CN117045856A - 多功能自愈合可注射水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药领域，涉及伤口敷料，具体涉及多功能自愈合可注射水凝胶及其制备方法与应用，所述水凝胶包括水凝胶主体、负载在水凝胶主体内的活性成分；水凝胶主体为CMCS原液与QOSA原液按一定比例混合制得；活性成分为DABP；其中，CMCS为羧甲基壳聚糖，QOSA是海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵反应后经氧化处理获得的产物；DABP为鹿茸血经碱性蛋白酶酶解获得的产物。该水凝胶具有较好的自愈合性和可注射特性，有利于伤口部位给药，其还具有止血、抑菌、抗氧化活性，可诱导伤口修复第一个阶段（止血）的发生，减轻伤口部位ROS的损害，降低糖尿病伤口中的炎症反应，促进慢性伤口修复。

Description

多功能自愈合可注射水凝胶及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药领域，涉及伤口敷料，具体涉及多功能自愈合可注射水凝胶及其制备方法与应用。
背景技术
糖尿病伤口治疗在临床上仍面临着重大挑战，过度炎症，持续出血和伤口渗出液堆积是糖尿病伤口普遍遇到的问题，会妨碍细胞增殖和扰动组织重构；另外，糖尿病伤口微环境中持续的炎症环境产生大量活性氧(ROS)，高表达的 ROS会对正常细胞及组织造成损害，使得糖尿病伤口难以愈合。
现如今，科研人员开发了多种生物材料，例如电纺纤维膜，橡胶敷料，海绵敷料等。水凝胶因其与天然细胞外机质（ECM）相似的特性常被应用于生物医学领域。其一，水凝胶湿软的特性，不仅能为伤口部位提供湿润的环境，还可有效避免与伤口部位的摩擦引起二次伤害。其二，水凝胶疏松多孔的结构，可以快速吸收伤口部位渗出液，还为伤口部位气体的交换，营养物质的输送，细胞的黏附增值等提供有利条件。
针对于病患伤口的多样性，临床上对于多功能材料的需求不断提升，而自愈合、可注射的水凝胶因其使用方便，无痛，便于更换的特点备受到关注。同时水凝胶在应用于伤口部位时，常常发生损坏，而对于具有可逆动态网络的水凝胶，其可以自动恢复结构，继续使用，延长了伤口材料的使用时间，提高了生物材料的利用率。而自身拥有抑菌、止血、促进细胞增值迁移、抗氧化等功能的水凝胶对于促进慢性伤口修复存在更大优势。因此，有必要设计一种具有抑菌、止血、促进细胞增值、抗氧化活性的多功能自愈合、可注射水凝胶材料。
发明内容
鉴于上述技术问题，本发明的目的在于提供一种多功能自愈合可注射水凝胶，该水凝胶具有较好的自愈合性和可注射特性，有利于伤口部位给药，其还具有止血、抑菌、抗氧化等活性，可诱导伤口修复第一个阶段（止血）的发生，减轻伤口部位 ROS 的损害，降低糖尿病伤口中的炎症反应，促进糖尿病伤口修复。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
多功能自愈合可注射水凝胶，包括水凝胶主体、负载在水凝胶主体内的活性成分；所述水凝胶主体是CMCS原液与QOSA原液按照1:1的比例混合制得；所述活性成分为DABP；其中，所述CMCS为羧甲基壳聚糖；所述QOSA是海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵反应后经氧化处理获得的产物，所述海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1:1-2；所述DABP为鹿茸血经碱性蛋白酶酶解获得的产物。
作为本发明的优选，所述海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1:1.715。
本发明还提供一种多功能自愈合可注射水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
（1）QSA的制备：
取海藻酸钠溶于蒸馏水中充分搅拌至其完全溶解，加入2，3环氧丙基三甲基氯化铵搅拌均匀，置于搅拌器中避光反应，待反应结束，调节PH至7以下，终止阳离子化过程，然后放置室温；加入乙醇进行沉淀，过滤，收集产品进行烘干；其中，所述海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1:1-2；
（2）QOSA的制备
称取步骤（1）的产物，将其溶于蒸馏水中搅拌至其完全溶解，加入高碘酸钠避光反应，然后加入乙二醇终止反应，放置室温，在去离子水中用3500Da的透析袋透析，冻干获得QOSA；
（3）DABP的制备
将鹿茸血冻干粉溶于蒸馏水中，配置鹿茸血溶液，搅拌均匀后，用2mol/l的氢氧化钠调节PH 至11，加入碱性蛋白酶，58℃反应3h后，升温至100℃消化10min 使酶失活，抽滤，获得鹿茸血总酶解物，再通过超滤处理获得小于3000Da 的组分，冻干获得DABP；
（4）水凝胶的制备
取DABP冻干粉加入到CMCS原液中，然后按照1:1的比例与QOSA 原液混合获得负载DABP的水凝胶。
作为本发明的优选，步骤（1）中所述海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1: 1.715，在60℃搅拌器中避光反应24小时。
作为本发明的优选，步骤（2）中所述步骤（1）的产物与高碘酸钠的质量比为1:1.08，避光反应5h。
作为本发明的优选，步骤（3）中配置2%的鹿茸血溶液，所述碱性蛋白酶的加入量为鹿茸血冻干粉的2%。
作为本发明的优选，步骤（4）中CMCS原液的制备方法为：取25 mg的CMCS溶于5ml的PBS中，搅拌至其完全溶解，获得CMCS原液；QOSA 原液的制备方法为：取25 mg的QOSA溶于5ml的PBS中，搅拌至其完全溶解，获得QOSA原液。
本发明在进行试验对两种季铵化程度的QSA止血效果进行测定，发现样品2具有更低的BCI 数值、凝血时间和肝脏出血量，止血效果好，样品2与CMCS混合制备的水凝胶具有较好的止血效果，且负载DABP的QOSA&CMCS&DABP水凝胶的止血效果更优；因此，多功能自愈合可注射水凝胶可以作为止血凝胶在体内或体外伤口止血药物中应用。
本发明在进行试验时发现，QOSA&CMCS&DABP水凝胶可以降低伤口部位TNF-α 、IL-1β 和MMP-9的表达；同时，还可提高伤口部位TGF-β1、PDGFA和CollagenⅠ的表达；因此，多功能自愈合可注射水凝胶可以在制备降低伤口部位TNF-α 、IL-1β 和MMP-9表达的药物中应用；或，在制备提高伤口部位TGF-β1、PDGFA和CollagenⅠ表达的药物中应用；或，在制备降低伤口部位TNF-α 、IL-1β 和MMP-9表达，同时提高伤口部位TGF-β1、PDGFA和CollagenⅠ表达的药物中应用。
本发明在进行试验时发现，QOSA&CMCS&DABP组伤口部位已经完全再上皮化，皮脂腺和毛囊已经生成，且胶原蛋白含量明显增加，存在更为紧凑和有序的胶原排列，与正常皮肤的胶原沉积排列更相近；因此，多功能自愈合可注射水凝胶可以在制备促进糖尿病伤口组织的胶原基质重塑和功能重建的药物中应用。
本发明的优点和有益效果：
（1）本发明提供的装载DABP的水凝胶，通过QOSA 中的醛基与CMCS中的氨基自发席夫碱反应，使水凝胶具有较好的自愈合性和可注射特性，可有效提高伤口敷料的稳定性，有利于伤口部位给药，且更益于不规则伤口的填充，还可延长伤口材料的使用时间，提高生物材料的利用率。
（2）本发明选用季铵试剂对海藻酸钠进行改性，将阳离子基团引入海藻酸钠中，海藻酸钠被成功季铵化后，选用高碘酸钠对海藻酸钠进行氧化，获得季铵化氧化海藻酸钠，带有正电荷的QOSA 不仅能够起到抑菌作用，还可以促进红细胞聚集，促进伤口部位的凝血，诱导伤口修复第一个阶段（止血）的发生。
（3）本发明提供的装载DABP的水凝胶呈现出多孔结构，有利于伤口部位气体的交换、细胞生长和附着，其具有更高的溶胀比，可快速吸收伤口部位的渗出液，降低伤口部位的染菌率，并借助水凝胶的保水性能，为伤口部位提供湿润的环境，加速伤口修复。
（4）本发明提供的装载DABP的水凝胶具有较好的血液相容性和生物相容性，其可持续释药，达到长久持续止血、抗炎、抗菌、抗氧化、促修复的效果，从而加速伤口愈合。
（5）本发明提供的装载DABP的水凝胶（QOSA&CMCS&DABP）具有较好的抗氧化性能，可以减轻伤口部位 ROS 的损害，降低糖尿病伤口中的炎症反应；另外，该水凝胶还具有较好的止血性能和抑菌效果，考虑可能是由于DABP丰富的肽段结构中含有抑菌效果的肽段和止血效果的肽段，DABP与QOSA两者协同作用，可以有效促进糖尿病伤口修复。
（6）本发明通过H&E和Masson染色发现，QOSA&CMCS&DABP组伤口部位已经完全再上皮化，皮脂腺和毛囊已经生成，且胶原蛋白含量明显增加，存在更为紧凑和有序的胶原排列，与正常皮肤的胶原沉积排列更相近，进一步证明QOSA&CMCS&DABP水凝胶可促进糖尿病伤口组织的胶原基质重塑和功能重建，促进糖尿病皮肤伤口修复。
（7）本发明通过免疫组织化学染色和Western Blot分析，确定QOSA&CMCS&DABP水凝胶能够增强皮肤伤口部位细胞的增殖，降低伤口部位炎症反应（降低TNF-α 、IL-1β 和MMP-9的表达）；同时，还可提高伤口部位TGF-β1、PDGFA和collagenⅠ的表达，从而加速糖尿病伤口愈合。
附图说明
图1是QOSA的制备。
图2是水凝胶的制备和材料表征；其中，(a)水凝胶QOSA、Q2-1、Q1-1、Q1-2、QOSA&CMCS&DABP、CMCS形成图片；（b）载药水凝胶的制备； (c)FT-IR光谱；(d)核磁共振氢谱图。
图3是水凝胶的自愈合可注射性能分析图；其中，（a）各组注射前体水凝胶；(b)水凝胶切口修复图片；(c)各组水凝胶的可注射性照片；（d）、（e）、（f）、(g)分别表示应变由100%切换到1500%时各组水凝胶的流变性能。
图4是水凝胶扫描电镜图；其中，（a）Q2-1、Q1-1、 Q1-2、 QOSA&CMCS&DABP水凝胶的SEM图片（×50、×100、×200）；(b) 各组水凝胶孔径大小正态分布图。
图5是水凝胶的性能分析图；其中，(a)各组水凝胶流变图片；（b）溶胀率；（c）水凝胶降解；（d）QOSA&CMCS&DABP水凝胶体外药物释放；（e）ABTS自由基清除率。
图6是水凝胶血液相容性和体内、体外止血结果分析图；其中，（a）1mg/ml 和5mg/ml 水凝胶溶血照片；（b）水凝胶溶血量化图片；（c）、(d)、(e)样品止血筛选图，分别为BCI指数、凝血时间、肝脏出血；（f）水凝胶BCI指数；（g）水凝胶体外凝血时间；（h）水凝胶肝脏止血。
图7是水凝胶体外抑菌结果分析图；其中，（a）各组水凝胶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的菌落计数结果；（b）各组水凝胶对大肠杆菌抑菌效果量化图片；（c）各组水凝胶对金环色葡萄球菌抑菌效果量化图片；（d）不同浓度水凝胶的生物相容性图片。
图8是水凝胶促糖尿病伤口修复的示意图；其中，（a）伤口处理过程流程图；（b）Modle、 Q1-1、QOSA&CMCS&DABP 在0、3、 7、 14、 21 天伤口大小变化；（c）伤口面积愈合量化图；（d）各组伤口愈合面积热图。
图9是水凝胶组织病理学和免疫组化结果分析图；其中，（a）伤口组织H&E、Masson染色图片；（b）PCNA、CD68的免疫组织化学图片；（c）Modle、Q1-1、QOSA&CMCS&DABP胶原沉积统计；（d）Modle、Q1-1、 QOSA&CMCS&DABP的PCNA表达量；（e）Modle、Q1-1、 QOSA&CMCS&DABP的CD68的表达量。
图10 是水凝胶蛋白质印迹结果分析图；其中，（a）TNF-α、IL-1β、MMP-9、TGF-β1、PDGFA、COL-I、β-actin的蛋白条带；(b) TNF-α 的定量分析；（c）IL-1β的定量分析；（d）MMP-9的定量分析；（e）TGF-β1 的定量分析；(f) PDGFA 的定量分析；(g) CollagenⅠ的定量分析。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
一、试验材料
海藻酸钠（SA）购自阿拉丁有限公司；羧甲基壳聚糖（CMCS）购自上海麦克林生化有限公司；2，3环氧丙基三甲基氯化铵（GTMAC）购自上海麦克林生化有限公司；碱性蛋白酶（200000u/g）购自北京索莱宝科技有限公司；高碘酸钠（分析纯）、盐酸羟胺、盐酸、氯化钙均购自上海国药化工试剂有限公司。
动物：所有ICR雄性小鼠（18-22g）均购自长春市益思实验动物技术有限公司（中国长春），饲养在标准的实验室环境中（22±2°C，湿度：60±5%，12h光照/12h黑暗循环）。所有实验程序均由吉林农业大学动物保育与使用委员会批准（编号：2022-11-20-1），并严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）的《实验动物保育与使用指南》。
细胞和菌：人永生化角质形成细胞（Hacat），购自上海富航生物技术有限公司；大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均购自上海雅吉生物科技有限公司。
二、水凝胶的制备
（1）QSA 的制备
首先取5g的海藻酸钠溶于250ml 的蒸馏水中充分搅拌至其完全溶解，分别加入5.725g 和8.575g的GTMAC搅拌均匀，置于60℃搅拌器中避光反应24小时（见图1），待反应结束，调节PH至7以下，终止阳离子化过程，然后放置室温；加入过量的乙醇进行沉淀，过滤，收集产品进行烘干，这里分别命名为样1 和样2，并采用元素分析仪对样1 和样2 的季铵化程度进行测定。
（2）QOSA的制备
依据样1 和样2 的季铵化程度和及其止血效果综合评价，本申请选用样2进行下一步氧化。称取1g样2 溶于100ml 的蒸馏水中搅拌至其完全溶解，加入1.08g的高碘酸钠避光反应5h（见图1），然后加入乙二醇终止反应，放置室温，在去离子水中用3500Da的透析袋透析3天，冻干获得QOSA。采用盐酸羟胺法测定其氧化程度。
（3）DABP的制备
选用碱性蛋白酶对鹿茸血进行酶解。取鹿茸血冻干粉20g溶于1000ml的蒸馏水中，配置2%(w/t) 的鹿茸血溶液，37℃搅拌10分钟，搅拌均匀后，用2mol/l的氢氧化钠调节PH至11，加入碱性蛋白酶2%（0.4g），58℃反应3h后，升温至100℃消化10min 使酶失活，抽滤，获得鹿茸血总酶解物，再通过超滤处理获得小于3000Da 的组分，其主要成分为鹿茸血肽，这里命名为DABP。
（4）水凝胶的制备
4.1空白水凝胶的制备
分别取25 mg的QOSA和CMCS（羧甲基壳聚糖）溶于5ml的PBS中，搅拌至其完全溶解，获得QOSA和CMCS原液；取两种溶液，将两种溶液按照2:1，1:1，1:2 的比例混合，搅拌均匀，静置获得水凝胶，并通过试管倒置法测定其是否成胶，将三种比例混合的水凝胶分别命名为Q2-1(2:1)，Q1-1(1:1)，Q1-2(1:2)。
4.2 负载DABP水凝胶的制备
依据水凝胶的溶胀性能和交联程度等综合评价选用1：1比例混合的水凝胶负载DABP，取DABP冻干粉5mg加入到5ml的CMCS原液中，然后按照1:1的比例与QOSA 原液混合获得负载DABP的水凝胶（QOSA&CMCS&DABP），载药水凝胶的制备流程图如图2b所示。
本发明参照上述方法制备了QOSA、Q2-1、Q1-1、Q1-2、QOSA&CMCS&DABP、CMCS水凝胶（见图2a），并对上述制备的QSA 、QOSA及水凝胶进行表征和测试，具体情况如下：
（1）QSA 和QOSA的表征。
通过元素分析仪测定QSA 中CHN 的含量，计算QSA的季铵化取代程度。用核磁共振氢谱 1H NMR和傅里叶红外光谱FT-IR 对样1和样2 以及QOSA的化学结构进行了表征。
（2）水凝胶的自愈合性
本实验通过两种方法测定了水凝胶的自愈合性能。首先将水凝胶前体溶液置于圆形模具中，形成两个圆形水凝胶，取其中一块水凝胶采用亚甲基蓝进行染色。然后将两块水凝胶都切为两部分，最后将两种颜色的水凝胶进行拼接，室温放置，观察其自愈合情况（如图3b）。
用流变仪测定了水凝胶的自愈合性能。将水凝胶Q2-1 Q1-1 Q1-2和QOSA&CMCS&DABP制备为直径25mm 厚2mm 的圆饼状。角频率设定为1rad/s，振幅振荡应变由100%转化为1500%，循环3次，每次60s，每组平行三次。
（3）水凝胶的可注射性能
通过1ml 的注射器注射各组水凝胶，来验证各种水凝胶的可注射性能。首先制备1ml的Q2-1,Q1-1, Q1-2, QOSA&CMCS&DABP 的水凝胶，通过亚甲基蓝、亚甲基橙、石蕊红、和溴甲酚绿对各种水凝胶进行染色（便于后续的观查），结果如图3a所示。将染色后的水凝胶吸入注射器内，然后利用注射器注射出各组水凝胶。
（4）水凝胶的流变性能
采用HAAKE MARS 60 流变仪对Q2-1 ,Q1-1 ,Q1-2, QOSA&CMCS&DABP水凝胶的流变学性能进行测定。温度设定为25 ℃，振荡应变范围设定为0.1%-100% 测定了水凝胶的弹性模量（G’）和损耗模量（G’’）。
（5）水凝胶的扫描电镜图（SEM）
将冻干的水凝胶Q2-1,Q1-1,Q1-2 和QOSA&CMCS&DABP,切块喷金，采用扫描电镜，在加速电压15KV的条件下，观察水凝胶的微观结构。
（6）溶胀率测定
通过测定水凝胶的重量变化，来评价水凝胶的溶胀性能。制备同等体积的水凝胶，冻干处理获得冻干水凝胶Q2-1,Q1-1,Q1-2, QOSA&CMCS&DABP 称重记为W0。在固定时间取出水凝胶，放置滤纸上吸干水凝胶表面多余水分称重。按照下列公式计算水凝胶的溶胀率：
Q=(Wt-W0)/W0×100%；其中，Wt 为固定时间取出的水凝胶的重量，W0 为冻干水凝胶的原始重量。
（7）降解性能
通过失重法对水凝胶Q2-1 、Q1-1、Q1-2 和 QOSA&CMCS&DABP的降解程度进行评价。首先制备等体积的水凝胶，称重，将水凝胶的初始重量记为W0。将称重后的水凝胶浸泡在含有20ml PBS(PH =7.4)的离心管中，置于空气浴37℃，100r。于不同的时间内取出水凝胶，并吸干水凝胶表面的水分称重记为Wt。按照下列公式计算水凝胶的降解率。
降解率=W0/Wt×100。
（8）DABP 的体外药物释放
制备体积为1ml的QOSA&CMCS&DABP水凝胶，将其浸泡在预热好的PBS中，37℃，100r的条件下孵育。在固定时间，吸出1ml的释放溶液，同时添加1ml 的PBS溶液，用BCA蛋白定量试剂盒测定在不同时间点DABP的释放量。
（9）ABTS 自由基清除活性
采用ABTS自由基清除实验对水凝胶Q1-1和QOSA&CMCS&DABP的抗氧化活性进行评价，具体方法如下，取浓度为7.4 mM和2.45 mM的ABTS和过硫酸钾溶液，按照1:1 (v/v)的比例混合后低温暗反应12 h，使用前用蒸馏水进一步稀释溶液至734 nm处的吸光度为0.7±0.02。取冻干后的Q1-1 和QOSA&CMCS&DABP水凝胶进行粉碎，37℃浸泡在10ml PBS中24h，获不同浓度的水凝胶样品溶液，将受试样品与ABTS工作液1:2 (v/v)混合，室温避光反应10min，测定734 nm处的吸光度，计算公式如下：
ABTS自由基清除能力(%) =[1−(As−Ab)/Ac]×100%；
其中，As是样品的吸光度，Ab是仅样品的吸光度， Ac是对照品的吸光度。
（10）水凝胶的血液相容性
利用紫外分光光度计评价了水凝胶的溶血性能。取新鲜兔血离心获得红细胞，用PBS缓冲液将红细胞稀释至浓度为4%红细胞悬浮液。然后取冻干后的水凝胶粉碎，配置成1mg/ml和5mg/ml的水凝胶匀浆分散体，取400ul的红细胞悬浮液与等体积的水凝胶的分散液混匀，37℃孵育3h后，离心吸取100ul的上清液点至96孔板，每组平行3次，在540nm处记录上清液中血红蛋白含量，Trionx-100和PBS 分别作为阳性对照和阴性对照，按照下列公式进行计算水凝胶的溶血率：
Hemolysis (%) = (As-An)/(Ap -An) × 100%；其中，As为水凝胶样品组吸光度，An为PBS组吸光度，Ap为Trionx-100组的吸光度（OD 值）。
（11）体外止血效果
11.1 凝血指数
凝血指数（BCI）用于评价水凝胶的止血性能，BCI值越小，材料凝血效果越好。首先称取10mg的冻干的各组水凝胶，在37℃孵育10分钟，加入100ul 的抗凝兔血和20ul的CaCl2溶液，孵育5分钟后，加入25ml 的蒸馏水。利用紫外分光光度计，测定其在545nm 处的吸光度。按照下列公式计算水凝胶样品的BCI指数。每组平行3 次，不添加样品组作为对照。
BCI=(AS/AC)×100%
其中，AS为水凝胶样品的吸光度值，AC为不添加样品的吸光度值。
11.2 血液凝固时间
首先取10mg的冻干的水凝胶样品置于5ml 的离心管中37℃孵育10min，加入500ul的抗凝兔血和100ul的0.2mol/l 的CaCl2溶液，每5s 倾斜离心管，直到血液全部凝固，记录血液凝固时间。每组平行3次，记录凝血时间。
（12）水凝胶的体内止血性能
基于上述体外止血实验，通过小鼠肝脏止血实验验证水凝胶的体内止血性能。采用ICR雄性小鼠，30-40g。用4%的水合氯醛麻醉小鼠，将其固定在手术板上，切开小鼠腹部使其肝脏暴露，利用棉球迅速吸收小鼠腹腔积液，将预先称重的滤纸置于肝脏下方。用18G针头诱导肝脏出，然后将0.1ml的水凝胶注射至肝脏出血位置，计时5min 称量吸血后滤纸重量，对照组不给予水凝胶处理，通过计算对照组与空白组差值为出血量，每组平行4次。
（13） 水凝胶体外抑菌性能
通过采用菌落计数法对水凝胶Q2-1、Q1-1、Q1-2 和QOSA&CMCS&DABP的抑菌性能进行评价。选用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为模型菌。制备同等大小的水凝胶，在紫外灯下灭菌2h。将灭菌后的水凝胶放置在48孔板中，吸取10ul (108 cfu/ml) 的菌液，滴加置水凝胶表面，不添加材料组作为对照，37℃ 100r 培养两小时后。每孔加入1ml 灭菌后的PBS 重悬菌液，每孔吸取100ul，均匀的涂抹在固体培养基中，培养12-24h 计数，按照下列公式计算抑菌率。
细菌抑制率%=对照组-样品组/对照组×100%。
（14）生物相容性
选用Hacat为研究对象，通过浸出模式试验测定了各组水凝胶的生物安全性，每组平行6次。实验前将水凝胶样品在紫外灯下照射2h 杀菌，将不同体积水凝胶浸泡在培养基中24h,获得含有不同浓度水凝胶提取物的培养基。取对数增长期的Hacat以20000/孔密度接种到96孔板中，培养24h 后。更换为含药培养基继续培养细胞24h，每孔加入20ul 的MTT反应4h 后，每孔加入10ul 的DMSO，摇匀10min。在490nm 的波长下测定其吸光度，不更换载药培养基组作为对照。依照下列公式计算细胞活力：
Cell ability %=(At-Ab/Ac-Ab)×100；
其中，At 为样品组吸光度，Ab调零孔吸光度，Ac为对照组吸光度。
（15）皮肤伤口愈合试验
构建糖尿病创伤伤口模型，评估水凝胶对创面伤口愈合的影响。选用ICR雄性小鼠（25±5g），所有小鼠均按照实验动物护理指南进行培养，小鼠适应性饲养一周后，选用高糖高脂饲料喂养5周，断食12h，3天内依次腹腔注射STZ（80mg/ml、70mg/ml 、60mg/ml）。一周后测定血糖值≥10 mM 的为患病小鼠。取患病小鼠分为3组，每组12 只，麻醉小鼠，剃毛，创建直径为1.5cm 的伤口。给药组每日注射水凝胶至伤口位置，模型组不做任何处理。在创建伤口的第0，3，7，14 ，21拍照观察伤口愈合情况。用Image J 软件计算伤口面积大小。按照下列公式计算伤口愈合率：
伤口愈合率=（W0-Wt）/W0×100%；
其中，W0 为伤口初始面积，Wt 为伤口愈合面积。
（16）组织病理学分析
在伤口修复的第21天，取不同组别处理的伤口部位皮肤。通过苏木精-伊红（H&E ）和马森三色（Masson） 染色对其伤口部位的再上皮化和胶原蛋白的沉积进行观察。染色切片用日本尼康公司Eclipse E400光镜进行观察。
（17）免疫组织化
选用CD68 和PCNA 蛋白的表达来观察伤口部位的炎症反应和细胞增值情况。采用Image J 软件测定阳性染色区的积分光密度（OD）。
（18）蛋白质印记分析
取第21天的伤口部位皮肤组织，剪碎，在冰浴条件下，用含有PMSF的RIPA 裂解液提取皮肤组织中的蛋白质。利用BCA蛋白的定量试剂盒测定各组样品中的蛋白浓度。将提取获得的蛋白质分装，加入5×的loading buffer 煮沸10min。上样，选用5% 的凝缩胶和10%的分离胶，分离蛋白。电泳分离结束后，转膜至PVDF上，选用5%的脱脂奶粉封闭2h，孵育特异性一级抗体1.5h 后。用TBST清洗PVDF膜3次，每次10分钟。孵育对应的二级抗体（鼠抗、兔抗）孵育1h后。再用TBST 清洗三次，每次10分钟。用成像仪进行检测。用Image J 软件计算蛋白条带灰度值。
本发明数据统计分析选用SPSS 22.0 版，进行统计学意义分析。当p值小于0.05时（*p＜0.05)，数据之间存在显著性差异。结果为均值±标准差(SD)进行表示。
三、结果
（1）QSA 和QOSA 的制备与表征
季铵化接枝SA其机理如图1所示，将GTMAC 接枝到SA 上，再通过NaIO4 氧化QSA ，将QSA的邻位羟基氧化为醛基获得QOSA。通过元素分析，样1和样2的季铵化取代度分别为30.45% ，45.94% 。盐酸羟胺法测定QOSA的氧化程度为46.50%。
图2c为SA、GTMAC、样1（Sample1） 、样2（Sample2）和QOSA 的红外光谱图。SA 在3591cm-1 存在显著的OH的伸缩振动。样1和样2 在1484cm-1处的吸收峰为季氨基团的特征吸收峰，表明样1和样2被成功的季铵化。QOSA 在1746cm-1处存在CHO的特征吸收峰，表明QSA成功被氧化，其在1484cm-1处存在季铵基团的特征吸收峰。表明QOSA的成功合成。
核磁共振氢谱结果见图2d。与SA相比，样1和样2在3.20 ppm 处存在特征吸收峰，该峰是由于季铵盐甲基中的氢引起的，表明SA被成功季铵化。QOSA 在3.2ppm和9.60ppm 处存在特征吸收峰，表明QSA被成功氧化，并且季铵基团并未遭到破坏。
（2）水凝胶的自愈合评价
水凝胶应用在伤口部位时，常因外力的作用而被破坏，具有良好的自愈合，可注射特性可有效提高伤口敷料的稳定性，并且更益于不规则伤口的填充。通过宏观实验和流变实验对水凝胶的自愈性能进行评价。在宏观实验中，如图3b显示，可以发现深色水凝胶可与浅色水凝胶重新组合在一起，并存在向对方过度的趋势。流变实验用于定量评价水凝胶Q2-1,Q1-1,Q1-2,QOSA&CMCS&DABP 的自愈合性能。如图3d-g，应力由100% 和1500%进行交替变化，当应力为100%时，各组水凝胶的G’ 值均大于G’’ 值，表明水凝胶结构稳定。当应力切换为1500% 时水凝胶的弹性模量(G’) 小于损耗模量（G’’），表明水凝胶网络结构被破坏，当应力还原为100% 时，水凝胶的G’值恢复，表明水凝胶存在自愈合的特征。
（3）水凝胶的可注射性能评价
图3c 显示，水凝胶可通过针头注射为“JLNY”等形状，表明水凝胶存在注射性能，注射过程中由于Q1-1拥有最流畅的注射过程，无堵塞的现象，有利于伤口部位给药，其作为后续被选为载药比例的原因之一。而Q2-1注射过程存在堵塞显现，这可能归因于Q2-1的交联程度较强，存在较高的G’值，与其它组水凝胶相比，Q2-1相对较硬。综上结果显示，QOSA&CMCS&DABP水凝胶具有良好的可注射性能，符合理想敷料的需求，为其应用到伤口部位奠定了基础。
（4）水凝胶的流变性能分析
理想的水凝胶敷料应存在稳定的力学性能，可承受伤口部位的压力，提高水凝胶敷料的利用率。为了测定Q2-1、Q1-1、Q1-2、QOSA&CMCS&DABP 水凝胶的力学性能。通过HAAKEMARS 60 流变仪在25℃条件下测定了各种水凝胶的弹性模量（G’）和损耗模量（G’’）。如图5a，各组水凝胶的弹性模量均大于损耗模量，表明水凝胶存在稳定的结构。同时可以发现，随着QOSA所占比例的增加，水凝胶的弹性模量增高，这可能是与各组水凝胶的交联程度有关，QOSA所占比例越大，水凝胶结构越稳定，水凝胶硬度增强，这与上述水凝胶的微观结构结果保持一致。
（5）水凝胶的扫描电镜图（SEM）
通过扫描电镜SEM 对水凝胶的微观结构进行观察，结果如图4a，各组水凝胶均呈现出多孔结构，这有利于伤口部位气体的交换和细胞生长和附着，同时可快速吸收伤口部位渗出液，为伤口部位提供湿润的环境。本发明通过image J 软件对各组水凝胶的孔径进行分析，结果如图4b 所示。由图4b可知，各组水凝胶孔径大小不一，这可能与QOSA的添加比例有关，其中Q2-1 的孔径最小，这是由于QOSA 的添加比例最大，其醛基含量增加，使其与CMCS 的交联程度增加，使水凝胶结构更加紧密；Q1-1 与QOSA&CMCS&DABP 的孔径分别为108.3±56.61 和106.36 ±33.72，负载DABP的水凝胶孔径相对降低，但两者无显著差异。表明DABP的载入对水凝胶的孔径未产生显著性影响。
（6）水凝胶的溶胀性能
保持湿润的伤口环境，快速清除伤口部位渗出液对创面伤口的修复存在重要意义。本发明中，测定了各组水凝胶的溶胀比来评价水凝胶的溶胀性能。图5b显示了各组水凝胶的溶胀比，由图得出水凝胶Q2-1 在3小时就达到了溶胀平衡，其溶胀率为2800%，Q1-1在第3小时的溶胀率为3404%，Q2-1的溶胀比低于Q1-1，这可能是由于Q2-1交联程度较高，孔径降低。水凝胶QOSA&CMCS&DABP在3h后溶胀比相对降低，这可能与DABP从水凝胶中释放出来有关。水凝胶Q1-2 在溶胀比达到最高值后，迅速降低，这可能是由于水凝胶Q1-2的交联程度较低的原故。与以往实验研究相比，本发明水凝胶存在更高的溶胀比，其可以快速吸收伤口部位的渗出液，降低伤口部位的染菌率，并借助水凝胶的保水性能，为伤口的修复提供适宜环境。与Q2-1，Q1-2 相比，Q1-1的溶胀比最高，及制备方法简单，所以选用1：1的比例负载DABP，负载上DABP的水凝胶的溶胀比相对降低，但其仍大于Q2-1 的溶胀比，其原因可能DABP负载到水凝胶所致。
（7）水凝胶的降解性能
伤口敷料的可降解性是生物材料的基本要求，本发明采用重力法对各组水凝胶的体外降解性能进行评价。其在PBS中的降解曲线如图5c所示，冻干水凝胶在PBS中呈现出先溶胀再将降解的情况，在50h 后各组开始降解，在空白水凝胶中Q2-1在120h时干重质量剩余59.86%，降解速度低于Q1-1 和Q2-1，这可能与其交联程度有关。QOSA&CMCS&DABP和Q1-1在165h，质量剩余分别为28%和31.82%，满足生物材料缓慢降解的性能。QOSA&CMCS&DABP和Q1-1在50h后开始逐步降解，满足生物材料缓慢降解的性能。
（8）DABP的体外药物释放
评价QOSA&CMCS&DABP 的控释能力如图5d 所示，由图可见，在最初的5h ，DABP 快速释放，这可能归因于水凝胶大孔隙的特点。在5h 后DABP的释放减慢变得舒缓，在第10hDABP 的释放量接近79.44%，而在持续的150h 内释放量接近100%。表明QOSA&CMCS&DABP存在控释的能力。
（9）ABTS自由基清除率
通过水凝胶Q1-1 和QOSA&CMCS&DABP对ABTS自由基的清除率，评价了水凝胶抗氧化性能。结果如图5e，浓度为1mg/ml 的Q1-1和QOSA&CMCS&DABP 水凝胶均存在对ABTS自由基的清除的作用，其清除率分别为26.9±0.02%和89.6±0.06%，且随着样品浓度增加，其清除作用也随之增加。此外，与空白水凝胶相比，载药水凝胶呈出更强的抗氧化能力，这是由于DABP的抗氧化作用。
（10）血液相容性评价
在水凝胶敷料应用于伤口之前，为确保其安全性，对水凝胶的血液相容性进行评价。如图6a所示，与曲拉通阳性对照组相比，水凝胶组并未出现溶血现象，两者形成了显著对比，与阴性对照PBS组相近，表明水凝胶并未破坏红细胞。图6b为水凝胶的溶血率的量化图。本发明测定了水凝胶在1mg/ml 和5mg/ml 的两个浓度下各水凝胶的溶血率，由图6b可知，水凝胶在1mg/ml 的浓度下溶血率低于5mg/ml的溶血率，但在两种浓度的范围内，两者溶血率均小于1%，符合生物材料溶血率低于5% 的要求。表明其具有较好的血液相容性，可用于创面伤口。
（11）水凝胶的体外止血性能
11.1 凝血指数（BCI）
止血作为伤口修复过程的第一步，可诱导伤口愈合的发生。所以具有止血性能的伤口敷料为促进伤口修复打下基础。本发明首先对两种季铵化程度的QSA（这里命名为样1和样2）止血效果进行测定。通过血液凝血指数，体外凝血时间，肝脏出血量对样1和样2进行筛选，结果6c-d显示，样品2 具有更低的BCI 数值，凝血时间和肝脏出血量，所以选用样2继续进行后续试验。
凝血指数（BCI）作为评价敷料止血能力的方法之一，其可用于反映材料的凝血效果，BCI 值越小，表明材料的凝血效果越好。水凝胶的BCI数值结果如图6f 显示，与对照组相比，各组水凝胶的BCI 值均低于对照组。与Q1-1 和Q1-2 相比，Q2-1 水凝胶的凝血指数为41.39%，与市售明胶海绵凝血指数相近。QOSA&CMCS&DABP的BCI值为31.44% 其凝血指数最小，其凝血指数低于市售海绵的凝血指数，表明其存在较好的止血效果，原因可能是由于DABP中存在止血肽段。
11.2 血液凝固时间
体外血液凝固时间用于评价材料的促进血液凝固的能力。血液凝固时间越短，表明材料的凝血效果越好。如图6g各组的体外凝血时间分别为，空白对照组（14.24 ±0.33min）、Q2-1(8.45±0.15 min) 、Q1-1(10.07±0.72min) 、Q1-2(10.9±0.90min)、QOSA&CMCS&DABP(6.79 ±50.33min)。与空白组相比，各组水凝胶与其存在显著性差异；其中，QOSA&CMCS&DABP存在最短的体外血液凝固时间，表明其可显著缩短体外凝血时间，存在促进血液凝固的作用。
（12）水凝胶的体内止血性能
本发明采用小鼠肝脏出血模型，进一步评价不同比例混合的水凝胶和QOSA&CMCS&DABP 水凝胶的体内止血性能。如图6h，不进行治疗的作为对照组，与对照组（149±54mg）相比各组水凝胶的肝脏出血量均减少。其中Q2-1水凝胶的出血量为26.7 ±5.7mg, 约为对照组出血量的1/4。与Q1-1(36.66 ±20.81mg)和Q1-2（46.8 ±15mg）相比Q2-1 存在更好的止血效果。其原因可能归因于QOSA 添加比例的增多，使其带有正电荷的季铵盐基团含量增加，带有正电荷的材料能够更好的促进红细胞聚集从而起到止血作用。与Q2-1、Q1-1相比，QOSA&CMCS&DABP存在更低的出血量（20 ±10mg）。
（13）水凝胶的体外抑菌效果评价
与普通皮肤伤口相比，糖尿病伤口处在高糖的环境下更易受到细菌的侵袭，所有具有较好抑菌活性的水凝胶对促进糖尿病伤口修复存在重要意义。带有正电核的季铵基团，可与带负电荷细菌细胞壁结合从而破坏细菌细胞壁，达到杀死细菌的效果。本发明通过菌落计数法测定水凝胶的抑菌效果，如图7a所示，与对照组相比，可以发现各组水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均存在抑制作用。图7b、c，通过定量分析发现，水凝胶对于金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌。Q2-1 对于大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为91.32±1.29%，97.94 ±0.89%，与Q1-1 和Q1-2的抑菌率相比，Q2-1存在更好的抑菌效果。这是由于QOSA所占比例较大的原因。而对于大肠杆菌，含有DABP的水凝胶组，抑菌率最高，这可能是由于DABP中丰富的肽段结构，其中含有抑菌效果的肽段。
（14）水凝胶的生物相容性评价
由于QOSA中含有季铵盐基团会对细胞的生长存在一定的影响，所以本发明通过MTT实验，测定水凝胶的细胞毒性。结果如图7d所示，Q2-1在 50-100mg/ml 的浓度范围内细胞活力在85%以上，而在100-200mg/ml的浓度范围内细胞存活率低于80%，存在细胞毒性。而Q1-1 和Q1-2 以及QOSA&CMCS&DVBP在50-200mg/ml 的浓度范围内细胞活力均在80% 以上。此外随着浓度的提高，水凝胶QOSA&CMCS&DABP表现出促进细胞增殖的作用，表明其存在了良好的生物相容性。
（15）水凝胶促进皮肤伤口修复
在糖尿病全层皮肤伤口缺损模型中观察了水凝胶的创面愈合特征，基于水凝胶适中的机械性能，较大的溶胀性能以及较好的生物安全性能，选择体积比为1：1的水凝胶负载DABP，评估其对促进糖尿病伤口修复的作用。图8a为水凝胶治疗糖尿病伤口愈合的流程图。图8b 显示了Q1-1 和QOSA&CMCS&DABP水凝胶组在第0，3，7，14，21 天伤口面积的变化。由图8c可见，在第7天，QOSA&CMCS&DABP 水凝胶的创面愈合率为65.2 ±3.02% ，优于Q1-1 的创面愈合率为23.72±9.76% 。这是由于DABP 较好的抗氧化效果和促进细胞增值的能力。在第21天，与模型组相比，水凝胶QOSA&CMCS&DABP（98.49±0.45%）伤口几乎完全愈合，由图8d的伤口部位愈合热图也可清晰看出，QOSA&CMCS&DABP组对糖尿病伤口愈合作用显著。其原因一方面是由于QOSA 存在较好的止血性能和抑菌效果，并由于水凝胶大孔径的特点可快速吸收伤口部位组织渗出液，为伤口部位提供湿润的环境。另一方面DABP具有较好的生物活性，两者协同作用，从而有效促进皮肤创面修复。
（16）组织病理学分析
为进一步评价伤口部位皮肤愈合情况，取第21 天3组糖尿病小鼠伤口部位皮肤，进行组织病理学分析。如图9a所示，苏木精-伊红（H&E）结果表明，与模型组相比，QOSA&CMCS&DABP组伤口部位已经完全再上皮化，Q1-1水凝胶组部分上皮化，而模型组仍存在伤口。此外，还可以看出与模型组相比，水凝胶组存在更多的血管，和皮肤附属物（毛囊、皮脂腺）。马森（Masson）三色染色评价了各组伤口部位的胶原沉积情况，颜色越深表明伤口部为胶原蛋白含量越高。如图9a显示，与模型组相比，水凝胶Q1-1 和QOSA&CMCS&DABP组颜色更深，而QOSA&CMCS&DABP存在更为紧凑和有序的胶原排列，与正常皮肤的胶原沉积排列更相近。图9c的胶原蛋白定量分析表明，QOSA&CMCS&DABP组存在最高的胶原蛋白含量，与模型组存在显著性差异（p＜0.05）)。
（17）免疫组织化——伤口愈合中PCNA和CD68 的表达
为进一步研究伤口部位愈合情况。采用免疫组织化学染色PCNA 和CD68 对伤口部位细胞增值和炎症情况进行分析。图9b、d为PCNA免疫组织化学染色和定量分析。与模型组相比，Q1-1 和QOSA&CMCS&DABP的表达量提高，且QOSA&CMCS&DABP表达量最高，与模型组差异显著，表明水凝胶组可有效提高伤口部位细胞的增殖。从CD68免疫组织化学染色图片及其定量图9b、e可以看出；与模型组相比，Q1-1 和QOSA&CMCS&D1 存在较少的炎症表达，与模型组存在显著性差异（P＜0.05），这可能归因于QOSA 存在较强的抑菌效果，减少伤口部位的感染，降低炎症的发生。综上所述，可以得出水凝胶QOSA&CMCS&DABP增强了皮肤伤口部位细胞的增殖并降低伤口部位炎症反应，从而促进伤口愈合。
（18）Western Blot 结果分析
本发明对TNF-α 和IL-1β的表达量进行考察，与模型组相比，经过Q1-1和QOSA&CMCS&DABP 治疗后，显著下调了炎症因子TNF-α 和IL-1β 的表达(图10a、b、c)，并降低了基质金属蛋白MMP-9的表达(图10a、d)。同时显著提高了TGF-β1、PDGFA和CollagenⅠ（缩写为COL-I）的表达(图10e、f、g)，这些迹象表明，水凝胶组可提高伤口部位生长因子TGF-β1、PDGFA的表达水平，增加Ⅰ型胶原蛋白的含量从而促进糖尿病伤口愈合。
以上所述为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.多功能自愈合可注射水凝胶，包括水凝胶主体、负载在水凝胶主体内的活性成分；其特征在于，所述水凝胶主体是CMCS原液与QOSA原液按照1:1的比例混合制得；所述活性成分为DABP；其中，所述CMCS为羧甲基壳聚糖；所述QOSA是海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵反应后经氧化处理获得的产物，所述海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1:1-2；所述DABP为鹿茸血经碱性蛋白酶酶解获得的产物。
2.根据权利要求1所述的多功能自愈合可注射水凝胶，其特征在于，所述海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1:1.715。
3.权利要求1所述的多功能自愈合可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）QSA的制备：
取海藻酸钠溶于蒸馏水中充分搅拌至其完全溶解，加入2，3环氧丙基三甲基氯化铵搅拌均匀，置于搅拌器中避光反应，待反应结束，调节PH至7以下，终止阳离子化过程，然后放置室温；加入乙醇进行沉淀，过滤，收集产品进行烘干；其中，所述海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1:1-2；
（2）QOSA的制备
称取步骤（1）的产物，将其溶于蒸馏水中搅拌至其完全溶解，加入高碘酸钠避光反应，然后加入乙二醇终止反应，放置室温，在去离子水中用3500Da的透析袋透析，冻干获得QOSA；
（3）DABP的制备
将鹿茸血冻干粉溶于蒸馏水中，配置鹿茸血溶液，搅拌均匀后，用2mol/l的氢氧化钠调节PH 至11，加入碱性蛋白酶，58℃反应3h后，升温至100℃消化10min 使酶失活，抽滤，获得鹿茸血总酶解物，再通过超滤处理获得小于3000Da 的组分，冻干获得DABP；
（4）水凝胶的制备
取DABP冻干粉加入到CMCS原液中，然后按照1:1的比例与QOSA 原液混合获得负载DABP的水凝胶。
4.根据权利要求3所述的多功能自愈合可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述海藻酸钠与2，3环氧丙基三甲基氯化铵的质量比为1: 1.715，在60℃搅拌器中避光反应24小时。
5.根据权利要求3所述的多功能自愈合可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述步骤（1）的产物与高碘酸钠的质量比为1:1.08，避光反应5h。
6.根据权利要求3所述的多功能自愈合可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中配置2%的鹿茸血溶液，所述碱性蛋白酶的加入量为鹿茸血冻干粉的2%。
7.根据权利要求3所述的多功能自愈合可注射水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（4）中CMCS原液的制备方法为：取25 mg的CMCS溶于5ml的PBS中，搅拌至其完全溶解，获得CMCS原液；QOSA 原液的制备方法为：取25 mg的QOSA溶于5ml的PBS中，搅拌至其完全溶解，获得QOSA原液。
8.权利要求3至7所述方法制备的多功能自愈合可注射水凝胶作为止血凝胶在制备止血药物中的应用。
9.权利要求3至7所述方法制备的多功能自愈合可注射水凝胶在制备降低伤口部位TNF-α 、IL-1β 和MMP-9表达的药物中的应用；或，在制备提高伤口部位TGF-β1、PDGFA和CollagenⅠ表达的药物中的应用；或，在制备降低伤口部位TNF-α 、IL-1β 和MMP-9表达，同时提高伤口部位TGF-β1、PDGFA和CollagenⅠ表达的药物中的应用。
10.权利要求3至7所述方法制备的多功能自愈合可注射水凝胶在制备促进糖尿病伤口组织的胶原基质重塑和功能重建的药物中的应用。
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