CN117024578A - 一种用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体及应用，以提高HBV检测的精确性。本发明提供的IgG抗体，包括重链可变区与轻链可变区，重链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的碱基序列，轻链可变区包含如SEQ ID NO.2所示的碱基序列。本发明的IgG抗体可用于细胞培养物和临床血清中HBcAg的分子检测，特异性强，灵敏度高，能够提高HBV诊断和监测的精确性，同时还可以用于乙肝疾病的其他治疗方法。

Description

一种用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体及应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体及应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是一种双链DNA病毒,属于嗜肝DNA病毒科。乙型肝炎病毒是引起病毒性肝炎的最常见病原，可以通过血液、母婴、密切接触和性接触传染，人体感染乙肝病毒后，易引起慢性乙型肝炎，进而导致肝硬化或肝癌。据统计，世界上有2.92亿人是乙肝病毒携带者，中国大约有8600万人乙肝病毒携带者，因此，HBV感染仍然是世界范围内严重的公共卫生问题，如何预防和治疗慢性乙型肝炎仍是目前面临的严峻挑战。

现目前，利用免疫学反应原理来检测样本中是否存在某种物质的这一技术，被广泛应用于各个领域。由于免疫分子之间具有特异性结合的性能，例如抗体与抗原、半抗原/抗体等，因此可以利用该原理来检测各种生物样本中的被分析物质，以检测疾病和人类健康状况等目的。乙型肝炎病毒c抗原(hepatitis B core antigen,HBcAg)是乙型肝炎病毒的核心抗原，其存在几乎只与HBV感染相关，因此可以作为HBV感染的特异性标志物。同时，HBcAg可以在HBV感染的早期阶段就出现，甚至可以在病毒复制前出现，因此可以帮助早期诊断HBV感染。

然而，HBcAg存在许多突变型，其中一些突变型可能无法被传统的HBcAg检测方法所识别。这些突变型可能导致HBcAg的结构或表位发生改变，进而影响抗原-抗体的结合，使得传统的HBcAg检测方法无法准确检测到这些突变型HBcAg，从而影响检测结果的准确性。此外，HBcAg在血液中的浓度较低，因此对于低病毒载量的患者，检测的灵敏度较低，对HBV感染的诊断和监测的准确度也较低。

同时，绝大部分情况下，HBV核心颗粒外面包裹着一层表面抗原与磷脂双分子层形成的外膜，并不直接暴露，一部分现有技术认为在细胞培养的HBV感染模型和血清中存在着裸露的HBV核心颗粒。然而，临床患者的血清中是否存在裸露的HBV核心颗粒，还有待临床检测方法的进一步验证。同时，临床血清中的HBV核心颗粒是否能有效地被特异性的免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)抗体识别并捕获，也仍需更进一步的研究。

综上所述，目前仍有很多突变型的HBcAg未能被识别，对于HBV感染的诊断和监测的准确度也较低，当前市面上缺少有效、准确地用于检测HBV感染的抗体，因此急需进一步开发有效捕获HBV核心颗粒的抗体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体，以提高HBV检测的精确性。

本发明提供的基础方案为：一种用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体，包括重链可变区与轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO.2所示的碱基序列。

进一步，所述重链可变区与轻链可变区通过如SEQ ID NO.3所示的碱基链进行连接。

进一步，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

进一步，所述重链可变区与轻链可变区通过如SEQ ID NO.7所示的氨基酸链进行连接。

进一步，所述重链可变区包含与SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列≥80％同源的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列≥80％同源的氨基酸序列。

本发明提供的第二个技术方案为：一种包含编码本发明任一所述的IgG抗体的核苷酸序列的核酸分子。

本发明提供的第三个技术方案为：一种含有上述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞系。

本发明提供的第四个技术方案为：一种含有本发明任一所述的IgG抗体用于检测与诊断乙肝病毒的产品。

本发明提供的第五个技术方案为：一种含有上述核酸分子的生物材料。

本发明提供的第六个技术方案为：本发明所述的任一一种含用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体，涉及在制备用于检测与诊断乙肝病毒的产品中的应用；涉及在制备用于治疗与预防乙肝病毒所引起的疾病的药物中的应用。

本发明的有益效果：

当前市面上缺少有效、准确地用于检测HBV感染的抗体，本发明筛选出一种能满足科研及临床检测需求的IgG抗体，能够进一步填补市场上检测HBV表面抗原的抗体的空缺。本发明的IgG抗体可用于细胞培养物和临床血清中HBcAg的分子检测，特异性强，灵敏度高，能够提高HBV诊断和监测的精确性，同时还可以用于乙肝疾病的其他治疗方法。

附图说明

图1为本发明ELISA阳性杂交瘤细胞株的鉴定结果图。

图2为本发明蛋白电泳检测抗体纯度图。

图3为本发明HBcAg核心颗粒的电镜图。

图4为本发明抗体-核心颗粒结合的亲和力检测结果图，其中(a)为分子相互作用动态拟合分析曲线，(b)为分子相互作用为稳态拟合分析曲线。

图5为本发明单链抗体-核心颗粒结合的亲和力检测结果图，其中(a)为分子相互作用动态拟合分析曲线，(b)为分子相互作用为稳态拟合分析曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细的说明：

实施例一：用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体

用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体制备步骤如下：

1.重组HBcAg蛋白的制备

将分泌HBcAg蛋白的重组枯草芽孢杆菌于37℃摇床振荡培养48h，收集菌液，10000×g离心20min，弃沉淀，保留上清。上清用10倍体积的结合缓冲液(binding buffer：5mmol/L Imidazole，0.5mol/Lurea,1×CB solution,pH9.6)稀释后，充分混匀后置冰上备用。以下操作在4℃条件下进行，填装Ni-NTA Agarose的亲和层析柱空柱管用10倍填料体积的binding buffer(冲洗并平衡，将上清稀释液加入填料柱管，速度为0.5mL/min；用10倍填料体积的洗涤缓冲液(washing buffer：20mmol/L Imidazole，0.5mol/Lurea,1×CBsolution,pH9.6)以1mL/min的速度洗涤3次；最后用洗脱液(elution buffer：300mmol/LImidazole，0.5mol/L urea,1×CB solution,pH9.6)洗脱柱上结合蛋白，收集洗脱液。洗脱液装透析袋后，放置于100倍体积透析液(0.5mol/L urea,1×CB solution,pH9.6)中，4℃条件下透析4～6小时，然后更换透析液继续透析4～6小时，重复2次。最后将透析后的液体用10KD的超滤管进行离心浓缩，得到重组HBcAg蛋白,浓度为1mg/ml左右。

2.抗原免疫BALB/c小鼠

将0.2μg/ml的HBcAg抗原与免疫佐剂1：1混合后，按照50μg/只的注射量免疫SPF级BALB/c雌性小鼠，14天后同样剂量免疫第二次，7天后断尾取血进行血清效价检测，效价最强的小鼠加强免疫第三次，3天后手术取脾脏，进行脾细胞进行细胞融合制备单克隆抗体杂交瘤细胞株。

3.单克隆细胞株的制备

(1)饲养细胞制备

将健康BALB/c小鼠进行牺牲，浸泡于75％酒精5分钟，随即放入超净工作台内，腹部朝上放于平皿内或固定于解剖板上。用眼科镊子夹起小鼠腹部皮肤，用剪刀剪一小口，注意切勿剪破腹膜，以免腹腔液外流。然后用剪刀向上下两侧做钝性分离，充分暴露腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜消毒。用注射器吸取5mlRPMI-1640基础培养液，注入小鼠腹腔，注射器停留不动，晃动小鼠或反复抽吸几次。用原注射器抽回腹腔内液体，注入离心管。如此反复操作3～4次。1000rpm离心10min，弃上清。用20～50ml完全培养液重悬细胞，100μl/孔滴加到培养板，置培养箱备用。观察饲养细胞的生长状态，一般生长良好的饲养细胞和巨嗜细胞呈梭形或多角形、细胞透亮、折光性强。

(2)细胞融合

取加强免疫小鼠一只，眼眶采血后将其牺牲，在75％酒精中消毒后取脾脏，去除结缔组织，制备脾细胞悬液，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500～2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，白细胞稀释液稀释20倍，计数，取1×108个细胞待用。

取3瓶生长状态良好的(活细胞数>95％)小鼠骨髓瘤细胞S/P20，将之完全吹下，转移到50ml离心管中，加RPMI1640至30ml，1500～2000rpm离心5分钟，弃上清，加RPMI1640至30ml，RPMI1640稀释10倍，计数，取2×107个细胞待用。

按照脾细胞/骨髓瘤为5/1比例混合，1500～2000rpm离心5分钟。将离心上清倒干，把沉淀细胞块弹成糊状，置37℃水浴，在1分钟内加入1ml融合剂，并搅拌细胞，37℃水浴放置45秒后，依次在1分钟内加入1ml1640并搅拌细胞；2分钟内加入5ml1640并搅拌细胞；2分钟内加入10ml1640并搅拌细胞；2分钟内加入10ml1640并搅拌细胞，终止融合剂的融合作用后，500rpm离心7分钟，弃上清保留细胞沉淀。

轻轻将细胞弹匀，缓缓加入HAT培养液至所需体积，将细胞重悬，轻轻地将之混匀，加到预先准备好的饲养细胞板中。10ml吸管滴加1滴(配8ml/板)，排枪滴加80～100微升(配10ml/板)，37℃，CO₂培养箱培养、观察。细胞融合后第一天开始，对细胞进行仔细观察，记录好细胞的生长状态、每孔杂交细胞瘤个数、块数、培养液有无污染、饲养细胞的状况。培养3～5天HAT培养液换液一次，10天后换HT培养液培养至20天，之后换1640完全培养液。

(3)阳性细胞株鉴定

当96孔细胞培养板内有肉眼可观察到的细胞团后，进行整板ELISA检测，挑选阳性较高的孔进行亚克隆，一个阳性孔细胞对应一块96孔板。当孔内有肉眼可观察到的细胞团后，再次进行亚克隆挑拣，至少进行三次亚克隆，最后挑选出阳性高、细胞状态好单克隆细胞团定株。具体检测如下：

用包被液稀释HBcAg抗原至1μg/ml后取100μl加入聚苯乙烯酶联检测板各孔中，4℃过夜后，洗液洗涤3次。每孔加200μl或加满封闭液，4℃过夜或37℃两小时后，洗涤3次，拍干，置4℃冰箱保存备用。

无菌条件下取96孔板单孔细胞上清，50～100μl/孔加样到包被好的酶标板中，同时，每板分别选取无细胞生长的两孔为阴性对照，另选取无细胞生长的两孔加入阳性血清作为阳性对照；检测血清或腹水效价时，对血清或腹水做倍比稀释，100μl/孔，以正常小鼠血清为阴性对照，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。根据酶标二抗的效价选择稀释倍数，100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤3次，拍干。加入A、B液各80μl/孔，37℃显色15min。加入终止液80μl/孔。以450nm单波长测定各孔OD值，以与阴性对照孔OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳性或确定效价的临界点。

4.单克隆抗体的制备

老鼠致敏：液体石蜡致敏6～8周龄的BALB/c小鼠，注射体积为500ul/只。培养10天。收集阳性杂交瘤细胞并用1640或PBS洗细胞两遍，取100到150万细胞注射于老鼠腹腔，一周后可见老鼠状态不活跃并且老鼠的腹腔肿大。注射细胞一周后用无菌注射器于老鼠腹腔采集腹水，每隔一到两天采集一次，直到老鼠自然死亡。取腹水在4℃,12000g条件下离心15min。使用Protein A+G Agarose装填纯化柱，用10-20倍柱体积的PBS重力洗涤并平衡纯化柱。把腹水离心上清用5倍体积的PBS稀释后上样到纯化柱。过柱后，用10-20倍柱体积的PBS洗涤。洗涤完后，按每毫升洗脱液加入100μl中和液的比例，在收集管中预先加入适量中和液(1M Tris-HCl,pH8.8)，然后用10ml 50mM glycine，pH1.9～2.7作为洗脱液，洗脱结合的抗体。分管收集洗脱下的抗体，根据蛋白浓度或后续的检测效果确定洗脱峰在哪几个收集管中。

5.测序

提取阳性单克隆抗体交瘤细胞株的总RNA，进一步纯化为mRNA，反转录后获得cDNA；通过PCR扩增获得重链和轻链可变区DNA片段；克隆至pMD18-T载体，测序；使用IMGT/V-QUEST进行测序结果比对，之后得到全部序列。

6.单链抗体((single-chain fragment variable，scFv)的制备

通过重叠延伸PCR(SOE-PCR)将抗体重链可变区DNA片段与轻链可变区DNA片段通过一段(GS4)3的Linker链接，再将该链接DNA插入pET28a(+)原核表达载体，转化大肠杆菌，通过诱导表达产生重组scFv抗体蛋白；或插入pcDNA3.1(+)真核表达载体，转染293细胞或CHO细胞，培养2-10天后，通过纯化细胞培养上清获得重组scFv抗体蛋白。

经测序，筛选的用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体序列分别如表1、表2所示。

表1用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体的碱基序列

表2用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体的氨基酸序列

本申请的发明人还分别进行了以下实验。

实验1

通过重组HBcAg/His-tag标签蛋白对杂交瘤细胞株进行阳性鉴定。

ELISA法鉴定，将浓度为1μg/mL的重组HBcAg蛋白包被ELISA板1后2％BSA封闭，同时用1μg/ml的His-tag标签蛋白包被另一块ELISA板后2％BSA封闭。取单株杂交瘤细胞的培养基上清100μL作为样本进行ELISA检测，PBS作为空白对照(BLK),1640细胞培养基作为阴性对照(NEG),外购商品化的核心抗体(北京博生福公司)作为阳性对照，HRP标记的羊抗鼠IgG作为二抗。对板1，S/N≥2，视为阳性结果，对板2，S/＜2视为阳性结果，板1和板2结果均为阳性的细胞株，视为阳性细胞株。

本申请共检测42株杂交瘤细胞的上清分泌抗体，如图1所示，在42株单克隆细胞株中，共有18株细胞上清分泌物显示阳性，9株(06、12、13、15、17、19、29、39、42)显示为强阳性(星号标注)。其中06号细胞株信号最强。

实验2

通过ELISA法，使用抗体IgG亚型检测试剂盒对筛选出的9株强阳性细胞株进行IgG亚型鉴定，其鉴定结果如表3所示。

表3阳性细胞株分泌抗体的亚型鉴定

如表3所示，9株抗体的轻链均为κ型，重链分型结果均为IgG(ε型)，其中06、12和19等3株为IgG2b亚型，其余6株为IgG2a亚型。

实验3

12％SDS-PAGE凝胶电泳对纯化后的单克隆抗体进行纯度检测。

按0.5μg/孔的浓度上样，电泳后考马斯亮蓝染色，30％乙醇+5％乙酸溶液脱色。其结果如图2所示，泳道1：蛋白分子量Marker，泳道2-10抗体编号顺序：06、12、13、15、17、19、29、39、42，重链分子量为55KD左右，轻链分子量为25KD左右。抗体纯度均大于90％。

实验4

通过超速离心制备乙型肝炎病毒核心颗粒。

重组表达的HBcAg蛋白在4℃条件下保存48～96小时后，可以自组装核心颗粒。通过超速离心机进行超速离心(60，000g，8小时)可分离纯化获得HBcAg核心颗粒，通过电镜检测其粒径大小和分散均匀度。

如图3所示，电镜检测显示，核心颗粒粒径大小为40～60nm，颗粒大小均匀。可作为与抗体相互作用的检测样品进行抗体-核心颗粒复合物的结合实验。

实验5

通过分子相互作用力检测仪(Biacore X100)检测单克隆抗体(mAb06)、单链抗体(scFv06)与乙型肝炎病毒核心颗粒的相互作用力。

单克隆抗体(mAb06)与乙型肝炎病毒核心颗粒相互作用力检测结果分别如图4(a)和4(b)所示，mAb06抗体与HBcAg核心颗粒的亲和力检测值KD＝3.28nm，亲和力(KD解离常数)达到了个位数的纳摩尔级，证明mAb06号抗体与核心颗粒具有极高的结合能力，且mAb06抗体与核心颗粒存在剂量依赖性的强相互作用。

单链抗体(scFv06)与乙型肝炎病毒核心颗粒相互作用力检测结果分别如图5(a)和5(b)所示，scFv06单链抗体与HBcAg核心颗粒的亲和力检测值KD＝5.23nm，亲和力(KD解离常数)达到了个位数的纳摩尔级，证明scFv06与核心颗粒具有极高的结合能力，且scFv06抗体与核心颗粒存在剂量依赖性的强相互作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体，包括重链可变区与轻链可变区，其特征在于：所述重链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的碱基序列，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO.2所示的碱基序列。

2.如权利要求1所述的用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体，其特征在于：所述重链可变区与轻链可变区通过如SEQ ID NO.3所示的碱基链进行连接。

3.如权利要求1所述的用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体，其特征在于：所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

4.如权利要求3所述的用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体，其特征在于：所述重链可变区与轻链可变区通过如SEQ ID NO.7所示的氨基酸链进行连接。

5.如权利要求3所述的用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体，其特征在于：所述重链可变区包含与SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列≥80％同源的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列≥80％同源的氨基酸序列。

6.一种包含编码权利要求1-5任一所述的IgG抗体的核苷酸序列的核酸分子。

7.一种含有权利要求6所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞系。

8.一种含有权利要求1-5任一所述的IgG抗体用于检测与诊断乙肝病毒的产品。

9.一种含有权利要求6所述的核酸分子的生物材料。

10.权利要求1-5任一所述的一种用于捕获HBV核心颗粒的IgG抗体，涉及在制备用于检测与诊断乙肝病毒的产品中的应用；涉及在制备用于治疗与预防乙肝病毒所引起的疾病的药物中的应用。