CN117018266A - 一种双面组织黏合剂的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种双面组织黏合剂的制备方法及应用，该方法基于多巴胺化学和水凝胶涂层技术，利用异种脱细胞真皮基质敷料作为基底，聚多巴胺作为涂层，首先得到聚多巴胺纳米颗粒沉积的异种脱细胞真皮基质敷料，通过疏水改性制备各向异性的异种脱细胞真皮基质敷料，再将水凝胶涂层组装到改性后异种脱细胞真皮基质敷料的亲水侧而获得具有不对称黏附性能的双层组织黏合剂。本发明所制备的双层组织黏合剂的方法具有可重复利用、成本低廉、操作简易及便于大规模生产等优点，制备的双面组织黏合剂具有抗爆破性、不对称润湿性、不对称黏附性和抗氧化性，并可促进组织修复且抗术后粘连，能够在制备促进组织修复的敷料中应用。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种双面组织黏合剂的制备方法及应用，该双面组织黏合剂可应用在促进组织修复等技术领域中。
背景技术
水凝胶是一种高含水量的三维聚合网络，可以促进细胞的迁移和增殖。近年来，水凝胶组织黏合剂在生物医学领域的应用十分广泛。但水凝胶也因其高含水量常缺乏足够的力学强度，在用于具有较大机械应力的组织表面时，例如胃肠道的损伤修复，容易遭受到结构的破坏，从而失去保护和修复损伤组织的作用。另外，传统水凝胶组织粘合剂的黏附性不具有选择性，这种无差别的黏附在体内应用时会导致不可避免的粘连邻近的体内其它组织。
鉴于多巴胺化学技术和水凝胶涂层的处理，我们提出了一种具有高力学强度、高爆破压强度和抗组织粘连的双面组织黏合剂，并将其用于促进胃穿孔的愈合。脱细胞真皮基质敷料是临床上广泛应用的生物敷料，具有良好的生物相容性，类似皮肤的结构和强度，是良好的皮肤替代物。但其缺乏保护功能，这也限制了它在许多临床治疗中的开发与应用。多巴胺是一种“黏性”生物分子，包含贻贝的典型官能团黏附蛋白，它可以在各种表面上自聚合成纳米涂层。并且该涂层可以提供反应平台接受进一步化学反应，例如疏水改性。另外，水凝胶涂层技术是将水凝胶与各类基底有机结合的一种方法，通过结合水凝胶涂层可以使基底获得水凝胶的各类性能，是生成双面组织黏合剂的优良方案。
因此，在本发明中，我们通过联合多巴胺化学和水凝胶涂层技术制造了双面组织黏合剂，并研究了它们在组织愈合中的实际效果。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题，提供一种双面组织黏合剂、制备方法及应用，解决了传统组织黏合剂力学强度不足以及容易引发组织粘连的缺点。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
(一)本发明提供一种双面组织黏合剂的制备方法，包括以下步骤：
S1、将脱细胞真皮基质敷料在无水乙醇中浸润处理，取出后再置入盐酸多巴胺溶液中搅拌，取出后用去离子水反复冲洗去除表面残留的聚多巴胺，干燥；
S2、将S1得到的脱细胞真皮基质敷料一侧进行密封保护以隔绝外界对其的反应，对脱细胞真皮基质敷料的另一侧表面进行疏水改性；
S3、在S2制备的脱细胞真皮基质敷料被保护的一侧表面涂覆预凝胶溶液，然后置于真空密封的环境下，固化后得到双面组织黏合剂。
进一步的，所述S1中，盐酸多巴胺溶液的配置方法为：将盐酸多巴胺溶解于Tris-HCL缓冲液中，调节pH，得到盐酸多巴胺溶液。
进一步的，所述Tris-HCL缓冲液浓度为50mmol/L，调节pH至8.5；所制备的盐酸多巴胺溶液中，盐酸多巴胺的浓度为2mg/ml。
进一步的，所述S1中，脱细胞真皮基质敷料置入盐酸多巴胺溶液后，在30℃水浴环境下剧烈搅拌，反应时间为8小时。
进一步的，所述S1中，干燥方法为25℃室温下通风自然干燥。
进一步的，所述S2中，疏水改性方法为：将一侧密封好后的脱细胞真皮基质敷料和三乙氧基-1H,1H,2H,2H-全氟癸基硅烷放在同一密封容器中，置于60℃的烘箱中进行蒸镀，蒸镀时间为4小时，蒸镀完成后常温冷却，用去离子水反复冲洗表面去除未反应的残留物质。
进一步的，所述S3中，预凝胶溶液包括丙烯酸30w/v％、季铵盐壳聚糖5w/v％、过硫酸铵3w/v％和四甲基乙二胺0.3w/v％。
进一步的，所述S3中，通过注射器将预凝胶溶液注射到脱细胞真皮基质敷料表面；预凝胶溶液固化时间为2小时。
(二)本发明还提供了一种双面组织黏合剂，由以上所述的制备方法制备得到。
(三)本发明还提供了以上所述的制备方法制备的双面组织黏合剂在制备创面修复材料中的应用。
本发明的有益效果是：
(1)本发明以多巴胺化学改性异种脱细胞真皮基质并以其为基底利用水凝胶涂层技制备双面组织黏合剂，方法简单，操作方便，价格低廉，可重复利用，不需要很高的技术要求，且易对双面组织黏合剂的结构和性能进行控制；
(2)本发明设计了双面组织黏合剂，实现了不对称的润湿性和抗细菌粘污性，高力学强度和高爆破压强度，实用性强；
(3)本发明制备的双面组织黏合剂生物相容性好，具有良好的抗氧化功能，可用于促进损伤组织修复。
附图说明
图1为异种脱细胞真皮基质的聚多巴胺涂层化前后对比图，其中，图a从左向右依次为聚多巴胺涂层化前异种脱细胞真皮基质的直观图和电镜图；图b从左向右依次为聚多巴胺涂层化后异种脱细胞真皮基质的直观图和电镜图；
图2为异种脱细胞真皮基质上聚多巴胺涂层的稳定性示意图，其中，图a从左向右依次表示将聚多巴胺涂层化后异种脱细胞真皮基质被置于水下，在水下被扭成麻花样，然后再展开；图b从左向右依次表示将聚多巴胺涂层化后异种脱细胞真皮基质被置于水下，用手术刀在其表面进行刮取以及反复刮取3遍；
图3为改性后异种脱细胞真皮基质的不对称润湿性试验结果图，其中，从上往下为改性后异种脱细胞真皮基质的双面直观图及其相应的接触角检测结果；
图4为改性后异种脱细胞真皮基质的抗细菌粘污性试验结果图，其中，图a从左向右依次表示将改性后异种脱细胞真皮基质分别与大肠杆菌共培养24小时、48小时和72小时后其亲水面细菌生长繁殖的荧光染色结果；图b从左向右依次表示将改性后异种脱细胞真皮基质分别与大肠杆菌共培养24小时、48小时和72小时后其疏水面细菌生长繁殖的荧光染色结果。
图5为双面组织黏合剂的结构图，其中，从左向右依次为双面组织黏合剂的电镜图和结构放大图；
图6为双面组织黏合剂的力学强度示意图，其中，图a为双面组织黏合剂与水凝胶组织黏合剂的力学强度对比图；图b为双面组织黏合剂与水凝胶组织黏合剂的爆破压强度对比图；
图7为双面组织黏合剂的抗氧化性试验图，其中，从左向右依次表示过氧化氢组、过氧化氢+双面组织黏合剂组和正常对照组处理后细胞生存的荧光染色结果；
图8为双面组织黏合剂的抗术后粘连试验图，其中，从左向右依次表示缝线缝合、氰基丙烯酸酯黏合剂、水凝胶组织黏合剂和双面组织黏合剂对胃穿孔大鼠的外科干预，从上至下依次表示实施外科干预手术当天和手术后14天的腹腔内粘连结果；
图9为双面组织黏合剂的促进组织修复效果图，其中，从左向右依次表示缝线缝合、氰基丙烯酸酯黏合剂、水凝胶组织黏合剂和双面组织黏合剂对胃穿孔大鼠实施外科干预后14天，动物被安乐死并取材进行HE染色的结果；
图10为本发明双面组织黏合剂应用示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例及附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：双面组织黏合剂的制备
本实施例提供一种双面组织黏合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)改性异种脱细胞真皮基质的制备：
首先将异种脱细胞真皮基质于无水乙醇中浸润处理。
将1mol/L的Tris-HCL缓冲液用去离子水稀释到50mmol/L，并通过滴加盐酸将缓冲液pH调整至8.5；然后将盐酸多巴胺粉末以2mg/ml的浓度溶解于Tris-HCL缓冲液中。
将无水乙醇中浸润处理后的异种脱细胞真皮基质置于上述盐酸多巴胺溶液中，在30℃水浴环境下剧烈搅拌，反应8小时后取出，用去离子水反复冲洗去除表面残留的聚多巴胺，最后放在25℃室温下通风自然干燥。
随后，将自然干燥后的沉积聚多巴胺纳米颗粒的异种脱细胞真皮基质敷料的一侧用胶带密封保护使其不与外界化学物质相反应。另外一侧不采取处理，让其自然暴露。此操作后，将5μL三乙氧基-1H,1H,2H,2H-全氟癸基硅烷均匀分散到2m二氯甲烷溶液中，并将该溶液和密封好的异种脱细胞真皮基质敷料放到一个密封的塑料盒中。然后将该塑料盒置于60℃的烘箱中进行蒸镀。4小时过后，将上述异种脱细胞真皮基质敷料取出，用去离子水洗净表面。
如图1所示，图1为异种脱细胞真皮基质的聚多巴胺涂层化前后对比图，图1a从左向右依次为聚多巴胺涂层化前异种脱细胞真皮基质的直观图和电镜图，图1b从左向右依次为聚多巴胺涂层化后异种脱细胞真皮基质的直观图和电镜图。由图1可以看出，获得的异种脱细胞真皮基质敷料表面为黑色，沉积了大量的聚多巴胺纳米颗粒。
图2为异种脱细胞真皮基质上聚多巴胺涂层的稳定性试验效果图，图2a从左向右依次为将聚多巴胺涂层化后异种脱细胞真皮基质被置于水下，在水下被扭成麻花样，然后再展开。此过程中水的颜色没有任何变化，证明聚多巴胺涂层没有脱落；另外，图2b从左向右依次为将聚多巴胺涂层化后异种脱细胞真皮基质被置于水下，用手术刀在其表面进行刮取，反复刮取3遍。此过程中水的颜色没有任何变化，且手术刀上也没有任何聚多巴胺纳米颗粒残留，证明聚多巴胺涂层有极强的稳定性。因此，由图2可知，本实施例所制备的聚多巴胺涂层具有很好的稳定性，不容易被外力破坏。
(2)水凝胶组织黏合剂的制备：
配制30％(w/v)丙烯酸溶液，将季铵盐壳聚糖粉末按5％(w/v)的浓度溶解于丙烯酸溶液中。在常温下剧烈搅拌3小时，形成澄清透明的混合溶液。然后将过硫酸铵粉末以3％(w/v)的浓度和四甲基乙二胺以0.3％(w/v)的浓度一齐加入上述混合溶液中。在常温下剧烈搅拌5分钟，形成澄清透明的混合溶液。
(3)双面组织黏合剂的制备：
用注射器抽取步骤(2)制备的水凝胶溶液，并将该溶液缓慢均匀地注射到步骤(1)中制备的改性异种脱细胞真皮基质敷料中被保护的一侧表面。然后将预凝胶溶液和步骤(1)中制备的改性异种脱细胞真皮基质敷料一起置于真空环境下。2小时后，水凝胶自然固化，并与步骤(1)中制备的改性异种脱细胞真皮基质敷料紧密结合，形成双面结构。
如图5所示，其中，从左向右依次为双面组织黏合剂的电镜图和结构放大图。可见获得的组织黏合剂具有不同的两面，且双面之间没有观察到任何缝隙，相互之间紧密链接形成一个整体。
本实施例获得的双面组织黏合剂兼具水凝胶和异种脱细胞真皮基质敷料的特点，结合了改性异种脱细胞真皮基质敷料的不对称润湿性和抗细菌粘污性，并且展现出皮肤样高力学强度和高抗爆破压强度，抗氧化性，抗组织粘连和促进组织修复效果。
实施例2：双面组织黏合剂的物理及生物学作用
(1)改性异种脱细胞真皮基质的不对称润湿性
将实施例1(1)中制备的改性异种脱细胞真皮基质置于水下，然后取出，观察改性异种脱细胞真皮基质双侧的润湿性。然后将改性异种脱细胞真皮基质置于接触角测量仪上，检测其双侧的接触角。
结果如图3所示，图3为改性后异种脱细胞真皮基质的不对称润湿性研究效果图，从上往下为改性后异种脱细胞真皮基质的双面直观图及其相应的接触角检测结果。可见改性后异种脱细胞真皮基质的两面具有截然相反的亲疏水性能，展现出不对称的润湿性。
(2)改性异种脱细胞真皮基质的抗细菌粘污性
根据McFarland标准，将复苏后大肠杆菌(ATCC 25922)用无菌PBS稀释到0.5麦氏浊度。然后用Luria-Bertani(LB)液体培养基进行培养。同时将实施例1(1)中制备的改性异种脱细胞真皮基质置于液体培养基中。在和细菌共培养后的24小时、48小时和72小时的时间点取出改性异种脱细胞真皮基质，用SYTO 9绿色荧光核酸染料对细菌进行染色。
结果如图4所示，图4为改性后异种脱细胞真皮基质的抗细菌粘污性研究效果图，图4a从左向右依次为将改性后异种脱细胞真皮基质分别与大肠杆菌共培养24小时、48小时和72小时后其亲水面细菌生长繁殖的荧光染色结果；图4b从左向右依次为将改性后异种脱细胞真皮基质分别与大肠杆菌共培养24小时、48小时和72小时后其疏水面细菌生长繁殖的荧光染色结果。可见改性后异种脱细胞真皮基质的疏水面具有抗细菌粘污的特性。
(3)双面组织黏合剂的力学强度
将实施例1(2)中制备的水凝胶组织黏合剂和实施例1(3)中制备的双面组织黏合剂于万能力学机(CMT2103)上进行拉伸断裂实验。
实验结果如图6a所示，图6a为双面组织黏合剂与水凝胶组织黏合剂的力学强度对比，与单纯的水凝胶组织黏合剂相比，双面组织黏合剂的力学强度明显提升，达到0.7兆帕斯卡，接近于皮肤组织的强度。
(4)双面组织黏合剂的爆破压强度
将实施例1(2)中制备的水凝胶组织黏合剂和实施例1(3)中制备的双面组织黏合剂黏附于离体的带有破裂口的猪胃表面。然后经一端(贲门)往猪胃里灌气，猪胃的另一端(幽门)连接压力检测仪。待猪胃的破裂口被爆破时压力检测仪显示的爆破压即为所检材料的爆破压强度。
实验结果如图6b所示，图6b为双面组织黏合剂与水凝胶组织黏合剂的爆破压强度对比，与单纯的水凝胶组织黏合剂相比，双面组织黏合剂的爆破压强度明显提升，达到24千帕斯卡。
(5)双面组织黏合剂的抗氧化性
将实施例1(3)中制备的双面组织黏合剂置于24孔板中，并在2mL DMEM培养基中浸泡24小时。此外，将密度为5×105个细胞/孔的L929成纤维细胞置于24孔板中，在1mL DMEM中培养24小时。将过氧化氢加入培养基中以制备0.1mmol/L浓度的过氧化氢溶液。用制备的0.1mmol/L浓度的过氧化氢溶液代替24孔板中的培养基。24小时后通过荧光显微镜测定细胞数量。实验结果如图7所示。
图7为双面组织黏合剂的抗氧化性效果图，从左向右依次为过氧化氢组、过氧化氢+双面组织黏合剂组和正常对照组处理后细胞生存的荧光染色结果。过氧化氢处理后细胞出现大量的死亡，而添加双面组织黏合剂进行处理后细胞的存活数量明显提升，与正常细胞培养的对照组接近。证实双面组织黏合剂具有良好的抗氧化性。
实施例3：双面组织黏合剂的抗术后粘连及促组织修复效果
(1)动物造模
经腹腔注射舒泰50麻醉(40mg/Kg)大鼠，然后用手术刀沿腹中线切开腹部皮肤和肌肉，打开腹腔。在大鼠胃大弯处用手术刀形成一个0.5厘米的全层切口。
(2)损伤干预
雄性SD大鼠20只，体重180～200g，随机分为4组。进行实施例3(1)中的造模。随后分别进行缝线缝合、氰基丙烯酸酯黏合剂、实施例1(2)制备的水凝胶组织黏合剂、实施例1(3)制备的双面组织黏合剂。然后进行间断缝合关闭腹腔，于14天进行观察并取标本进行HE染色。试验结果见图8和图9。
图8为双面组织黏合剂的抗术后粘连试验结果图，其中，从左向右依次为缝线缝合、氰基丙烯酸酯黏合剂、水凝胶组织黏合剂和双面组织黏合剂对胃穿孔大鼠的外科干预。从上向下依次为实施外科干预手术当天和手术后14天的腹腔内粘连结果。图9双面组织黏合剂的促进组织修复效果：从左向右依次为缝线缝合、氰基丙烯酸酯黏合剂、水凝胶组织黏合剂和双面组织黏合剂对胃穿孔大鼠实施外科干预后14天，动物被安乐死并取材进行HE染色的结果。双面组织黏合剂能够修复胃穿孔损伤，并且防止术后粘连。由图8和图9可以看出，本发明所制备的双面组织黏合剂能够修复胃穿孔损伤，并且能够防止术后粘连。
本发明所制备的双面组织黏合剂兼具水凝胶和异种脱细胞真皮基质敷料的特点，结合了改性异种脱细胞真皮基质敷料的不对称润湿性和抗细菌粘污性，并且展现出皮肤样高力学强度和高抗爆破压强度，具有良好的抗氧化性、抗组织粘连和促进组织修复效果。
本发明公开了一种双面水凝胶黏合剂的制备及应用，该方法基于多巴胺化学和水凝胶涂层技术，利用异种脱细胞真皮基质敷料作为基底，聚多巴胺作为涂层，首先得到聚多巴胺纳米颗粒沉积的异种脱细胞真皮基质敷料，将异种脱细胞真皮基质敷料表面的聚多巴胺纳米颗粒通过三乙氧基-1H,1H,2H,2H-全氟癸基硅烷进行选择性的疏水改性制备各向异性的异种脱细胞真皮基质敷料。再将水凝胶涂层组装到改性后异种脱细胞真皮基质敷料的亲水侧(另一侧为改性后异种脱细胞真皮基质敷料的疏水侧)而获得具有不对称黏附性能的双层组织黏合剂。本发明所制备的异种脱细胞真皮基质敷料经过多巴胺化学可以获得各向异性的润湿性，结合水凝胶涂层后获得的组织黏合剂吸收了脱细胞真皮基质敷料和水凝胶的特性和优势，在组织修复方面展现出潜在的价值。这种基于多巴胺化学和水凝胶涂层技术联合制备双层组织黏合剂的方法具有可重复利用、成本低廉、操作简易、便于大规模生产等优点，制备的双面组织黏合剂具有抗爆破性、不对称润湿性、不对称黏附性和抗氧化性，可促进组织修复且抗术后粘连，能够在制备促进组织修复的敷料中应用。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种双面组织黏合剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将脱细胞真皮基质敷料在无水乙醇中浸润处理，取出后再置入盐酸多巴胺溶液中搅拌，取出后用去离子水清洗，干燥；
S2、将S1得到的脱细胞真皮基质敷料一侧进行密封保护，对脱细胞真皮基质敷料的另一侧表面进行疏水改性；
S3、在S2制备的脱细胞真皮基质敷料被保护的一侧表面涂覆预凝胶溶液，然后置于真空密封的环境下，固化后得到双面组织黏合剂。
2.根据权利要求1所述的双面组织黏合剂的制备方法，其特征在于，
所述S1中，盐酸多巴胺溶液的配置方法为：将盐酸多巴胺溶解于Tris-HCL缓冲液中，调节pH，得到盐酸多巴胺溶液。
3.根据权利要求2所述的双面组织黏合剂的制备方法，其特征在于，
所述Tris-HCL缓冲液浓度为50mmol/L，调节pH至8.5；所制备的盐酸多巴胺溶液中，盐酸多巴胺的浓度为2mg/ml。
4.根据权利要求1所述的双面组织黏合剂的制备方法，其特征在于，
所述S1中，脱细胞真皮基质敷料置入盐酸多巴胺溶液后，在30℃水浴环境下剧烈搅拌，反应时间为8小时。
5.根据权利要求1所述的双面组织黏合剂的制备方法，其特征在于，
所述S1中，干燥方法为25℃室温下通风自然干燥。
6.根据权利要求1所述的双面组织黏合剂的制备方法，其特征在于，
所述S2中，疏水改性方法为：将一侧密封好后的脱细胞真皮基质敷料和三乙氧基-1H,1H,2H,2H-全氟癸基硅烷放在同一密封容器中，置于60℃的烘箱中进行蒸镀，蒸镀时间为4小时，蒸镀完成后常温冷却，用去离子水反复冲洗表面去除未反应的残留物质。
7.根据权利要求1所述的双面组织黏合剂的制备方法，其特征在于，
所述S3中，预凝胶溶液包括丙烯酸30w/v％、季铵盐壳聚糖5w/v％、过硫酸铵3w/v％和四甲基乙二胺0.3w/v％。
8.根据权利要求1所述的双面组织黏合剂的制备方法，其特征在于，
所述S3中，通过注射器将预凝胶溶液注射到脱细胞真皮基质敷料表面；预凝胶溶液固化时间为2小时。
9.权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备的双面组织黏合剂。
10.权利要求1～8任意一项所述的制备方法制备的双面组织黏合剂在制备创面修复材料中的应用。
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| CN117942420A (zh) * | 2024-03-26 | 2024-04-30 | 上海威高医疗技术发展有限公司 | 一种以脱细胞基质材料为基材的可降解体内用压敏胶及其制备方法 |
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2023
- 2023-09-15 CN CN202311193140.0A patent/CN117018266A/zh active Pending
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