CN116983396A - 兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂及其制备和应用，该疫苗乳剂是将作为油相的疫苗佐剂和水相以体积比2：1混合在14000rpm/min下乳化2min获得的；其中，所述疫苗佐剂包含：司班‑80、注射用大豆油和茶皂甙；所述水相包含：灭活兔支气管败血波氏杆菌全菌蛋白和吐温‑80。本发明佐剂使用可注射用植物油替代传统兽用疫苗中使用的矿物油或铝胶佐剂，提高安全性的同时，也减轻了动物免疫疫苗后产生的局部副作用，关注动物福利保护。而且，本发明的疫苗乳剂经皮下注射免疫，克服了现有疫苗注射造成的免疫部位明显副作用及免疫效果不理想等缺点。

Description

兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂及其制备和应用

技术领域

本发明涉及一种灭活疫苗乳剂，具体涉及一种兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂及其制备和应用。

背景技术

由支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica，Bb)引起的呼吸道传染病严重危害我国畜牧业健康发展，该病传播范围广，传播速度快，易引起其它疾病继发感染，给养殖户造成严重经济损失。以兔子为例，波氏杆菌病在兔场普遍存在，且该病在幼兔中的发病率和死亡率极高，严重制约兔业可持续发展。临床上常用抗生素进行防治，但近年来，由于抗生素滥用导致细菌耐药性的产生，不仅引发诸多食品安全问题，更造成严重环境污染。随着我国饲料全面禁用抗生素政策的落地实施，疫苗接种成为防控兔波氏杆菌病的重要措施。然而，目前我国并无商品化兔波氏杆菌疫苗可售。

疫苗研究多集中于灭活疫苗，但普遍存在免疫原性弱、免疫效果差等问题。添加佐剂是提高疫苗免疫效果的有效措施。氢氧化铝和矿物油是畜禽灭活疫苗中最常用佐剂。尽管氢氧化铝佐剂的优势在于刺激机体产生体液免疫反应，但其刺激细胞免疫应答的能力有限，且使用后易引起动物注射部位溃疡、脓肿等明显副作用，严重影响兔食用和皮用价值。矿物油作为波氏杆菌疫苗佐剂可以显著增强疫苗诱导的免疫应答反应，但矿物油佐剂在动物体内不易代谢，且含致癌性物质芳香烃成分，这些成分可通过动物源食品进入食物链，对人类健康构成潜在威胁。因此，寻找一种合适的佐剂来提高波氏杆菌疫苗的免疫效力具有重要意义。

目前，公开了一些疫苗佐剂，但是均存在一定的问题，具体如下：

(1)中国专利CN201310754903.4公开了一种含人参皂苷的植物油佐剂及其制备方法和应用，该植物油佐剂的制备为：在植物油中加入去水山梨醇单油酸酯；将人参皂苷加入二甲基亚砜中进行溶解，混匀得到人参皂苷溶液；将所述人参皂苷溶液加入植物油中直接混合均匀。虽然用食用植物油来制备疫苗，使疫苗的安全性大幅度提高，克服了常规矿物油佐剂对食品卫生潜在的危害，但是该植物油佐剂的不足之处是选用食用型植物油而非注射用植物油，且佐剂作用较弱；

(2)中国专利CN201910518452.1公开了一种植物油疫苗佐剂及其制备方法和用途，该植物油疫苗佐剂的制备为：在植物油中加入司班-80和吐温-80，再加入维生素E和人参皂苷溶液，得组分A；将甘油和1,2-丙二醇混合，得组分B；将组分A和组分B混合，获得植物油疫苗佐剂。但该植物油佐剂的不足之处是制作方法繁琐。而且，将该植物油疫苗佐剂与含本抗原水相按照体积比56：44进行乳化时出现了明显的油水分离，不能形成稳定的乳剂(参见图2中B)，不能制备出波氏杆菌疫苗。

(3)中国专利CN202010132740.6公开了一种复合植物油疫苗佐剂及其用途，该复合植物油佐剂的制备为：在植物油中加入油酸、司班-85和聚甘油蓖麻醇酸酯；将人参皂苷加入二甲基亚砜中进行溶解，混匀得到人参皂苷溶液；将所述人参皂苷溶液加入植物油中直接混合均匀，得到油包水型疫苗。但该佐剂不但制作方法繁琐，且得到的疫苗为油包水型疫苗，适用于禽类免疫，并不适用于兔子的皮下免疫。兔子免疫油包水型疫苗后，注射部位易发生脓肿和溃疡等严重副反应。此外，该佐剂与波氏杆菌抗原水相乳化后不能形成稳定的乳剂，不能制备出波氏杆菌疫苗(参见图1)。

发明内容

本发明的目的是提供一种兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂及其制备和应用，本发明佐剂使用可注射用植物油替代传统兽用疫苗中使用的矿物油或铝胶佐剂，提高安全性的同时，也减轻了动物免疫疫苗后产生的局部副作用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种皮下注射用兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂，该疫苗乳剂是将作为油相的疫苗佐剂和水相以体积比2：1混合在14000rpm/min下乳化2min获得的；其中，所述疫苗佐剂包含：司班-80、注射用大豆油和茶皂甙，其中所述司班-80占其和注射用大豆油总体积的体积百分数为14％；所述茶皂甙的浓度为20μg/mL；所述水相包含：灭活兔支气管败血波氏杆菌全菌蛋白和吐温-80，其中所述吐温-80在水相中的体积百分数为8％。

优选地，所述疫苗佐剂是通过以下方法获得的：将司班-80和注射用大豆油混匀，得到混合液A，司班-80占混合液A的体积百分数为14％，再加入茶皂甙。

优选地，所述水相是通过以下方法获得的：将灭活兔支气管败血波氏杆菌全菌蛋白和吐温-80混匀，吐温-80在水相中的体积百分数为8％。

本发明的另一目的是提供所述的疫苗乳剂的制备方法，该方法包含：将司班-80和注射用大豆油混匀，得到混合液A，司班-80占混合液A的体积百分数为14％，再加入茶皂甙；将灭活兔支气管败血波氏杆菌全菌蛋白和吐温-80混匀，吐温-80在水相中的体积百分数为8％；将疫苗佐剂和水相以体积比2：1混合在14000rpm/min下乳化2min，获得疫苗乳剂。

本发明的另一目的是提供所述的疫苗乳剂在作为制备防控兔波氏杆菌病的灭活疫苗中的应用。

优选地，该疫苗乳剂作为皮下注射用疫苗。

本发明的另一目的是提供一种疫苗佐剂，该疫苗佐剂包含：司班-80、注射用大豆油和茶皂甙，其中所述茶皂甙的浓度为20μg/mL。

优选地，所述司班-80占其和注射用大豆油总体积的体积百分数为14％。

本发明的另一目的是提供所述的疫苗佐剂的制备方法，该方法包含：将司班-80和注射用大豆油混匀，得到混合液A，再加入茶皂甙。

本发明的另一目的是提供所述的疫苗佐剂在制备支气管败血波氏杆菌中的应用。

本发明的兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂及其制备和应用，具有以下优点：

本发明佐剂使用可注射用植物油替代传统兽用疫苗中使用的矿物油或铝胶佐剂，提高安全性的同时，也减轻了动物免疫疫苗后产生的局部副作用，关注动物福利保护。

本发明选用茶皂甙作为佐剂中的添加成分，绿色安全，茶皂甙与大豆油具有协同佐剂作用，可以提高疫苗的免疫效力。而且，本发明的佐剂不仅能增强兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗的免疫刺激能力，加强疫苗免疫效果，还具有制备方法简单方便，佐剂性能稳定，便于量产等优点。

本发明的疫苗乳剂经皮下注射免疫，克服了现有疫苗注射造成的免疫部位明显副作用及免疫效果不理想等缺点。

本发明研究了不同比例的Span-80、Tween-80及乳化时间对疫苗乳剂的稳定性的影响，发现当油：水为2：1，司盘为14％，吐温为8％，乳化时间为2min，分层率<5％，符合药典标准，可形成稳定的疫苗乳剂，该乳剂为水包油型乳剂，其它条件不能形成稳定的乳剂，不符合标准。

附图说明

图1为采用专利CN202010132740.6制备波氏杆菌疫苗乳剂的分层情况。

图2为采用本发明的方法和现有技术(专利CN201910518452.1)方法制备的疫苗乳剂分层结果。

图3为本发明实验例2中疫苗乳剂在水、油中分散的结果。

图4为本发明实验例3中茶皂甙佐剂剂量筛选结果；不同上标字母代表组间差异显著(P<0.05)。

图5为本发明实验例4中各疫苗乳剂在兔子皮下注射后注射部位情况。

图6为本发明实验例4中各实验组的佐剂对波氏杆菌灭活疫苗诱导体液免疫水平的影响；不同上标字母代表组间差异显著(P<0.05)。

图7为本发明实验例4中各实验组制备的疫苗乳剂对动物攻毒后肺部含菌量的影响；不同上标字母代表组间差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实验例中采用的试剂及抗原，如下：

注射用大豆油(浙江田雨山药用油有限公司)、司班-80(上海富畦工贸有限公司)、吐温-80(阿拉丁生化科技有限公司)、茶皂甙(西安小草植物科技公司，批号XC20210129，质量分数90％)；兔支气管败血波氏杆菌强毒株FX-1，由浙江省农业科学院畜牧兽医研究所细菌病研究室分离鉴定并保存。

实验例1采用现有技术制备兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂

参考中国专利CN202010132740.6，按其佐剂配方比例与波氏杆菌抗原配制波氏杆菌疫苗乳剂，乳化后出现明显分层，抗原菌液在离心管底部析出(参见图1)，因此不能制备出波氏杆菌疫苗。

参考中国专利CN201910518452.1，将该植物油疫苗佐剂与含兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗抗原水相按照体积比56：44进行乳化时出现了明显的油水分离，不能形成稳定的乳剂(参见图2中B)，不能制备出波氏杆菌疫苗。

实验例2疫苗乳剂制备条件摸索

为了探究助乳化剂(Span-80、Tween-80)的比例以及不同油相和水相比例对疫苗乳剂形成的影响，制备出稳定的疫苗乳剂，进行以下实验：

1、佐剂油相和水相的制备

将不同体积Span-80(司盘-80)加入注射用大豆油中，以Span-80的比例梯度(在佐剂油相中体积百分数)为8％、10％、12％、14％、16％、18％、20％、22％，分别制备10mL佐剂油相。

将不同体积Tween-80(吐温-80)加入灭活波氏杆菌全菌蛋白中，以Tween-80的比例梯度(在水相中体积百分数)为3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％，分别制备10mL水相。

2、乳化方法

使用分散机进行乳化，转速14000rpm/min，制备不同比例(体积之比)的乳剂，即佐剂油相：水相＝1:1、2:1、3:1，乳化时间分别为30s、1min、2min、3min，制备不同的疫苗乳剂。

3、乳剂稳定性判断标准

根据《中国兽药典》所示方法检测稳定性：吸取乳剂10mL加入离心管中，以3000r/min离心15min后不破乳，离心管底部析出的水相应不大于0.5ml(<5％)。

4、实验结果

将不同比例的Span-80、Tween-80及乳化时间做正交试验。结果发现，当油水比为1:1和3:1时，任一配比的助乳化剂和不同乳化时间制备成的乳剂，经3000r/min离心15min后均出现破乳现象，离心管底部析出的水相均大于0.5mL，分层率均>5％，不符合药典对乳剂稳定性的判断标准，结果见表1。

当油水比为2:1，Span-80在油相中比例为14％，且Tween-80在水相中比例为8％时，经3000r/min离心15min后未出现破乳现象，离心管底部析出的水相小于0.5mL，疫苗乳剂稳定符合药典判断标准，结果见表1，制备的乳剂离心后的情况见图2中的A，没有出现分层，将制备的乳剂滴于清洁冷水表面，呈云雾状扩散，滴入油中不能散开(参见图3)，可见制备的乳剂为水包油型乳剂。

表1为不同比例助乳化剂、乳化时间和油水比例对乳剂稳定性的影响

实验例3茶皂甙剂量筛选试验

将48只小鼠随机分成8组，每组6只，各试验组分组如下：

(1)抗原组：注射支气管败血波氏杆菌抗原；

(2)大豆油组：注射支气管败血波氏杆菌抗原+注射用大豆油(SO)；

(3)～(5)不同剂量茶皂甙(TS)组：分别注射含2μg、4μg和6μg的茶皂甙+支气管败血波氏杆菌抗原，即每0.2mL疫苗中含茶皂甙分别为2μg、4μg和6μg，采用茶皂甙的DMSO溶液(茶皂甙浓度为10mg/mL)进行配置；

(6)～(8)分别为含2μg、4μg和6μg茶皂甙的大豆油组：分别注射含2μg、4μg和6μg的茶皂甙+支气管败血波氏杆菌抗原+注射用大豆油，即每0.2mL疫苗中含茶皂甙分别为2μg、4μg和6μg。

各试验组分别于第0、14d给小鼠免疫注射200μL相应的试剂。在二免后二周于小鼠眼眶丛静脉采集血液，先于37℃放置1h，再于4℃放置2h后经4000rpm离心10min，分离血清用于检测IgG。

结果如图4所示：二免后二周，添加4μg茶皂甙的大豆油组小鼠抗体水平显著高于其余各组(P<0.05)，表明该剂量(20μg/mL疫苗)茶皂甙与大豆油具有协同佐剂作用，因此以此剂量为后续试验使用剂量。

实验例4支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂的免疫效力研究

为了验证本发明佐剂对支气管败血波氏杆菌灭活疫苗免疫效果的影响，特做以下实验。

1、支气管败血波氏杆菌灭活疫苗的疫苗佐剂的制备

以制备100mL佐剂油相为例：注射用植物油为86mL，加入14mL司盘-80，即司盘-80在佐剂油相中的添加比例为14％，充分混匀，得到佐剂油相。

将2mg的茶皂甙加入上述100mL佐剂油相中，即每mL溶液中含有20μg茶皂甙，获得疫苗佐剂。

2、支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂的制备

以制备100mL水相为例：灭活波氏杆菌全菌蛋白为92mL，加入8mL吐温-80，即吐温-80在抗原水相中的添加比例为8％，充分混匀，得到水相。

将上述疫苗佐剂与水相以体积比2:1混合，在转速为14000rpm/min的条件下乳化2min，获得乳白色的支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂。

3、支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂稳定性实验

采用实验例2中的乳剂稳定性判断标准对上述制备的支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂进行实验，未分层，能够形成稳定的疫苗乳剂，符合标准。

4、免疫效力实验

(1)实验材料

将45只新西兰大白兔随机分成5组，每组9只，各试验组分组如下：

第1组(生理盐水组)：生理盐水；

第2组(抗原组)：抗原，即灭活波氏杆菌全菌蛋白；

第3组(本佐剂组)：本发明实验例2中制备的支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂；

第4组(铝胶佐剂组)：铝胶佐剂+抗原；将铝胶佐剂与抗原按体积3:1进行混合，震荡混匀30分钟，形成乳白色疫苗乳剂；其中，铝胶佐剂(购自美国Thermo Scientific公司)；

第5组(矿物油佐剂组)：矿物油佐剂(ISA 201，购自法国Seppic公司)+抗原；将矿物油ISA 201佐剂与抗原按体积1:1进行混合，再用乳化机乳化6分钟(4000转/分)，制成乳白色疫苗乳剂。

上述各实验组中含有抗原的，疫苗中抗原终浓度均为1.2×10¹⁰CFU/mL。

(2)实验过程

各试验组兔子皮下注射疫苗乳剂的体积为2mL，免疫两次，间隔2周，每次注射完后观察注射部位情况。二免后1～4周耳静脉采血，血液37℃静置2h，4℃静置2h，4000r/min离心10min，分离血清，检测抗体IgG。免疫后四周，兔耳静脉注射波氏杆菌(即兔支气管败血波氏杆菌强毒株FX-1)进行攻毒，攻毒剂量为2.4×10¹⁰CFU/只。

注射部位情况：注射本佐剂组(第3组)的兔子的注射部位无任何副反应发生(参见图5的A)。注射铝胶佐剂组免疫部位出现明显脓肿炎症(参见图5的B)。注射矿物油佐剂组免疫部位出现明显溃疡(参见图5的C)。

(3)抗体IgG检测方法

抗体检测过程，具体如下：

1)包被：将波氏杆菌蛋白用碳酸盐缓冲液调整至2μg/mL，每孔100μL加入96孔酶标板中，37℃孵育2h后放入4℃冰箱孵育过夜；

2)洗板：弃去板内液体，用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)洗板，每孔300μL洗涤3～5次，然后将板拍干(下同)；

3)封闭：将含5％(w/v)脱脂乳的PBS封闭液，以每孔300μL加入酶标板中，37℃孵育2h；

4)洗板后，每孔加入100μL 1:100稀释的待检血清，37℃孵育1h；

5)洗板后，每孔加入100μL 1:10000稀释的HRP标记山羊抗兔IgG抗体，37℃孵育1h；

6)洗板后，每孔加入100μL TMB显色液，37℃孵育15min；

7)终止和读数：每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止反应，酶标仪读取OD₄₅₀nm处吸光值。

结果如图6所示，含本发明佐剂的波氏杆菌灭活疫苗诱导的特异性抗体水平显著高于抗原对照组。二免后1-4周，本佐剂组抗体水平显著高于铝胶佐剂和矿物油佐剂组(P<0.05)，且在二免后二周抗体水平达到峰值，明显早于其余两个佐剂组，说明本佐剂可以明显提高波氏杆菌灭活疫苗诱导体液免疫水平。

(4)肺部含菌量检测

攻毒7天后，将动物处死，无菌取出肺脏，置于盛有2mL TSB(Tryptone SoyaBroth，胰蛋白胨大豆肉汤)和钢珠的破碎管内，通过全自动样品快速研磨仪60Hz振荡180s，取肺匀浆液用TSB倍比稀释10、100、1000倍，每个梯度取100μL在TSA培养基上涂布分离，于37℃恒温培养箱倒置培养，次日记录平皿中菌落数，计算攻毒后肺部含菌量。

结果如图7所示，与抗原对照组相比，免疫含本发明佐剂制备的波氏杆菌灭活疫苗后，显著降低了动物攻毒后肺部含菌量(P<0.05)，且与其它两个佐剂组相比，本佐剂组肺部含菌量最低(P<0.05)，表明含本发明佐剂疫苗能有效抵抗波氏杆菌攻毒感染。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (10)

1.一种皮下注射用兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗乳剂，其特征在于，该疫苗乳剂是将作为油相的疫苗佐剂和水相以体积比2：1混合在14000rpm/min下乳化2min获得的；

其中，所述疫苗佐剂包含：司班-80、注射用大豆油和茶皂甙，其中所述司班-80占其和注射用大豆油总体积的体积百分数为14％；所述茶皂甙的浓度为20μg/mL；

所述水相包含：灭活兔支气管败血波氏杆菌全菌蛋白和吐温-80，其中所述吐温-80在水相中的体积百分数为8％。

2.根据权利要求1所述的疫苗乳剂，其特征在于，所述疫苗佐剂是通过以下方法获得的：将司班-80和注射用大豆油混匀，得到混合液A，司班-80占混合液A的体积百分数为14％，再加入茶皂甙。

3.根据权利要求1所述的疫苗乳剂，其特征在于，所述水相是通过以下方法获得的：将灭活兔支气管败血波氏杆菌全菌蛋白和吐温-80混匀，吐温-80在水相中的体积百分数为8％。

4.如权利要求1-3中任意一项所述的疫苗乳剂的制备方法，其特征在于，该方法包含：

将司班-80和注射用大豆油混匀，得到混合液A，司班-80占混合液A的体积百分数为14％，再加入茶皂甙；

将灭活兔支气管败血波氏杆菌全菌蛋白和吐温-80混匀，吐温-80在水相中的体积百分数为8％；

将疫苗佐剂和水相以体积比2：1混合在14000rpm/min下乳化2min，获得疫苗乳剂。

5.如权利要求1-3中任意一项所述的疫苗乳剂在作为制备防控兔波氏杆菌病的灭活疫苗中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，该疫苗乳剂作为皮下注射用疫苗。

7.一种疫苗佐剂，其特征在于，该疫苗佐剂包含：司班-80、注射用大豆油和茶皂甙，其中所述茶皂甙的浓度为20μg/mL。

8.根据权利要求7所述的疫苗佐剂，其特征在于，所述司班-80占其和注射用大豆油总体积的体积百分数为14％。

9.如权利要求7或8所述的疫苗佐剂的制备方法，其特征在于，该方法包含：

将司班-80和注射用大豆油混匀，得到混合液A，再加入茶皂甙。

10.如权利要求7或8所述的疫苗佐剂在制备支气管败血波氏杆菌中的应用。