CN116987753A - 一种天然结构水母胶原蛋白的酶解制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明属于海洋活性成分制备技术领域，公开了一种天然结构水母胶原蛋白的酶解制备工艺，包括对水母进行蛋白酶酶解，在蛋白酶酶解之前，对水母原料进行预处理，所述的预处理包括如下步骤：（1）向水母原料中加入NaOH水溶液溶胀；（2）向溶胀后的水母中加入水、吐温‑20以及脂肪氧合酶，维持温度15~20℃，处理12~24 h；其中，吐温‑20的用量为以反应体系计0.01wt%~0.02wt%。本发明使用吐温‑20和脂肪氧合酶预处理水母，有利于促进蛋白酶尤其是胃蛋白酶制备水母胶原蛋白的效率；同时，更有利于维持水母胶原蛋白的天然三螺旋结构。
Description
技术领域
本发明属于海洋活性成分制备技术领域，具体涉及一种天然结构水母胶原蛋白的酶解制备工艺。
背景技术
水母生物量大，在黄渤海海域，9~11月是主要的采收季节，是一类重要的海洋胶原蛋白生物来源。水母胶原水分含量通常高于95%，且水母死后会有自溶现象，在渔船上通常会用“三钒两盐”来进行腌制，但是腌制后的水母胶原也就是海蜇胶原蛋白无法维持天然结构，胶原蛋白的三级结构发生了改变，进而如伤口愈合，抗氧化，皮肤修复等生物活性也会发生改变，造成了生物活性的降低，影响了其在生物医药领域的应用。
现有技术中，胶原蛋白或胶原蛋白肽的制备方法包括水提、酸法、碱法等，但上述方法均无法保证胶原蛋白天然三螺旋结构的维持，且收率不理想。低温条件下提取的大分子胶原蛋白，通常分子量较大，但是因为没有进行酶解工艺，暴露出来的氧化还原末端较少，影响了其活性的表达。酶解法是胶原蛋白制备较为理想的解决方向，但如果酶解程度较高，不利于其天然结构的表达，甚至直接水解成单链多肽，进而对活性表达产生了一定的影响。而酶解程度较低，对制备效率会有影响，且水母胶原蛋白作为水产胶原蛋白，其变性温度更低，不利于反应条件的控制。因此，如何能提供一种快速高效且可维持水母胶原蛋白天然结构的制备方法是急需解决的问题。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种天然结构水母胶原蛋白的酶解制备工艺。本发明的工艺提升了水母胶原蛋白的制备效率，获得的胶原蛋白分子量适中，且能有效维持水母胶原蛋白的天然结构。
具体技术方案如下：
本发明的目的是提供一种天然结构水母胶原蛋白的酶解制备工艺，包括对水母进行蛋白酶酶解，其与现有技术的区别在于，在蛋白酶酶解之前，对水母原料进行预处理，所述的预处理包括如下步骤：
（1）向水母原料中加入NaOH水溶液溶胀；
（2）向溶胀后的水母中加入水、吐温-20以及脂肪氧合酶（LOX），维持温度15~20℃，处理12~24 h；其中，吐温-20的用量为以反应体系计0.01wt%~0.02wt%。
蛋白酶尤其是胃蛋白酶在合适的酶解条件下，会破坏胶原蛋白天然结构三螺旋末端，提高制备效率，但是不会完全破坏三螺旋结构；然而，制备效率仍然有限。本发明中，在碱溶胀后加入脂类成分吐温-20以及脂肪氧合酶，使水母胶原蛋白外部和氧化脂结合，变成氧化脂蛋白复合体，暴露出更多的酶解位点，更利于蛋白酶尤其是胃蛋白酶的定向酶解，通过定向酶解，得到了分子量适中，天然三螺旋结构比例较高，且生物活性良好的胶原蛋白制品。该制备工艺提升胶原蛋白（其中还包括胶原蛋白肽）的制备效率。制备效率的提升意味着同等得率的前提下缩短制备时间，防止胶原蛋白和胶原蛋白肽在长时间处理的情况下由于酶或温度的原因发生结构破坏；同时，更多氧化末端的暴露降低了酶切开其他位点的风险，进一步防止三螺旋结构的破坏。在本发明的工艺条件下，水母胶原蛋白的整体抗氧化功能得到了提升。
进一步，步骤（2）中，脂肪氧合酶的用量为以反应体系计3~5 U/mg。
进一步，步骤（2）中：水的用量为水母原料质量的4~6倍。
进一步，步骤（1）中：NaOH水溶液的浓度为0.04~0.06 mol/L。
进一步，步骤（1）中：溶胀时间为4~10 h。
进一步，步骤（1）中：水母原料与NaOH水溶液的用量比为1g:(6~8)mL。
进一步，步骤（1）中：加入NaOH水溶液溶胀之前，对水母进行匀浆，优选在冰浴条件下进行匀浆。
进一步，所述的蛋白酶酶解中，使用胃蛋白酶对预处理后的水母进行酶解。
具体地，所述的蛋白酶酶解的工作条件包括：
调节预处理获得的物料pH值为2~3，加入胃蛋白酶，4~10℃条件下处理48~60 h。
其中，胃蛋白酶的用量优选为以反应体系计0.5~2 U/mg。
具体地，胃蛋白酶处理完成后，过滤后取上清液，将上清液调整pH至中性，加入NaCl，至NaCl终浓度0.8~1 mol/L，过滤收集沉淀即为水母胶原蛋白。
进一步，所述的水母原料为水母的伞部。应选用新鲜水母作为原料，新鲜水母捕捞后优选进行-2~4℃冷链运输。
本发明的有益效果如下：
本发明使用吐温-20和脂肪氧合酶预处理水母，有利于促进蛋白酶尤其是胃蛋白酶制备水母胶原蛋白的效率；同时，更有利于维持水母胶原蛋白的天然三螺旋结构。本发明的工艺使水母胶原蛋白的分子量适中，整体抗氧化功能获得了提升，同时实现了水母胶原蛋白的高效制备和活性维持。
附图说明
图1为测试2中实施例1的高效液相色谱图；
图2为测试3中正常对照组的HE染色结果；
图3为测试3中模型对照组的HE染色结果；
图4为测试3中实施例1组的HE染色结果；
图5为测试3中对比例3组的HE染色结果。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。
具体实施方式中，使用的水母为新鲜水母捕捞后-2~4℃冷链运输。
实施例1
一种天然结构水母胶原蛋白的酶解制备工艺，步骤如下：
S1. 原料预处理：
（1）取水母的伞部作为原料，冰浴匀浆，然后加入0.06 mol/L的NaOH水溶液溶胀4h，然后用水冲洗干净；水母原料与NaOH水溶液的用量比为1g:6mL；
（2）向溶胀后的水母中加入水、吐温-20以及脂肪氧合酶，维持温度15℃，处理24h；其中，水的用量为水母原料质量的5倍，吐温-20的用量为以反应体系计0.02wt%，脂肪氧合酶的用量为以反应体系计4 U/mg。
S2. 蛋白酶辅助提取：
调节步骤S1获得的物料pH值为3，加入以反应体系计1 U/mg胃蛋白酶，6℃条件下搅拌处理48 h；滤后取上清液，调整pH到中性，加入NaCl至NaCl终浓度0.9 mol/L，过滤收集沉淀即为水母胶原蛋白。
实施例2
一种天然结构水母胶原蛋白的酶解制备工艺，步骤如下：
S1. 原料预处理：
（1）取水母的伞部作为原料，冰浴匀浆，然后加入0.06 mol/L的NaOH水溶液溶胀8h，然后用水冲洗干净；水母原料与NaOH水溶液的用量比为1g:8mL；
（2）向溶胀后的水母中加入水、吐温-20以及脂肪氧合酶，维持温度20℃，处理15h；其中，水的用量为水母原料质量的6倍，吐温-20的用量为以反应体系计0.01wt%，脂肪氧合酶的用量为以反应体系计5 U/ mg。
S2. 蛋白酶辅助提取：
调节步骤S1获得的物料pH值为2，加入以反应体系计1 U/mg胃蛋白酶，6℃条件下搅拌处理48 h；滤后取上清液，调整pH到中性，加入NaCl至NaCl终浓度0.9 mol/L，过滤收集沉淀即为水母胶原蛋白。
实施例3
一种天然结构水母胶原蛋白的酶解制备工艺，步骤如下：
S1. 原料预处理：
（1）取水母的伞部作为原料，冰浴匀浆，然后加入0.04 mol/L的NaOH水溶液溶胀4h，然后用水冲洗干净；水母原料与NaOH水溶液的用量比为1g:8mL；
（2）向溶胀后的水母中加入水、吐温-20以及脂肪氧合酶，维持温度15℃，处理24h；其中，水的用量为水母原料质量的5倍，吐温-20的用量为以反应体系计0.015wt%，脂肪氧合酶的用量为以反应体系计4 U/mg。
S2. 蛋白酶辅助提取：
调节步骤S1获得的物料pH值为3，加入以反应体系计1 U/mg胃蛋白酶，4℃条件下搅拌处理60 h；滤后取上清液，调整pH到中性，加入NaCl至NaCl终浓度0.9 mol/L，过滤收集沉淀即为水母胶原蛋白。
对比例1
参照实施例1，与实施例1的区别在于，不进行步骤S1（2），直接向溶胀后的水母中加入以水母原料质量计5倍的水，然后进行步骤S2；
其余技术特征与实施例1相同。
对比例2
参照对比例1，与对比例1的区别在于，步骤S2的工作条件为：调节步骤S1获得的物料pH值为中性，6℃条件下搅拌处理48 h；滤后取上清液，调整pH到中性，加入NaCl至NaCl终浓度0.9 mol/L，过滤收集沉淀即为水母胶原蛋白；
其余技术特征与对比例1相同。
对比例3
参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤S2中，酶解的温度和时间替换为：40℃条件下处理8 h；
其余技术特征与实施例1相同。
对比例4
参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤S2中，将胃蛋白酶等量替换为木瓜蛋白酶，并将pH值调整至5；
其余技术特征与实施例1相同。
对比例5
参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤S2中，将胃蛋白酶等量替换为胰蛋白酶，并将pH值调整至8；
其余技术特征与实施例1相同。
对比例6
参照实施例1，与实施例1的区别在于，步骤S2中，将胃蛋白酶等量替换为中性蛋白酶，并将pH值调整至7；
其余技术特征与实施例1相同。
测试1
在原料量即水母伞部重量均为200g±0.5g时，对实施例1~3与对比例1、对比例2的获得的水母胶原蛋白的干重与羟脯氨酸含量进行对比，结果见表1。
表1 水母胶原蛋白的干重与羟脯氨酸的含量
| 样品 | 胶原蛋白干重(g) | 羟脯氨酸含量(%) |
| 实施例1 | 0.660 | 7.2 |
| 实施例2 | 0.567 | 6.9 |
| 实施例3 | 0.621 | 7.2 |
| 对比例1 | 0.428 | 5.9 |
| 对比例2 | 0.325 | 5.7 |
水产胶原蛋白羟脯氨酸含量和胶原蛋白含量的转化系数约为11.1，从表1数据中可以看出实施例水母胶原蛋白的纯度和提取率均高于对比例1、对比例2。
测试2
应用高效液相色谱（色谱柱：TSKgel3000），测定各实施例与对比例的水母胶原蛋白的平均分子量；同时测定样品对DPPH自由基的保护作用， DPPH自由基采用南京建成DPPH自由基测试试剂盒所建议的标准方法进行测量。结果见表2。实施例1的高效液相色谱图见图1。
表2 水母胶原蛋白的平均分子量与DPPH自由基抑制率
| 样品 | 保留时间(min) | 平均分子量预计(D) | DPPH自由基抑制率（%） |
| 实施例1 | 11.250 | 20K~30K | 72.04±0.5 |
| 对比例1 | 11.120 | 20K~30K | 69.35±0.42 |
| 对比例2 | 7.750 | 80K-150K | 59.27±0.89 |
| 对比例4 | 18.827 | 1608.7 | 49.10±0.32 |
| 对比例5 | 19.085 | 1474 | 56.10±0.45 |
| 对比例6 | 17.19 | 1874 | 50.55±0.55 |
表2数据提示本发明有利于保存完整结构。本发明的预处理方法有利于水母胶原蛋白完整结构的保存；除胃蛋白酶外，其他酶辅助提取的胶原蛋白分子量过低，源于其破坏了三螺旋结构；同时实施例的自由基抑制率明显高于各对比例。
测试3
通过动物实验对实施例1与对比例3获得的水母胶原蛋白的功效进行比较。
选取健康昆明小白鼠，雌性，体重为18~22g，80只小鼠随机分为8组：正常对照组，模型对照组，阳性对照1组，阳性对照2组；以及实施例1、对比例3各两组；其中阳性对照组涂抹不同浓度的维生素C溶液，实施例1组、对比例3组涂抹其相应的不同浓度的水母胶原蛋白溶液，正常对照组、模型对照组不涂抹任何制剂。具体分组情况及相应溶液浓度见表3、表4。除正常对照组外，其他各组小鼠均在背部进行2*2cm2脱毛处理，各组小鼠在实验开始背部脱毛部位进行预防性涂抹2周，第3周开始进行紫外线照射，照射前30min涂抹1次，直至实验结束。用试剂盒测定皮肤组织匀浆中的水分含量和抗氧化系指标（SOD、CAT、GSH-Px|、MDA）并进行组织HE染色，观察形态。皮肤含水量结果见表3。抗氧化指标结果见表4。正常对照组的HE染色结果见图2，模型对照组的HE染色结果见图3，实施例1组的HE染色结果见图4，对比例3组的HE染色结果见图5。
表3 皮肤含水量结果
| 组别 | 浓度（wt%） | 皮肤水分含量（wt%） |
| 正常对照组 | - | 68.24±0.56 |
| 模型对照组 | - | 55.72±0.89 |
| 阳性对照组1 | 0.5 | 58.09±0.59 |
| 阳性对照组2 | 1 | 60.76±0.67 |
| 实施例1A组 | 0.5 | 60.03±0.83 |
| 实施例1B组 | 1 | 66.34±0.74 |
| 对比例3A组 | 0.5 | 57.94±0.54 |
| 对比例3B组 | 1 | 59.99±0.62 |
表4 抗氧化指标测试结果
| 组别 | 浓度（wt%） | SOD含量（U/mg） | CAT酶活力（U） | GSH-Px酶活力（U） | MDA（nmol/mg.prot） |
| 正常对照组 | - | 124.61 | 20.16 | 166.60 | 11.027 |
| 模型对照组 | - | 84.76 | 10.15 | 45.67 | 13.359 |
| 阳性对照组1 | 0.5 | 111.89 | 17.08 | 160.16 | 11.596 |
| 阳性对照组2 | 1 | 104.41 | 21.21 | 144.17 | 14.656 |
| 实施例1A组 | 0.5 | 109.67 | 17.35 | 155.75 | 10.939 |
| 实施例1B组 | 1 | 114.26 | 19.70 | 150.07 | 12.581 |
| 对比例3A组 | 0.5 | 100.07 | 11.08 | 137.52 | 12.558 |
| 对比例3B组 | 1 | 111.10 | 11.35 | 113.23 | 12.326 |
氢氧自由基是化学性质最活泼的活性氧，可以与细胞内的有机物反应，因此它的破坏性极强；但它可以被过氧化氢酶CAT分解，保护机体细胞稳定的内环境及细胞的正常生活。一般认为谷胱甘肽过氧化物酶在细胞内能清除有害的过氧化物代谢产物，阻断脂质过氧化连锁反应，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。谷胱甘肽过氧化物酶可以促进过氧化氢与还原型谷胱甘肽反应形成H2O和氧化型谷胱甘肽，谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示。机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，并因此形成脂质过氧化物。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。因此，初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中一些能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。氧自由基不但能通过生物膜中多不饱和脂肪酸的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因而测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。从表4中可以看出实施例1的抗氧化效果优于对比例3。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种天然结构水母胶原蛋白的酶解制备工艺，包括对水母进行蛋白酶酶解，其特征在于，在蛋白酶酶解之前，对水母原料进行预处理，所述的预处理包括如下步骤：
（1）向水母原料中加入NaOH水溶液溶胀；
（2）向溶胀后的水母中加入水、吐温-20以及脂肪氧合酶，维持温度15~20℃，处理12~24h；其中，吐温-20的用量为以反应体系计0.01wt%~0.02wt%。
2.根据权利要求1所述的酶解制备工艺，其特征在于，步骤（2）中：脂肪氧合酶的用量为以反应体系计3~5 U/mg。
3.根据权利要求1所述的酶解制备工艺，其特征在于，步骤（2）中：水的用量为水母原料质量的4~6倍。
4.根据权利要求1~3任一项所述的酶解制备工艺，其特征在于，步骤（1）中：
NaOH水溶液的浓度为0.04~0.06 mol/L；
溶胀时间为4~10 h。
5.根据权利要求4所述的酶解制备工艺，其特征在于，步骤（1）中：水母原料与NaOH水溶液的用量比为1g:(6~8)mL。
6.根据权利要求1~3任一项所述的酶解制备工艺，其特征在于，步骤（1）中：加入NaOH水溶液溶胀之前，对水母进行匀浆。
7.根据权利要求1~3任一项所述的酶解制备工艺，其特征在于，所述的蛋白酶酶解中，使用胃蛋白酶对预处理后的水母进行酶解。
8.根据权利要求7所述的酶解制备工艺，其特征在于，所述的蛋白酶酶解的工作条件包括：
调节预处理获得的物料pH值为2~3，加入胃蛋白酶，4~10℃条件下处理48~60 h。
9.根据权利要求1~3任一项所述的酶解制备工艺，其特征在于，所述的水母原料为水母的伞部。
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Non-Patent Citations (1)
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| 陶宇: "沙海蛰胶原蛋白肽对光老化小鼠皮肤的保护作用及体外透皮吸收研究", 万方学位论文库, pages 113 - 114 * |
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