CN117045865B - 一种戊二醛交联的生物材料中残留戊二醛脱除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种戊二醛交联的生物材料中残留戊二醛的脱除方法。本发明采用化学中和结合物理离心的方法将生物材料里的戊二醛彻底去除。具体来说，将与戊二醛交联后的生物材料在甘氨酸中以300‑600W的功率超声浸泡10～30min，然后再使用2轮间接离心，控制离心转速为4000～10000rpm离心5～30min。经过本发明方法处理后的戊二醛交联生物材料，几乎可以变回原本的颜色，同时戊二被完全去除，生物材料几乎没有细胞毒性，适合临床推广和应用。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种戊二醛交联的生物材料中残留戊二醛的脱除方法。
背景技术
生物材料是指可用来对生物体进行诊断、治疗、修复或替换其病损组织、器官或增进其功能的一类材料，可进一步细分为合成生物材料和天然生物材料。对于一些常见的天然大分子生物材料，例如胶原、纤维素、壳聚糖、明胶、丝素蛋白和脱细胞外基质等，其表面通常具有丰富的羟基、氨基和羧基等特征基团，为该类材料提供了诸多化学反应位点，因此为该类材料的功能化和高性能化的实现提供可能。但这些天然生物大分子材料在进一步再生或加工后，得到的后续材料的机械性能往往达不到应用要求，因此需要进一步通过物理交联或化学交联的手段来提高材料的机械性，实现高性能化。
戊二醛是目前认为交联强度最好的交联剂之一，然而却因经过戊二醛处理的生物材料中残留的戊二醛(包括游离戊二醛分子和戊二醛残基)具有较强的细胞毒性，因此限制了在生物材料领域的深入应用。目前，戊二醛交联生物材料中残留戊二醛脱除方法主要有如下3种：(1)反复洗涤，如用氨基乙酸洗涤，但这种方法仅能除去材料表面交联的戊二醛，对渗透入材料内部的残留戊二醛去除效果有限。(2)热处理，如120℃高温下进行12小时的热处理，将戊二醛从交联的胶原蛋白中去除，但这种工艺若控制不当会引起胶原的高温变性。(3)超临界二氧化碳萃取残留戊二醛，但搭建超临界二氧化碳平台的设备成本较高，萃取脱除工艺具有较大难度，高压条件也对安全性也提出了更高要求。因此，寻求一种低成本、简单高效的戊二醛脱除方法，对促进生物材料广泛临床化应用于组织修复与再生具有极大地推动作用。
申请号为CN202210860705.5，发明名称为“生物组织片材的处理工艺以及由该工艺得到的生物组织片材”的专利，公开了一种将先经过戊二醛交联固定的生物组织片用NaCl水溶液清洗1～8次，然后再与甘氨酸溶液混合反应3～6小时以去除残留戊二醛。然而该方法中甘氨酸的作用是作为化学中和试剂对戊二醛进行了中和，但本质上中和后的戊二醛仍然留在生物组织片内部因此并未真正解决将戊二醛从生物组织片中脱除的问题。因此该专利方法处理后的生物组织片仍然具有一定程度的戊二醛残留，导致该生物组织片还是具有较低的生物毒性。此外，已有研究表明，甘氨酸和戊二醛反应后的产物为甘氨酰基戊二醛，甘氨酰基戊二醛会使处理后的生物材料发生黄变。且甘氨酰基戊二醛不稳定，容易再次分解为甘氨酸和戊二醛。另一方面，残留在生物材料中的甘氨酸会发生氧化，也会使得材料变黄。因此清除甘氨酸与戊二醛的反应后产物及残留尤为重要。最后，该专利方法工艺方法耗时较长，仅与甘氨酸共浸泡的时间就需要3～6小时。
综上所述，有必要提出改进的方法和策略，以有效去除生物材料中的残留戊二醛，提高生物材料的安全性和适用性。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种戊二醛交联的生物材料中残留戊二醛的彻底去除的方法，具体技术方案如下。
：一种戊二醛交联的生物材料中残留戊二醛的脱除方法，所述方法为化合中和结合物理离心，主要采用甘氨酸短时超声浸泡结合间接机械离心，具体步骤如下：
步骤1：生物材料预处理；
步骤2：将步骤1中预处理后的生物材料与质量浓度为0.001％～0.1％的戊二醛溶液交联10～48h；
步骤3：将步骤2得到的与戊二醛交联的生物材料置于甘氨酸溶液中以300-600W的功率超声浸泡10～30min；
步骤4：将步骤3完成超声浸泡后的生物材料放入滤布中，并在滤布中加入少量纯净水使所述生物材料保持湿润，然后将所述滤布封口并固定于离心管中部，控制离心温度为17～40℃、离心转速为4000～10000rpm离心5～30min；
步骤5：重复1次步骤4的离心操作。
可以理解的是，为保持生物材料本身的形状和性质，不影响后续的临床使用，本发明使用间接机械离心的方式来进行。此外，由于生物材料在温度较高的环境下离心容易变性，因此本发明将离心时的温度控制在17～40℃。
进一步，所述步骤2中生物材料与戊二醛溶液交联的时间为24h。
进一步，步骤2中的生物材料与戊二醛溶液在室温下交联。交联完成后用纯水洗涤3～8次。
进一步，步骤3中完成超声浸泡后的生物材料用纯水洗涤3～8次。
进一步，控制所述步骤3中超声浸泡的温度为25～40℃。
进一步，所述步骤3中甘氨酸溶液的摩尔浓度为0.01mol/L～1mol/L。
优先的，所述超声的功率为400W。
进一步，所述步骤4中滤布目数为50～500目。
进一步，所述步骤4中加入纯净水的量为2～5ml。
进一步，所述步骤4和步骤5中完成离心操作后取出滤袋中的生物材料进行纯水漂洗。
进一步，所述生物材料包括脱细胞外基质、胶原、明胶、弹力蛋白或蚕丝蛋白。这些材料的基本结构单元为氨基酸，氨基酸上游离的氨基或羟基基团能与戊二醛发生交联反应。
可以理解的是，本发明脱除残留戊二醛的方法还可以适用于几丁质、甲壳素、壳聚糖、琼脂糖、透明质酸、纤维蛋白原、硫酸软骨素、藻酸盐、氨基葡聚糖或脂质体。
进一步，所述步骤1中的生物材料预处理包括脱脂处理和/或脱细胞处理；所述脱脂处理是将生物材料置于有机试剂中浸泡清洗，所述有机试剂包括丙酮、异丙醇、乙醚、甲醇、氯仿、乙酸乙酯或正己烷中的任意一种。
在其中一些实施例中，所述生物材料为猪腹膜，将猪腹膜与有机试剂以1:6～1:14(w/v)的比例浸泡一定时间，然后在纯水中洗涤3～8次。
进一步，所述脱细胞处理是将生物材料置于氢氧化钠与氯化钠混合的碱性溶液中浸泡后再用纯水清洗。
优选的，氢氧化钠浓度为0.1％～2％(w/w)，氯化钠浓度为0.5％～2％(w/w)。
进一步，将上述步骤处理后的脱细胞外基质在真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，以便进行保存。
有益技术效果
本发明提出一种化学中和结合物理离心的方法将生物材料里的戊二醛彻底去除。具体来说，采用甘氨酸超声短时浸泡结合2次间接机械离心，以彻底去除生物材料内部残留的戊二醛。首先，与甘氨酸短时浸泡可以较好的避免生物材料变黄，进而不影响生物材料的后续应用。而超声的方式则可以加快甘氨酸对戊二醛的中和，因此该步骤可以做到在较短时间内完成甘氨酸对生物材料内部绝大部分戊二醛的中和，同时使生物材料颜色不会变得过黄。进一步，采用间接机械离心，使被中和的戊二醛和残留的甘氨酸一起彻底脱除，同时保护生物材料不发生形变和质变。经过本发明设置的2轮间接机械离心后，生物材料几乎可以变回原本的颜色，同时戊二被完全去除，生物材料几乎没有细胞毒性，适合临床推广和应用。
本发明采用甘氨酸超声短时浸泡的时间远小于现有技术中与甘氨酸长时间浸泡的技术方案，因此整个工艺时间都缩短，效率有效提升，因此本发明方法适合大规模推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为猪腹膜经过脱脂脱细胞处理后的乳白色薄膜状脱细胞外基质效果图；
图2为与戊二醛交联后的脱细胞外基质与甘氨酸溶液常温浸泡24小时后的颜色图；
图3为与戊二醛交联后的脱细胞外基质与甘氨酸溶液超声浸泡30min后的颜色图；
图4为甘氨酸与游离戊二醛的反应机理图；
图5为与戊二醛交联后的脱细胞外基质与甘氨酸溶液常温浸泡24小时后高效液相法检测戊二醛残留色谱图；
图6为与戊二醛交联后的脱细胞外基质与甘氨酸溶液超声浸泡30min后高效液相法检测戊二醛残留色谱图；
图7为经过甘氨酸短时超声浸泡结合两次间接机械离心后的脱细胞外基质颜色图；
图8为经过甘氨酸短时超声浸泡结合两次间接机械离心后的脱细胞外基质高效液相法检测残留色谱图；
图9为不同方法和材料去除戊二醛后细胞毒性检测图；
图10为经过甘氨酸短时超声浸泡结合两次间接机械离心后的胶原海绵高效液相法检测残留色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本文中“和/或”包括任何和所有一个或多个列出的相关项的组合。
本文中“多个”意指两个或两个以上，即其包含两个、三个、四个、五个等。
需要说明的是，在本文中，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者装置不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者装置所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括该要素的过程、方法、物品或者装置中还存在另外的相同要素。
如在本说明书中使用的，术语“大约”，典型地表示为所述值的+/-5％，更典型的是所述值的+/-4％，更典型的是所述值的+/-3％，更典型的是所述值的+/-2％，甚至更典型的是所述值的+/-1％，甚至更典型的是所述值的+/-0.5％。
在本说明书中，某些实施方式可能以一种处于某个范围的格式公开。应该理解，这种“处于某个范围”的描述仅仅是为了方便和简洁，且不应该被解释为对所公开范围的僵化限制。因此，范围的描述应该被认为是已经具体地公开了所有可能的子范围以及在此范围内的独立数字值。例如，范围的描述应该被看作已经具体地公开了子范围如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及此范围内的单独数字，例如1，2，3，4，5和6。无论该范围的广度如何，均适用以上规则。
名词解释
本发明所述的“短时超声浸泡”是指与戊二醛交联后的生物材料在特定浓度的甘氨酸溶液中浸泡的时间为不大于30min。
本发明所述的“间接机械离心”是指待离心的材料不直接放入离心管中，而是放入一种保护性容器后再置于离心管内进行离心。
实施例1
本实施例提供一种以猪腹膜为原材料制备脱细胞外基质的示例
(1)猪腹膜脱脂处理：手工去除猪腹膜组织中附着大多数脂肪，并用生理盐水清洗3～8次，清洗后的猪腹膜室温浸泡于有机试剂中一定时间进行脱脂，脱脂后的猪腹膜在纯水中清洗3～8次，以去除猪腹膜中剩余的有机试剂。用于猪腹膜脱脂的有机试剂可选地包括丙酮、异丙醇、乙醚、甲醇、氯仿、乙酸乙酯或正己烷中的任意一种。猪腹膜与有机试剂的比例为1:6～1:14(w/v)。
(2)猪腹膜脱细胞处理：将完成脱脂处理后的猪腹膜浸泡在氢氧化钠与氯化钠的混合碱液中进一步脱除细胞，氢氧化钠浓度为0.1％～2％(w/w)，氯化钠浓度为0.5％～2％(w/w)，然后在纯水中清洗3～8次至溶液呈中性，冷冻干燥后，即得到脱细胞外基质，见图1。
可以理解的是，本发明方法适用的材料还可以包括胶原蛋白海绵、胶原蛋白凝胶、胶原蛋白薄膜以及取材于其他哺乳动物的胶原蛋白材料。
实施例2
将实施例1处理后的脱细胞外基质材料(简称为材料)裁剪成1.5cm×1.5cm的薄片，浸泡在质量浓度0.001％～0.1％的戊二醛溶液中，室温交联24h，纯水漂洗3次。得到的与戊二醛交联的脱细胞外基质机械强度显著增强。然后将与戊二醛交联的脱细胞外基质在(1)：0.2mol/L甘氨酸溶液中常温浸泡24h和在(2)：0.2mol/L甘氨酸溶液中以400W的功率超声浸泡30min，超声温度为25～40℃。将使用(1)和(2)方法处理后的材料用纯水漂洗3次除去大部分表面未反应的甘氨酸溶液。将处理后的脱细胞外基质在真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，以便进行保存。
图2为经过与戊二醛交联处理后在甘氨酸溶液里常温浸泡24h后的脱细胞外基质，呈现较深黄色。图3为经过与戊二醛交联处理后在甘氨酸溶液里超声浸泡30min后的脱细胞外基质，呈现淡黄色。颜色变黄的原因在于游离的戊二醛与甘氨酸反应生成的甘氨酰基戊二醛呈现黄色，在甘氨酸溶液中浸泡的时间越长，呈现的黄色越深。图4为甘氨酸与游离戊二醛的反应机理图，脱细胞外基质在甘氨酸浸泡后其浸泡液呈现黄色。
将经过上述(1)、(2)方法步骤处理得到的脱细胞外基质按6cm2/mL的比例加入生理盐水，(37±1)℃下恒温振荡浸提(24±2)小时，振荡速度为200rpm。浸提结束后，将样品与液体分离，冷却至室温，取液体作为浸提液。参照DB 13/T 5127.11-2019(植入性医疗器械高分子材料浸提液中有毒有害物质的测定第11部分：戊二醛迁移量高效液相色谱法)浸提液进行戊二醛残留量测试。在(1)甘氨酸溶液里常温浸泡24h后的脱细胞外基质的戊二醛含量为0.103mg/L，见图5；在(2)甘氨酸溶液里超声浸泡30min后的脱细胞外基质的戊二醛含量为1.748mg/L，见图6。
细胞毒性测试：将经过上述(1)、(2)方法步骤处理得到的脱细胞外基质在紫外灯下灭菌8小时以上。然后按6cm2/mL的比例加入含胎牛血清的MEM培养基，(37±1)℃下恒温振荡浸提(24±2)小时，振荡速度为200rpm。浸提结束后，将样品与液体分离，冷却至室温，取液体作为浸提液。参照GB/T 16886.5-2017(医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验)浸提液进行体外细胞毒性的测试，细胞毒性的测试方法参照CCK-8法。其中，测试得到的细胞存活率大于或等于70％为合格，测试得到的细胞存活率小于70％为不合格。结果见图9。(1)(2)材料的细胞毒性分别见图9实施例2(1)和图9实施例2(2)。可见，与甘氨酸溶液短时超声浸泡以后，脱细胞基质中残留的戊二醛含量更高，因此细胞毒性更大，细胞活力更低。
实施例3
将实施例2中与戊二醛交联的脱细胞外基质，经0.2mol/L甘氨酸溶液中以400W的功率超声浸泡30min后，进一步进行间接机械离心。将脱细胞外基质置于500目滤布中，进一步在滤布中加入5ml纯净水，然后将所述滤布封口并固定于离心管中部，控制离心温度为17～40℃(控制温度离心对于保护生物材料十分关键)、离心转速设定为4000～10000rpm离心5～30min，离心两次。经过间接机械离心后的材料呈现更淡的黄色，接近脱细胞外基质材料本身的颜色，见图7，说明被甘氨酸中和的戊二醛被进一步去除。将此时的材料继续按6cm2/mL的比例加入生理盐水，(37±1)℃下恒温振荡浸提(24±2)小时，振荡速度为200rpm。浸提结束后，将样品与液体分离，冷却至室温，取液体作为浸提液。参照DB 13/T 5127.11-2019(植入性医疗器械高分子材料浸提液中有毒有害物质的测定第11部分：戊二醛迁移量高效液相色谱法)浸提液进行戊二醛残留量测试。本实施中的脱细胞外基质中残留戊二醛含量未检出，仪器检测限为0.025mg/L，见图8，说明经过间接机械离心后残留戊二醛被有效脱除。材料细胞毒性见图9，细胞活力显著高于实施例2(1)中与甘氨酸溶液浸泡24h的脱细胞外基质材料的细胞活力。
实施例4
本实施例提供一种戊二醛交联的胶原海绵的戊二醛脱除结果
根据实施例2甘氨酸短时超声浸泡和实施例3的机械离心方法处理胶原海绵。完成离心后使用纯水漂洗3次除去大部分表面未反应的甘氨酸溶液。将处理后的胶原海绵在真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥，以便于进行保存。然后按照上述实施例的标准方法进行高效液相色谱测试和细胞毒性测试。结果为未检出残留戊二醛，仪器检测限为0.025mg/L，见图9和图10。
实施例5
本实施例提供不同超声浸泡和离心操作下的脱细胞外基质中戊二醛残留量
表1不同超声浸泡操作的戊二醛残留
| 超声功率 | 超声时间 | 戊二醛残留量 |
| 300W | 30min | 2.146mg/L |
| 400W | 30min | 1.748mg/L |
| 600W | 10min | 1.836mg/L |
从上述实验可以看出，当以400W的功率超声30min后，戊二醛的残留量最少，因此选择该超声参数下的材料继续进行间接机械离心。
表2不同离心次数的戊二醛残留
| 离心次数 | 离心参数 | 戊二醛残留量 |
| 1次 | 4000rpm/30min | 0.153mg/L |
| 2次 | 4000rpm/30min | ≤0.025mg/L |
从上述实验可以看出，当离心第2次后，几乎没有戊二醛的残留，因此本发明方法最终确定进行2次机械离心。
表3不同离心参数的戊二醛残留
| 离心转数 | 离心时间 | 戊二醛残留量 |
| 4000rpm | 30min | ≤0.025mg/L |
| 8000rpm | 12min | 0.541mg/L |
| 10000rpm | 5min | 1.156mg/L |
从上述实验可以看出，当以4000rpm、30min离心后，戊二醛的残留量最少，因此选择该离心参数为最优操作。
上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。
Claims (7)
1.一种戊二醛交联的脱细胞外基质材料中残留戊二醛的脱除方法，其特征在于，所述方法主要采用甘氨酸短时超声浸泡结合间接机械离心，具体步骤如下：
步骤1：生物材料预处理，所述预处理包括脱脂处理和/或脱细胞处理，得到脱细胞外基质；
步骤2：将步骤1中得到的脱细胞外基质材料与质量浓度为0.001%~0.1%的戊二醛溶液交联10~48h；
步骤3：将步骤2得到的与戊二醛交联的脱细胞外基质材料置于甘氨酸溶液中以400W的功率超声浸泡30min，控制超声浸泡的温度为25~40℃；
步骤4：将步骤3完成超声浸泡后的脱细胞外基质材料放入滤布中，滤布目数为50~500目，并在滤布中加入少量纯净水使所述脱细胞外基质材料保持湿润，然后将所述滤布封口并固定于离心管中部，控制离心温度为17~40℃、离心转速为4000rpm离心30min；
步骤5：重复1次步骤4的离心操作。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2中脱细胞外基质材料与戊二醛溶液交联的时间为24h。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中甘氨酸溶液的摩尔浓度为0.01mol/L ~ 1 mol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4中加入纯净水的量为2~5ml。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4和步骤5中完成离心操作后取出滤布中的脱细胞外基质材料进行纯水漂洗。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱脂处理是将生物材料置于有机试剂中浸泡清洗，所述有机试剂包括丙酮、异丙醇、乙醚、甲醇、氯仿、乙酸乙酯或正己烷中的任意一种。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述脱细胞处理是将生物材料置于碱性溶液中浸泡后再用纯水清洗。
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