CN117025621A - 一种百合珠芽形成调控基因LlLBD18的克隆及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种百合珠芽形成调控基因LlLBD18的克隆及其应用。其中百合珠芽形成调控基因LlLBD18的苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明基于转录组数据，克隆了卷丹珠芽形成调控基因LlLBD18的全长序列，运用qRT‑PCR分析了LlLBD18在卷丹组织中的表达特异性及在珠芽形成过程中的表达特征，并进一步通过瞬时过表达和病毒诱导的基因沉默技术分析了其在卷丹珠芽形成中的功能，为深入研究百合珠芽形成的分子机制及繁殖应用提供了参考。

Description

一种百合珠芽形成调控基因LlLBD18的克隆及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种百合珠芽形成调控基因LlLBD18的克隆及其应用。
背景技术
卷丹(Lilium lancifolium)，又名宜兴百合，是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物，兼具食用与药用价值。中国分布的卷丹为天然三倍体植物，不产生种子，但其茎中上部的叶腋可形成珠芽，且整株卷丹珠芽多达上百粒。成熟珠芽可长成独立植株，且子代能较好地保留母体特征，因而在生产上有广泛的应用前景。
目前，关于腋生珠芽的研究主要集中于部分珠芽植物的解剖学观察和外源激素处理上，在分子水平上有少数基因被分离，并进行了初步的功能验证。台闽苣苔GFLO基因可抑制其珠芽形成(Wang et al.，2004)。龙舌兰AtqKNOX基因在珠芽的发育过程中有不同的表达模式，AtqKNOX2在珠芽形成的早期和后期阶段均高表达，而AtqKONX1只在后期阶段表达(Abraham-Juárez et al.，2010)。LlAGO1基因在卷丹形成珠芽的叶腋中特异性表达(杨盼盼等，2018)。细胞分裂素B类响应因子LlRR1、LlRR2、LlRR10、LlRR11和LlRR12在调控卷丹珠芽形成中具有功能冗余性(He et al.，2021)。而植物珠芽形成的分子机制尚不清楚，更多相关功能基因有待挖掘。
LBD(Lateral organ boundaries domain)蛋白是植物特有的一类转录因子家族，在定义植物器官边界及调控植物各种组织器官发育方面发挥重要作用。依据结构域的差异，LBD蛋白被分为两类，I类成员含有完整的LOB结构域，主要参与植物侧生器官的形成；II类成员只有类锌指结构，主要参与植物花青素的合成及氮代谢(Majer andHochholdinger，2011；Zhang et al.，2020)。目前已在拟南芥、水稻、玉米、棉花、菊花等物种上开展了研究，其中以拟南芥的研究最为深入。作为I类LBD家族成员，LBD18含有完整的LOB结构域，主要参与调控侧根形成，但是关于LBD18调控地上腋生器官形成的研究未见报道。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种百合珠芽形成调控基因LlLBD18的克隆及其应用。本发明基于转录组数据，克隆了卷丹珠芽形成调控基因LlLBD18的全长序列，运用qRT-PCR分析了LlLBD18在卷丹组织中的表达特异性及在珠芽形成过程中的表达特征，并进一步通过瞬时过表达和病毒诱导的基因沉默(VIGS)技术分析了其在卷丹珠芽形成中的功能，为深入研究百合珠芽形成的分子机制及繁殖应用提供参考。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
提供一种百合珠芽形成调控基因LlLBD18，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
提供一种百合珠芽形成调控基因LlLBD18的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
提供一种含有百合珠芽形成调控基因LlLBD18的载体pCAMBIA-3301-LlLBD18。
提供一种百合珠芽形成调控基因LlLBD18或含有百合珠芽形成调控基因LlLBD18的载体在调控百合珠芽形成中的应用。
本发明的有益效果为：
1.本发明从百合科百合属植物卷丹中分离鉴定出了一个与珠芽形成相关的LlLBD18基因，并对其结构特征及在珠芽形成中的功能做了初步分析，为深入阐明百合珠芽形成的分子机制提供了参考。
2.本发明通过克隆卷丹(Lilium lancifolium)LlLBD18(GenBank序列号ON455210)，并研究其对珠芽形成的调控作用，为全面解析珠芽发生发育机理，进而充分利用百合珠芽繁殖方式奠定了分子基础。
附图说明
图1为实施例1百合珠芽形成调控基因LlLBD18的PCR扩增结果示意图；
图2为实施例2百合珠芽形成调控基因LlLBD18与拟南芥AtLBD18基因序列比对图；
图3为实施例2百合珠芽形成调控基因LlLBD18与其他14个物种LBD18转录因子的系统进化树示意图；
图4为实施例3百合珠芽形成调控基因LlLBD18的亚细胞定位分析示意图；
图5为实施例4百合珠芽形成调控基因LlLBD18在卷丹珠芽形成过程中的时空表达分析示意图；
图6为实施例4百合珠芽形成调控基因LlLBD18的功能分析示意图；其中，A为瞬时过表达LlLBD18后的叶腋表型，其中CK为pCAMBIA-3301空载处理，OE为pCAMBIA-3301-LlLBD18处理；B为瞬时过表达后的珠芽诱导率，C为瞬时过表达后的LlLBD18基因相对表达量；D为VIGS沉默LlLBD18后的叶腋表型，其中TRV为空载处理，TRV::LlLBD18为瞬时沉默处理；E为VIGS沉默后的珠芽诱导率，F为VIGS沉默后的基因相对表达量；图中刻度尺等于1mm，小写a、b表示在P<0.05水平差异显著。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
植物材料：
以中国农业科学院蔬菜花卉研究所百合课题组资源圃的卷丹为供试材料，秋季挑选均匀一致的卷丹种球进行包埋冷藏处理，待其抽出长度为15-20cm的茎后，按照百合珠芽离体诱导的方法切取卷丹茎段，进行珠芽离体诱导。在离体诱导卷丹珠芽形成期间，取0d、2d、4d、6d、8d、10d和12d的卷丹叶腋，用于珠芽形成过程中LlLBD18的表达分析，每阶段取5个叶腋，设置3个重复；取卷丹根、茎、叶、鳞片、成熟珠芽和初生珠芽，用于组织特异性分析，3株组织为1个重复，每种样品取3个生物学重复。以培养4-5周的本氏烟草(Nicotianabenthamiana)为亚细胞定位材料。
实施例1
LlLBD18基因的cDNA全长克隆：
以卷丹叶腋为材料，使用RNAprep Pure Plant Plus kit(天根)试剂盒提取总RNA，并利用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix(全式金)试剂盒进行反转录。基于转录组的序列信息，利用SnapGene设计全长扩增引物(表1)。以卷丹叶腋cDNA为模板，按照KAPA HiFi HotStart Ready Mix(Kapa)说明书进行PCR扩增。反应体系为：cDNA 2μL，引物各1.5μL，KAPA HiFi HotStart Ready Mix 25μL，ddH2O 20μL。反应程序：95℃预变性3min；98℃变性20s，58℃退火15s，72℃延伸15s，35个循环；72℃延伸1min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后回收目的片段，连接克隆载体并转化Trans1-T1大肠杆菌感受态，挑取单克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。
结果表明，经PCR扩增获得一条长度约为700bp的特异性条带(图1)。测序分析表明该基因包含一个长度为684bp的完整开放阅读框，编码227个氨基酸，由ATG起始、TGA终止。该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其所编译表达的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
实施例2
LlLBD18基因的生物信息分析：
通过在线分析软件ProtParam分析LlLBD18蛋白的理化性质，使用NetPhos-3.1网站(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetPhos-3.1)预测LlLBD18蛋白的磷酸化位点，使用在线分析软件NetNGlyc 1.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php？NetNGlyc-1.0)预测糖基化位点，使用CD-search分析LlLBD18的结构域。在NCBI数据库中进行拟南芥AtLBD18蛋白的搜索，并通过Clustal-Omega进行多序列比对；使用MEGA 7.0软件，通过邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建进化树，分析LlLBD18和其他物种LBD18蛋白之间的亲缘关系，检验参数为1000。
ProtParam预测LlLBD18编码的蛋白质分子量为23.713KD，等电点为7.63，不稳定系数为71.70；NetPhos分析发现LlLBD18蛋白含有21个磷酸化位点，包括14个丝氨酸(Ser)，4个苏氨酸(Thr)和3个络氨酸(Tyr)；NetNGlyc预测该蛋白含有1个糖基化位点，位于第66个氨基酸残基处。
结构域分析发现，LlLBD18编码蛋白的25-124个氨基酸组成一个典型的LOB结构域。氨基酸序列比对(图2)发现，LlLBD18与拟南芥AtLBD18蛋白结构类似，都含有一个类锌指结构(CX2CX6CX3C)、一个GAS区和一个完整的类亮氨酸拉链基序(LX6LX3LX6L)，属于I类LBD蛋白。通过构建卷丹和其他植物LBD18蛋白的系统进化树(图3)，发现单子叶植物和双子叶植物的LBD18蛋白明显属于两大不同的分支，在单子叶植物分支中，卷丹与姜(Zingiberofficinale)的LBD18蛋白(XP_042466579.1)聚在一起，亲缘关系最近。综上，该基因命名为LlLBD18，GenBank序列号为ON455210。
实施例3
LlLBD18基因的亚细胞定位分析：
以含有GFP报告基因的植物表达载体pCAMBIA-2300为基础，设计带有酶切位点SmaI、XbaI的载体引物(表1)扩增LlLBD18的编码序列，构建植物表达载体pCAMBIA-2300-LlLBD18。将pCAMBIA-2300-LlLBD18重组质粒和pCAMBIA-2300空载分别转入农杆菌EHA105。参照农杆菌介导法将重悬菌液注射到本氏烟草背面，培养2-3d后进行激光共聚焦显微镜观察。
结果显示(图4)，pCAMBIA-2300空载对照在整个细胞中均能观察到绿色荧光，而pCAMBIA-2300-GFP-LlLBD18融合表达载体在细胞质和细胞核上能观察到绿色荧光。表明LlLBD18蛋白定位于细胞质和细胞核，定位于细胞核显示其能够调控细胞核中靶基因的转录过程，定位于细胞质推测与蛋白质翻译后修饰相关。结合LlLBD18的生物信息学分析，该蛋白存在糖基化位点和大量磷酸化位点，而磷酸化与糖基化是蛋白重要的翻译后修饰，可以影响许多生物学活性，包括亚细胞定位，由此推测LlLBD18在细胞质中的定位可能与蛋白质翻译后修饰相关。
实施例4
LlLBD18基因的表达分析和功能分析：
1、荧光定量PCR(qRT-PCR)
各样品分别以1μg总RNA为模板，参照II 1st Strand cDNA SynthesisSuperMix for qPCR(gDNA)试剂盒(翊圣)说明书合成第一链cDNA。实时荧光定量试剂盒为qPCR/>Green Master Mix(No Rox)(翊圣)，LlLBD18荧光定量引物序列见表1，内参基因为LilyActin(F：5′-GCATCACACCTTCTACAACG-3′，R：5′-GAAGAGCATAACCCTCATAGA-3′)。反应体系20μL，其中/>qPCR/>Green Master Mix10μL，上游引物和下游引物(10μM)各0.4μL，cDNA 2μL，ddH2O 7.2μL。qRT-PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火20s，72℃延伸20s，40次循环。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量(Livak and Schmittgen，2001)。每种样品设置3个生物重复。
2、LlLBD18表达载体的构建及瞬时转化卷丹
以pCAMBIA-3301表达载体为基础，设计带有酶切位点XbaI、HindIII的载体引物(表1)扩增LlLBD18的CDS，构建重组载体pCAMBIA-3301-LlLBD18。将pCAMBIA-3301-LlLBD18质粒和pCAMBIA-3301空载质粒分别转入EHA105农杆菌细胞，PCR鉴定获得阳性农杆菌。采用真空渗入法进行卷丹茎段的瞬时转化，0.05MPa抽真空5min，缓慢放气后重复一次。每组处理30个茎段，并设置3个生物学重复。培养箱25℃恒温培养12d后，进行珠芽诱导率统计和荧光定量分析。
用qRT-PCR检测LlLBD18在卷丹不同组织中的表达，结果显示LlLBD18在初生珠芽中表达量最高，表明该基因的表达具有组织特异性，与珠芽发生高度相关。其次是根中，在成熟珠芽中的表达量较低，在叶片中的表达量最低(图5-A)。在卷丹珠芽形成过程中，LlLBD18在珠芽原基启动准备阶段(0-4d)显著上升，并在叶柄近轴侧出现较多散生颗粒状突起时(第4d)表达量最高，之后显著下降，在珠芽原基形成及分化成珠芽过程中表达量逐渐升高(图5-B)。
表达分析还发现，卷丹珠芽形成过程中，LlLBD18在珠芽原基形成前期，即叶柄基部近轴侧出现较多散生突起时，表达量最高。通过组织学分析发现，离体诱导卷丹珠芽形成的第4d会形成染色深而浓密的细胞团，此时处于分裂旺盛的状态，据此推测LlLBD18可能与细胞分裂有一定关系。
卷丹中瞬时过表达LlLBD18，于培养12d取材，统计珠芽诱导率并分析LlLBD18的表达。结果显示，空载处理组绝大多数叶腋仍处于突起状态(图6-A-CK)，珠芽诱导率为47.04％，而过表达组珠芽诱导率为73.53％，显著高于对照组。qRT-PCR结果表明，过表达处理组的LlLBD18表达量显著上升，约为空载处理组的3.6倍。
3、VIGS载体的构建及瞬时转化卷丹
避开LlLBD18的LOB结构域，选取长度约为300bp的特异性片段作为VIGS沉默片段；设计带有酶切位点EcoRI、XbaI的载体引物(表1)，进行目的片段扩增，构建pTRV2-LlLBD18重组质粒。将含有pTRV2空载质粒、pTRV2-LlLBD18重组质粒的EHA105菌液分别与含有pTRV1的EHA105菌液等比例混合，黑暗中活化3h后采用真空渗入法转化卷丹茎段。培养12d后进行珠芽诱导率统计与荧光定量分析。
VIGS诱导LlLBD18沉默后，于培养12d取材，统计珠芽诱导率并分析该基因的相对表达量。结果表明，空载处理组的珠芽诱导率为37.78％，而沉默LlLBD18后，珠芽诱导率显著降低，统计结果为18.89％。qRT-PCR结果表明(图6-F)，VIGS沉默后的LlLBD18表达量显著下降，约为空载处理组的0.45倍。
表1 本申请实施例中的引物序列
注：小写字母为载体序列。
本研究发现，卷丹LlLBD18含有一个典型的LOB结构域，其编码蛋白属于I类LBD蛋白，与单子叶植物姜的LBD18蛋白亲缘关系最近。在卷丹中过表达和瞬时沉默LlLBD18证实了其具有正向调控珠芽形成的功能，是一个优质的调节腋生器官发育的基因，可以为百合珠芽繁殖的分子育种工作提供参考。
目前，关于百合珠芽形成的研究主要集中在生理生化层面，分子机理方面的研究较少。本申请从百合中分离鉴定出一个与珠芽形成相关的LBD家族成员，并对其结构特征及在珠芽形成中的功能做了初步分析，为深入阐明百合珠芽形成的分子机制提供参考。
现有技术对LBD18转录因子的研究多集中在对侧根的调控作用，本申请首次对LBD18调控地上腋生器官的形成进行了研究，不仅丰富了LBD18转录因子的生物学功能，也为提高百合繁殖效率奠定了理论基础。
于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (4)

1.一种百合珠芽形成调控基因LlLBD18，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的百合珠芽形成调控基因LlLBD18的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
3.含有权利要求1所述的百合珠芽形成调控基因LlLBD18的载体，所述载体为pCAMBIA-3301-LlLBD18。
4.权利要求1所述的百合珠芽形成调控基因LlLBD18或权利要求3所述的载体在调控百合珠芽形成中的应用。
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