CN116970582A - 一种耐热耐碱的乙醇脱氢酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种耐热耐碱的乙醇脱氢酶突变体，所述乙醇脱氢酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID NO.1所示序列中的位点突变获得，所述突变的位点选自第65位、187位、213位中的任意一个。本申请提供的乙醇脱氢酶突变体，其以NCBI WP_015868859来源于Kosmotoga属的蛋白氨基酸序列为野生型，对其进行生物信息学分析及耐热性筛选，获得同时含有R65E、A187S和H213L三位点突变蛋白的氨基酸序列。相比于野生型，本申请获得的乙醇脱氢酶突变体的最适温度由70℃提升至75℃，提取酶液75℃保存5小时，pH 10条件下测定残余活性由64%提升至89%，显示出了显著提升的温度稳定性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种耐热耐碱的乙醇脱氢酶突变体及其应用。
背景技术
乙醇脱氢酶（Alcohol Dehydrogenase，简称ADH）是一种在生物化学工程中常用的酶，主要参与酒精代谢过程中的乙醇氧化反应。该酶能够催化乙醇（酒精）与辅酶NAD+之间的氧化还原反应，将乙醇转化为乙醛，并同时生成NADH。由于ADH在酒精代谢中的重要作用，其活性和存在量在酒驾测试等法医学领域有着重要意义。其次，通过改造ADH的基因，提高其催化效率和底物特异性，可广泛应用于酶工程及工业化生产中。此外，利用ADH催化乙醇氧化反应所释放的氧化还原电流变化，构建生物传感器可以实现对乙醇浓度的检测，在酒精检测仪器和生物传感器中有着重要的应用价值。
然而，乙醇脱氢酶生产应用存在一些缺陷，如酶稳定性问题：乙醇脱氢酶在高温和极端酸碱环境下的稳定性较差，容易失活。这限制了它在工业应用中的广泛使用，特别是在高温反应条件下的应用。
现有技术中提供了一些乙醇脱氢酶突变体，例如，专利CN108753745A该技术利用易错PCR随机突变的方法，对乙醇脱氢酶进行了蛋白质工程改造，获得了一种乙醇脱氢酶突变体，然而，该突变体的最适温度为35~40℃，温度升高容易失活，即高温稳定性较差。专利CN116042555A通过位点突变获得了一种乙醇脱氢酶突变体，然而该突变体的Tm值为66℃，仍有待提高。
发明内容
为了解决上述问题，本申请提供了一种耐热耐碱的乙醇脱氢酶突变体，所述乙醇脱氢酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID NO.1所示序列中的位点突变获得，所述突变的位点选自第65位、187位、213位中的任意一个。
在一种实施方式中，所述突变为第65位的精氨酸（Arg，R）突变为谷氨酸（Glu，E）、第187位的丙氨酸（Ala，A）突变为丝氨酸（Ser，S）、第213位的组氨酸（His，H）突变为亮氨酸（Leu，L）中的至少一种。
优选的，所述乙醇脱氢酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID NO.1所示序列作出R65E、A187S和H213L三位点同时突变获得。
在一种实施方式中，所述乙醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
另一方面，本申请提供了一种生物材料，其选自如下任意一种：
I）核酸分子，其编码所述的乙醇脱氢酶突变体；
II）表达盒，其含有I）所述核酸分子；
III）重组表达载体，其含有如I）所述核酸分子和/或如II）所述表达盒；
IV）重组微生物，其含有如I）所述核酸分子、如II）所述表达盒和/或如III）所述重组表达载体；
V）重组细胞，其含有如I）所述核酸分子、如II）所述表达盒和/或如III）所述重组表达载体；
VI）全细胞催化剂，其含有如I）所述核酸分子、如II）所述表达盒、如III）所述重组表达载体、如IV）所述重组微生物和/或如V）所述重组细胞。
在一种实施方式中，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在一种实施方式中，所述重组表达载体选自质粒载体、病毒载体、噬菌粒载体中的一种或多种。
可以理解的是，本申请所述“载体”是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体，所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体。
优选的，所述重组表达载体为质粒载体，所述质粒载体可选自pET系列、pQE系列、pRSET系列、pGEX系列、pBV系列、pUC系列、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pACYC系列。
可选的，本申请中所述“微生物”可为酵母、细菌、藻或真菌。
在一种实施方式中，所述重组微生物、重组细胞和/或所述全细胞催化剂为基因工程菌，所述基因工程菌的底盘细胞选自大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、酵母菌(saccharomyces) 、谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum）中的一种或多种。
另一方面，本申请提供了所述乙醇脱氢酶突变体在制备乙醇催化剂和/或醇类物质检测设备中的应用。
在一种实施方式中，所述醇类物质检测设备包括酒精检测仪和醇类生物传感器。
另一方面，本申请提供了一种催化乙醇转化的方法，包括利用所述的乙醇脱氢酶突变体，或所述的生物材料进行催化的步骤。
在一种实施方式中，所述催化的温度为60~90℃，pH值为7~12。
优选的，所述乙醇脱氢酶突变体的最适催化温度为75℃，最适pH值为10。
本申请的有益效果至少包括：
本申请提供的乙醇脱氢酶突变体，其以NCBI WP_015868859来源于Kosmotoga属的蛋白氨基酸序列为野生型，采用随机突变的方式获得了960株突变菌，对其进行生物信息学分析及耐热性筛选，获得一株酶活性最高的突变菌，测序对比得知该突变菌产生的酶突变体的氨基酸序列同时含有R65E、A187S和H213L三位点突变。相比于野生型，本申请获得的乙醇脱氢酶突变体的最适温度由70℃提升至75℃，提取酶液75℃保存5小时，pH 10条件下测定残余活性由64%提升至89%，显示出了显著提升的温度稳定性。
本申请提供的乙醇脱氢酶突变体，突变前后酶的最适pH无明显改变，酶液在pH 10条件下室温保存3h，最适温度处测定残余活性，分别为53%、55%，仍具有很好的耐碱活性。
本申请提供的乙醇脱氢酶突变体，对乙醇催化率高，并对多种醇类展现优异的催化效果，在酒精检测仪器以及醇类生物传感器等检测设备中具有很好的应用前景。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请乙醇脱氢酶突变体的适宜温度范围曲线图；
图2为本申请乙醇脱氢酶突变体的适宜pH范围曲线图；
图3为本申请乙醇脱氢酶突变体的温度稳定性曲线图；
图4为本申请乙醇脱氢酶突变体的在pH10缓冲体系中的稳定性曲线图；
图5为本申请乙醇脱氢酶突变体对不同底物的适应性柱状图。
实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面结合说明书附图以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。
下述实施例中所涉及的材料和试剂的来源如下：
PBS缓冲液、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素（索莱宝）；Escherichiacoli BL21（DE3）感受态细胞（昂羽生物）；NAD（Sigma）；Na2HPO4、柠檬酸、甘氨酸-NaOH、甲醇、乙醇、正丙醇、正丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、丙三醇（国药）；随机突变试剂盒GeneMorph II Random Mutagenesis Kit购自安捷伦科技（中国）有限公司。
以NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/） WP_015868859来源于Kosmotoga属的蛋白氨基酸序列为野生型（其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示），利用博尚生物科技有限公司在线工具通过氨基酸序列获得优化DNA序列（如SEQ ID NO.2所示），并合成相关序列，构建基因工程菌原始菌ADH-Y0。
利用引物：kol-F：5-GGCAGCCATATGTGGCATTATTACCTGCCAACT-3；kol-R：5- GCTCTCGAGTATTCAGTGTTCTGGCATTTACGGA-3；随机突变试剂盒：GeneMorph II Random MutagenesisKit（购自安捷伦科技（中国）有限公司）。构建如表1所示的PCR扩增体系：
其中，PCR 扩增程序如下：预变性，96℃ 1 min；变性 95℃ 40 s；退火 60℃ 40s；延伸 72℃ 90s；最后延伸 72℃ 10 min；变性至延伸共 35 个循环，热盖温度 105℃。
利用NdeI和XhoI双酶切将目的基因连接到pET-28a（+）载体，采用热激法转化至感受态E.coli BL21（DE3）中，利用96孔板进行筛选，每孔加入 150 μL LB培养基（含抗生素Kana 35 μg/mL及终浓度0.1 mM的IPTG），挑单克隆分别至每孔中，25℃、150 rpm过夜培养，培养液离心8 min；弃上清，加入150 μL破菌缓冲液（pH=7.4 50 mM PBS缓冲液），混匀，于-80℃冰箱内放置20 min，37℃培养箱20 min，反复冻融3~5次，得到粗酶液；取出50 μL粗酶液至另一块96孔平板，每孔加50 μL乙醇等底物进行酶促反应，优选60℃反应温度进行耐高温高通量初筛优势菌株。
酶活测定条件：以乙醇为底物，分光光度计A340下检测醇脱氢酶氧化反应活性。60℃，终浓度100 mM乙醇；50mM pH 7.4的PBS缓冲液；3mM NAD+，加入酶液后反应开始计时，测定340nm吸光值在10min内的变化。
采用上述方法共计筛选960株菌，以ADH-Y0菌为对照，酶活性正向提高占比1.8%，优选酶活性最高的菌株ADH-Y307进行进一步分析。
对菌株ADH-Y307测序，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，该序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，与如SEQ ID NO.1所示的野生型对比发现同时存在3个位点突变，分别为R65E、A187S和H213L。
乙醇脱氢酶突变体的异源表达：
将ADH-Y307菌甘油管保存菌株接种于5mL LB液体培养基（含卡那霉素）中，37℃摇床振荡培养过夜，以1%的添加量转接至100mL LB发酵培养基中（500mL锥形瓶），37℃培养至OD600为0.6~1.0，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）并在30℃下进行诱导，6h后收集菌体。于4℃、8000rpm离心弃上清。
乙醇脱氢酶突变体粗酶液的获得：
收集的菌体用50mM PBS缓冲液（pH7.4）按10mL/1g湿重菌体重新悬浮，并超声破碎细胞，于4℃、10000rpm离心，取上清即得到乙醇脱氢酶突变体的粗酶液。
1、乙醇脱氢酶突变体最适温度测定
对所得乙醇脱氢酶突变体进行最适温度的测定，测度温度范围65-85℃。以最适温度值的酶活为100%，并以温度值为横坐标，各个温度值下的相对酶活为纵坐标，做温度曲线图，所得结果如表2和图1所示。
结合表2以及图1中的结果可知，所得乙醇脱氢酶突变体的最适温度为75℃。
2、乙醇脱氢酶突变体最适pH测定
对所得乙醇脱氢酶突变体进行最适pH的测定，测度pH范围5~12。其中，pH≤8.0用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液，9.0≤pH≤10.0用甘氨酸-NaOH缓冲液，11.0≤pH≤12.0用Na2HPO4-NaOH缓冲液。以最适pH值的酶活为100%，并以pH值为横坐标，各个pH值下的相对酶活为纵坐标，做pH曲线图，所得结果如表3和图2所示。
结合表3以及图2中的结果可知，所得乙醇脱氢酶突变体的最适pH值为10。
3、乙醇脱氢酶突变体75℃稳定性
将所得乙醇脱氢酶突变体置于75℃分别放置0-360min，75℃、pH 10缓冲体系反应10min，测定相对酶活力下降情况，所得结果如表4和图3所示。
结合表4以及图3中的结果可知，所得乙醇脱氢酶突变体在75℃处理360min后，相对酶活力达到88%，具有显著提升的耐热稳定性。
4、乙醇脱氢酶突变体pH10稳定性
将所得乙醇脱氢酶突变体置于pH10缓冲体系中分别放置0-360min，75℃、pH 10缓冲体系反应10min，测定相对酶活力下降情况，所得结果如表5和图4所示。
结合表5以及图4中的结果可知，所得乙醇脱氢酶突变体在碱处理360min后，相对酶活力仍能保持在38%，显示出很好的耐碱活性。
5、不同底物特异性分析
将所得乙醇脱氢酶突变体酶液以终浓度为100mM的不同其他醇溶液为底物，75℃、pH 10缓冲体系反应10 min，以乙醇为底物的酶反应活力为100%。测定其他底物的相对酶活力，所得结果如表6和图5所示。
结合表6以及图5中的结果可知，所得乙醇脱氢酶突变体对正丙醇、正丁醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇等具有良好的酶反应活性，其中丁二醇相对活性高达1446%，在不同醇检测试剂盒开发及通过生物催化法催化醇与酮之间酶法转化具有良好应用前景。
6、乙醇脱氢酶突变体和野生型的性能对比
将所得乙醇脱氢酶突变体和其野生型的性能进行对比，结果如表7所示
由表7中的结果可知，相较于野生型，其突变体的最适温度由70℃提升至75℃，提取酶液75℃保存5小时，pH 10条件下测定残余活性由64%提升至89%；突变前后酶最适pH无明显改变，酶液在pH 10条件下室温保存3h，最适温度处测定残余活性，分别为53%、55%，变化不大。因此，本申请提供的乙醇脱氢酶突变体具有显著提升的温度稳定性和很好的耐碱活性。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (10)
1. 一种耐热耐碱的乙醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述乙醇脱氢酶突变体的氨基酸序列由如SEQ ID NO.1所示序列中的位点突变获得，所述突变的位点选自第65位、187位、213位中的任意一个。
2.根据权利要求1所述的乙醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变为第65位的精氨酸突变为谷氨酸、第187位的丙氨酸突变为丝氨酸、第213位的组氨酸突变为亮氨酸中的至少一种。
3. 根据权利要求2所述的乙醇脱氢酶突变体，其特征在于，所述乙醇脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.生物材料，其特征在于，选自如下任意一种：
核酸分子，其编码如权利要求1-3任一所述的乙醇脱氢酶突变体；
表达盒，其含有I）所述核酸分子；
重组表达载体，其含有如I）所述核酸分子和/或如II）所述表达盒；
重组微生物，其含有如I）所述核酸分子、如II）所述表达盒和/或如III）所述重组表达载体；
重组细胞，其含有如I）所述核酸分子、如II）所述表达盒和/或如III）所述重组表达载体；
全细胞催化剂，其含有如I）所述核酸分子、如II）所述表达盒、如III）所述重组表达载体、如IV）所述重组微生物和/或如V）所述重组细胞。
5. 根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
6.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述重组表达载体选自质粒载体、病毒载体、噬菌粒载体中的一种或多种。
7.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述重组微生物、重组细胞和/或所述全细胞催化剂为基因工程菌，所述基因工程菌的底盘细胞选自大肠杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌中的一种或多种。
8.如权利要求1-3任一所述的乙醇脱氢酶突变体在制备乙醇催化剂和/或醇类物质检测设备中的应用，所述醇类物质检测设备包括酒精检测仪和醇类生物传感器。
9.一种催化乙醇转化的方法，其特征在于，包括利用如权利要求1-3任一所述的乙醇脱氢酶突变体，或如权利要求4-7任一所述的生物材料进行催化的步骤。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述催化的温度为60~90℃，pH值为7~12。
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