CN116271140A - 一种动物源性生物材料的病毒灭活方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，通过使用碱液对动物源性生物材料进行静置浸泡，随后通过过氧化氢溶液再次对动物源性生物材料进行静置浸泡，从而有效的去除动物源性生物材料中的各种病毒，且同时有效的祛除了动物源性生物材料中的免疫原，而通过静置浸泡的方式，使得碱液以及过氧化氢溶液可以适用不同的病毒和不同的动物种属，从而适用于多种动物的不同组织，整个过程简单易操作，涉及的溶液较少，病毒灭活后的试剂残留易祛除，同时，两次简单的静置浸泡，即可在达到病毒灭活效果的同时具有祛除脂肪和内毒素的效果，降低动物源医疗器械的的免疫原，使得病毒灭活的整个工艺流程变得简单易操作。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种动物源性生物材料的病毒灭活方法。
背景技术
动物源性生物材料就是指材料来源于人或动物的组织器官，或者是能引起人、动物致病的细菌等材料，而研究表面明采用无生命或使其成为无生命的动物源性生物材料制造的医疗器械(以下简称动物源性医疗器械)，与非动物来源的材料(例如金属、高分子材料以及无机物材料等)相比，具有更有益的生物相容性和生物活性；但是应用动物源医疗器械受益的同时也面临着风险，主要体现在：动物组织及其衍生物本身携带的病毒等危险性分子、及其外源因子污染引起的安全风险问题，因种属不同带来的动物源性生物材料特殊的免疫毒性风险等问题；
因此，为了保证动物源医疗器械的正常使用，需要在制成动物源医疗器械前对动物源性生物材料进行病毒灭活的同时，进行免疫原祛除；众所周知，目前常用的动物源病毒灭活的方法有，有机溶剂法(常用SDS)、热力消毒法、烷基化剂灭菌、电离辐照和化学消毒剂(醛类、消毒剂、碱类等)等；
其中，化学消毒剂法为最常用的灭活手段，虽然能取到较好的动物源性生物材料的病毒灭活结果，却仍然存在不足，如传统的病毒灭活试剂功能单一，仅具有病毒灭活功能，无法同时兼顾免疫原祛除，需要在病毒灭活后，再次对动物源性生物材料进行免疫原祛除步骤，流程较多，操作复杂；且在动物源性生物材料病毒灭活后，病毒灭活试剂残留却不易祛除，存在试剂残留安全问题；同时，具有一定的针对性，不能适用于不同的动物源性生物材料的不同病毒以及不同动物种属。
以上种种，均表明在动物生物源性材料病毒灭活时，采用化学消毒剂法存在诸多不足，亟需改进。
因此，发明一种动物源性生物材料的病毒灭活方法来解决上述问题很有必要。
发明内容
(一)发明目的
本发明的目的是提供一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，通过使用碱液对动物源性生物材料进行静置浸泡，随后通过过氧化氢溶液再次对动物源性生物材料进行静置浸泡，从而有效的去除动物源性生物材料中的各种病毒，且同时有效的祛除了动物源性生物材料中的免疫原，而通过静置浸泡的方式，使得碱液以及过氧化氢溶液可以适用不同的病毒和不同的动物种属，从而适用于多种动物的不同组织，整个过程简单易操作，涉及的溶液较少，病毒灭活后的试剂残留易祛除，同时，两次简单的静置浸泡，即可在达到病毒灭活效果的同时具有祛除脂肪和内毒素的效果，降低动物源医疗器械的的免疫原，使得病毒灭活的整个工艺流程变得简单易操作，以解决技术中的上述不足之处。
(二)技术方案
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，包括如下步骤：
(A)、使用碱液对动物源性生物材料进行静置浸泡；
(B)、采用纯化水清洗残留碱液至pH为中性，完成第一次病毒灭活；
(C)、使用强氧化物对完成第一次病毒灭活后的动物源性生物材料再次进行静置浸泡；
(D)、再次采用纯化水清洗试剂残留至pH为中性，完成第二次病毒灭活。
优选的，在步骤(A)中，碱液为氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钙中的一种。
优选的，在步骤(A)中，碱液的浓度为0.5-1.5mol/L，静置时间为40-120min，动物源性生物材料与碱液的料液比为，动物源性生物材料：碱液＝1g：4-8ml。
优选的，在步骤(A)中，碱液选用浓度为1.5mol/L的氢氧化钾溶液，静置时间为120min，动物源性生物材料与碱液的料液比为，动物源性生物材料：碱液＝1g：5ml。
优选的，在步骤(C)中，强氧化物为过氧化氢、高锰酸钾或次氯酸的一种。
优选的，在步骤(C)中，选用4％-15％强氧化物溶液，静置时间为3-10h，动物源性生物材料与强氧化物的料液比为，动物源性生物材料：强氧化物＝1g：4-10ml。
优选的，在步骤(C)中，选用15％强氧化物溶液，静置时间为10h，动物源性生物材料与强氧化物的料液比为，动物源性生物材料：强氧化物＝1g：10ml。
在上述技术方案中，本发明提供的技术效果和优点：
1、与现有技术相比，本发明通过使用碱液对动物源性生物材料，如猪肠衣进行静置浸泡，随后通过过氧化氢溶液再次对动物源性生物材料进行静置浸泡，从而有效的去除动物源性生物材料中的伪狂犬病毒、水疤性口炎病毒、脑心肌炎病毒及猪细小病毒，且同时有效的祛除了动物源性生物材料中的免疫原，而通过静置浸泡的方式，使得碱液以及过氧化氢溶液可以适用不同的病毒和不同的动物种属，从而适用于多种动物的不同组织，达到病毒的高度灭活的效果；
2、与现有技术相比，本发明通过使用两次静置浸泡，即碱液以及过氧化氢对动物源性生物材料进行两次静置浸泡，整个过程简单易操作，涉及的溶液较少，病毒灭活后的试剂残留易祛除，而两次简单的静置浸泡，即可在达到病毒灭活效果的同时具有祛除脂肪和内毒素的效果，降低动物源医疗器械的的免疫原，进而省去传统病毒灭活中需要进行免疫原祛除的工艺步骤，从而极大的简化了工艺流程，操作简单方便。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明猪肠衣病毒灭活/去除的验证流程图；
图2为本发明氢氧化钠验证实验中样品对照组第一批样品、第二批样品以及第三批样品在不同取样点时，其残余PRV的滴度曲线图；
图3为本发明氢氧化钠验证实验中样品对照组第一批样品、第二批样品以及第三批样品在不同取样点时，其残余VSV的滴度曲线图；
图4为本发明氢氧化钠验证实验中样品对照组第一批样品、第二批样品以及第三批样品在不同取样点时，其残余EMCV的滴度曲线图；
图5为本发明氢氧化钠验证实验中样品对照组第一批样品、第二批样品以及第三批样品在不同取样点时，其残余PPV的滴度曲线图；
图6为本发明过氧化氢验证实验中样品对照组第一批样品、第二批样品以及第三批样品在不同取样点时，其残余PRV的滴度曲线图；
图7为本发明过氧化氢验证实验中样品对照组第一批样品、第二批样品以及第三批样品在不同取样点时，其残余VSV的滴度曲线图；
图8为本发明过氧化氢验证实验中样品对照组第一批样品、第二批样品以及第三批样品在不同取样点时，其残余EMCV的滴度曲线图；
图9为本发明过氧化氢验证实验中样品对照组第一批样品、第二批样品以及第三批样品在不同取样点时，其残余PPV的滴度曲线图；
图10为本发明不同工序处理后的猪肠衣的脂肪残留量图；
图11为本发明不同工序处理后的猪肠衣的pH数值图；
图12为本发明不同工序处理后的猪肠衣的炽灼残渣含量图；
图13为本发明不同工序处理后的猪肠衣的重金属含量图；
图14为本发明不同工序处理后的猪肠衣的蛋白总量图；
图15为本发明不同工序处理后的猪肠衣的羟脯氨酸占比柱状图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、氢氧化钠对动物源性生物材料的病毒灭活/去除验证实验：
为了验证氢氧化钠对动物源性生物材料，如伪狂犬病毒(PRV)、水疤性口炎病毒(VSV)、脑心肌炎病毒(EMCV)及猪细小病毒(PPV)的灭活/去除效果，使用口腔胶原生产过程中的猪肠衣(氢氧化钠处理前原料，且样品为冷冻保存)为检验样品，进行病毒灭活/去除验证实验，具体步骤如下：
(1)、配制0.9mol/L氢氧化钠溶液，且保持温度<10℃，备用；
(2)、按照100m原料:5L氢氧化钠溶液的比例，将配制好的氢氧化钠溶液加入到装有猪肠衣原料的容器中，用四氟棒搅拌2min，使原料充分浸没于氢氧化钠溶液中，浸泡处理1小时；
(3)、取各批次样品，裁剪并选择均匀样品各4份，1米/份，加入指示病毒液浸泡30min，并用微针导入法染毒，然后将样品取出并沥干多余的指示病毒液，即为染毒样品；
(4)、取出一份沥干后的染毒样品，用10mL的DMEM培养基进行振荡浸提30min处理，浸提液作为染毒后的零点对照，备检；
(5)、将其余染毒样品分别放置于离心管中，并按照比例100米:5L加入0.9mol/L氢氧化钠溶液50mL，温度10℃，搅拌2min，使原料充分浸没于氢氧化钠溶液中；
(6)、浸泡处理1小时；
(7)、分别于20min、40min、60min各取样一份，取出样品并沥干表面液体用10mL的DMEM培养基进行浸提，并将pH调至中性，浸提液作为处理过程取样点，备检。
然后设置对照与取样，具体过程如下：
(1)、样品对照：为所取三批样品各1份，加入10mL培养基振荡浸提30min；收集浸提液，备检，用于考察样品对细胞存在的影响；
(2)、病毒(阳性)对照：为染毒用的指示病毒，用于考察指示病毒的滴度值是否符合指导原则的要求；
(3)、零点对照：染毒后样品，加入10mL培养基振荡浸提30min，收集浸提液，备检，用于考察样品染毒情况及对病毒的影响。
采用细胞病变法，对猪肠衣的病毒进行滴度检测，具体过程如下：
(1)、将检测用细胞以0.5～1.5x10F/mL的密度加入96孔细胞培养板，每孔100uL；培养板放置于37℃，5％CO2培养箱中培养12～24小时；
(2)、将各对照及工艺处理样品进行梯度连续稀释，稀释倍数为10倍，即10-1～10-10；
(3)、在细胞培养板的第2～11列加入10-1～10-10连续梯度稀释的病毒，每孔100uL，其中，第1列和12列为正常细胞对照；
(4)、培养板于37℃，5％CO，培养箱中培养，每日观察细胞病变，记录病变细胞孔数目，直至细胞对照孔内细胞无法维持正常形态。
根据细胞病变达到50％以上的病变孔数，运用Karber法计算TCID50，Karber法中直接给出了检测下限，即0.5logs。计算公式如下：
lgTCID50＝xk-d[(1/n)(r)-0.5]
其中，xk＝最大稀释度的对数；
R为所有感染孔数；
D为稀释度对数的差；
N为每稀释度下复孔。
按照以下步骤对上述检测结果进行分析：
(5)、根据病毒灭活/去除前后的滴度检测值，按照如下公式计算灭活/去除工艺步骤的病毒降低值：
病毒滴度降低值＝零点对照病毒滴度-工艺处理后病毒滴度；
(6)、根据病毒滴度检测值和病毒灭活/去除前后的样品体积，按照如下公式计算每一灭活/去除工艺步骤的病毒降低系数：
降低系数R＝log10[(V1xT1)/(V2xT2)]；
其中，V1为工艺步骤开始前材料的体积；
V2为工艺步骤完成后的材料的体积；
T1为工艺步骤开始前材料中的指示病毒滴度(TCID50)；
T2为工艺步骤完成后材料中的指示病毒滴度(TCID50)；
(7)、本验证试验中，样品为肠衣，氢氧化钠工艺处理前后后体积未发生变化，且浸提液均为等体积处理，所以体积变化系数Rv＝V1/V2，约等于1，即病毒降低系数R＝log10[(1xT1)/(1xT2)]，
(8)、根据指导原则的要求，医疗器械的生产过程中去除/灭活病毒的总降低系数宜达到6.00logs以上，并且原则上需至少有一个病毒去除/灭活步骤的降低系数达到4.00logs以上，且如因检测方法的灵敏度造成检出的病毒降低系数接近但小于4logs时，应盲传三代，如无病毒检出，亦可认为是有效地去除/灭活病毒步骤；
如果经过处理后病毒降低系数符合指导原则要求，则可以判定该处理灭活/去除病毒有效。
氢氧化钠对动物源性生物材料的病毒灭活/去除验证的结果：
1、样品中残余指示病毒PRV的检查结果如下表1所示：
表1
根据表1可以得出：样品对照中细胞形态及生长状态正常，说明样品对检测细胞没有影响，即样品本身不会影响病毒的检测结果；
三批样品不同取样点残余PRV滴度曲线图结果如附图2所示；
从附图2可以看出，三批染毒样品经0.9mol/L氢氧化钠处理后，均未检测出PRV，三批样品经过该处理后使PRV的滴度降低值(降低系数)分别≧5.13logs、≧5.38logs以及≧5.00lgs，三批染毒样品经处理后指示病毒PRV的平均下降滴度(降低系数)为≧5.17lgs。
2、样品中残余指示病毒VSV的检查结果如下表2所示：
表2
根据表2可以得出：样品对照中细胞形态及生长状态正常，说明样品对检测细胞没有影响，即样品本身不会影响病毒的检测结果；
三批样品不同取样点残余VSV滴度曲线图结果如附图3所示；
从附图3可以看出，三批染毒样品经0.9mol/L氢氧化钠处理后，均未检测出VSV，三批样品经过该处理后使VSV的滴度降低值(降低系数)分别≧4.13logs、≧4.38logs以及≧4.75lgs，三批染毒样品经处理后指示病毒VSV的平均下降滴度(降低系数)为≧4.42lgs。
3、样品中残余指示病毒EMCV的检查结果如下表3所示：
表3
根据表3可以得出：样品对照中细胞形态及生长状态正常，说明样品对检测细胞没有影响，即样品本身不会影响病毒的检测结果；
第三批样品不同取样点残余EMCV滴度曲线图结果如附图4所示；
从附图4可以看出，三批染毒样品经0.9mol/L氢氧化钠处理后，均未检测出EMCV，三批样品经过该处理后使EMCV的滴度降低值(降低系数)分别≧4.88logs、≧5.25logs以及≧4.88lgs，三批染毒样品经处理后指示病毒EMCV的平均下降滴度(降低系数)为≧5.00lgs。
4、样品中残余指示病毒PPV的检查结果如下表4所示：
表4
根据表4可以得出：样品对照中细胞形态及生长状态正常，说明样品对检测细胞没有影响，即样品本身不会影响病毒的检测结果；
第三批样品不同取样点残余PPV滴度曲线图结果如附图5所示；
从附图5可以看出，三批染毒样品经0.9mol/L氢氧化钠处理后，均未检测出PPV，三批样品经过该处理后使PPV的滴度降低值(降低系数)分别≧4.88logs、≧4.38logs以及≧4.75lgs，三批染毒样品经处理后指示病毒PPV的平均下降滴度(降低系数)为≧4.67lgs。
综上，结合检测结果可以看出，染毒样品经0.9mol/L氢氧化钠处理后，均未检测出PRV、VSV、EMCV和PPV，并且该处理工艺可使PRV、VSV、EMCV和PPV的滴度降低值(降低系数)均达到4logs以上。表明在0.9mol/L氢氧化钠处理条件下，口腔胶原膜的0.9mol/L氢氧化钠处理可以有效灭活上述指示病毒及其所代表的相关病毒，符合指导原则的要求。
二、过氧化氢对动物源性生物材料的病毒灭活/去除验证实验：
采用与8％氢氧化钠对动物源性生物材料的病毒灭活/去除验证实验相同的方法，对过氧化氢对动物源性生物材料的病毒灭活/去除进行验证实验，并得到以下表5-8数据以及附图6-9：
表5
表6
表7
表8
对表5-8数据以及附图6-9进行分析可以得出，染毒样品经8％过氧化氢处理后，均未检测出PRV、VSV、EMCV和PPV，并且该处理可使PRV、VSV、EMCV和PPV的滴度降低值(降低系数)均达到4logs以上。表明口腔胶原膜在8％过氧化氢处理条件下可以有效灭活上述指示病毒及其所代表的相关病毒，符合指导原则的要求。
实施例：
其中，首先选用年龄在24个月内的猪，在猪小肠黏膜下层进行取材，以猪肠衣为动物源性材料，对原材料进行检验，记录脂肪、pH、炽灼残渣、重金属、蛋白总量以及羟脯氨酸的初始含量占比；
一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，包括如下步骤：
(A)、选用浓度为1.5mol/L的氢氧化钾溶液对动物源性生物材料进行静置浸泡，静置时长为120min，且动物源性生物材料与碱液的料液比为，动物源性生物材料：碱液＝1g：5ml；
(B)、采用纯化水清洗残留碱液至pH为中性，完成第一次病毒灭活。
此时，对猪肠衣进行伪狂犬病毒、水痕性口炎病毒、脑心肌炎病毒以及猪细小病毒的灭活或去除验证实验，记录数据，制得第一次病毒灭活后猪肠衣的实际病毒降低结果表9：
表9
根据表格9内容可知，第一次病毒灭活后，猪肠衣内伪狂犬病毒的病毒降低系数均值≧5.17、水痕性口炎病毒的病毒降低系数均值≧4.42、脑心肌炎病毒的病毒降低系数均值≧5.00以及猪细小病毒的病毒降低系数均值≧4.67，即猪肠衣内的病毒总降低系数不低于19.26，单次实验病毒降低系数不低于4.13，可见，猪肠衣的第一次病毒灭活后，其携带的病毒被有效的去除；
随后，进行第二病毒灭活，即
(C)、使用15％强氧化物对完成第一次病毒灭活后的动物源性生物材料再次进行静置浸泡，静置时长为10h，且动物源性生物材料与碱液的料液比为，动物源性生物材料：碱液＝1g：10ml；
(D)、再次采用纯化水清洗试剂残留至pH为中性，完成第二次病毒灭活；
此时，对猪肠衣进行伪狂犬病毒、水痕性口炎病毒、脑心肌炎病毒以及猪细小病毒的灭活或去除验证实验，记录数据，制得第二次病毒灭活后猪肠衣的实际病毒降低结果表10：
表10
根据表格10内容可知，第二次病毒(即去内毒)灭活后，猪肠衣内伪狂犬病毒的病毒降低系数均值≧5.08、水痕性口炎病毒的病毒降低系数均值≧4.71、脑心肌炎病毒的病毒降低系数均值≧4.50以及猪细小病毒的病毒降低系数均值≧4.15，即猪肠衣内的病毒总降低系数不低于18.54，单次实验病毒降低系数不低于4.13，可见，猪肠衣的第二次病毒灭活后，其携带的病毒被有效的去除；
同时，在猪肠衣在进行第二次病毒灭活前，将一部分已经经过第一次病毒灭活后的猪肠衣进行脱蛋白和脱脂处理，分别记录脱蛋白以及脱脂后的脂肪、pH、炽灼残渣、重金属、蛋白总量以及羟脯氨酸的含量占比，并在第二次病毒灭活后，再次记录脂肪、pH、炽灼残渣、重金属、蛋白总量以及羟脯氨酸的含量占比，两次静置浸泡处理后，对成品的猪肠衣内的脂肪、pH、炽灼残渣、重金属、蛋白总量以及羟脯氨酸的含量占比再做一次记录，以上数据制成柱状图，如附图10-15所示；
鉴于附图10-15，可见，在第一次病毒灭活后，此时的猪肠衣相较于原材料，其pH数值基本不变、脂肪含量占比下降、炽灼残渣显著减少、重金属保持不变、蛋白总量有所提升、羟脯氨酸的含量提高；
在第一次病毒灭活后，此时的猪肠衣相较于原材料，其pH数值基本不变、脂肪含量占比下降、炽灼残渣显著减少、重金属保持不变、蛋白总量有所提升、羟脯氨酸的含量提高；
因此，通过病毒灭活评估确认去除了产品中最危险的免疫原，通过各制造工序的免疫原项目DNA残留量评价，确认去除了原材料中可引起免疫反应的免疫原DNA，即原料内部的免疫原在该过程中被完全去除、管理和控制。
综上，本发明通过使用碱液对动物源性生物材料，如猪肠衣，进行静置浸泡，随后通过过氧化氢溶液再次对动物源性生物材料进行静置浸泡，从而有效的去除动物源性生物材料中的伪狂犬病毒、水疤性口炎病毒、脑心肌炎病毒及猪细小病毒，且同时有效的祛除了动物源性生物材料中的免疫原，而通过静置浸泡的方式，使得碱液以及过氧化氢溶液可以适用不同的病毒和不同的动物种属，从而适用于多种动物的不同组织，达到病毒的高度灭活的效果；
本发明通过使用两次静置浸泡，即碱液以及过氧化氢对动物源性生物材料进行两次静置浸泡，整个过程简单易操作，涉及的溶液较少，病毒灭活后的试剂残留易祛除，而两次简单的静置浸泡，即可在达到病毒灭活效果的同时具有祛除脂肪和内毒素的效果，降低动物源医疗器械的的免疫原，进而省去传统病毒灭活中需要进行免疫原祛除的工艺步骤，从而极大的简化了工艺流程，操作简单方便。
以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。
Claims (7)
1.一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，其特征在于：包括如下步骤：
(A)、使用碱液对动物源性生物材料进行静置浸泡；
(B)、采用纯化水清洗残留碱液至pH为中性，完成第一次病毒灭活；
(C)、使用强氧化物对完成第一次病毒灭活后的动物源性生物材料再次进行静置浸泡；
(D)、再次采用纯化水清洗试剂残留至pH为中性，完成第二次病毒灭活。
2.根据权利要求1所述的一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，其特征在于：在步骤(A)中，碱液为氢氧化钠、氢氧化钾或碳酸钙中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，其特征在于：在步骤(A)中，碱液的浓度为0.5-1.5mol/L，静置时间为40-120min，动物源性生物材料与碱液的料液比为，动物源性生物材料：碱液＝1g：4-8ml。
4.根据权利要求3所述的一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，其特征在于：在步骤(A)中，碱液选用浓度为1.5mol/L的氢氧化钾溶液，静置时间为120min，动物源性生物材料与碱液的料液比为，动物源性生物材料：碱液＝1g：5ml。
5.根据权利要求1所述的一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，其特征在于：在步骤(C)中，强氧化物为过氧化氢、高锰酸钾或次氯酸的一种。
6.根据权利要求5所述的一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，其特征在于：在步骤(C)中，选用4％-15％强氧化物溶液，静置时间为3-10h，动物源性生物材料与强氧化物的料液比为，动物源性生物材料：强氧化物＝1g：4-10ml。
7.根据权利要求6所述的一种动物源性生物材料的病毒灭活方法，其特征在于：在步骤(C)中，选用15％强氧化物溶液，静置时间为10h，动物源性生物材料与强氧化物的料液比为，动物源性生物材料：强氧化物＝1g：10ml。
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