CN117050856A - 一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱及其应用，属于医学检测技术领域。本发明的富集结核分枝杆菌核酸的分析柱，包括预处理柱和富集柱；所述预处理柱包括上层蛋白吸附微球、中层滤纸和下层葡聚糖凝胶微球；所述富集柱包括上层石英砂、中层纳米材料和下层石英砂。本发明的分析柱，能够大体积去除胸水样本中的蛋白和脂类，吸附游离的结核分枝杆菌核酸，解决传统离心富集结核分枝杆菌过程中结核分枝杆菌丢失的问题，提高结核分枝杆菌的检出率。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱及其应用。
背景技术
肺部结核病是由结核分枝杆菌引起，伴随着医学上对结核分枝杆菌的生物学特性、致病机制、耐药机制、诊断方法、抗结核药物的研制等方面都取得了一定的成就，但是肺部结核病仍然是影响人类健康流行性最广、病死率最高的感染性疾病之一。目前，肺部结核病仍然是一个全球性的公共卫生挑战。如何预防和治疗结核病成为临床上一个重要课题，如何准确、高效检测结核分枝杆菌成为一个有效预防和治疗的手段。
伴随着分子生物学聚合酶链反应(PCR)和基因组测序技术检测方法的进展，可实现结核分枝杆菌检测，在临床上主要采用培养结核分枝杆菌的方法，对其进行扩增而实现结核分枝杆菌的检出；但在临床实际应用上发现，结核分枝杆菌的检出率不高，主要问题出现在样本处理上，不能从痰液、胸腔积液、或肺部冲洗液样本标本中捕获和富集足够用于检测的结核分枝杆菌。目前，如何从胸腔积液的检测样本中快速、高效、准确的富集结核分枝杆菌成为一个技术难点和一个急需解决的问题，传统的DNA核酸纯化方法不能解决上述问题。因此，亟需开发一种从胸水中富集纯化结核分枝杆菌核酸的设备和方法，以满足临床检验合格样本要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱及其应用。本发明的分析柱，能够大体积去除胸水样本中的蛋白和脂类，吸附游离的结核分枝杆菌核酸，解决传统离心富集结核分枝杆菌过程中结核分枝杆菌丢失的问题，提高结核分枝杆菌的检出率。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱，包括预处理柱和富集柱；所述预处理柱包括上层蛋白吸附微球、中层滤纸和下层葡聚糖凝胶微球；所述富集柱包括上层石英砂、中层纳米材料和下层石英砂。
优选的，所述上层蛋白吸附微球为右旋糖酐吸附微球、纤维素吸附微球和琼脂糖吸附微球的一种或多种，所述上层蛋白吸附微球的粒径为5.0～8.0μm；所述中层滤纸为天然纤维滤纸、玻璃纤维滤纸和化学纤维滤纸的一种或多种，所述中层滤纸的孔径为3.0～4.0μm；所述下层葡聚糖凝胶微球为葡聚糖凝胶G-25、葡聚糖凝胶G-50和葡聚糖凝胶G-75的一种或多种，所述下层葡聚糖凝胶微球的粒径为5.0～6.0μm；所述中层纳米材料为氧化石墨烯、纳米还原石墨烯或纳米二氧化硅的一种或多种，所述中层纳米材料的粒径小于1.5nm；所述上层石英砂和下层石英砂的粒径为500.0～800.0目。
优选的，所述上层蛋白吸附微球的铺设厚度为1.0～2.0cm；所述中层滤纸的铺设厚度为0.2～0.4μm；所述下层葡聚糖凝胶微球的铺设厚度为1.5～2.0cm；所述上层石英砂的铺设厚度为0.5～0.8cm；所述中层纳米材料的铺设厚度为1.5～2.5cm；所述下层石英砂的铺设厚度为0.5～0.8cm。
优选的，所述预处理柱的内径为1.8～2.2cm，长度为10.0～15.0cm；所述富集柱的内径为0.8～1.2cm，长度为6.0～10.0cm。
本发明还提供了一种上述分析柱在非诊断目的的富集胸水中结核分枝杆菌核酸的应用，包括如下步骤：
(1)采用所述预处理柱分离预处理后的胸水样本后，离心，得到一级滤液；
(2)对所述一级滤液进行再处理；
(3)采用所述富集柱纯化再处理后的一级滤液，弃滤液；
(4)对步骤(3)所述的富集柱进行清洗和洗脱，得到富集纯化后的核酸。
优选的，步骤(1)所述预处理为将胸水样本与蛋白酶K、SDS混合，得到混合溶液，再加入饱和酚氯仿溶液，静置，得到所述预处理后的胸水样本。
优选的，所述混合溶液中蛋白酶K的终浓度为50.0～100.0mg/mL，所述混合溶液中SDS的终浓度为10.0～20.0％；所述混合的温度为37.0～45.0℃，时间为8.0～12.0h；所述饱和酚氯仿溶液与所述混合溶液的体积比为1：(2～4)；所述静置的温度为20.0～30.0℃，时间为25.0～35.0min。
优选的，步骤(1)所述分离的温度为20.0～30.0℃，时间为25.0～35.0min；所述离心的温度为2.0～8.0℃，转速为3000～5000rpm，时间为5.0～10.0min。
优选的，步骤(2)所述再处理为向所述一级滤液中加入Tris-HCl溶液，静置，得到再处理后的一级滤液；所述Tris-HCl溶液的pH为8.0～10.0，浓度为4.0～6.0mol/L；所述Tris-HCl溶液与所述一级滤液的体积比为1：(1.5～3.0)；所述静置的时间为10.0～20.0min。
优选的，步骤(3)所述纯化的温度为2.0～8.0℃，转速为3000～5000rpm，时间为5.0～10.0min。
优选的，所述清洗用的溶液为体积分数为45.0～75.0％的乙醇溶液，所述清洗的次数为2～3次；所述洗脱为将10.0～20.0μL的水加入所述清洗后的富集柱中，离心收集纯化后的核酸。
本发明提供了一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱及其应用。本发明的分析柱包括预处理柱和富集柱(如图1所示)，预处理柱的上层蛋白吸附微球材料具有吸附变性残余纤维蛋白、白蛋白或酶蛋白、去除细胞碎片的作用；中间层滤纸具有过滤去除细胞碎片、结晶体、有机溶剂酚氯仿溶液的作用；下层葡聚糖凝胶微球具有去除胸水中的阴、阳离子而获得纯化DNA溶液的作用有利于蛋白酶K的活化。富集柱的上层和下层石英砂具有过滤、吸附和净化的作用；中层纳米材料具有比表面积大和DNA特异性吸附的特性，可大量特异性吸附细胞或细菌被裂解的或游离的DNA。
本发明富集结核分枝杆菌核酸的方法中包括裂解步骤，通过蛋白酶K和SDS溶液，可以使得人体DNA、细菌或结核分枝杆菌的DNA完全从组蛋白结合状态分离，避免在蛋白和脂类物质变性去除过程中DNA丢失。本发明采用高盐高pH盐溶液去改变DNA的极性，使得纳米材料对DNA产生特异性的吸附。再通过本发明的纳米结构多级分析柱，可以大体积的纯化富集胸水中的核酸，解决了传统离心富集结核分枝杆菌过程中结核分枝杆菌丢失的问题，降低了实验操作者气溶胶感染可能性。
附图说明
图1为本发明分析柱的结构示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱，包括预处理柱和富集柱；所述预处理柱包括上层蛋白吸附微球、中层滤纸和下层葡聚糖凝胶微球；所述富集柱包括上层石英砂、中层纳米材料和下层石英砂。
在本发明中，所述上层蛋白吸附微球优选为右旋糖酐吸附微球、纤维素吸附微球和琼脂糖吸附微球的一种或多种；进一步优选为琼脂糖吸附微球。
在本发明中，所述上层蛋白吸附微球的粒径优选为5.0～8.0μm，进一步优选为5～6μm。
在本发明中，所述中层滤纸优选为天然纤维滤纸、玻璃纤维滤纸和化学纤维滤纸的一种或多种，进一步优选为玻璃纤维滤纸。
在本发明中，所述中层滤纸的孔径优选为3.0～4.0μm，进一步优选为3.0μm。
在本发明中，所述下层葡聚糖凝胶微球优选为葡聚糖凝胶G-25、葡聚糖凝胶G-50和葡聚糖凝胶G-75的一种或多种，进一步优选为葡聚糖凝胶G-50。
在本发明中，所述下层葡聚糖凝胶微球的粒径优选为5.0～6.0μm。
在本发明中，所述中层纳米材料优选为氧化石墨烯、纳米还原石墨烯或纳米二氧化硅的一种或多种，进一步优选为纳米还原石墨烯。
在本发明中，所述中层纳米材料的粒径优选小于1.5nm，进一步优选小于1.0nm。
在本发明中，所述上层石英砂的粒径优选为500.0～800.0目，进一步优选为800.0目。
在本发明中，所述下层石英砂的粒径优选为500.0～800.0目，进一步优选为500.0目。
在本发明中，所述上层蛋白吸附微球的铺设厚度优选为1.0～2.0cm，进一步优选为2.0cm。
在本发明中，所述中层滤纸的铺设厚度优选为0.2～0.4μm，进一步优选为0.4μm。
在本发明中，所述下层葡聚糖凝胶微球的铺设厚度优选为1.5～2.0cm，进一步优选为2.0cm。
在本发明中，所述上层石英砂的铺设厚度优选为0.5～0.8cm，进一步优选为0.5cm。
在本发明中，所述中层纳米材料的铺设厚度优选为1.5～2.5cm，进一步优选为2.0cm。
在本发明中，所述下层石英砂的铺设厚度优选为0.5～0.8cm，进一步优选为0.5cm。
在本发明中，所述预处理柱的内径优选为1.8～2.2cm，进一步优选为2.0cm。
在本发明中，所述预处理柱的长度优选为10.0～15.0cm，进一步优选为12.0cm。
在本发明中，所述富集柱的内径优选为0.8～1.2cm，进一步优选为1.0cm。
在本发明中，所述富集柱的长度优选为6.0～10.0cm，进一步优选为8.0cm。
本发明还提供了一种上述分析柱在非诊断目的的富集胸水中结核分枝杆菌核酸的应用，包括如下步骤：
(1)采用所述预处理柱分离预处理后的胸水样本后，离心，得到一级滤液；
(2)对所述一级滤液进行再处理；
(3)采用所述富集柱纯化再处理后的一级滤液，弃滤液；
(4)对步骤(3)所述的富集柱进行清洗和洗脱，得到富集纯化后的核酸。
本发明采用所述预处理柱分离预处理后的胸水样本后，离心，得到一级滤液。
在本发明中，所述预处理优选为将胸水样本与蛋白酶K、SDS混合，得到混合溶液，再加入饱和酚氯仿溶液，静置，得到所述预处理后的胸水样本。
在本发明中，所述混合溶液中蛋白酶K的终浓度优选为50.0～100.0mg/mL，进一步优选为100.0mg/mL。
在本发明中，所述混合溶液中SDS的终浓度优选为10.0～20.0％，进一步优选为20.0％。
在本发明中，所述混合的温度优选为37.0～45.0℃，进一步优选为37.0℃。
在本发明中，所述混合的时间优选为8.0～12.0h，进一步优选为12.0h。
在本发明中，所述饱和酚氯仿溶液与所述混合溶液的体积比优选为1：(2～4)，进一步优选为1：3。
在本发明中，所述静置的温度优选为20.0～30.0℃，进一步优选为25.0℃。
在本发明中，所述静置的时间优选为25.0～35.0min，进一步优选为30.0min。
在本发明中，所述分离的温度优选为20.0～30.0℃，进一步优选为25.0℃。
在本发明中，所述分离的时间优选为25.0～35.0min，进一步优选为30.0min。
在本发明中，所述离心的温度优选为2.0～8.0℃，进一步优选为4.0℃。
在本发明中，所述离心的转速优选为3000～5000rpm，进一步优选为3000rpm。
在本发明中，所述离心的时间优选为5.0～10.0min，进一步优选为5.0min。
本发明对所述一级滤液进行再处理。
在本发明中，所述再处理优选为向所述一级滤液中加入Tris-HCl溶液，静置，得到再处理后的一级滤液。
在本发明中，所述Tris-HCl溶液的pH优选为8.0～10.0，进一步优选为10.0。
在本发明中，所述Tris-HCl溶液的浓度优选为4.0～6.0mol/L，进一步优选为5.0mol/L。
在本发明中，所述Tris-HCl溶液与所述一级滤液的体积比优选为1：(1.5～3.0)，进一步优选为1：2。
在本发明中，所述静置的时间优选为10.0～20.0min，进一步优选为15.0min。
本发明采用所述富集柱纯化再处理后的一级滤液，弃滤液。
在本发明中，所述纯化的温度优选为2.0～8.0℃，进一步优选为4.0℃。
在本发明中，所述纯化的转速优选为3000～5000rpm，进一步优选为3000rpm。
在本发明中，所述纯化的时间优选为5.0～10.0min，进一步优选为5.0min。
本发明对步骤(3)所述的富集柱进行清洗和洗脱，得到富集纯化后的核酸。
在本发明中，所述清洗用的溶液优选为体积分数为45.0～75.0％的乙醇溶液，进一步优选为体积分数为50.0％的乙醇溶液。
在本发明中，所述清洗的次数优选为2～3次，进一步优选为2次。
在本发明中，所述洗脱优选为将10.0～20.0μL的水加入所述清洗后的富集柱中，对洗脱液离心收集纯化后的核酸；进一步优选为将20.0μL的水加入所述清洗后的富集柱中，离心收集纯化后的核酸。
在本发明中，所述水优选为体外诊断试剂用纯化水。
在本发明中，所述离心的温度优选为2.0～8.0℃，进一步优选为4.0℃。
在本发明中，所述离心的转速优选为10000～15000rpm，进一步优选为12000rpm。
在本发明中，所述离心的时间优选为5.0～10.0min，进一步优选为5.0min。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供了一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱，具体制备过程如下：
(1)选用内径为2.0cm，长度为12.0cm的聚乙烯材质柱管，上层加入粒径为7.0～8.0μm的琼脂糖吸附微球，厚度为2.0cm；中层放入孔径为3.0μm的玻璃纤维滤纸，滤纸的厚度为0.4μm；下层放入粒径为5.0～6.0μm的葡聚糖凝胶G-50，厚度为2.0cm，压实，制成预处理柱；
(2)选用内径为1.0cm，长度为8.0cm的聚乙烯材质柱管，上层加入粒径为800.0目的石英砂，厚度为0.5cm；中层放入粒径<1.0nm的纳米氧化石墨烯，厚度为2.0cm；下层放入粒径为500.0目的石英砂，厚度为0.5cm，压实，制成富集柱。
本实施例还提供了上述制备的分析柱在非诊断目的的富集胸水中结核分枝杆菌核酸的应用，具体过程如下：
1)取结核性胸膜炎患者胸水样本10.0mL，加入蛋白酶K和SDS，得到混合溶液中，使混合溶液中蛋白酶K的浓度为100.0mg/mL，SDS的浓度为20.0％。将混合溶液于37.0℃下放置12.0h，完成样本裂解。
2)向步骤1)裂解后的胸水样本中加入3.0mL的饱和酚氯仿溶液，颠倒混匀，于25.0℃下静置变性30.0min，完成预处理。
3)将步骤2)预处理后的胸水样本加入上述步骤(1)制备得到的预处理柱，于25.0℃下静置30.0min，进行蛋白质、脂类与DNA的静置分离，然后于4.0℃下，以3000rpm离心5.0min，收集一级滤液。
4)按照1：2的体积比，将步骤3)的一级滤液与pH为10.0、5.0mol/L的Tris-HCl溶液混合，颠倒混匀，静置15.0min，以改变DNA极性，完成一级滤液的再处理。
5)取步骤4)再处理后的一级滤液，加入上述步骤(2)制备得到的富集柱，于4.0℃下，以3000rpm离心5.0min，弃去滤液，使富集柱吸附样本中的DNA。
6)用10.0mL，体积分数为50％的乙醇溶液对步骤5)吸附了DNA的富集柱离心清洗2次，离心条件为：温度4.0℃，转速为5000rpm，时间为5.0min，弃滤液。
7)将50.0μL体外诊断试剂用纯化水加入步骤6)清洗后的富集柱中，于4.0℃下，以12000rpm离心5.0min，将DNA洗脱下来，得到富集纯化后的核酸。
实施例2
本实施例提供了一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱，具体制备过程如下：
(1)选用内径为2.0cm，长度为12.0cm的聚乙烯材质柱管，上层加入粒径为7.0～8.0μm的琼脂糖吸附微球，厚度为2.0cm；中层放入孔径为3.0μm的玻璃纤维滤纸，滤纸的厚度为0.4μm；下层放入粒径为5.0～6.0μm的葡聚糖凝胶G-50，厚度为2.0cm，压实，制成预处理柱；
(2)选用内径为1.0cm，长度为8.0cm的聚乙烯材质柱管，上层加入粒径为800.0目的石英砂，厚度为0.5cm；中层放入粒径<1.0nm的纳米还原石墨烯，厚度为2.0cm；下层放入粒径为500.0目的石英砂，厚度为0.5cm，压实，制成富集柱。
本实施例还提供了上述制备的分析柱在非诊断目的的富集胸水中结核分枝杆菌核酸的应用，具体过程如下：
1)取结核性胸膜炎患者胸水样本(与实施例1的样本来自同一患者，同时采集)10mL，加入蛋白酶K和SDS，得到混合溶液中，使混合溶液中蛋白酶K的浓度为100.0mg/mL，SDS的浓度为20.0％。将混合溶液于37.0℃下放置12.0h，完成样本裂解。
2)向步骤1)裂解后的胸水样本中加入3.0mL的饱和酚氯仿溶液，颠倒混匀，于25.0℃下静置变性30.0min，完成预处理。
3)将步骤2)预处理后的胸水样本加入上述步骤(1)制备得到的预处理柱，于25.0℃下静置30.0min，进行蛋白质、脂类与DNA的静置分离，然后于4.0℃下，以3000rpm离心5.0min，收集一级滤液。
4)按照1：2的体积比，将步骤3)的一级滤液与pH为10.0、5.0mol/L的Tris-HCl溶液混合，颠倒混匀，静置15.0min，以改变DNA极性，完成一级滤液的再处理。
5)取步骤4)再处理后的一级滤液，加入上述步骤(2)制备得到的富集柱，于4.0℃下，以3000rpm离心5.0min，弃去滤液，使富集柱吸附样本中的DNA。
6)用10.0mL，体积分数为50％的乙醇溶液对步骤5)吸附了DNA的富集柱离心清洗2次，离心条件为：温度4.0℃，转速为5000rpm，时间为5.0min，弃滤液。
7)将50.0μL体外诊断试剂用纯化水加入步骤6)清洗后的富集柱中，于4.0℃下，以12000rpm离心5.0min，将DNA洗脱下来，得到富集纯化后的核酸。
实施例3
本实施例提供了一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱，具体制备过程如下：
(1)选用内径为2.0cm，长度为12.0cm的聚乙烯材质柱管，上层加入粒径为7.0～8.0μm的纤维素吸附微球，厚度为2.0cm；中层放入孔径为3.0μm的玻璃纤维滤纸，滤纸的厚度为0.4μm；下层放入粒径为5.0～6.0μm的葡聚糖凝胶G-50，厚度为2.0cm，压实，制成预处理柱；
(2)选用内径为1.0cm，长度为8.0cm的聚乙烯材质柱管，上层加入粒径为800目的石英砂，厚度为0.5cm；中层放入粒径<1.5nm的纳米二氧化硅，厚度为2.0cm；下层放入粒径为500目的石英砂，厚度为0.5cm，压实，制成富集柱。
本实施例还提供了上述制备的分析柱在非诊断目的的富集胸水中结核分枝杆菌核酸的应用，具体过程如下：
1)取结核性胸膜炎患者胸水样本(与实施例1的样本来自同一患者，同时采集)10mL，加入蛋白酶K和SDS，得到混合溶液中，使混合溶液中蛋白酶K的浓度为100.0mg/mL，SDS的浓度为20.0％。将混合溶液于37.0℃下放置12.0h，完成样本裂解。
2)向步骤1)裂解后的胸水样本中加入3.0mL的饱和酚氯仿溶液，颠倒混匀，于25.0℃下静置变性30.0min，完成预处理。
3)将步骤2)预处理后的胸水样本加入上述步骤(1)制备得到的预处理柱，于25.0℃下静置30.0min，进行蛋白质、脂类与DNA的静置分离，然后于4.0℃下，以3000rpm离心5.0min，收集一级滤液。
4)按照1：2的体积比，将步骤3)的一级滤液与pH为10.0、5.0mol/L的Tris-HCl溶液混合，颠倒混匀，静置15.0min，以改变DNA极性，完成一级滤液的再处理。
5)取步骤4)再处理后的一级滤液，加入上述步骤(2)制备得到的富集柱，于4.0℃下，以3000rpm离心5.0min，弃去滤液，使富集柱吸附样本中的DNA。
6)用10.0mL，体积分数为50％的乙醇溶液对步骤5)吸附了DNA的富集柱离心清洗2次，离心条件为：温度4.0℃，转速为5000rpm，时间为5.0min，弃滤液。
7)将50.0μL体外诊断试剂用纯化水加入步骤6)清洗后的富集柱中，于4.0℃下，以12000rpm离心5.0min，将DNA洗脱下来，得到富集纯化后的核酸。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例采用离心法，而不采用分析柱对胸水样本进行处理，具体过程如下：
1)取结核性胸膜炎患者胸水样本(与实施例1的样本来自同一患者，同时采集)10mL，加入离心管，在25℃下，以3000rpm离心15min，弃上清液。
2)取胸水沉渣1.0mL加入蛋白酶K和SDS，得到混合溶液中，使混合溶液中蛋白酶K的浓度为100.0mg/mL，SDS的浓度为20.0％。将混合溶液于37.0℃下放置12.0h，完成样本裂解。
3)向步骤1)裂解后的胸水样本中加入3.0mL的饱和酚氯仿溶液，颠倒混匀，于25.0℃下静置变性30.0min，完成预处理。
4)将步骤2)预处理后的胸水样本加入离心管中，于25.0℃下，以12000rpm离心10.0min，进行蛋白质、脂类与DNA的分离，取上清液。
5)按照1：1的体积比，将步骤3)的上清液与氯仿溶液混合，颠倒混匀，于25.0℃下，以12000rpm离心10.0min清洗DNA，弃上清，该步骤重复2次。
6)取步骤4)离心后的沉淀，于25℃下进行自然风干。
7)用50.0μL体外诊断试剂用纯化水溶解步骤5)风干后的沉淀物，得到纯化后的核酸。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于，不采用分析柱的富集柱对胸水样本进行处理，具体过程如下：
1)取结核性胸膜炎患者胸水样本(与实施例1的样本来自同一患者，同时采集)10mL，加入离心管，在25℃下，以3000rpm离心15min，弃上清液。
2)取胸水沉渣1.0mL加入蛋白酶K和SDS，得到混合溶液中，使混合溶液中蛋白酶K的浓度为100.0mg/mL，SDS的浓度为20.0％。将混合溶液于37.0℃下放置12.0h，完成样本裂解。
3)向步骤1)裂解后的胸水样本中加入3.0mL的饱和酚氯仿溶液，颠倒混匀，于25.0℃下静置变性30.0min，完成预处理。
4)将步骤2)预处理后的胸水样本加入实施例1制备的预处理柱中，于25.0℃下静置30.0min，进行蛋白质、脂类与DNA的静置分离，然后于4.0℃下，以3000rpm离心5.0min，收集一级滤液。
5)按照1∶1的体积比，将步骤3)的一级滤液与甲醇溶液混合，颠倒混匀，于25.0℃下，以12000rpm离心10.0min清洗DNA，弃滤液，该步骤重复2次。
6)将50.0μL体外诊断试剂用纯化水加入步骤5)清洗后的富集柱中，于4.0℃下，以12000rpm离心5.0min，将DNA洗脱下来，得到富集纯化后的核酸。
试验例1
本试验例采用Qubit3荧光定量仪(厂家：thermofisher)对实施例1～3，对比例1～2得到的核酸样本进行DNA总量检测，重复检测3次，检测结果如下表1所示：
表1各例核酸中总DNA检测结果
| 核酸样本 | DNA含量(μg/mL) |
| 实施例1 | 5.00±0.50 |
| 实施例2 | 8.00±0.20 |
| 实施例3 | 6.04±0.32 |
| 对比例1 | 0.45±0.12 |
| 对比例2 | 1.64±0.32 |
从表1的数据可以看出，采用本发明实施例1～3的分析柱和方法对胸水的总DNA进行富集，可以使微量DNA含量达到5.0μg/mL以上，最高可以达到8.0μg/mL，说明本发明提供的分析柱对DNA提取的效果更好。
试验例2
本试验例采用国家食品药品监督管理局批准的结核分枝杆菌复合群核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法，购自艾康生物技术(杭州)有限公司，注册证号：国械注准20163402547)进行定量扩增检测，并采用Real-time PCR仪(厂家：Bio Rad；型号：CFX96Touch)对实施例1～3，对比例1～2得到的核酸样本进行检测，PCR数值(Δct)结果如下表2所示：
表2患者胸水中结核分枝杆菌核酸检测结果
| 核酸样本 | PCR数值(Δct) |
| 实施例1 | 176 |
| 实施例3 | 165 |
| 实施例3 | 162 |
| 对比例1 | 30 |
| 对比例2 | 45 |
从表2的检测结果可以看出，采用本发明实施例1～3方法得到的结核分枝杆菌核酸Δct数值较高；在临界值Δct为40的条件下，实施例均可以明确判定该病例为阳性，而在对比例1的Δct数值为30，不能判定该病例为阳性病例，造成假阴性，而对比例2的Δct数值为45，可以判定阳性，但处理临界值边缘。由此说明本发明的分析柱和结核分枝杆菌核酸的富集纯化方法能够满足临床样本检测要求，且优于现有临床方法。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (11)
1.一种富集结核分枝杆菌核酸的分析柱，其特征在于，包括预处理柱和富集柱；所述预处理柱包括上层蛋白吸附微球、中层滤纸和下层葡聚糖凝胶微球；所述富集柱包括上层石英砂、中层纳米材料和下层石英砂。
2.根据权利要求1所述的分析柱，其特征在于，所述上层蛋白吸附微球为右旋糖酐吸附微球、纤维素吸附微球和琼脂糖吸附微球的一种或多种，所述上层蛋白吸附微球的粒径为5.0～8.0μm；所述中层滤纸为天然纤维滤纸、玻璃纤维滤纸和化学纤维滤纸的一种或多种，所述中层滤纸的孔径为3.0～4.0μm；所述下层葡聚糖凝胶微球为葡聚糖凝胶G-25、葡聚糖凝胶G-50和葡聚糖凝胶G-75的一种或多种，所述下层葡聚糖凝胶微球的粒径为5.0～6.0μm；所述中层纳米材料为氧化石墨烯、纳米还原石墨烯或纳米二氧化硅的一种或多种，所述中层纳米材料的粒径小于1.5nm；所述上层石英砂和下层石英砂的粒径为500.0～800.0目。
3.根据权利要求2所述的分析柱，其特征在于，所述上层蛋白吸附微球的铺设厚度为1.0～2.0cm；所述中层滤纸的铺设厚度为0.2～0.4μm；所述下层葡聚糖凝胶微球的铺设厚度为1.5～2.0cm；所述上层石英砂的铺设厚度为0.5～0.8cm；所述中层纳米材料的铺设厚度为1.5～2.5cm；所述下层石英砂的铺设厚度为0.5～0.8cm。
4.根据权利要求3所述的分析柱，其特征在于，所述预处理柱的内径为1.8～2.2cm，长度为10.0～15.0cm；所述富集柱的内径为0.8～1.2cm，长度为6.0～10.0cm。
5.一种权利要求1～4任一项所述的分析柱在非诊断目的的富集胸水中结核分枝杆菌核酸的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用所述预处理柱分离预处理后的胸水样本后，离心，得到一级滤液；
(2)对所述一级滤液进行再处理；
(3)采用所述富集柱纯化再处理后的一级滤液，弃滤液；
(4)对步骤(3)所述的富集柱进行清洗和洗脱，得到富集纯化后的核酸。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述预处理为将胸水样本与蛋白酶K、SDS混合，得到混合溶液，再加入饱和酚氯仿溶液，静置，得到所述预处理后的胸水样本。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述混合溶液中蛋白酶K的终浓度为50.0～100.0mg/mL，所述混合溶液中SDS的终浓度为10.0～20.0％；所述混合的温度为37.0～45.0℃，时间为8.0～12.0h；所述饱和酚氯仿溶液与所述混合溶液的体积比为1：(2～4)；所述静置的温度为20.0～30.0℃，时间为25.0～35.0min。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述分离的温度为20.0～30.0℃，时间为25.0～35.0min；所述离心的温度为2.0～8.0℃，转速为3000～5000rpm，时间为5.0～10.0min。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述再处理为向所述一级滤液中加入Tris-HCl溶液，静置，得到再处理后的一级滤液；所述Tris-HCl溶液的pH为8.0～10.0，浓度为4.0～6.0mol/L；所述Tris-HCl溶液与所述一级滤液的体积比为1：(1.5～3.0)；所述静置的时间为10.0～20.0min。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤(3)所述纯化的温度为2.0～8.0℃，转速为3000～5000rpm，时间为5.0～10.0min。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述清洗用的溶液为体积分数为45.0～75.0％的乙醇溶液，所述清洗的次数为2～3次；所述洗脱为将10.0～20.0μL的水加入所述清洗后的富集柱中，离心收集纯化后的核酸。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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