CN116982553B - 一种黄果厚壳桂组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黄果厚壳桂组织培养方法：(1)挑选外植体；(2)外植体清洗及消毒；(3)接种及培养；(4)增殖培养；(5)生根培养；(6)炼苗移栽，得到完整的黄果厚壳桂植株。本发明研究了植物营养组分对黄果厚壳桂组培苗生长的影响，全面改进培养基组分和含量，减少大量元素的用量，增加了微量元素和有机成分的用量和种类；本发明方法更适合黄果厚壳桂组织培养试管苗生长，培养所得的黄果厚壳桂组培苗生长健壮，增殖率和生根率高，为黄果厚壳桂规模化生产提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种黄果厚壳桂组织培养方法。
背景技术
黄果厚壳桂(Cryptocarya concinna)系樟科(Lauraceae)厚壳桂属(Cryptocarya)常绿乔木，主要分布在我国广东、广西、江西、云南、香港和台湾等海拔600m以下谷地或缓坡常绿阔叶林中，是南亚热带季风性气候典型的植被类群之一。黄果厚壳桂的木材纹理美观、木材颜色鲜明、干形饱满通直、材质坚硬且韧且分枝少，可作为建筑材料和家具原料，具有很高的栽种和研究价值。黄果厚壳桂的研究起步较晚，其繁殖方式仍然以天然林的自然更新为主。近年来有学者尝试通过扦插繁殖培育黄果厚壳桂苗木，但其生长速度慢，难以满足对苗木的需求。
发明内容
为培育黄果厚壳桂苗木，本发明提供一种黄果厚壳桂组织培养方法，旨在得到一种生长健壮、增殖率和生根率高的黄果厚壳桂组培苗的方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种黄果厚壳桂组织培养方法，包含以下操作步骤：
(1)挑选外植体：选择成年黄果厚壳桂当年新生健壮无病虫害、半木质化带芽茎段为外植体，在连续日照5d以上(无阴雨天)晴朗的天气进行采集，用干净剪刀剪下；
(2)外植体清洗及消毒：将步骤(1)中采集所得外植体茎段去掉叶片，用清水洗净表面灰尘，用洗衣粉溶液浸泡10min并用软毛笔仔细刷洗，尤其注意分枝处缝隙，清水漂洗干净后用流水冲洗60min以上，转入超净台，放入酒精中浸泡30秒，无菌水清洗2次，再将所述外植体放入浓度为0.1％的氯化汞溶液中，加入2滴吐温80(聚山梨酯-80)，期间不停的摇晃，浸泡8～10min，无菌水清洗5～6次，即消毒完成；
(3)接种及培养：将步骤(2)中消毒完成的外植体的两端切口处切除少量，避免伤口褐化严重，将外植体茎段切成至少带一个腋芽的短茎段，竖直插入启动培养基中，进行初代启动培养，25±1℃培养25～30d；所述启动培养基为HKG培养基中添加0.2mg/L 6-BA、0.03～0.05mg/L NAA和30g/L蔗糖后所得；
(4)增殖培养：将步骤(3)中启动培养过程中萌出的侧芽小心切下，转接到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养30～35d后，获得增殖生长的芽苗；所述的增殖培养基为HKG培养基中添加0.2～0.4mg/L 6-BA、0.1～0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖后所得；
(5)生根培养：待步骤(4)中增殖培养产生的组培苗生长到1.5cm以上时，逐个切下，竖直转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养30～35d，获得生根的黄果厚壳桂组培苗；所述的生根培养基为向1/2HKG培养基中添加1.0～1.2mg/L IBA、0.1-0.2mg/L NAA和20g/L蔗糖后所得；
(6)炼苗移栽：将步骤(5)中获得的生根黄果厚壳桂组培苗移出组培室，置于室外遮阴炼苗7d，打开盖子，向培养基注入适量无菌水保湿，继续遮阴炼苗，5d后将黄果厚壳桂组培苗移出，移出时切忌不能直接拔取，而要先捏碎根系周围培养基后，用清水小心漂洗干净残留的培养基，将黄果厚壳桂组培苗用0.05％高锰酸钾浸泡10min，移栽至0.1％多菌灵喷洒消毒过的基质(果园土：蛭石：珍珠岩＝4:1:1)中，移栽前几天注意遮阴保湿，每天喷灌一次，直至移栽的黄果厚壳桂长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的黄果厚壳桂植株。
优选的是，步骤(3)中所述启动培养培养时间为25～30d，其中过程包括暗培养和光培养，所述暗培养的培养时间为7d，所述光培养的培养时间为18～23d，光培养的光照强度2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65％。
优选的是，所述启动培养基、增殖培养基、生根培养基的基本培养基是HKG培养基，所述启动培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基均为固体培养基，均以琼脂为支撑物，所述琼脂的添加量为5.8～6.0g/L，所述启动培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基的pH均为5.8～6.0。
优选的是，步骤(3)、步骤(4)和步骤(5)中所述的HKG培养基各组分及含量如下：
大量元素：NH4NO3 1274.4mg/L，K2SO4 1403.1mg/L，KH2PO4 265.0mg/L，CaCl2112.5mg/L，CaCO3 915.9mg/L，MgSO4·7H2O 361.49mg/L；
微量元素：H3BO3 6.2mg/L，CuSO4·5H2O 0.1mg/L，Na2-EDTA 45.4mg/L，FeSO4·7H2O 33.8mg/L，Zn(NO3)2·6H2O 17.0mg/L，MnSO4·H2O 33.5mg/L，Na2MoO4 0.39mg/L，NiSO4·6H2O 0.005mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，KI 0.83mg/L；
有机成分：甘氨酸2.0mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，核黄素5.0mg/L，叶酸0.2mg/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明研究了植物营养组分对黄果厚壳桂组培苗生长的影响，全面改进培养基组分和含量，减少大量元素的用量，增加了微量元素和有机成分的用量和种类；本发明方法更适合黄果厚壳桂组织培养试管苗生长，培养所得的黄果厚壳桂组培苗生长健壮，增殖率(增殖系数2.5以上)和生根率高(生根率80％以上)，为黄果厚壳桂规模化生产提供技术支撑。
具体实施方式
下面结合具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂若无特殊说明，皆为市售所得。
实施例中使用的HKG培养基各组分及含量如下：
大量元素：NH4NO3 1274.4mg/L，K2SO4 1403.1mg/L，KH2PO4 265.0mg/L，CaCl2112.5mg/L，CaCO3 915.9mg/L，MgSO4·7H2O 361.49mg/L；
微量元素：H3BO3 6.2mg/L，CuSO4·5H2O 0.1mg/L，Na2-EDTA 45.4mg/L，FeSO4·7H2O 33.8mg/L，Zn(NO3)2·6H2O 17.0mg/L，MnSO4·H2O 33.5mg/L，Na2MoO4 0.39mg/L，NiSO4·6H2O 0.005mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，KI 0.83mg/L；
有机成分：甘氨酸2.0mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，核黄素5.0mg/L，叶酸0.2mg/L。
启动培养基、增殖培养基、生根培养基的基本培养基是HKG培养基，均为向HKG培养基中加入相应的植物生长调节剂后，再加入琼脂和蔗糖煮沸融化，并调节pH值为5.8～6.0；琼脂的添加量为5.8～6.0g/L。
1/2HKG培养基是指HKG培养基配方中的大量元素对应的化合物成分减为标准用量的一半，微量元素、有机成分及其他添加物用量不变。
实施例1
一种黄果厚壳桂组织培养方法，操作步骤如下：
(1)挑选外植体：选择成年黄果厚壳桂当年新生健壮无病虫害、半木质化带芽茎段为外植体，在连续日照5d以上(无阴雨天)晴朗的天气进行采集，用干净剪刀剪下；
(2)外植体清洗及消毒：将步骤(1)中采集所得外植体茎段去掉叶片，用清水洗净表面灰尘，用洗衣粉溶液浸泡10min并用软毛笔仔细刷洗，尤其注意分枝处缝隙，清水漂洗干净后用流水冲洗60min以上，转入超净台，放入酒精中浸泡30秒，无菌水清洗2次，再将所述外植体放入浓度为0.1％的氯化汞溶液中，加入标准滴管2滴吐温80(聚山梨酯-80)，期间不停的摇晃，浸泡8min，无菌水清洗5次，即消毒完成；
(3)接种及培养：将步骤(2)中消毒完成的外植体的两端切口处切除少量，避免伤口褐化严重，将外植体茎段切成至少带一个腋芽的短茎段，竖直插入启动培养基中，进行初代启动培养，培养温度为25±1℃，启动培养基为HKG培养基中添加0.2mg/L 6-BA、0.05mg/LNAA和30g/L蔗糖后所得，其中过程包括暗培养和光培养，暗培养的培养时间为7d，光培养的培养时间为23d，光培养的光照强度2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65％，启动培养时间为30d，30d时统计得出，外植体保存率为72％，启动率为83％；
(4)增殖培养：将步骤(3)中启动培养过程中萌出的侧芽小心切下，转接到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基为HKG培养基中添加0.2mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA和30g/L蔗糖后所得，光照强度为2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65％，增殖培养35d后，获得增殖生长的芽苗，经统计，增殖系数为2.5；
(5)生根培养：待步骤(4)中增殖培养产生的组培苗生长到1.5cm以上时，逐个切下，竖直转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养基为向1/2HKG培养基中添加1.0mg/LIBA、0.1mg/L NAA和20g/L蔗糖后所得，光照强度为2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65％，生根培养30d，获得生根的黄果厚壳桂组培苗；经统计，生根率为82％；
(6)炼苗移栽：将步骤(5)中获得的生根黄果厚壳桂组培苗移出组培室，置于室外遮阴炼苗7d，打开盖子，向培养基注入适量无菌水保湿，继续遮阴炼苗，5d后将黄果厚壳桂组培苗移出，移出时切忌不能直接拔取，而要先捏碎根系周围培养基后，用清水小心漂洗干净残留的培养基，将黄果厚壳桂组培苗用0.05％高锰酸钾浸泡10min，移栽至0.1％多菌灵喷洒消毒过的基质(果园土：蛭石：珍珠岩＝4:1:1(v:v:v))中，移栽前几天注意遮阴保湿，每天喷灌一次，直至移栽的黄果厚壳桂长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的黄果厚壳桂植株，移栽成活率为85％。
实施例2
一种黄果厚壳桂组织培养方法，操作步骤如下：
(1)挑选外植体：选择成年黄果厚壳桂当年新生健壮无病虫害、半木质化带芽茎段为外植体，在连续日照5d以上(无阴雨天)晴朗的天气进行采集，用干净剪刀剪下；
(2)外植体清洗及消毒：将步骤(1)中采集所得外植体茎段去掉叶片，用清水洗净表面灰尘，用洗衣粉溶液浸泡10min并用软毛笔仔细刷洗，尤其注意分枝处缝隙，清水漂洗干净后用流水冲洗60min以上，转入超净台，放入酒精中浸泡30秒，无菌水清洗2次，再将所述外植体放入浓度为0.1％的氯化汞溶液中，加入标准滴管2滴吐温80(聚山梨酯-80)，期间不停的摇晃，浸泡10min，无菌水清洗6次，即消毒完成；
(3)接种及培养：将步骤(2)中消毒完成的外植体的两端切口处切除少量，避免伤口褐化严重，将外植体茎段切成至少带一个腋芽的短茎段，竖直插入启动培养基中，进行初代启动培养，培养温度为25±1℃，启动培养基为HKG培养基中添加0.2mg/L 6-BA、0.03mg/LNAA和30g/L蔗糖后所得，其中过程包括暗培养和光培养，暗培养的培养时间为7d，光培养的培养时间为23d，光培养的光照强度2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65％，启动培养时间为30d，30d时统计得出，外植体保存率为78％，启动率为86％；
(4)增殖培养：将步骤(3)中启动培养过程中萌出的侧芽小心切下，转接到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基为HKG培养基中添加0.3mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖后所得，光照强度为2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65％，增殖培养33d后，获得增殖生长的芽苗，经统计，增殖系数为2.7；
(5)生根培养：待步骤(4)中增殖培养产生的组培苗生长到1.5cm以上时，逐个切下，竖直转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养基为向1/2HKG培养基中添加1.2mg/LIBA、0.1mg/L NAA和20g/L蔗糖后所得，光照强度为2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65％，生根培养34d，获得生根的黄果厚壳桂组培苗；经统计，生根率为86％；
(6)炼苗移栽：将步骤(5)中获得的生根黄果厚壳桂组培苗移出组培室，置于室外遮阴炼苗7d，打开盖子，向培养基注入适量无菌水保湿，继续遮阴炼苗，5d后将黄果厚壳桂组培苗移出，移出时切忌不能直接拔取，而要先捏碎根系周围培养基后，用清水小心漂洗干净残留的培养基，将黄果厚壳桂组培苗用0.05％高锰酸钾浸泡10min，移栽至0.1％多菌灵喷洒消毒过的基质(果园土：蛭石：珍珠岩＝4:1:1(v:v:v))中，移栽前几天注意遮阴保湿，每天喷灌一次，直至移栽的黄果厚壳桂长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的黄果厚壳桂植株，移栽成活率为85％。
实施例3
一种黄果厚壳桂组织培养方法，操作步骤如下：
(1)挑选外植体：选择成年黄果厚壳桂当年新生健壮无病虫害、半木质化带芽茎段为外植体，在连续日照5d以上(无阴雨天)晴朗的天气进行采集，用干净剪刀剪下；
(2)外植体清洗及消毒：将步骤(1)中采集所得外植体茎段去掉叶片，用清水洗净表面灰尘，用洗衣粉溶液浸泡10min并用软毛笔仔细刷洗，尤其注意分枝处缝隙，清水漂洗干净后用流水冲洗60min以上，转入超净台，放入酒精中浸泡30秒，无菌水清洗2次，再将所述外植体放入浓度为0.1％的氯化汞溶液中，加入标准滴管2滴吐温80(聚山梨酯-80)，期间不停的摇晃，浸泡9min，无菌水清洗6次，即消毒完成；
(3)接种及培养：将步骤(2)中消毒完成的外植体的两端切口处切除少量，避免伤口褐化严重，将外植体茎段切成至少带一个腋芽的短茎段，竖直插入启动培养基中，进行初代启动培养，培养温度为25±1℃，启动培养基为HKG培养基中添加0.2mg/L 6-BA、0.05mg/LNAA和30g/L蔗糖后所得，其中过程包括暗培养和光培养，暗培养的培养时间为7d，光培养的培养时间为21d，光培养的光照强度2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65％，启动培养时间为28d，28d时统计得出，外植体保存率为77％，启动率为84％；
(4)增殖培养：将步骤(3)中启动培养过程中萌出的侧芽小心切下，转接到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养基为HKG培养基中添加0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA和30g/L蔗糖后所得，光照强度为2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65％，增殖培养30d后，获得增殖生长的芽苗，经统计，增殖系数为2.6；
(5)生根培养：待步骤(4)中增殖培养产生的组培苗生长到1.5cm以上时，逐个切下，竖直转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养基为1/2HKG培养基中添加1.0mg/LIBA、0.2mg/L NAA和20g/L蔗糖后所得，光照强度为2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65％，生根培养35d，获得生根的黄果厚壳桂组培苗；经统计，生根率为87％；
(6)炼苗移栽：将步骤(5)中获得的生根黄果厚壳桂组培苗移出组培室，置于室外遮阴炼苗7d，打开盖子，向培养基注入适量无菌水保湿，继续遮阴炼苗，5d后将黄果厚壳桂组培苗移出，移出时切忌不能直接拔取，而要先捏碎根系周围培养基后，用清水小心漂洗干净残留的培养基，将黄果厚壳桂组培苗用0.05％高锰酸钾浸泡10min，移栽至0.1％多菌灵喷洒消毒过的基质(果园土：蛭石：珍珠岩＝4:1:1(v:v:v))中，移栽前几天注意遮阴保湿，每天喷灌一次，直至移栽的黄果厚壳桂长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的黄果厚壳桂植株，移栽成活率为85％。
对比实施例1
本对比实施例1中，基本培养基为常用的普通MS培养基，其余培养方法和培养条件均与实施例1一致。
对比实施例1中使用的MS培养基各组分及含量如下：
大量元素：NH4NO3 1650mg/L，KNO3 1900mg/L，MgSO4·7H2O 370mg/L，KH2PO4170mg/L，CaCl2·2H2O 440mg/L；
微量元素：KI 0.83mg/L，H3BO3 6.2mg/L，MnSO4·4H2O 22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；CuSO4·5H2O 0.025mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，FeSO4·7H2O(28.7mg/L)+Na2-EDTA·2H2O(37.3mg/L)；
有机成分：肌醇100mg/L，烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1)0.1mg/L，甘氨酸2.0mg/L。
培养基的pH为5.8～6.0，琼脂的添加量为5.8～6.0g/L。
启动培养阶段，外植体普遍难启动且褐化现象明显，30d时统计外植体启动率为35％；
增殖培养阶段，组培苗黄化现象较普遍，生长缓慢，增殖效果不佳，35d后统计增殖系数为1.3；
生根培养30d统计生根率为31％，根系状态不佳，根短粗且无主根，移栽成活率为0％，不利于移栽。
综合对比本发明的培养基配方，从启动培养阶段到增殖培养、生根培养阶段及最后的移栽，对比实施例1均效果不佳。
对比实施例2
本对比实施例2中，基本培养基为B5培养基，其余培养方法和培养条件均与实施例1一致。
对比实施例2中使用的B5培养基各组分及含量如下：
大量元素：(NH4)2SO4 134mg/L，KNO3 2500mg/L，MgSO4 122.09mg/L，NaH2PO4150mg/L，CaCl2113.24 mg/L；
微量元素：KI 0.75mg/L，H3BO3 3.0mg/L，MnSO4·2H2O 10mg/L，ZnSO4·7H2O2.0mg/L，Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；CuSO4·5H2O 0.025mg/L，FeSO4·7H2O(28.7mg/L)+Na2-EDTA·2H2O(37.3mg/L)；
有机成分：肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)1.0mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1)10mg/L。
培养基的pH为5.8～6.0，琼脂的添加量为5.8～6.0g/L。
启动培养阶段，外植体启动较晚，30d时统计外植体启动率为39％；
增殖培养阶段，组培苗生长较缓慢，增殖效果不佳，35d后统计增殖系数为1.4；
生根培养30d统计生根率为37％，根系状态不佳，较细弱，移栽成活率为5％。
综合对比本发明的培养基配方，从启动培养阶段到增殖培养、生根培养阶段及最后的移栽，对比实施例2均效果不佳。
对比实施例3
本对比实施例3中，基本培养基为N6培养基，其余培养方法和培养条件均与实施例1一致。
对比实施例3中使用的N6培养基各组分及含量如下：
大量元素：(NH4)2SO4 463mg/L，KNO3 2800mg/L，MgSO4·7H2O 185mg/L，KH2PO4400mg/L，CaCl2·2H2O 165mg/L；
微量元素：KI 0.8mg/L，H3BO3 1.6mg/L，MnSO4·H2O 4.4mg/L，ZnSO4·7H2O 1.5mg/L，FeSO4·7H2O(28.7mg/L)+Na2-EDTA·2H2O(37.3mg/L)；
有机成分：烟酸0.5mg/L，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg/L，盐酸硫胺素(维生素B1)1.0mg/L，甘氨酸2.0mg/L。
培养基的pH为5.8～6.0，琼脂的添加量为5.8～6.0g/L。
启动培养阶段，外植体普遍难启动，30d时统计外植体启动率为41％；
增殖培养阶段，组培苗生长缓慢，增殖效果不佳，35d后统计增殖系数为1.3；
生根培养30d统计生根率为38％，根系细弱且无主根，移栽成活率为5％。。
综合对比本发明的培养基配方，从启动培养阶段到增殖培养、生根培养阶段及最后的移栽，对比实施例3均效果不佳。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (3)
1.一种黄果厚壳桂组织培养方法，其特征在于，包含以下操作步骤：
（1）挑选外植体：选择成年黄果厚壳桂当年新生健壮无病虫害、半木质化带芽茎段为外植体，在连续日照5d以上晴朗的天气进行采集；
（2）外植体清洗及消毒：将步骤（1）中采集所得外植体茎段去掉叶片，洗净表面灰尘，用洗衣粉溶液浸泡并用软毛笔仔细刷洗，尤其注意分枝处缝隙，清水漂洗干净后用流水冲洗，转入超净台，放入酒精中浸泡，清洗，再将所述外植体放入氯化汞溶液中，加入吐温80，期间不停的摇晃，浸泡，无菌水清洗，即消毒完成；
（3）接种及培养：将步骤（2）中消毒完成的外植体的两端切口处切除少量，避免伤口褐化严重，将外植体茎段切成至少带一个腋芽的短茎段，竖直插入启动培养基中，进行初代启动培养，25±1℃培养25~30d；所述启动培养基为HKG培养基中添加0.2mg/L 6-BA、0.03~0.05mg/L NAA、30g/L蔗糖和5.8~6.0g/L琼脂后所得；
（4）增殖培养：将步骤（3）中启动培养过程中萌出的侧芽切下，转接到增殖培养基中进行增殖培养，增殖培养30~35d后，获得增殖生长的芽苗；所述的增殖培养基为HKG培养基中添加0.2~0.4mg/L 6-BA、0.1~0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖和5.8~6.0g/L琼脂后所得；
（5）生根培养：待步骤（4）中增殖培养产生的组培苗生长到1.5cm以上时，逐个切下，竖直转接到生根培养基中进行生根培养，生根培养30~35d，获得生根的黄果厚壳桂组培苗；所述的生根培养基为向1/2 HKG培养基中添加1.0~1.2mg/L IBA、0.1-0.2mg/L NAA、20g/L蔗糖和5.8~6.0g/L琼脂后所得；
（6）炼苗移栽：将步骤（5）中获得的生根黄果厚壳桂组培苗置于室外遮阴炼苗7d，向培养基注水保湿，继续遮阴炼苗，5d后将黄果厚壳桂组培苗移出，漂洗，将黄果厚壳桂组培苗用高锰酸钾浸泡，移栽至0.1%多菌灵喷洒消毒过的基质中，每天喷灌一次，直至移栽的黄果厚壳桂长出新叶即可移出遮阴网接受正常光照，得到完整的黄果厚壳桂植株；
步骤（3）、步骤（4）和步骤（5）中所述的HKG培养基各组分及含量如下：
大量元素：NH4NO3 1274.4mg/L，K2SO4 1403.1mg/L，KH2PO4 265.0mg/L，CaCl２112.5 mg/L，CaCO3 915.9mg/L，MgSO4·7H2O361.49 mg/L；
微量元素：H3BO3 6.2mg/L，CuSO4·5H2O 0.1mg/L，Na2-EDTA 45.4mg/L，FeSO4·7H2O33.8mg/L，Zn(NO3)2·6H2O 17.0mg/L，MnSO4·H2O 33.5mg/L，Na2MoO4 0.39mg/L，NiSO4·6H2O 0.005mg/L，CoCl2·6H2O 0.025mg/L，KI 0.83mg/L；
有机成分：甘氨酸2.0mg/L，肌醇100mg/L，烟酸1.0mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，核黄素5.0mg/L，叶酸0.2mg/L。
2.根据权利要求1所述的黄果厚壳桂组织培养方法，其特征在于：步骤（3）中所述启动培养培养时间为25~30d，其中过程包括暗培养和光培养，所述暗培养的培养时间为7d，所述光培养的培养时间为18~23d，光培养的光照强度2500LX，光照周期为16h/d，温度为25±1℃，湿度为65%。
3.根据权利要求1所述的黄果厚壳桂组织培养方法，其特征在于：所述启动培养基、所述增殖培养基和所述生根培养基的pH均为5.8~6.0。
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| CN116982553A (zh) | 2023-11-03 |
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