CN117004501A - 一种分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母及其应用，属于生物技术领域。本发明基于牛乳铁蛋白抑菌肽具有较强的抑菌性，但其在微生物细胞中的异源表达比较困难的问题，首先构建了能够成功表达牛源乳铁蛋白抑菌肽的重组毕赤酵母菌株X‑33‑LFcinB，对其进行摇瓶发酵测得产量为19.3mg/L；其次对信号肽进行了筛选，得到重组菌株X‑33‑0030‑α‑LFcinB，进一步促进了LFcinB的分泌，摇瓶发酵产量为28.8mg/L；最后融合阴离子氧化肽再次促进LFcinB在毕赤酵母中的异源高效表达，并使其摇瓶总产量达到了55.3 mg/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
乳铁蛋白抑菌肽（Lactoferricin）是一种多功能的25-残基肽，由胃蛋白酶裂解天然乳铁蛋白产生，位于乳铁蛋白 N 末端区域（17-41 aa），含有二硫键，并具有丰富的碱性氨基酸以及疏水残基，净正电荷为 8+。1992年，关于乳铁蛋白的首次报告描述说，与完整的乳铁蛋白相比，该肽作为一种抗菌剂更有效，并被证明会导致其大多数靶点的集落形成能力的快速丧失。乳铁蛋白抑菌肽除了具有广谱抑菌活性，还具有抗病毒、抗原虫、肿瘤抑制和细胞凋亡诱导活性。
通过对人、牛、鼠和山羊的乳铁素的抗菌活性进行比较，发现牛的乳铁蛋白抑菌肽（Lactoferricin Bovin，LFcinB）是最有效的，其对某些大肠杆菌的MIC值达到30 μg/mL。
目前主要通过酶解乳铁蛋白获取乳铁蛋白抑菌肽，但乳铁蛋白本身提取困难，价格昂贵。而通过在微生物细胞中进行重组表达获得抗菌肽，因其生产成本低、制备工艺简单等优点而受到广泛关注，例如，使用pPIC9K-His质粒，在毕赤酵母GS115中成功用甲醇诱导牛乳铁蛋白衍生肽。使用启动子P trnQ 驱动六个串联重复序列的表达，Li等人在枯草芽孢杆菌中实现了乳铁蛋白的重组表达。然而，已有报道的利用微生物细胞重组表达的乳铁蛋白产量相对较低，仍需要进一步研究以实现其在工业环境中的应用。
毕赤酵母具有生长快，操作简单的特点，具有各翻译后加工和修饰功能，并且可大规模发酵，适合高密度培养，因此本发明以毕赤酵母为宿主，对牛源乳铁蛋白抑菌肽的微生物发酵生产进行进一步优化。
发明内容
为解决上述问题，本发明首先将牛乳铁蛋白抑菌肽在毕赤酵母中进行异源表达，其次对不同来源的信号肽进行筛选，并对其进行组合，得到更利于牛乳铁蛋白抑菌肽分泌表达的菌株，最后通过融合表达阴离子氧化肽进一步提高牛乳铁蛋白抑菌肽的产量。
本发明的第一个目的是提供一种分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母，所述毕赤酵母异源表达了由杂合信号肽0030-α调控表达的牛乳铁蛋白抑菌肽，所述杂合信号肽0030-α由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列融合得到。
进一步地，所述融合为，将SEQ ID NO.10所示核苷酸序列融合至SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的N端。
进一步地，所述毕赤酵母过表达了阴离子氧化肽编码基因。其中，阴离子氧化肽通过水解酶位点连接在牛源乳铁蛋白抑菌肽的N端。
进一步地，所述阴离子氧化肽包括SEQ ID NO.20所示序列、SEQ ID NO.21所示序列或由两者融合得到的序列。
进一步地，上述的融合为将SEQ ID NO.20所示序列融合至SEQ ID NO.21所示序列的N端，两者融合得到的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。
进一步地，所述牛乳铁蛋白抑菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述杂合信号肽0030-α的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
进一步地，出发菌株包括毕赤酵母X-33、毕赤酵母GS115、毕赤酵母SMD1168或毕赤酵母SMD1163。
进一步地，所述牛乳铁蛋白抑菌肽由诱导型启动子或组成型启动子启动表达。
进一步地，优选为诱导型启动子，所述诱导型启动子包括P AOX1 。
进一步地，以PICZaA为表达载体。
本发明的第二个目的是提供上述分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母的构建方法，包括以下步骤：
S1、将杂合信号肽0030-α融合表达至牛乳铁蛋白抑菌肽编码基因的N端，并连接至载体骨架PICZaA上，得到重组质粒；
S2、将S1得到的重组质粒导入毕赤酵母宿主中，得到上述分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母。
进一步地，步骤S1中还包括将阴离子氧化肽融合至牛乳铁蛋白抑菌肽编码基因N端的步骤，具体地，将杂合信号肽0030-α和阴离子氧化肽融合表达至牛乳铁蛋白抑菌肽编码基因的N端，并连接至载体骨架PICZaA上，得到重组质粒。
进一步地，为便于后续纯化，在牛乳铁蛋白抑菌肽表达框上设置纯化标签，本发明中选用6×his标签，氨基酸序列为HHHHHH。
本发明的第三个目的是提供上述毕赤酵母在制备生物、制药、食品或化工领域产品中的应用，尤其是含牛乳铁蛋白抑菌肽的产品。
本发明的第四个目的是提供一种生产牛乳铁蛋白抑菌肽的方法，包括采用上述毕赤酵母进行发酵生产的步骤。
进一步地，所述发酵条件为：发酵时间4-6天，发酵温度28-32℃。
进一步地，所述发酵的过程为：将上述毕赤酵母基因工程菌接种于发酵培养基中发酵培养获得发酵液，再收集发酵液中的菌体并清洗，之后接种于诱导培养基中进行诱导表达，得到LfcinB。
进一步地，所述发酵培养基：蛋白胨18-22 g/L，酵母粉8-12 g/L，甘油8-12 mL/L，YNB 10-15 g/L，生物素3×10-4 -5×10-4 g/L，磷酸钾缓冲液80-120 mM。
在本发明的实施例中，所述发酵培养基：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，甘油10mL/L，YNB 13.4 g/L，生物素4×10-4 g/L，磷酸钾缓冲液100 mM。
进一步地，所述诱导培养基：蛋白胨18-22 g/L，酵母粉8-12 g/L，甲醇4-7 mL/L，YNB 10-15 g/L，生物素3×10-4 -5×10-4 g/L，磷酸钾缓冲液80-120 mM。
进一步地，所述诱导培养基：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，甲醇5 mL/L，YNB 13.4g/L，生物素4×10-4 g/L，磷酸钾缓冲液100 mM。
进一步地，所述诱导培养基中含有诱导剂，诱导剂终浓度为0.8-1.2%（v/v）。
进一步地，所述诱导剂为甲醇。
本发明的有益效果：
本发明首先构建了能够成功表达LfcinB的重组毕赤酵母菌株X-33-LfcinB，摇瓶发酵产量为19.3 mg/L，其次对原有信号肽进行优化，发现含有0030信号肽和α因子信号肽组合的X-33-0030-α-LfcinB菌株为LfcinB生产最优结构，产量达到28.8 mg/L，在此基础上通过水解酶位点融合表达了阴离子氧化肽，使其产量进一步提高至55.3mg/L。本发明构建的重组菌株所生产的LfcinB表达稳定，表达量高，且有明显的抑菌活性，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为重组表达质粒构建示意图。
图2为不同底盘菌株蛋白质印迹（Western Blot）验证图谱。
图3为不同信号肽蛋白印迹验证图谱。
图4为不同杂合信号肽蛋白印迹验证图谱。
图5为融合不同阴离子氧化肽LFcinB表达菌株SDS-PAGE验证图谱。
图6 为BCA kit检测标准曲线。
图7为不同菌株LFcinB产量图。
图8为发酵样品抑菌活性检测结果，图中1为阳性对照，2为检测样品，3为阴性对照。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例涉及的材料如下：
（一）菌株和载体
质粒的构建在E. coli DH5α中进行，质粒构建完成后转化到毕赤酵母中进行牛源乳铁蛋白抑菌肽LfcinB的表达和发酵。
所使用的载体pPICZaA为商业化质粒。
（二）培养基
E. coli使用LB培养基（每升含10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母粉和10 g NaCl）进行培养。
工程菌株0-1天使用发酵培养基（蛋白胨18-22 g/L，酵母粉8-12 g/L，甘油8-12mL/L，酵母氮源YNB 10-15 g/L，生物素3×10-4 -5×10-4 g/L，磷酸钾缓冲液80-120 mM）进行发酵，2-6天使用诱导培养基（蛋白胨18-22 g/L，酵母粉8-12 g/L，甲醇4-7 mL/L，酵母氮源YNB 10-15 g/L，生物素3×10-4 -5×10-4 g/L，磷酸钾缓冲液80-120 mM）进行发酵。
实施例1：LFcinB重组菌株X-33-LFcinB的构建
如图1所示，所构建的牛源乳铁蛋白抑菌肽LFcinB表达框由LFcinB基因和6×His标签两部分构成。LFcinB已按照毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。通过6×His标签可使用镍柱对重组蛋白进行纯化。使用的质粒载体是商业化质粒pPICZaA，该载体的启动子为P AOX1 ，且本身具有α因子信号肽。之后将LFcinB表达框连接到质粒载体上得到重组质粒pPICZaA-LFcinB。
选用毕赤酵母菌株X-33为表达宿主进行LFcinB的表达，将重组质粒pPICZaA-LFcinB转化X-33菌株，得到重组菌株X-33-LFcinB，采用Western blot对表达产量进行验证，结果如图2所示。
实施例2：对LFcinB重组菌株的信号肽优化
对信号肽进行筛选，将筛选得到的SUC2、SCW10、INU1、SP、MEL1、0030、PHO11和OST信号肽分别替换实施例1构建的重组质粒上的α因子信号肽，得到重组质粒pPICZaA-SUC2-LFcinB、pPICZaA-SCW10-LFcinB、pPICZaA-INU1-LFcinB、pPICZaA-SP-LFcinB、pPICZaA-MEL1-LFcinB、pPICZaA-0030-LFcinB、pPICZaA-PHO11-LFcinB、pPICZaA-OST-LFcinB，之后将SUC2、SCW10、INU1、SP、MEL1、0030、PHO11和OST信号肽分别连接在α因子信号肽N端，得到杂合信号肽重组质粒pPICZaA-SUC2-α-LFcinB、pPICZaA-SCW10-α-LFcinB、pPICZaA-INU1-α-LFcinB、pPICZaA-SP-α-LFcinB、pPICZaA-MEL1-α-LFcinB、pPICZaA-0030-α-LFcinB、pPICZaA-PHO11-α-LFcinB、pPICZaA-OST-α-LFcinB。其中，信号肽α因子、SP、INU1、MEL1、SCW10、SUC2、PHO11、0030、OST以及杂合信号肽SP-α、INU1-α、MEL1-α、SCW10-α、SUC2-α、PHO11-α、0030-α、OST-α的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3-19所示。
将以上重组质粒转化进X-33菌株中，得到重组信号肽菌株X-33-SUC2-LFcinB、X-33-SCW10-LFcinB、X-33-INU1-LFcinB、X-33-SP-LFcinB、X-33-MEL1-LFcinB、X-33-0030-LFcinB、X-33-PHO11-LFcinB、X-33-OST-LFcinB以及重组杂合信号肽菌株X-33-SUC2-α-LFcinB、X-33-SCW10-α-LFcinB、X-33-INU1-α-LFcinB、X-33-SP-α-LFcinB、X-33-MEL1-α-LFcinB、X-33-0030-α-LFcinB、X-33-PHO11-α-LFcinB、X-33-OST-α-LFcinB。
对重组信号肽菌株进行发酵，采用Western blot进行验证，结果如图3所示，可以看出原始的α因子信号肽菌株X-33-LFcinB产量最高。对杂合信号肽菌株以及α因子信号肽菌株进行发酵验证，采用Western blot 进行验证，得到结果如图4所示，可以看出菌株X-33-0030-α-LFcinB产条带最粗，产量最高。
实施例3：融合阴离子氧化肽的LFcinB重组菌株的构建
在实施例2构建的重组质粒pPICZaA-0030-α-LFcinB基础上，将阴离子氧化肽PEP1、PEP2、PEP1/2（氨基酸序列分别如SEQ ID NO.20-22所示）分别融合到LFcinB表达框的N端，得到重组质粒pPICZaA-0030-α-PEP1-LFcinB、pPICZaA-0030-α-PEP2-LFcinB、pPICZaA-0030-α-PEP1/2-LFcinB，之后将以上重组质粒转化进X-33菌株中，得到重组菌株0030-α-PEP1-LFcinB、0030-α-PEP2-LFcinB和0030-α-PEP1/2-LFcinB。对上述重组菌株进行发酵，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行验证，结果如图5所示，可以看出重组菌株0030-α-PEP1/2-LFcinB产量最高。
实施例4：LFcinB在重组菌株中的高效表达
将实施例1、实施例2和实施例3中所得到的工程菌株X-33-LFcinB、X-33-0030-α-LFcinB、0030-α-PEP1-LFcinB、0030-α-PEP2-LFcinB和0030-α-PEP1/2-LFcinB接种至含有2mL YPD培养基（10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖）的圆底试管过夜培养，取1 mL过夜培养菌液接种至25 mL 发酵培养基中进行摇瓶发酵，30℃，220 rpm条件下培养至OD600为60左右，4℃，3500 g，离心10 分钟，收集细胞，弃上清，并用无菌水清洗两次，每次清洗后同样条件离心，取上清。用诱导培养基重悬细胞，在30℃，220 rpm条件下进行诱导表达，每24小时加甲醇至终浓度1%（体积浓度）。经甲醇诱导培养5天后，离心并收集上清液，通过离心浓缩，使用镍柱对样品进行纯化。
实施例5：发酵上清液纯化
将实施例4中收集得到的上清液，采用Ni smart beads 6FF重力柱（smart-Lifesciences）纯化上清液。首先，使用10倍柱体积的PBS缓冲液平衡重力柱，之后将10 mL发酵上清液装入预平衡的重力柱中，然后加入10倍柱体积的洗涤缓冲液（含有5 mM咪唑的PBS）冲洗管壁，洗涤结束后，使用4倍柱体积洗脱缓冲液（含有250 mM咪唑的PBS）进行目的蛋白洗脱，分六管进行梯度收集，第一管和最后一管分别收集1 mL，2-5管每管收集0.5 mL，得到的样品进行SDS-PAGE分析，取含有目的条带且条带单一的收集管中的样品进行BCAkit定量分析，得到样品产量。
实施例6：LFcinB的产量测定
使用碧云天BCA试剂盒，梯度稀释标准品直至浓度分别为0、25、50、100、200、300、400、500mg/L，与样品共同检测，最终得到吸光度如表1，并作出回归曲线如图6，其拟合方程为y=743.17x-89.245，其中y为抑菌肽浓度（mg/L），x为吸光值。
表1 标准品检测吸光度
取镍柱纯化后的发酵样品，然后对样品进行平行检测，结果如表2和图7所示。
表2 乳铁蛋白抑菌肽产量
实施例7：融合阴离子氧化肽的切除
将实施例5中得到的纯化后0030-α-PEP1/2-LFcinB的样品用裂解缓冲液（1.86 mM羟胺盐酸蛋白在200 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 9.0）进行裂解。4小时后，通过盐酸的加入调节pH至7.0，终止反应。然后，用2-kD透析管去除盐酸羟胺和低分子量肽得到裂解样品。
实施例8：LFcinB抑菌活性的测定
采用牛津杯法验证发酵所得样品对金黄色葡萄球菌的抑菌活性。以100 μg/L的氨苄青霉素为阳性对照，纯化后的X-33-pPICZaA菌株样品为阴性对照，对菌株X-33-0030-α-LFcinB纯化后的样品，以及0030-α-PEP1/2-LFcinB裂解后的样品进行抑菌活性鉴定。如图8所示，其中a为0030-α-PEP1/2-LFcinB裂解后的样品结果，其抑菌圈直径为26mm，为阳性对照的68.4%，b为X-33-0030-α-LFcinB纯化后样品抑菌性检测结果，其抑菌圈直径为19mm，为阳性对照的50%（1为阳性对照，2为检测样品，3为阴性对照，牛津杯外径为8mm）。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母，其特征在于：所述毕赤酵母异源表达了由杂合信号肽0030-α调控表达的牛乳铁蛋白抑菌肽，所述杂合信号肽0030-α由SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列融合得到，所述融合为，将SEQ ID NO.10所示核苷酸序列融合至SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的N端。
2.根据权利要求1所述的分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母，其特征在于：所述毕赤酵母过表达了阴离子氧化肽编码基因。
3.根据权利要求2所述的分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母，其特征在于：阴离子氧化肽通过水解酶位点连接在牛源乳铁蛋白抑菌肽的N端。
4.根据权利要求2所述的分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母，其特征在于：所述阴离子氧化肽选自SEQ ID NO.20-22任一项所示序列。
5.根据权利要求1所述的分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母，其特征在于：出发菌株包括毕赤酵母X-33、毕赤酵母GS115、毕赤酵母SMD1168或毕赤酵母SMD1163。
6.根据权利要求1所述的分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母，其特征在于：所述牛乳铁蛋白抑菌肽由诱导型启动子或组成型启动子启动表达。
7.根据权利要求6所述的分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母，其特征在于：所述诱导型启动子包括P AOX1 。
8.权利要求1-7任一项所述的分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将杂合信号肽0030-α融合表达至牛乳铁蛋白抑菌肽编码基因的N端，并连接至载体骨架PICZaA上，得到重组质粒；
S2、将S1得到的重组质粒导入毕赤酵母宿主中，得到所述分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母。
9.权利要求1-7任一项所述的分泌表达牛乳铁蛋白抑菌肽的毕赤酵母在制备生物、制药、食品或化工领域的产品中的应用。
10.一种生产牛乳铁蛋白抑菌肽的方法，其特征在于：包括采用权利要求1-7任一项所述的毕赤酵母进行发酵生产的步骤。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117004501B (zh) | 2024-01-02 |
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