CN117004495A - 一株深绿木霉t280及其筛选方法、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，具体涉及一株深绿木霉T280及其筛选方法、应用。本发明筛选的菌株，其保藏编号为CGMCC NO.40730，于2023年07月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明筛选得到的深绿木霉T280具有漆酶和过氧化物酶活性，具有耐高温特性，能够在50℃条件下高效降解木质素，从而使堆肥快速发酵技术更易实现。本发明提供的深绿木霉T280为丝状真菌，相比较常见的细菌类腐熟菌种，具有遗传和功能性状稳定的优势，其菌丝结构有助于菌体抵达秸秆等纤维组织内部，增加了降解酶系的可及性，使木质素快速解聚，从而实现腐熟效率的提高。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株深绿木霉T280及其筛选方法、应用。
背景技术
在现代农业产量不断提升过程中，我国每年产出逾10亿吨农作物秸秆，是阻碍农业绿色发展的主要面源污染物之一。虽然秸秆中包含丰富的有机质和矿物质营养，但由于其高度聚合的木质纤维素结构，造成自然腐解效率低，其中木质素与半纤维素交织包裹在纤维素外部，阻碍了降解微生物的可及性。
木质纤维素结构复杂，其降解需要多种微生物的协同互作，其中木质素的降解是秸秆腐熟过程中的限速因子。好氧堆肥技术是对秸秆无害化肥料化利用的主要应用技术，其发酵温度一般达45℃以上，但是受到耐高温木质素降解菌匮乏的制约，堆肥产业普遍面临腐熟周期长的问题。传统木质素降解以白腐菌等真菌为代表，存在预处理周期长、对高温环境适应性差等问题，而大部分耐高温的腐熟菌为细菌，对木质素降解作用很差。目前，深绿木霉及其菌剂主要应用于生物防治、植物促生等方面，将其用于高温条件下的木质素降解菌则鲜有报道。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一株深绿木霉T280，本发明提供的深绿木霉T280分离筛选自农业固体废弃物堆肥发酵物，筛选得到的菌株能够在高温条件下高效降解木质素。
本发明还提供了上述深绿木霉T280的筛选方法。
本发明的另一目的为提供了上述深绿木霉T280在高温条件下高效降解木质素中的应用。
本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：
本发明提供了一株深绿木霉T280，其保藏编号为CGMCC NO.40730，于2023年07月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
上述深绿木霉T280的ITS基因序列（如SEQ ID NO.1所示）为：CGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT
本发明还提供了一种深绿木霉T280的筛选方法，包括以下步骤：
（1）将多地点广泛采集的农业固体废弃物堆肥发酵物进行梯度稀释至10-1～10-7倍，分别取每个梯度稀释液涂布玫瑰红钠琼脂培养基平板，恒温培养；
（2）从每个梯度稀释的平板中挑取单菌落，通过形态学显微镜观察和内源转录间隔区比对，鉴定种属，得到优势菌株深绿木霉T280。
进一步的，步骤（1）中，所述梯度稀释采用含有0.3%吐温-80的无菌水进行。
进一步的，步骤（1）中，所述恒温培养的条件为28℃下培养3d～14d。
本发明的另一目的为提供了上述深绿木霉T280在高温条件下降解木质素中的应用。
本发明的有益效果为：
（1）本发明筛选得到的深绿木霉T280同时具有漆酶和过氧化物酶活性，具有耐高温特性，能够在50℃条件下高效降解木质素；避免了现有技术中多采用常温发酵菌，其在发酵过程中对发酵条件要求苛刻的问题，从而使堆肥快速发酵技术更易实现。
（2）本发明提供的深绿木霉T280为丝状真菌，相比较常见的细菌类腐熟菌种，具有遗传和功能性状稳定的优势，其菌丝结构有助于菌体抵达秸秆等纤维组织内部，增加了降解酶系的可及性，使木质素快速解聚，从而实现腐熟效率的提高。
保藏信息
保藏时间：2023年07月11日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC NO.40730，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，
邮政编码：100101
分类命名：深绿木霉（Trichodermaatroviride）。
附图说明
图1为深绿木霉T280菌落状态图，其中，A为菌落正面图，B为菌落反面图；
图2为深绿木霉T280在含不同底物或染料培养基内的显色或脱色反应；
图3为木质素浓度测定的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。
实施例1菌株的分离鉴定
本发明提供的深绿木霉T280分离筛选自农业固体废弃物堆肥发酵物，具体筛选方法为：将采集的发酵物样本用含有0.3%吐温-80的无菌水梯度稀释至10-1～10-7倍，从每个梯度稀释液中分别取100 μL涂布玫瑰红钠琼脂培养基平板，在28℃恒温培养3天。从每个梯度稀释的平板中挑取不同形态单菌落转接至PDA在28℃培养7～14天，通过形态学显微镜观察和内源转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）比对，鉴定种属，其中编号为T280的菌株为分离得到的优势菌株，经鉴定为深绿木霉（Trichodermaatroviride）。
本发明深绿木霉T280在PDA上生长菌落边界清晰，中央有菌丝相对致密的圆盘状结构，菌落从白色逐渐变为深绿色，不产生扩散性色素。筛选得到的T280在28℃培养14天的菌落状态见图1，图中，A为菌落正面图，B为菌落反面图。
T280的ITS基因序列为：
CGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT。
实施例2木质素降解酶平板测定
漆酶是贯穿于木质素解聚和矿化过程的主要木质素降解酶，对愈创木酚、单宁酸、ABTS等底物的氧化作用中会产生明显的变色反应，从而判断是否具有漆酶活性。过氧化物酶系是在木质素解聚过程的主要降解酶，能够根据苯胺蓝平板脱色判断是否具有过氧化物酶活性。
培养基的配置：
PDB培养基：马铃薯浸粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸馏水定容至1L；
PDA培养基：PDB培养基加入15g/L琼脂，115℃高温高压灭菌30分钟，冷却至60℃以下备用；
愈创木酚+PDA培养基：将愈创木酚单独过滤除菌制成1%母液，无菌条件下以终浓度0.04%加入到PDA培养基中；
单宁酸+PDA培养基：将单宁酸单独过滤除菌制成20%母液，无菌条件下以终浓度0.04%加入到PDA培养基中；
2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）+PDA培养基：将ABTS单独过滤除菌制成4.4%母液，无菌条件下以终浓度0.11%加入到PDA培养基中；
苯胺蓝+PDA培养基：将苯胺蓝单独过滤除菌制成2%母液，无菌条件下以终浓度0.01%加入到PDA培养基中。
菌种活化：
将-80℃保藏的T280接种于PDA固体平板，28℃活化3天，在菌落边缘取新生菌丝再次接种于PDA平板中，28℃培养3天，再重复取菌丝培养一次，即为活化的菌株T280。
T280木质素降解酶的平板测定：
用无菌直径为5 mm打孔器取活化的菌株T280，分别接种于愈创木酚+PDA、ABTS+PDA、单宁酸+PDA和苯胺蓝+PDA平板上，在28℃条件下培养5～7天，记录在上述平板上有无显色或脱色现象。
经培养，T280在含愈创木酚、单宁酸和ABTS的培养基中培养，与PDA对照（图2E）相比，分别显浅砖红色（图2A）、褐色（图2B）和墨绿色（图2C），表明具有漆酶活性。在含苯胺蓝培养基中培养，可使蓝色染料脱色（图2D），表明T280具有过氧化物酶活性。
实施例3深绿木霉T280的耐高温性能测定
培养基的配制：
PDB培养基：马铃薯浸粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸馏水定容至1 L，115℃高温高压灭菌30分钟，冷却至室温备用；
PDA培养基：PDB培养基加入15 g/L琼脂，115℃高温高压灭菌30分钟，冷却至室温备用；
木质素无机盐培养液：Na2HPO4, 2.8 g/L、KH2PO4, 1.0 g/L、(NH4)2SO4, 0.5 g/L、MgCl2, 0.053g/L、四水钙盐, 0.05 g/L、Na2EDTA, 0.0005 g/L、FeSO4·7H2O, 0.0002 g/L、ZnSO4·7H2O, 0.00001 g/L、MnCl2·4H2O, 0.000003 g/L、H3BO3, 0.00003 g/L、CoCl2·6H2O, 0.0002 g/L、CuCl2·2H2O, 0.000001 g/L、NiCl2·6H2O, 0.000002 g/L、Na2MoO4·2H2O, 0.000003g/L、碱木质素1g/L，ddH2O定容至1L。木质素降解培养液经过121℃高温高压灭菌20分钟，冷却至室温备用。
在固体培养基高温培养：用无菌的直径为5 mm打孔器取新鲜活化的T280菌株，接种于PDA平板（直径150 mm）上，分别在28℃条件和50℃下培养至室温条件下刚好接触平皿边缘，设6个生物学重复，根据公式计算平板耐高温率，其中，/>表示平板培养耐高温性(%)，/>表示28℃培养的直径（cm），/>表示50℃培养的直径（cm）。分析结果表明，50℃平板培养耐高温性为42.31%±6.32%。
在液体培养基高温培养：将活化好的T280菌株在PDA平板上28℃、12小时光照12小时黑暗条件下培养10天，制备106个/mL的分生孢子悬液，将制备好的孢子悬液按1：100体积比分别接种于木质素无机盐培养液和PDB培养基中作为处理，以不接菌的两种培养液为对照，分别在28℃和50℃条件下180 rpm条件下培养14天，离心后测菌体干物质生物量，设6个生物学重复。根据公式，其中，/>表示液体培养耐高温性（%），/>表示26℃振荡培养的处理生物量减对照干物质的质量差（mg），/>表示50℃振荡培养的处理生物量减对照干物质的质量差（mg）。分析结果表明，在50℃木质素无机盐培养液和PDB培养基中培养的耐高温性分别为55.24%±9.22%和40.60%±7.85%
效果实施例T280在高温条件下的木质素降解率测定
培养基的配制：
PDA培养基：马铃薯浸粉6.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂15 g，蒸馏水定容至1L，115℃高温高压灭菌30分钟，冷却至室温备用；
木质素无机盐培养液：Na2HPO4, 2.8 g/L、KH2PO4, 1.0 g/L、(NH4)2SO4, 0.5 g/L、MgCl2, 0.053 g/L、四水钙盐, 0.05 g/L、Na2EDTA, 0.0005 g/L、FeSO4·7H2O, 0.0002 g/L、ZnSO4·7H2O, 0.00001 g/L、MnCl2·4H2O, 0.000003 g/L、H3BO3, 0.00003 g/L、CoCl2·6H2O, 0.0002 g/L、CuCl2·2H2O, 0.000001 g/L、NiCl2·6H2O, 0.000002 g/L、Na2MoO4·2H2O, 0.000003 g/L、碱木质素1 g/L，ddH2O定容至1 L。木质素降解培养液经过121℃高温高压灭菌20分钟，冷却至室温备用。
孢子悬浮液的制备：将活化好的菌株在PDA固体平板上28℃、12小时光照12小时黑暗条件下培养10天，制备106个/mL的分生孢子悬液。
接种：将制备好的孢子悬液按1:100体积比接种于木质素无机盐培养液中为处理，不接种菌体的木质素无机盐培养液为空白对照，设6个生物学重复。50℃、160 rpm条件下振荡培养15天。
木质素浓度标准曲线的绘制：取6个不同浓度碱木质素（分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1 g/L）降解培养基溶液，吸取200 μL于96孔UV板中测280 nm处吸光度，绘制标准曲线（图3）。
高温条件木质素降解率测定：在无菌环境中取混匀后的木质素降解培养基1 mL于离心管中，12000 rpm条件下离心3 min，取200 μL上清液，通过酶标仪测定对照和处理组280 nm处吸光度，将测得的数值带入标准曲线计算木质素含量，根据公式计算木质素降解率，其中，/>表示木质素降解率（%），/>表示空白对照中木质素的含量（g/L），/>表示处理中木质素的含量（g/L）。结果表明，50℃条件下深绿木霉T280培养15天的木质素降解率为47.52±8.28%，优于现有的高温木质素降解真菌。在高温堆肥发酵秸秆等含木质素的原料降解方面具有很好的应用潜力，能够促进木质纤维素组分的降解，提高堆肥效率。
Claims (6)
1.一株深绿木霉T280，其特征在于，其保藏编号为CGMCC NO.40730，于2023年07月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.根据权利要求1所述的深绿木霉T280，其特征在于，所述深绿木霉T280的ITS基因序列为：CGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCAT。
3.一种如权利要求1或2所述的深绿木霉T280的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将多地点广泛采集的农业固体废弃物堆肥发酵物进行梯度稀释至10-1～10-7倍，分别取每个梯度稀释液涂布玫瑰红钠琼脂培养基平板，恒温培养；
（2）从每个梯度稀释的平板中挑取单菌落，通过形态学显微镜观察和内源转录间隔区比对，鉴定种属，得到优势菌株深绿木霉T280。
4.根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，步骤（1）中，所述梯度稀释采用含有0.3%吐温-80的无菌水进行。
5.根据权利要求3或4所述的筛选方法，其特征在于，步骤（1）中，所述恒温培养的条件为28℃下培养3d～14d。
6.一种如权利要求1或2所述的深绿木霉T280在高温条件下降解木质素中的应用。
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