列)可包含一种或多种化学修饰，所述化学修饰的类型包括但不限于硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、纳米粒子修饰中的一种或多种。纳米粒子修饰包括但不限于PLGA、壳聚糖和脂质体中的一种或多种。
优选，所述CpG寡聚脱氧核苷酸经过全硫代修饰。
未甲基化的寡聚核苷酸在机体内很容易被降解，本发明通过硫代磷酸酯修饰增强了CpG ODN抗核酸酶降解的能力，延长了作用时间。
本发明的CpG ODN序列经人工合成后还可包括纯化及脱盐步骤。
第二方面，本发明提供上述CpG寡聚脱氧核苷酸在以下任一方面的应用：
(1)制备提高机体免疫功能的药物；
(2)制备提高免疫细胞增殖功能的药物；
(3)制备提高免疫细胞细胞因子释放功能的药物；
(4)制备预防和治疗病毒对机体感染的药物；
(5)制备预防和治疗呼吸道细菌感染性疾病的药物；
(6)制备预防和治疗呼吸道真菌感染性疾病的药物；
(7)制备预防和治疗呼吸道寄生虫感染性疾病的药物；
(8)制备治疗肿瘤的药物；
(9)制备人用疫苗；
(10)制备动物用疫苗。
本发明的应用中，所述病毒为COVID-19病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒或带状疱疹病毒。
本发明的应用中，所述治疗肿瘤的药物中所述的CpG寡聚脱氧核苷酸作为唯一的活性成分，或作为活性成分之一，或作为活性成分的佐剂。
本发明的应用中，所述药物的给药方式为全身给药或局部给药。
本发明的应用中，所述药物的给药方式包括但不限于鼻喷给药、肺部吸入、口服、肛门给药、生殖道给药、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、肿瘤内注射、静脉注射、粘膜施用中的一种或多种。
本发明的CpG ODN序列(免疫调节核酸)可以是双链也可以是单链。一般而言，在体内双链分子更加稳定，而单链分子能增强免疫活性。因此在本发明中，一般最佳选择为单链核酸分子，而根据其他需求，也可选择为双链分子。
本发明的免疫调节核酸用于治疗时，可以单独使用或与其它治疗剂联合使用。如免疫调节核酸可以与抗原同时使用诱导产生能够降低或消除感染性病原的抗原特异的体液或粘膜免疫反应。
本发明的免疫调节核酸还可以与其它治疗性制剂包括抗微生物制剂，佐剂，细胞因子，抗癌制剂，治疗药物，治疗药物及其它类似物进行联合使用。
用于治疗目的时，有效用量的免疫调节核酸通过任何将核酸导入局部或全身的方法进行施用。
口服施用时，本发明免疫调节核酸可以与药学界认可的活性化合物赋形剂(如，填充剂、分散剂、结合剂等)联合组成制剂。所述赋形剂能使本发明的成份形成片剂，丸剂，糖衣丸，胶囊，液体制剂，凝胶剂，糖浆剂，膏剂，悬浊液及适用于治疗对象口服摄取的类似制剂。
吸入施用时，本发明免疫调节核酸能通过使用密封装置或含适当推进气体(如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它适当气体)的喷雾器进行施用。
注射施用时，注射液可为在油或水介质中的悬浮液、溶液或乳状液。其中可含有防腐剂悬浮剂，稳定剂和/或分散剂。
本发明的有益效果至少在于：
本发明全新设计并合成的CpG寡聚脱氧核苷酸序列，能有效激活人体或动物免疫系统，具有广谱预防和治疗病原微生物感染的功能；具有提高共用疫苗的免疫原性的功能，能作为人或动物疫苗佐剂应用；对比已上市CpG 1018可以显著提高免疫增强效果。
附图说明
图1为本发明实施例2的不同CpG ODN对IgG的激活作用结果；
图2为本发明实施例2的不同CpG ODN对细胞增殖的影响结果；
图3为本发明实施例2的不同CpG ODN对IFNγ和IL-2细胞因子释放的刺激作用结果；
图4为本发明实施例3的不同疫苗和佐剂组合对IgG激活作用的效果；
图5为本发明实施例3的不同疫苗和佐剂组合对IFNγ释放的刺激作用结果；
图6为本发明实施例3的不同疫苗和佐剂组合对IL-2释放的刺激作用结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。
实施例1CpG ODN分子的设计与合成
本发明共设计了9条CpG ODN序列(其中，序列1、2、7、8为对比序列)，并委托基因合成公司进行人工合成。
序列1-8为不含回文结构、全硫代修饰的B型CpG ODN，序列9为含回文结构、全硫代修饰的C型CpG ODN，CpG1018为对照CpG。
序列1：5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-T-T-G-T-T-T-T-G-T-C-G-T-T-3’(SEQ ID NO.1)；
序列2：5’-T-C-G-T-G-C-G-T-T-T-T-T-G-T-T-T-T-G-T-C-G-T-T-T-3’(SEQ IDNO.2)；
序列3：5’-T-C-G-T-G-C-C-G-T-G-C-C-G-T-T-T-T-G-T-C-G-C-G-T-3’(SEQ IDNO.3)；
序列4：5’-T-C-G-T-G-C-G-T-T-T-T-T-G-T-T-T-T-G-T-C-G-C-G-T-3’(SEQ IDNO.4)；
序列5：5’-T-C-G-T-G-C-C-G-T-T-T-T-G-T-C-G-C-G-T-C-G-C-G-T-3’(SEQ IDNO.5)；
序列6：5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-T-G-T-C-G-T-T-T-G-T-C-G-C-G-T-3’(SEQ IDNO.6)；
序列7：5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-T-G-T-C-G-T-T-3’(SEQ ID NO.7)；
序列8：5’-T-C-G-A-C-G-T-T-T-T-T-G-T-T-T-T-G-A-C-G-T-T-C-T-3’(SEQ IDNO.8)；
序列9：5’-T-C-G-T-C-G-T-T-T-T-T-A-A-A-A-A-C-G-A-C-G-A-3’(SEQ ID NO.9)；
CpG1018：5′-T-G-A-C-T-G-T-G-A-A-C-G-T-T-C-G-A-G-A-T-G-A-3′(SEQ IDNO.10)。
实施例2动物实验1
本实施例通过动物模型评估实施例1中的10条CpG ODN序列对疫苗的免疫促进作用。
一、小鼠免疫
将C57BL/6J小鼠(6-8周龄，14-20克，购于中国医学科学院医学生物学研究所实验动物中心)随机分为实验组和对照组，每组10只，实验组腹部皮下注射含不同CpG ODNs序列的VZV(带状疱疹病毒)疫苗(活性成分部分来自葛兰素史克)，注射量为50μl/只，抗原免疫量为5μg/只，CpG免疫量为10μg/只，对照组每只注射50μl不含CpG ODNs序列的VZV疫苗，抗原免疫量为5μg/只，14天后，加强免疫一次。
二、Elisa试剂盒检测特异性抗体IgG
1.C57BL/6J小鼠加强免疫14天后，摘眼球采血，每只小鼠的血收集于1.5ml EP管中，迅速将血样放置于4℃冰箱中，4小时后分离血清，采用冷冻离心机于4℃，3500rpm离心15min，吸取上清至标记好序号的新管中，-20℃冻存，以备抗体检测使用。
2.取出反应板，设置实验孔和对照孔。
3.将96孔板(Corning)用10μg/孔浓度的抗原包被，4℃过夜。
4.弃孔中溶液，用含2％牛血清白蛋白的PBS封闭孔板，200μl/孔，37℃孵育2小时。
5.甩干，洗板3次。
6.对照孔各加入PBS 100μl；实验孔加入1:200稀释的血清样品100μl，在培养箱中孵育1.5小时。
7.洗涤平板，每孔加入辣根过氧化物酶标记的IgG检测抗体(赛默飞)100μl，培养箱孵育1小时。
8.弃去液体，将平板洗涤5次，每孔加入100μl显色液(购自B D)，轻轻混匀10秒，室温温育20分钟。
9.每孔加入100μl 0.2M的H2SO4终止反应。30分钟内使用酶标仪在450nm处读取吸光值。
结果见图1。从图1可以看出，CpG ODN具有不同程度促进IgG抗体分泌的能力，其中序列3-6效果显著，序列6的效果最佳。VZV抗原+序列6组比单一VZV抗原组提高了378％，比VZV抗原+CpG1018组提高了150％。
三、小鼠脾细胞的制备
C57BL/6J小鼠加强免疫14天后，摘眼球取血并处死，无菌取脾，在有少量细胞培养液的平皿中，用注射器芯将脾脏挤压通过200目的钢丝网筛，得到单个细胞悬液，洗涤液洗涤细胞2次。1000rpm，5min离心。弃上清，加入1ml红细胞裂解液，弹起沉淀物，室温放置3-5分钟，加入1640培养液4ml，混匀，1500rpm离心5min，管底白色沉淀用培养液重悬洗涤一次，弹匀细胞，加入10％ FBS 1640培养液，用滴管轻轻吹打均匀，用台盼蓝染色后，计数单个核细胞数目并计算出活细胞百分率。
四、CCK-8试剂盒(GLPBIO)测定CpG ODNs对小鼠脾脏细胞的刺激增殖活性
1.在96孔板中接种细胞悬液100μl/孔，细胞浓度为1×105个/ml，将培养板放在培养箱中预培养24小时。
2.向培养板加入10μl含不同CpG序列的VZV疫苗，CpG浓度0.2mg/ml，抗原浓度0.1mg/ml。另设不含CpG ODNs序列的VZV疫苗组作为对照，抗原浓度为0.1mg/ml。
3.将培养板放在培养箱孵育96小时。
4.向每孔加入10μl的CCK-8溶液。
5.将培养板放在培养箱内孵育4小时。
6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
结果见图2。由图2可以看出，序列2、7、8对细胞活性无明显的促进作用。序列3-6对细胞活性的促进作用比较明显，其中最显著的是序列3。VZV抗原+序列3组吸光值是单一VZV抗原组的5.5倍，是VZV抗原+CpG1018组的1.4倍。
五、CpG ODNs刺激小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IFNγ及IL-2含量的检测
1.按照试剂盒(IFNγ试剂盒：U-CyTech；IL-2试剂盒：mabtech)说明书要求，稀释捕获抗体，100μl/孔，4℃包被过夜。
2.次日倾倒包被液，无菌PBS洗涤3遍，再用含10％ FBS的1640培养基进行封闭，200μl/孔，室温封闭2小时。
3.用10％ FBS RPMI-1640培养液稀释小鼠脾细胞至所需浓度(IFNγ检测：2×105个/ml；IL-2检测：5×105个/ml)。
4.弃封闭液，加入脾淋巴细胞(细胞浓度：IFNγ检测：2×105个/ml；IL-2检测：5×105个/ml)，100μl/孔，实验孔加入带CpG的VZV疫苗，CpG浓度0.2mg/ml，抗原0.1mg/ml，阴性对照孔中不加刺激物，ConA作为阳性对照，另设不含CpG ODNs序列的VZV疫苗组作为对照，抗原浓度为0.1mg/ml，培养箱中培养48小时。
5.倾倒培养基，以200μl/孔冰冷的去离子水，4℃冰浴20分钟裂解细胞。
6.用PBST洗板4次，加入生物素标记抗体，100μl/孔，室温避光孵育1小时。
7.PBST洗板4次，加入酶标亲和素，100μl/孔，室温避光孵育1小时。
8.用PBST洗板3次，再用PBS洗板2次，加入底物显色液，100μl/孔，室温下避光显色15-20分钟。
9.去离子水终止色反应，斑点分析仪进行斑点计数。
结果见图3。从细胞因子表达水平图(图3)中可以看出，序列3-6免疫的小鼠脾淋巴细胞中IFNγ及IL-2的表达水平均较高。IFNγ比无佐剂组高出7.9～16.6倍，比CpG1018组高出3.5～7.2倍；IL-2比无佐剂组高出6.0～7.6倍，比CpG1018组高出4.0～5.1倍。除序列3-6外，序列9对细胞因子IFNγ及IL-2的促进作用也较明显。
实施例3动物实验2
由实施例2可知CpG ODN序列3-6的免疫促进作用较显著，所以本实施例进一步通过动物模型评估实施例1中CpG ODN序列3-6与不同疫苗组合的免疫促进作用。
一、小鼠免疫
将C57BL/6J小鼠(6-8周龄，14-20克，购于中国医学科学院医学生物学研究所实验动物中心)随机分为9个实验组和3个对照组，每组10只，实验组腹部皮下注射不同疫苗和佐剂的组合物：COVID-19疫苗(智飞生物)，注射100μl/只，抗原免疫量5μg/只；流感疫苗(华兰生物四价(H1N1、H3N2、Bv和By)流感病毒裂解疫苗)，注射160μl/只，抗原免疫量5μg/只/亚型；HPV疫苗(默沙东，二价(HPV16、HPV18型))，注射100μl/只，抗原免疫量HPV16：8μg/只，HPV18：4μg/只；CpG ODN序列3-6分别免疫量为10μg/只；CpG1018免疫量为10μg/只；氢氧化铝佐剂免疫量为50μg/只，对照组注射和实验组相同量的不含佐剂的相应疫苗，14天后，加强免疫一次。
二、Elisa试剂盒检测特异性抗体IgG
1、C57BL/6J小鼠加强免疫14天后，摘眼球采血，每只小鼠的血收集于1.5ml EP管中，迅速将血样放置于4℃冰箱中，4小时后分离血清，采用冷冻离心机于4℃，3500rpm离心15min，吸取上清至标记好序号的新管中，-20℃冻存，以备抗体检测使用。
2、取出反应板，设置实验孔和对照孔。
3、将96孔板(Corning)用10μg/孔浓度的抗原包被，4℃过夜。
4、弃孔中溶液，用含2％牛血清白蛋白的PBS封闭孔板，200μl/孔，37℃孵育2小时。
5、甩干，洗板3次。
6、对照孔各加入PBS 100μl；实验孔加入1:200稀释的血清样品100μl，在培养箱中孵育1.5小时。
7、洗涤平板，每孔加入辣根过氧化物酶标记的IgG检测抗体(赛默飞)100μl，培养箱孵育1小时。
8、弃去液体，将平板洗涤5次，每孔加入100μl显色液(购自B D)，轻轻混匀10秒，室温温育20分钟。
9、每孔加入100μl 0.2M的H2SO4终止反应。30分钟内使用酶标仪在450nm处读取吸光值。
结果见图4。从图4中可以看出，CpG ODN序列3-6分别与COVID-19、流感和HPV疫苗组合免疫后，对IgG均有显著的免疫促进作用，在COVID-19疫苗组，CpG ODN序列3-6与疫苗组合后比单独疫苗、CpG1018和铝佐剂与疫苗组合组分别提高了4～6倍、3.5～5.4倍和0.7～1.4倍；在流感疫苗组，CpG ODN序列3-6与流感疫苗组合后比单独疫苗、CpG1018和铝佐剂与疫苗组合组分别提高了7.8～11.1倍、0.3～0.8倍和0.2～0.7倍；在HPV疫苗组，CpG ODN序列3-6与HPV疫苗组合后比单独疫苗、CpG1018和铝佐剂与疫苗组合组分别提高了7.6～9.8倍、1～1.6倍和2.4～3.3倍。比临床获批的CpG1018和铝佐剂对IgG分泌的促进作用均较显著提高。
三、小鼠脾细胞的制备
C57BL/6J小鼠加强免疫14天后，摘眼球取血并处死，无菌取脾，在有少量细胞培养液的平皿中，用注射器芯将脾脏挤压通过200目的钢丝网筛，得到单个细胞悬液，洗涤液洗涤细胞2次。1000rpm，5min离心。弃上清，加入1ml红细胞裂解液，弹起沉淀物，室温放置3-5分钟，加入1640培养液4ml，混匀，1500rpm离心5min，管底白色沉淀用培养液重悬洗涤一次，弹匀细胞，加入10％ FBS 1640培养液，用滴管轻轻吹打均匀，用台盼蓝染色后，计数单个核细胞数目并计算出活细胞百分率。
四、不同疫苗和佐剂组合刺激小鼠脾细胞培养上清中细胞因子IFNγ及IL-2含量的检测
1、按照试剂盒(IFNγ试剂盒：U-CyTech；IL-2试剂盒：mabtech)说明书要求，稀释捕获抗体，100μl/孔，4℃包被过夜。
2、次日倾倒包被液，无菌PBS洗涤3遍，再用含10％ FBS的1640培养基进行封闭，200μl/孔，室温封闭2小时。
3、用10％ FBS RPMI-1640培养液稀释小鼠脾细胞至所需浓度(IFNγ检测：2×105个/ml；IL-2检测：5×105个/ml)。
4、弃封闭液，加入脾淋巴细胞(细胞浓度：IFNγ检测：2×105个/ml；IL-2检测：5×105个/ml)，100μl/孔，实验孔加入带不同佐剂的疫苗，CpG ODN序列3-6的浓度分别为0.2mg/ml，CpG1018的浓度为0.2mg/ml，氢氧化铝浓度为1.0mg/ml，抗原浓度分别为COVID-19 0.05mg/ml，流感疫苗四个亚型均为0.03mg/ml，HPV疫苗HPV16型0.08mg/ml，HPV18型0.04mg/ml，阴性对照孔中不加刺激物，ConA作为阳性对照，另设不含佐剂的疫苗组作为对照，抗原浓度与实验组相同，培养箱中培养48小时。
5、倾倒培养基，以200μl/孔冰冷的去离子水，4℃冰浴20分钟裂解细胞。
6、用PBST洗板4次，加入生物素标记抗体，100μl/孔，室温避光孵育1小时。
7、PBST洗板4次，加入酶标亲和素，100μl/孔，室温避光孵育1小时。
8、用PBST洗板3次，再用PBS洗板2次，加入底物显色液，100μl/孔，室温下避光显色15-20分钟。
9、去离子水终止色反应，斑点分析仪进行斑点计数。
结果见图5-图6。从IFNγ和IL-2表达水平图5-图6中可以看出，序列3-6与COVID-19疫苗、流感疫苗和HPV疫苗组合后，对IFNγ和IL-2的刺激分泌作用显著增加。结合图4分析，序列3-6与CpG1018和铝佐剂相比，更加适合与COVID-19疫苗、流感疫苗和HPV疫苗组合使用。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，具有如SEQ ID NO.3-6、9任一条所示的序列。
2.根据权利要求1所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，具有如SEQ ID NO.3-6所示的序列。
3.根据权利要求1或2所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸含有化学修饰，所述化学修饰的类型包括但不限于硫代修饰、甲氧基修饰、氟代修饰、纳米粒子修饰中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述纳米粒子修饰包括但不限于PLGA、壳聚糖、脂质体中的一种或多种。
5.根据权利要求3所述的CpG寡聚脱氧核苷酸，其特征在于，所述CpG寡聚脱氧核苷酸经过全硫代修饰。
6.权利要求1-5任一项所述的CpG寡聚脱氧核苷酸在以下任一方面的应用：
(1)制备提高机体免疫功能的药物；
(2)制备提高免疫细胞增殖功能的药物；
(3)制备提高免疫细胞细胞因子释放功能的药物；
(4)制备预防和治疗病毒对机体感染的药物；
(5)制备预防和治疗呼吸道细菌感染性疾病的药物；
(6)制备预防和治疗呼吸道真菌感染性疾病的药物；
(7)制备预防和治疗呼吸道寄生虫感染性疾病的药物；
(8)制备治疗肿瘤的药物；
(9)制备人用疫苗；
(10)制备动物用疫苗。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述病毒为COVID-19病毒、流感病毒、人乳头瘤病毒或带状疱疹病毒。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述治疗肿瘤的药物中所述的CpG寡聚脱氧核苷酸作为唯一的活性成分，或作为活性成分之一，或作为活性成分的佐剂。
9.根据权利要求6-8任一项所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式为全身给药或局部给药。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物的给药方式包括但不限于鼻喷给药、肺部吸入、口服、肛门给药、生殖道给药、皮下注射、皮内注射、肌肉注射、肿瘤内注射、静脉注射、粘膜施用中的一种或多种。
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